CN107121362A - 一种研究分子迁移运动的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及光学显微领域，一种研究分子迁移运动的方法，激光束经起偏器、普克尔盒、检偏器后，分为两束激光，一束经过距离L直接照射于样品表面，另一束经过距离a到平面镜，经反射照射于样品表面，照射于样品表面的两束激光呈θ角；调节距离a和L的长度，能改变角θ值和干涉条纹间距i；普克尔盒使激光产生一个小于1秒极短的满强度脉冲，对亮条纹处荧光标记相应种类分子进行光脱色，激光器连续发射光强为I(r，t)激光以探测样品表面荧光变化；位移台使平面镜沿其法向以频率800Hz正弦振动，改变样品表面处干涉条纹位置；光电倍增管收集光漂白后荧光信号，经锁相放大器分析，得到样品表面亮条纹部分与暗条纹部分荧光强度比C(t)，求出扩散系数D。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微领域，特别是一种分析更为简单而精确的、能够测量扩散系数的一种研究分子迁移运动的方法。
背景技术
光脱色又称光漂白，是指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象。荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度，提高激发光强度可以提高信号强度，但当激发光的强度超过一定限度时，光吸收就趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子，这就是光漂白现象。荧光漂白后恢复技术是使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部运动及其迁移速率。荧光漂白后的恢复技术的原理是：利用高能激光照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子不可逆的淬灭，这一区域称荧光漂白区。随后，由于细胞质中的脂质分子或蛋白质分子的运动，周围非漂白区荧光分子不断向光漂白区迁移，结果使荧光漂白区的荧光强度逐渐地回复到原有水平，在此基础上迫切需要一种具有能够用于测量扩散系数的装置及方法。
传统的使用光漂白后荧光恢复的方法来研究分子迁移扩散等运动的技术具有的缺陷有：为了达到实验中光信号采集的需求，荧光分子的密度需要很高；光束轮廓的测量需要非常精确；光漂白过程的监控不容易达到，从而需要较高的光强进行光漂白，这样有可能会破坏样品分子的结构，特别是一些生物样品分子。所述一种研究分子迁移运动的方法使用平面的光斑对样品进行光漂白及随后的监控探测，解决了上述缺陷。
发明内容
为了解决上述问题，本发明装置使得在样品表面产生明暗相间的条纹状的光斑区域，在亮条纹区域用强光进行光漂白后，继续保持较低强度光照，来探测明暗条纹之间的对比度随时间的变化，并通过后续分析来得到待测分子的扩散系数等信息，布朗扩散系数可以独立地得到，其是整个光斑图案区域的平均值。
本发明所采用的技术方案是：
所述一种研究分子迁移运动的方法，装置主要包括激光器、起偏器、普克尔盒、检偏器、分光器、样品、位移台、平面镜、光纤、滤光片、光电倍增管、锁相放大器、电缆，所述平面镜位于所述位移台，所述锁相放大器通过电缆分别连接所述普克尔盒与所述位移台，所述样品表面的光经过所述光纤以及所述滤光片传输到所述光电倍增管中。方法步骤为：
一.所述激光器发射的激光束经过所述起偏器、普克尔盒、检偏器后，由所述分光器分为两束激光，一束激光经过距离L直接照射于所述样品表面，另一束激光经过距离a后到达所述平面镜，经过所述平面镜反射后照射于所述样品表面，上述照射于所述样品表面的两束激光呈θ角，从而在所述样品表面处产生光的干涉图案；
二.通过调节所述距离a和L的长度，能够改变所述角θ的值，从而改变所述样品表面干涉条纹间距i；
三.通过所述普克尔盒使激光产生一个小于1秒的极短的满强度的脉冲，对亮条纹处的荧光标记的相应种类的分子进行光脱色，在光脱色过程结束后，所述激光器连续发射光强为I(r，t)的激光以探测所述样品表面的荧光变化；
四.通过所述位移台对所述平面镜进行位置调制，使得所述平面镜沿其法向方向以频率800Hz进行正弦振动，从而改变所述样品表面处干涉条纹位置；
五.所述光电倍增管收集光漂白后由于分子扩散运动而新出现的荧光信号，然后通过所述锁相放大器进行分析，从而得到所述样品表面亮条纹部分与暗条纹部分的荧光强度之比，即平均对比度C(t)，所述光电倍增管测得的荧光信号F(t)与被荧光标记的分子的浓度cm(r，t)和探测光强I(r，t)相关其中和是cm(r，t)和I(r，t)的空间傅里叶变换，F(t)可以分解为调制频率的谐波级数，实验中，一阶和二阶的谐波分量f1(t)和f2(t)可以通过所述锁相放大器同时得到；
六.最终的实验数据给出暗条纹与亮条纹之间的平均对比度上式用一个指数衰减来表征布朗扩散行为；
七.由能够求出弛豫时间τq，由弛豫时间τq与扩散系数D的关系q为条纹图案的空间周期，能够求出扩散系数D。
所述样品表面具有一圆形开口的光掩膜、且其测量区域位于所述开口内，光掩膜的材料对光的反射率很小，以能减小由于激光光斑造成的所述样品表面非测量区域的杂散光对实验信噪比的影响；可以使用不同的激光波长488nm、532nm、633nm等来进行实验，并综合比较各激光波长条件实验得到的结果，以能够更准确地反映分子的迁移运动；对生物大分子样品，光漂白时激光光强小于250W/cm2，且脉冲时间小于400ms。
普克尔盒是一种电光器件，它包含一个由光通过的电光晶体，基于普克耳斯效应，能够通过施加到晶体上的电压来调控光的偏振方向以及改变光通过晶体后的位相延迟。
由于分子的扩散作用，所述对比度C(t)随时间减小，使用同一个条纹图案来对样品进行光脱色以及探测并收集信号保证了它们由同样的波长来表征。所述锁相放大器中探测的荧光强度的基频的成分随时间改变，并满足单模的扩散方程，且对比度C(t)按照简单的指数衰减其中弛豫时间τq与扩散系数D有关q为条纹图案的空间周期，这样，通过改变q，能够检验布朗扩散法则并精确地决定运动分子的扩散系数。常数C0、C1与运动分子和不运动分子之间的相对分数和有关。
在含有N种不同运动种群的复杂样品的情况，可以推广为
第k种种群的扩散系数和分数分别为
本发明的有益效果是：
本发明分析更为简单且精确，更易于探测扩散系数的较小变化，或是鉴别不同种群之间的区别；对样品进行光脱色以及探测并收集信号中使用的周期性正弦图案可以用于探测一个单模的扩散方程，光脱色的图案可以是一个更为复杂的图形，通常为高斯光斑；另外，本发明装置可以更容易地更改干涉条纹的参数，以在倒易空间直接检验扩散法则的真实性，该装置读取及光脱色同样的图案，能够应用于聚合物在界面的扩散的研究、DNA扩散以及电泳等领域。
附图说明
下面结合本发明的图形进一步说明：
图1是本发明装置示意图。
图中，1.激光器，2.起偏器，3.普克尔盒，4.检偏器，5.分光器，6.样品，7.位移台，8.平面镜，9.光纤，10.滤光片，11.光电倍增管，12.锁相放大器，13.电缆。
具体实施方式
如图1是本发明装置示意图，主要包括激光器1、起偏器2、普克尔盒3、检偏器4、分光器5、样品6、位移台7、平面镜8、光纤9、滤光片10、光电倍增管11、锁相放大器12、电缆13，所述平面镜8位于所述位移台7，所述锁相放大器12通过电缆13分别连接所述普克尔盒3与所述位移台7，所述样品6表面的光经过所述光纤9以及所述滤光片10传输到所述光电倍增管11中。
所述一种研究分子迁移运动的方法，步骤为：
一.所述激光器1发射的激光束经过所述起偏器2、普克尔盒3、检偏器4后，由所述分光器5分为两束激光，一束激光经过距离L直接照射于所述样品6表面，另一束激光经过距离a后到达所述平面镜8，经过所述平面镜8反射后照射于所述样品6表面，上述照射于所述样品6表面的两束激光呈θ角，从而在所述样品6表面处产生光的干涉图案；
二.通过调节所述距离a和L的长度，能够改变所述角θ的值，从而改变所述样品6表面干涉条纹间距i；
三.通过所述普克尔盒3使激光产生一个小于1秒的极短的满强度的脉冲，对亮条纹处的荧光标记的相应种类的分子进行光脱色，在光脱色过程结束后，所述激光器1连续发射光强为I(r，t)的激光以探测所述样品6表面的荧光变化；
四.通过所述位移台7对所述平面镜8进行位置调制，使得所述平面镜8沿其法向方向以频率800Hz进行正弦振动，从而改变所述样品6表面处干涉条纹位置；
五.所述光电倍增管11收集光漂白后由于分子扩散运动而新出现的荧光信号，然后通过所述锁相放大器12进行分析，从而得到所述样品6表面亮条纹部分与暗条纹部分的荧光强度之比，即平均对比度C(t)，所述光电倍增管11测得的荧光信号F(t)与被荧光标记的分子的浓度cm(r，t)和探测光强I(r，t)相关其中和是cm(r，t)和I(r，t)的空间傅里叶变换，F(t)可以分解为调制频率的谐波级数，实验中，一阶和二阶的谐波分量f1(t)和f2(t)可以通过所述锁相放大器12同时得到；
六.最终的实验数据给出暗条纹与亮条纹之间的平均对比度上式用一个指数衰减来表征布朗扩散行为；
七.由能够求出弛豫时间τq，由弛豫时间τq与扩散系数D的关系q为条纹图案的空间周期，能够求出扩散系数D。
所述样品6表面具有一圆形开口的光掩膜、且其测量区域位于所述开口内，光掩膜的材料对光的反射率很小，以能减小由于激光光斑造成的所述样品6表面非测量区域的杂散光对实验信噪比的影响；可以使用不同的激光波长488nm、532nm、633nm等来进行实验，并综合比较各激光波长条件实验得到的结果，以能够更准确地反映分子的迁移运动；对生物大分子样品，光漂白时激光光强小于250W/cm2，且脉冲时间小于400ms。
所述普克尔盒3是一种电光器件，它包含一个由光通过的电光晶体，基于普克耳斯效应，能够通过施加到晶体上的电压来调控光的偏振方向以及改变光通过晶体后的位相延迟。
由于分子的扩散作用，所述对比度C(t)随时间减小，使用同一个条纹图案来对样品进行光脱色以及探测并收集信号保证了它们由同样的波长来表征。所述锁相放大器12中探测的荧光强度的基频的成分随时间改变，并满足单模的扩散方程，且对比度C(t)按照简单的指数衰减其中弛豫时间τq与扩散系数D有关q为条纹图案的空间周期，这样，通过改变q，能够检验布朗扩散法则并精确地决定运动分子的扩散系数。常数C0、C1与运动分子和不运动分子之间的相对分数和有关。
在含有N种不同运动种群的复杂样品的情况，可以推广为
第k种种群的扩散系数和分数分别为。
Claims (4)
1.一种研究分子迁移运动的方法，装置主要包括激光器(1)、起偏器(2)、普克尔盒(3)、检偏器(4)、分光器(5)、样品(6)、位移台(7)、平面镜(8)、光纤(9)、滤光片(10)、光电倍增管(11)、锁相放大器(12)、电缆(13)，所述平面镜(8)位于所述位移台(7)，所述锁相放大器(12)通过电缆(13)分别连接所述普克尔盒(3)与所述位移台(7)，所述样品(6)表面的光经过所述光纤(9)以及所述滤光片(10)传输到所述光电倍增管(11)中，
其特征是，方法步骤为：
一.所述激光器(1)发射的激光束经过所述起偏器(2)、普克尔盒(3)、检偏器(4)后，由所述分光器(5)分为两束激光，一束激光经过距离L直接照射于所述样品(6)表面，另一束激光经过距离a后到达所述平面镜(8)，经过所述平面镜(8)反射后照射于所述样品(6)表面，上述照射于所述样品(6)表面的两束激光呈θ角，从而在所述样品(6)表面处产生光的干涉图案；
二.通过调节所述距离a和L的长度，能够改变所述角θ的值，从而改变所述样品(6)表面干涉条纹间距i；
三.通过所述普克尔盒(3)使激光产生一个小于1秒的极短的满强度的脉冲，对亮条纹处的荧光标记的相应种类的分子进行光脱色，在光脱色过程结束后，所述激光器(1)连续发射光强为I(r，t)的激光以探测所述样品(6)表面的荧光变化；
四.通过所述位移台(7)对所述平面镜(8)进行位置调制，使得所述平面镜(8)沿其法向方向以频率800Hz进行正弦振动，从而改变所述样品(6)表面处干涉条纹位置；
五.所述光电倍增管(11)收集光漂白后由于分子扩散运动而新出现的荧光信号，然后通过所述锁相放大器(12)进行分析，从而得到所述样品(6)表面亮条纹部分与暗条纹部分的荧光强度之比，即平均对比度C(t)，所述光电倍增管(11)测得的荧光信号F(t)与被荧光标记的分子的浓度cm(r，t)和探测光强I(r，t)相关
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其中和是cm(r，t)和I(r，t)的空间傅里叶变换，F(t)可以分解为调制频率的谐波级数，实验中，一阶和二阶的谐波分量f1(t)和f2(t)可以通过所述锁相放大器(12)同时得到；
六.最终的实验数据给出暗条纹与亮条纹之间的平均对比度上式用一个指数衰减来表征布朗扩散行为；
七.由能够求出弛豫时间τq，由弛豫时间τq与扩散系数D的关系q为条纹图案的空间周期，能够求出扩散系数D。
2.根据权利要求1所述的一种研究分子迁移运动的方法，其特征是：所述样品(6)表面具有一圆形开口的光掩膜、且其测量区域位于所述开口内，光掩膜的材料对光的反射率很小，以能减小由于激光光斑造成的所述样品(6)表面非测量区域的杂散光对实验信噪比的影响。
3.根据权利要求1所述的一种研究分子迁移运动的方法，其特征是：可以使用不同的激光波长488nm、532nm、633nm等来进行实验，并综合比较各激光波长条件实验得到的结果，以能够更准确地反映分子的迁移运动。
4.根据权利要求1所述的一种研究分子迁移运动的方法，其特征是：对生物大分子样品，光漂白时激光光强小于250W/cm2，且脉冲时间小于400ms。
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