CN107119094B - 一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法 - Google Patents

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法，具体涉及在废弃生物质Fenton反应预处理的基础上，利用一种木质素降解菌(Cupriavidus basilensis B‑8，保藏编号CGMCC No.4240)以及通过改善培养条件进一步去除废弃生物质中的残余木质素，并将废弃生物质的稳固直杆状变为松散片层状，提高了酶解糖化时的可及表面。该方法可使Fenton反应预处理的酶解效率提高约60％，最大可提高近120％，且具有处理时间短、操作简单、二次污染小、成本低廉等优点。

Description

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的 方法
技术领域：
本发明属于生物质新能源技术领域，具体涉及一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法。
背景技术：
近年来，为了降低对化石燃料的依赖，各国政府和科研机构大力开展对可再生能源的开发和研究。废弃生物质中的木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，蕴藏着巨量的碳资源，成为第二代生物质能源，是当前生物乙醇、生物塑料、生物柴油等绿色产品生物发酵最重要的碳源。木质纤维素中的半纤维素和木质素紧密镶嵌在纤维素的周围，如不进行任何处理，其糖化发酵效率极低。因此，预处理成为了废弃生物质开发利用的首要环节，即疏松或破坏纤维素的致密结构以及木质素和半纤维素的包裹，使纤维素、半纤维素和木质素分离，从而提高酶对纤维素的可及度和作用效率。
目前的预处理工艺主要分为物理法、化学法和生物法。其中Fenton反应是部分真菌用于攻击废弃生物质过程中的非酶途径，因此成为了一种有效的废弃生物质预处理方法。通常认为Fenton反应会产生高反应性羟基自由基攻击废弃生物质使得纤维素链内部裂解及木质素解聚，而使半纤维素含量升高。目前，已有人采用真菌法或真菌-化学联合预处理实现了废弃生物质中木质素的深度去除。但真菌生长所需时间过长(10～50天)，不利于工艺扩大化和商业化。与真菌相比，木质素降解细菌的数量虽然较少，但可大大缩短生物处理接种时间(<7天)，因此采用细菌替代真菌进行废弃生物质预处理具有重要意义。目前，国内外尚无木质素降解细菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的相关报道。
由于木质素具有天然异质性、多变性和极强的稳定性，当Fenton反应条件较温和时，木质素难以全部去除，不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。若改用高强度条件，又极易造成纤维素的过度破坏和流失。因此，减弱Fenton预处理条件，同时利用微生物深度去除渣中残留木质素是提高废弃生物质中碳源利用和资源化产率的关键。
此外，废弃生物质秸秆也就是原生木质纤维素，不仅包括木质素，还包括纤维素和半纤维素，三者紧密结合连接；其中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用原生木质纤维素时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，因此，找寻合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除Fenton反应预处理渣中残留木质素也是亟待解决的问题。
发明内容：
为了解决现有废弃生物质Fenton反应预处理技术存在的问题，本发明提供了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法。
本发明的技术方案为：
一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法，包括以下步骤：
(1)Fenton反应预处理：废弃生物质加入FeCl3和H2O2；或者FeCl2和H2O2，震荡反应，过滤分离，所得固体清洗至pH呈中性，烘干，得到Fenton反应预处理废弃生物质；
(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为CGMCC No.4240的木质素降解菌Cupriavidus basilensis B-8接种于含Fenton反应预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体，清洗，烘干，得到细菌强化Fenton反应预处理的废弃生物质。
步骤(1)所述的废弃生物质包括：水稻秸秆，玉米秸秆，小麦秸秆，甘蔗渣或柳枝稷等。
步骤(1)将废弃生物质粉碎后20-100目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
步骤(1)Fenton反应预处理：废弃生物质固液比为1:5-1:20(g/ml)，加入浓度为0.01-0.03mol/L的FeCl3和0.75-2.25mol/L的H2O2或0.01-0.03mol/L的FeCl2和0.75-2.25mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至pH呈中性，烘干至恒重，得到Fenton反应预处理废弃生物质。
步骤(2)木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含Fenton反应预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-2天后，过滤分离所得固体，用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化Fenton反应预处理的废弃生物质。
步骤(2)所述木质素降解菌培养条件为接种量5-15％(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，温度25-40℃，自然pH条件，培养时间1-2天。
步骤(2)所述的含Fenton反应预处理废弃生物质的无菌培养基为：Fenton反应处理后的废弃生物质5～15g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.015g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L。
本发明提供的预处理方法的优势在于：
(1)利用木质素降解菌预处理可实现Fenton反应预处理废弃生物质木质素和半纤维素的深度去除，同时破坏废弃生物质结构，废弃生物质结构变得松散，增加了酶解糖化时的可及表面。
(2)当化学反应条件较温和时，木质素难以全部去除，不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。若改用高强度条件，又极易造成纤维素的过度破坏和流失，也影响了酶解率。因此，本发明通过减弱化学预处理条件，同时采用微生物深度去除渣中残留木质素，提高废弃生物质中碳源利用和资源化产率。
(3)废弃生物质秸秆中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，本发明找寻了合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除了Fenton反应预处理废弃生物质中残留木质素。
(4)能够大幅提高酶解糖化效率，相比于未经预处理的废弃生物质，酶解效率提高为原来的3倍以上，比传统Fenton反应预处理提高了约60％-120％。
(5)具有操作简单、二次污染小、处理时间短、成本低廉等优点。
本发明所使用的木质素降解菌(Cupriavidus basilensis B-8)，保藏编号CGMCCNo.4240，是由本申请人筛选的已经做过专利保藏和专利申请的菌株。
附图说明:
图1：实施例中预处理后废弃生物质糖产量变化；
图2：实施例中预处理后废弃生物质各组分变化；
图3：实施例中预处理的废弃生物质预处理前后扫描电镜分析，(a)为未处理的水稻秸秆，(b)为单独Fenton反应处理的水稻秸秆，(c)、(d)为Cupriavidus basilensis B-8强化处理后的水稻秸秆。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)进一步将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.02mol/L的FeCl3和1.5mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离得到湿渣A。
(3)进一步用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm处光密度达到0.8-1.0)，得到B-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)进一步将收集的B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O 0.01g，蒸馏水1L；
(7)进一步用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得干渣D；
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM pH＝4.8的柠檬酸缓冲液及纤维素酶12PFU/g水稻秸秆干重，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
通过本实施例的实施，水稻秸秆各组分含量发生显著变化，Fenton反应产生高反应性羟基自由基攻击废弃生物质使得纤维素链内部裂解及木质素解聚，而使半纤维素含量升高，后经过细菌强化处理进一步去除了木质素和半纤维素(如附图2)。木质素和半纤维素的去除，使得水稻秸秆的结构更容易被酶解糖化；扫描电镜图(如附图3)所示，预处理前的直杆状结构消失，表面变成十分不规则且疏松多孔，可提高后续酶解的效率，最终使细菌强化Fenton反应预处理后的酶解效率提高为未处理的5.5倍，还原糖含量达到12.6g/L比本发明条件下单一Fenton反应预处理提高了近一倍(如附图1)，效果显著。
实施例2
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)进一步将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.03mol/L的FeCl3和2.25mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离得到湿渣A。
(3)进一步用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm处光密度达到0.8-1.0)，得到B-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)进一步将收集的B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中所述干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO41.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O 0.01g，蒸馏水1L；
(7)进一步用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D；
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM pH＝4.8的柠檬酸缓冲液及纤维素酶12PFU/g水稻秸秆干重，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经本实施例细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从未处理的2.3g/L提高到9.43g/L，酶解效率提高为未处理的4.1倍(如附图1)，较本发明条件下单独Fenton反应预处理提高了约45％。
实施例3
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)进一步将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.01mol/L的FeCl3和0.75mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离得到湿渣A。
(3)进一步用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm处光密度达到0.8-1.0)，得到B-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)进一步将收集的B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中所述干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO41.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O 0.01g，蒸馏水1L；
(7)进一步用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D；
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM pH＝4.8的柠檬酸缓冲液及纤维素酶12PFU/g水稻秸秆干重，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经本实施例细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从未处理的2.3g/L提高到7.84g/L，酶解效率提高为未处理的2.4倍(如附图1)，较本发明条件下单独Fenton反应预处理提高了约58％。
对比例1
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括高浓度Fenton反应预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)进一步将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.04mol/L的FeCl3和3mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B；
(4)将干渣B按固液比1:40(g/ml)加入50mM pH＝4.8的柠檬酸缓冲液及纤维素酶12PFU/g水稻秸秆干重，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
对比例1中的FeCl3和H2O2的浓度均高于实施例1～3，然而经此对比例预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量为7.1g/L，低于实施例，说明高浓度预处理效果不及本发明低浓度Fenton反应条件下的细菌强化预处理。
对比例2
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括本发明条件下单独的Fenton反应预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)进一步将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.01mol/L的FeCl3和0.75mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B；
(4)将干渣B按固液比1:40(g/ml)加入50mM pH＝4.8的柠檬酸缓冲液及纤维素酶12PFU/g水稻秸秆干重，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经此对比例温和Fenton化学条件预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量为4.9g/L低于实施例，且处理后木质素含量为(15％)高于实施例(10～13％)，不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。
对比例3
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括本发明细菌Cupriavidusbasilensis B-8预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm处光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidus basilensisB-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(3)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(4)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按20％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于水稻秸秆培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养3天，过滤分离得湿渣；其中水稻秸秆培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO42.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O0.01g，蒸馏水1L；
(5)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣，置于60℃烘干至恒重得到干渣；
(6)将干渣按固液比1:40(g/ml)加入50mM pH＝4.8的柠檬酸缓冲液及纤维素酶12PFU/g水稻秸秆干重，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经本对比例预处理后的水稻秸秆的还原糖产量约为2.4g/L，略高于未处理水稻秸秆(2.3g/L)，但远远低于实施例中的还原糖产量。说明单独采用Cupriavidus basilensisB-8预处理未能达到理想效果。而本发明在Fenton法预处理的基础上，通过Cupriavidusbasilensis B-8的作用产生了意想不到的效果。
对比例4
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法为细菌Cupriavidus basilensis B-8强化高浓度Fenton反应预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)进一步将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.04mol/L的FeCl3和3mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到Cupriavidus basilensis B-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中所述水稻秸秆培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O0.01g，蒸馏水1L；
(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D；
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM pH＝4.8的柠檬酸缓冲液及纤维素酶12PFU/g水稻秸秆干重，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经本实施例经过细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量为7.7g/L，仍然不及本发明温和低浓度条件下细菌强化预处理的还原糖产量(8.4～10.3g/L)，说明高强度条件极易造成纤维素的过度破坏和流失，影响了后续微生物处理的效果。
对比例5
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法与实施例中的过程相同，仅将实施例步骤(6)中的大部分培养基成分改为与专利(申请号：201610569477.0)相同，以本发明实施例制备的干渣B10.0g/L，代替碱木质素1-6g，其他组分为：(NH4)2SO4 0.28g，K2HPO4 1g，MgSO40.2g，CaCl20.1g，FeSO40.05g，MnSO40.02g，KH2PO41g，蒸馏水1000mL。结果发现，利用专利(申请号：201610569477.0)中的培养基条件后，细菌生物量显著减少，预处理后的水稻秸秆的酶解效果仅约为实施例中的1/2。对比说明本发明经过培养基成分和条件的筛选，得到了适合于本发明废弃生物质预处理的培养基成分和方法。

Claims (3)

1.一种利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)Fenton反应预处理：
废弃生物质固液比为1g:5-20ml，加入浓度为0.01-0.03mol/L的FeCl3和0.75-2.25mol/L的H2O2，于室温环境中震荡2h，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至pH呈中性，烘干至恒重，得到Fenton反应预处理废弃生物质；所述的废弃生物质为水稻秸秆，
(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为CGMCC No.4240的木质素降解菌Cupriavidus basilensis B-8接种于含Fenton反应预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体，清洗，烘干，得到细菌强化Fenton反应预处理的废弃生物质；
步骤(2)所述的含Fenton反应预处理废弃生物质的无菌培养基为：Fenton反应处理后的废弃生物质5～15g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L， MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.015g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L;
步骤(2)所述木质素降解菌培养条件为接种量5-15％，温度25-40℃，自然 pH条件，培养时间1-2天。
2.根据权利要求1所述的利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法，其特征在于，步骤(1)将废弃生物质粉碎后20-100目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
3.根据权利要求1所述的利用木质素降解菌强化废弃生物质Fenton反应预处理的方法，其特征在于，步骤(2)木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含Fenton反应预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-2天后，过滤分离所得固体，用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化Fenton反应预处理的废弃生物质。
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