CN107110848A - 以脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因作为指标使用的动脉硬化及癌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明人发现,以往被报告与***癌或子***关联的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(DHPS)基因,令人惊讶地,与动脉硬化及消化***癌非常良好地关联,能作为期望的动脉硬化及消化***癌的标志物使用,完成本发明。具体而言,本发明提供在所述受试试样中确认在受试试样、优选为血液受试体中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的动脉硬化及消化***癌的动脉硬化及消化***癌的检测方法。
Description
【技术领域】
[A]对于动脉硬化标志物
本发明是涉及疾病的检测方法的发明,更具体而言,是涉及以脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因作为指标使用的动脉硬化及癌的检测方法的发明。
【背景技术】
现已明了动脉硬化成为脑卒中或心肌梗塞等的循环***疾病的基础的要因,伴随年龄的增加,自然风险增大,但由遗传的本因或生活习惯的紊乱等而发生风险也变动,增大。
以动脉硬化为基础发生的循环***疾病对于患者本人或其家族负担重,社会上也伴随医疗费的增大,其发生的预防,或适宜的治疗的手段的确立依然是重要的课题。
特别是遗传的的本因的特定是,为了通过对其特别指定使适宜地进行早期的生活指导,或动脉硬化的预防药或治疗药的投药等的预防的的措置成为可能,近年日益被重视。
[B]对于癌标志物
癌伴随年龄的增加,自然风险增大,但由遗传的本因或生活习惯的紊乱等而发生风险也变动,增大。
伴随高龄化社会的癌患者的增加对患者本人或家族负担重,社会上也伴随医疗费的增大,其发生的预防或,适宜的治疗的手段的确立依然是重要的课题。
特别是遗传的的本因的特定,为了通过对其特别指定,使适宜地进行早期的生活指导等的预防的的措置成为可能,近年日益受重视。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特开2007-14277号公报
专利文献2:特表2006-507816号公报
【非专利文献】
非专利文献1:Cracchiolo BM,Heller DS,Clement PM,Wolff EC,Park MH,Hanauske-Abel HM,“Eukaryotic initiation factor 5A-1(eIF5A-1)as a diagnosticmarker for aberrant proliferation in intraepithelial neoplasia of the vulva.”Gynecol Oncol.200494:217-22
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
[A]对于动脉硬化标志物
动脉硬化的遗传的本因是多种多样的,在预见动脉硬化上伴随必要充分的检测力的,说起来作为“万能标志物”的特定的基因标志物的推定是困难的。
从而,为了实现无遗漏的动脉硬化的基因检查,有进一步发现伴随优良的判别力的基因标志物的必要。
[B]对于癌标志物
食道癌、大肠癌等的消化***的癌的一部分与其他种类的癌比,罹患率依然高,为了实现无遗漏的消化***癌的基因检查,有进一步发现伴随优良的判别力的基因标志物的必要。
【解决课题的技术方案】
[A]对于动脉硬化标志物
此番,本发明人令人惊讶地发现,以往被报告与***癌或子***有关系的基因“脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase)基因”与动脉硬化非常地良好地关联,作为期望的动脉硬化的标志物使用是可能的。
即,本发明是提供动脉硬化的检测方法(以下,也称为本发明的动脉硬化检测方法)的发明,在所述受试试样中确认在受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(以下,也称为DHPS)基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的动脉硬化。在本发明的动脉硬化检测方法中使用的受试试样适宜是血液受试体。本发明的动脉硬化检测方法也可为数据取得方法,其特征在于,进行在受试试样中的DHPS基因的表达的数据取得,当确认所述基因表达的亢进时,作为动脉硬化的存在数据。
本发明的动脉硬化检测方法大分为下述的3种实施方式(动脉硬化检测方法1~3)。进而,这些方法也能使用试剂盒进行。
(1)本发明的动脉硬化检测方法1
在本发明的动脉硬化检测方法中,可将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以所述基因编码的DHPS蛋白质的全部或一部分作为目标多肽检测进行。特别是,将所述DHPS蛋白质的全部或一部分的检测适宜地使用与其特异性结合的抗体、优选为单克隆抗体进行。
(2)本发明的动脉硬化检测方法2
在本发明的动脉硬化检测方法中,可将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过检测针对受试试样中的DHPS的抗体(自身抗体)进行。所述自身抗体的检测,例如,可通过使受试试样接触于含DHPS的全部或一部分的多肽的固定化物,以针对受试试样内的DHPS的抗体(自身抗体)与所述固定化多肽的结合作为信号检测进行。上述的固定化物中所含的DHPS的一部分的多肽的氨基酸数能到所述全部多肽的氨基酸数的1/2以上、即184个氨基酸以上,适宜地是186个氨基酸以上、再适宜地为187个氨基酸以上。确保多肽的抗原性是前提,多肽长度短的方在肽自体的稳定性上优良,并且,固定化物的每单位量的固定化肽数变大而有灵敏度提高的倾向。
(3)本发明的动脉硬化检测方法3
在本发明的动脉硬化检测方法中,可将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以受试试样中的DHPS基因的全部或一部分、或者,与所述基因的全部或一部分互补的核酸作为目标核酸检测进行。所述目标核酸的检测,例如,可通过使有与所述目标核酸的碱基序列互补的序列的核酸的核酸探针与固定化的或者未固定化的目标核酸杂交,检测由所述杂交发生的信号进行。此时,可以将DHPS基因的全部或一部分或者与所述基因的全部或一部分互补的核酸由PCR法等的基因扩增法扩增而成的基因扩增产物作为目标核酸检测。
(4)动脉硬化检测用试剂盒
再者,本发明的动脉硬化检测方法能由具备实施其的要素的动脉硬化检测用试剂盒进行。
(5)固定化板
本发明还提供含以下的步骤(a)~(d)的固定化板的使用方法。所述固定化板,在进行动脉硬化检测方法2时,作为“含DHPS的全部或一部分的多肽的固定化物”使用。
(a)使固定化了人工调制的DHPS的全部或一部分的板与血液受试体接触,在板上进行针对所述血液受试体中的DHPS的自身抗体和所述板上的DHPS的全部或一部分结合的抗原抗体结合体的形成的步骤;
(b)使人工附加了标记的抗体结合性的第二抗体与板上的上述抗原抗体结合体的自身抗体结合的步骤;
(c)使与自身抗体结合的上述第二抗体的标记在板上显现,为了检测所述显现信号而使用板的步骤;
(d)以由板得到的所述显现信号的检测值作为针对DHPS的自身抗体的定量值计数,以在大于统计学地得到的对于动脉硬化的阈值时的所述定量值作为上述血液受试体中的动脉硬化的指标的步骤。
固定化在上述板上的DHPS的一部分的多肽的氨基酸数适宜为所述全部的多肽的氨基酸数的1/2以上,与上述的动脉硬化检测方法2中记载的同样。
作为固定化了DHPS的全部或一部分的板(基板),可举出玻璃载玻片、多孔质凝胶、微滴定板等。作为向基板的DHPS的全部或一部分的固定化法,能使用公知的方法,可进行物理的吸附法、共价键法、离子键法、生物化学特异结合法等的抗体结合法等。再者,也能选择适宜于使用的固定化法的基板。例如,为了促进在基板的表面上的蛋白质的结合,能使用向其表面导入氨基的。此时,可进行使戊二醛结合于所述基板表面的氨基,使DHPS的全部或一部分的末端氨基等结合于此结合的戊二醛的方法;向所述基板表面的氨基由静电相互作用固定化DHPS的全部或一部分的方法等。另外,也能使用适宜于蛋白质的固定化的基板的各种市售品。
作为本发明的动脉硬化检测方法的目标要素的“脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(DHPS)”是已知与***癌或子***(专利文献1、非专利文献1)或凋亡(专利文献2)关联的公知的酶蛋白质,在该人中的氨基酸序列已知是SEQ ID NO:1(专利文献1)、编码其的DHPS基因的碱基序列被知为例如SEQ ID NO:2。再者,针对DHPS的抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)也公知,能由常规方法制造,也已经进行市售。在本发明中的DHPS(也称为DHPS蛋白质)是指与有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质、或者,DHPS的氨基酸序列有相同性,与有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质有实质上相同的生物学活性的,所述氨基酸序列的一部分含取代、缺损、***、附加部分的蛋白质。进而,在本发明中的DHPS基因是有编码上述的DHPS的碱基序列的基因。
如在专利文献1中公开,DHPS是在亚精胺存在下,对eIF5A(eukaryotictranslation Initiation Factor 5A)进行羟腐胺赖氨氧化(活化)的酶,在立体结构中,有酶活性部位(本体结构)、链状结构、球状结构,酶活性部位和球状结构经链状结构连接。由立体结构解析等已知,酶活性部位和球状结构相互作用,推测球状结构是酶活性部位的伪底物。羟腐胺赖氨氧化已知对于含细胞增殖的细胞功能是必须的。即,羟腐胺赖氨氧化是将亚精胺的丁基胺部分NAD依赖性地转移到特异性赖氨酸残基的ε-氨基后,被氢氧化的eIF5A上固有的翻译后修饰,是从酵母到人保守的对于生长必须的。
如上所述,DHPS特别被认识为作为***癌或子***的标志物的应用可能性,但作为动脉硬化的标志物的公开,则连提示都没有。
[B]对于癌标志物
此番,本发明人令人惊讶地发现,以往被报告为与***癌或子***有关系的基因“脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase)基因”与消化***癌非常良好地关联,能作为期望的癌标志物使用。
即,本发明是提供癌的检测方法(以下,也称为本发明的癌检测方法)的发明,其中在所述受试试样中确认在受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(以下,也称为DHPS)基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测消化***癌。在本发明的癌检测方法中使用的受试试样适宜为血液受试体。本发明的癌检测方法也可为数据的取得方法,其特征在于,进行在受试试样中的DHPS基因的表达的数据取得,在确认了所述基因表达的亢进时,作为消化***癌的存在数据。
本发明的癌检测方法大分为下述的3种实施方式(癌检测方法1~3)。进而,这些方法也能使用试剂盒进行。
(1)本发明的癌检测方法1
在本发明的癌检测方法中,可将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以所述基因所编码的DHPS蛋白质的全部或一部分作为目标多肽检测进行。特别是,将所述DHPS蛋白质的全部或一部分的检测适宜地使用与其特异性结合的抗体、优选为单克隆抗体进行。
(2)本发明的癌检测方法2
在本发明的癌检测方法中,可将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过检测针对受试试样中的DHPS的抗体(自身抗体)进行。所述自身抗体的检测,例如,可通过使受试试样接触于含DHPS的全部或一部分的多肽的固定化物,以针对受试试样内的DHPS的抗体(自身抗体)与所述固定化多肽的结合作为信号检测进行。上述的固定化物中所含的DHPS的一部分的多肽的氨基酸数能达到所述全部的多肽的氨基酸数的1/2以上、即184个氨基酸以上,适宜地是186个氨基酸以上、再者适宜地是187个氨基酸以上。确保多肽的抗原性是前提,但多肽长度短的方在肽自体的稳定性上优良,并且,固定化物的每单位量的固定化肽数变大而有灵敏度提高的倾向。
(3)本发明的癌检测方法3
在本发明的癌检测方法中,可将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以受试试样中的DHPS基因的全部或一部分、或者,与所述基因的全部或一部分互补的核酸作为目标核酸检测进行。所述目标核酸的检测,例如,可通过使有与所述目标核酸的碱基序列互补的序列的核酸的核酸探针与固定化的或者未固定化的目标核酸杂交而检测由所述杂交发生的信号来进行。此时,可以将DHPS基因的全部或一部分或者与所述基因的全部或一部分互补的核酸由PCR法等的基因扩增法扩增而成的基因扩增产物作为目标核酸检测。
(4)癌检测用试剂盒
再者本发明的癌检测方法能由具备实施其的要素的癌检测用试剂盒进行。
(5)固定化板
本发明还提供含以下的步骤(a)~(d)的固定化板的使用方法。所述固定化板,在进行癌检测方法2时,是作为“含DHPS的全部或一部分的多肽的固定化物”使用的。
(a)使固定化了人工调制的DHPS的全部或一部分的板与血液受试体接触,在板上进行针对所述血液受试体中的DHPS的自身抗体和所述板上的DHPS的全部或一部分结合的抗原抗体结合体的形成的步骤;
(b)使人工附加了标记的抗体结合性的第二抗体与板上的上述抗原抗体结合体的自身抗体结合的步骤;
(c)为了使与自身抗体结合的上述第二抗体的标记在板上显现而检测所述显现信号而使用板的步骤;
(d)以由板得到的所述显现信号的检测值作为针对DHPS的自身抗体的定量值计数,以在大于统计学地得到的对于消化***癌的阈值时的所述定量值作为上述血液受试体中的消化***癌的指标的步骤。
固定化在上述板上的DHPS的一部分的多肽的氨基酸数适宜地是所述全部的多肽的氨基酸数的1/2以上,与上述的癌检测方法2中记载的同样。
作为固定化了DHPS的全部或一部分的板(基板),可举出玻璃载玻片、多孔质凝胶、微滴定板等。作为向基板的DHPS的全部或一部分的固定化法,能使用公知的方法,可进行物理的吸附法、共价键法、离子键法、生物化学特异结合法等的抗体结合法等。再者,也能选择适宜于使用的固定化法的基板。例如,为了促进在基板的表面的蛋白质的结合,能使用向其表面导入氨基的。此时,可进行使戊二醛结合于所述基板表面的氨基,使DHPS的全部或一部分的末端氨基等结合于此结合的戊二醛的方法;向所述基板表面的氨基由静电相互作用固定化DHPS的全部或一部分的方法等。另外,也能使用适宜于蛋白质的固定化的基板的各种市售品。
作为本发明的癌检测方法的目标要素的“脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(DHPS)”是已知与***癌或子***(专利文献1、非专利文献1)或凋亡(专利文献2)关联的公知的酶蛋白质,在该人中的氨基酸序列已知是SEQ ID NO:1(专利文献1)、编码其的DHPS基因的碱基序列被知为例如SEQ ID NO:2。再者,针对DHPS的抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)也是公知的,能由常规方法制造,也已经进行市售。在本发明中的DHPS(也称为DHPS蛋白质)是指与有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质、或者,DHPS的氨基酸序列有相同性,与有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质有实质上相同的生物学活性的,在所述氨基酸序列的一部分上含取代、缺损、***、附加部分的蛋白质。进而,在本发明中的DHPS基因是有编码上述的DHPS的碱基序列的基因。
如在专利文献1中公开,DHPS是在亚精胺存在下,对eIF5A(eukaryotictranslation Initiation Factor 5A)进行羟腐胺赖氨氧化(活化)的酶,在立体结构中,有酶活性部位(本体结构)、链状结构、球状结构,酶活性部位和球状结构经链状结构连接。由立体结构解析等已知,酶活性部位和球状结构相互作用,球状结构被推测是酶活性部位的伪底物。羟腐胺赖氨氧化已知对于含细胞增殖的细胞功能是必须的。即,羟腐胺赖氨氧化是将亚精胺的丁基胺部分NAD依赖性地转移到特异性赖氨酸残基的ε-氨基后,被氢氧化的eIF5A上固有的翻译后修饰,从酵母到人保守的对生长必须的。
如上所述DHPS特别被认识为作为***癌或子***的标志物的应用可能性,作为消化***癌标志物的公开,则连提示都没有。
作为消化***癌,可举食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌(含直肠癌及结肠癌)、小肠癌、胆囊癌、胰腺癌、及肝脏癌,特别是,作为食道癌及大肠癌的标志物,DHPS是有用的。
【发明效果】
由本发明提供基于关于受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(DHPS)基因的表达的要素的动脉硬化的检测手段、及消化***癌的检测手段。
【附图说明】
【图1】是在医疗设施来源的血清受试体中,在急性期脑梗塞患者和健康人之间,将使用ELISA法探讨的DHPS的自身抗体价的分布的第一结果与截止值一同显示的附图。
【图2】是关于图1的DHPS的自身抗体价的分布的ROC曲线。
【图3】是在医疗设施来源的血清受试体中,在急性期脑梗塞患者和健康人之间,将使用ELISA法探讨的DHPS的自身抗体价的分布的第二的结果与截止值一同显示的附图。
【图4】是关于图3的DHPS的自身抗体价的分布的ROC曲线。
【图5】是在医疗设施来源的血清受试体中,分为作为既有的动脉硬化标志物的CRP值的阴性组和阳性组,再者,以在这些组之中的急性期脑梗塞患者组和健康人组之间的由ELISA法得到的DHPS的自身抗体价的分布作为第三的探讨结果显示的附图。
【图6】是图5的DHPS的自身抗体价之中,在CRP值的阴性组中的ROC曲线。
【图7】是显示对于急性期脑梗塞患者的血清受试体中的DHPS的自身抗体,进行由蛋白印迹法的探讨的结果的电泳图。
【图8】是显示对于急性期脑梗塞患者的血清受试体中的内源性的DHPS,用蛋白印迹法进行检测的结果的电泳图。
【图9】是在医疗设施来源的血清受试体中,在癌患者和健康人之间,将使用ELISA法探讨的DHPS的自身抗体价的分布的结果与截止值一同显示的附图。
【图10】是关于图9的DHPS的自身抗体价的分布的ROC曲线。
【实施方式】
[A]对于本发明的动脉硬化检测方法
(1)关于脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(DHPS)基因的材料的入手
如上所述,在人等中公知DHPS的存在,其氨基酸序列(对于人,SEQ ID NO:1)和编码其的碱基序列(例如,SEQ ID NO:2)是已经公知的。
可基于其,由公知的方法制造重组DHPS。具体而言,例如基于上述碱基序列,设计用于扩增有所述碱基序列的全部或一部分的双链DNA的核酸扩增用引物,以由使用所述扩增用引物的PCR法等的基因扩增产物作为DHPS基因的全部或一部分得到,使用其并入适宜的载体,选择并入所述载体而转化的转化体而进行克隆,再者,将作为目的的DHPS的全部或一部分在所述转化体、或者,将从所述转化体得到的DHPS基因适用于对于基因表达适宜的载体和宿主的转化体中进行DHPS基因的表达,由此可得到重组DHPS。再者,如上所述,不使用PCR法等的基因扩增法而也可经基因库的制作进行DHPS基因的克隆。再者,重组DHPS能根据需要,通过在编码成为对象的DHPS的核酸中进行点突变导入法、随机突变导入法、阶段性缺失基因制作法等的基因改变法,将其氨基酸序列从天然型改变。
另外,DHPS的全部或一部分能根据公知的肽的化学合成法制造。关于肽合成,能使用作为当今或常规方法确立的液相肽合成法、或者固相肽合成法制造。进而,一般而言,作为作为适宜的化学合成法识别的固相肽合成法,能使用Boc固相法或Fmoc固相法。特别是,可合成长链时使用连接法。
作为如上述得到的DHPS基因的其他用途,例如,可在将针对DHPS的抗体由基因免疫法制造时利用。另外,能作为在本发明的动脉硬化检测方法中使用的核酸探针利用。
再者,如上述得到的DHPS可作为制造针对DHPS的抗体时的免疫原、由自身抗体的检测进行本发明的动脉硬化检测方法时的自身抗体的结合场所、再者,在本发明的动脉硬化检测方法中的标准物质等使用。
针对DHPS的抗体可使用常规方法制造。即,对于免疫动物,给作为免疫原的DHPS、或者,DHPS基因,由此,可作为多克隆抗体得到在免疫动物体内生成的抗血清。另外,单克隆抗体通过从上述免疫动物得到B细胞,制作基于其的杂交瘤,将其再给于宿主动物,可由所述宿主动物得到。
在如上述得到的DHPS基因、DHPS、及针对DHPS的抗体中,也能根据需要进行适宜的修饰或处理。作为修饰,例如,可举出荧光物质、染料、酶、放射性物质等的标记物质的附加等,作为处理,例如,可举出抗体的片段化等。
关于上述的DHPS基因的要素,能使用市售品。在市售品中,既有产品自不必说,也包括根据订单制造的外订品。
(2)对于本发明的动脉硬化检测方法1
本发明的动脉硬化检测方法1的特征在于,在受试试样中确认DHPS基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的动脉硬化时,将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以所述基因所编码的DHPS的全部或一部分(以下,在本发明的动脉硬化检测方法中有时也总称为DHPSes)作为目标多肽检测进行。
即,对受试试样中的DHPSes进行定量,当其定量值比至少未确认动脉硬化者(以下,在本发明的动脉硬化检测方法中也称为动脉硬化健康者)的标准值大时,能认定在受试试样提供者中的DHPS基因的表达的亢进,以其作为指标检测所述受试试样提供者的动脉硬化。作为受试试样,可使用血清受试体、血浆受试体、全血受试体等的血液受试体、再者尿受试体等,但适宜地是血液受试体。另外,血液受试体也可进行适宜适合的处理、例如肝素处理等。
在受试试样中的DHPSes量的动脉硬化健康者的标准值通过设定推定为由一般的检查确认不到动脉硬化者的标本集团,求出在所述标本集团中的所述受试试样的DHPSes的定量值,对其实施统计处理而求出平均、标准偏差等,可含截止值而导出。
在受试试样中的DHPSes的定量手段无特别限定,例如,使用与DHPSes特异性结合的抗体、优选为单克隆抗体进行的定量手段、具体而言,可举出免疫沉降法、蛋白印迹法、免疫染色法、EIA法、RIA法、比浊法、散射比浊法、乳胶凝集比浊法、CLEIA法等。另外,也能使用TOF-MASS直接定量DHPSes。在EIA法中,使用特别固定化抗体的ELISA法是适宜的。任何的定量手段均可使用以定量目标物质作为受试试样中的DHPSes时的确立的手段进行。以下,对这些中的几个简单进行说明。
在定量手段是ELISA法时,例如,可通过使受试试样接触于固定化在微平板上的针对DHPS的抗体,使受试试样中的DHPSes与固定化抗体结合,将与此固定化抗体结合的DHPSes使用酶标记的别的针对DHPS的抗体等检测来进行定量。另外,也能使固定化抗体和受试试样及酶标记抗体同时反应,对受试试样中的DHPSes进行定量。
在定量手段是免疫沉降法时,例如,可通过使受试试样接触于固定化在珠上的针对DHPS的抗体而使DHPSes与固定化抗体结合,分离与此固定化抗体结合的DHPSes,从其分离物检测DHPSes来进行定量。此DHPSes的由免疫沉降法的定量,例如,可使用对于上述的分离物进行电泳,使针对DHPS的标记抗体作用于此电泳图谱的转印物,检测DHPSes的条带的蛋白印迹法进行。
再者,定量手段也能作为以蛋白印迹法作为主体的方法。例如,将自受试试样除去细胞的细胞除外受试试用样直接由电泳分离,使针对DHPS的标记抗体作于其转印物,通过检测条带,可对受试试样中的DHPSes进行定量。
在定量手段是乳胶凝集比浊法时,例如,可通过使受试试样接触于与乳胶粒子结合的针对DHPS的抗体,在液相中由抗原抗体反应形成免疫复合物的凝集块,测定其浊度的变化进行定量。
(3)对于本发明的动脉硬化检测方法2
本发明的动脉硬化检测方法2的特征在于,在受试试样中确认DHPS基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的动脉硬化时,将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过检测针对受试试样中的DHPS的抗体(自身抗体)来进行。
即,对针对受试试样中的DHPS的自身抗体进行定量,当其定量值大于动脉硬化健康者的标准值时,认定在受试试样提供者中的DHPS基因的表达的亢进,能以其作为指标检测所述受试试样提供者的动脉硬化。作为受试试样,可使用血清受试体、血浆受试体、全血受试体等的血液受试体、再者尿受试体等,但适宜地是血液受试体。另外,血液受试体也可进行适宜适合的处理、例如肝素处理等。
在受试试样中的DHPS自身抗体量的动脉硬化健康者的标准值通过设定推定为由一般的检查确认不到动脉硬化的者的标本集团,求出在所述标本集团中的所述受试试样的DHPS自身抗体的定量值,对其实施统计处理而求出平均、标准偏差等,可含截止值而导出。
所述自身抗体的定量,例如,可通过使受试试样接触于含DHPSes的多肽的固定化物,以针对受试试样内的DHPS的抗体(自身抗体)与所述固定化多肽的结合作为信号检测来进行。具体而言,可使用间接荧光抗体法、ELISA法、蛋白印迹法(免疫印迹法)、比浊法、散射比浊法、乳胶凝集比浊法、CLEIA法等的手段进行定量。任何的定量手段均可使用以定量目标物质作为受试试样中的DHPS自身抗体时的确立的手段进行。例如,在间接荧光抗体法(FANA)中,可使受试试样接触于固定化了DHPSes的蛋白阵列,使固定化DHPSes和针对受试试样中的DHPS的抗体结合,对于形成的固定化DHPSes-抗DHPS抗体复合物,再者,使实施荧光标记的第二抗体接触,对针对DHPS的自身抗体进行定量。在ELISA法中,是以在间接荧光抗体法中使用的第二抗体的标记作为酶标记进行定量的。第二抗体的标记能多样地选择。在蛋白印迹法中,可将DHPSes用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后,从凝胶转印到硝酸纤维素膜等的载体,使受试试样接触于所述转录载体,使所述转录载体上的DHPSes和针对受试试样中的DHPS的抗体的复合物形成,通过检测所述复合物进行定量。在比浊法或散射比浊法中,可通过将通过使受试试样和DHPSes接触而形成的DHPSes-抗DHPS抗体复合物用浊度(比浊法)或散射光强度的变化(散射比浊法)检测来进行定量。在乳胶凝集比浊法中,可通过使DHPSes结合的乳胶粒子和受试试样接触,由与乳胶粒子结合的自身抗体彼此的相互作用形成所述乳胶粒子的凝集体,通过对其进行检测来进行定量。在CLEIA法中,可通过使DHPSes结合磁性粒子和受试试样接触,在磁性粒子上形成DHPSes-抗DHPS抗体复合物而进行集磁,除去未反应物,实施适宜的荧光化处理等而检测所述复合物来进行定量。
(4)对于本发明的动脉硬化检测方法3
本发明的动脉硬化检测方法3的特征在于,在受试试样中确认DHPS基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的动脉硬化时,将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以受试试样中的DHPS基因的全部或一部分、或者与所述基因互补的核酸作为目标核酸检测进行。
例如,对受试试样中的编码DHPSes的mRNA量进行定量,当其定量值大于动脉硬化健康者的标准值时,认定在受试试样提供者中的DHPSes基因的表达的亢进,能以其作为指标检测所述受试试样提供者的动脉硬化。作为受试试样,可使用血清受试体、血浆受试体、全血受试体等的血液受试体、再者尿受试体等,但适宜地是血液受试体。另外,血液受试体也可进行适宜适合的处理、例如肝素处理等。
成为受试试样中的编码DHPSes的mRNA量检测的基础的核酸可通过将受试试样中的RNA由常规方法提取,对其进行向DNA的逆转录而作为cDNA得到。通过对于所述cDNA进行使用用于扩增DHPSes基因的基因扩增用引物的PCR法等的基因扩增方法(RT-PCR法),掌握显示成为其基础的mRNA量的程度,例如,在特定的循环数的基因扩增手段中的DHPSes基因的拷贝数,或DHPSes基因的拷贝数的增加速度等,可掌握受试试样中的DHPSes基因的表达量。
所述目标核酸的检测,例如,可通过使有与所述目标核酸的碱基序列互补的序列的核酸的核酸探针与固定化的或者未固定化的作为基因扩增产物得到的目标核酸杂交而检测由所述杂交发生的信号来进行。
所述信号的检测,例如,可由DNA印迹法进行。再者,可由使用RT-PCR法的实时分析等进行本发明的动脉硬化检测方法3的一系列的工序。
(5)本发明的动脉硬化检测用试剂盒
本发明的动脉硬化检测用试剂盒是具备用于如上所述进行本发明的动脉硬化检测方法的要素的试剂盒。所述动脉硬化检测用试剂盒的内容随本发明的动脉硬化检测方法的实施方式,或目的、对于将何程度试剂盒化的意图等而不同。
例如,在用于进行本发明的动脉硬化检测方法1的动脉硬化检测用试剂盒中,作为用于进行ELISA法的试剂盒的构成可举出,具备以针对DHPS的抗体作为第一抗体固定化的板、进行标记的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。另外,作为用于进行乳胶凝集比浊法的试剂盒构成可举出,使针对DHPS的抗体结合的乳胶粒子。再者,作为用于进行CLEIA法的试剂盒构成可举出,具备使针对DHPS的抗体结合的磁性粒子、进行标记的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。其中举的这些构成被充分例示,用于进行本发明的动脉硬化检测方法1的其他实施方式的试剂盒也包括在本发明的范围内。再者,也能以进一步减少其中例示的上述的要素的构成,增加检查的外订或自身筹备的程度的方式设定,相反,也能以稀释液或试剂用的管等作为构成增加,设定动脉硬化检测用试剂盒的即时使用。另外,也能考虑根据具体的检查实施方式的其他要素。
另外,在用于进行本发明的动脉硬化检测方法2的动脉硬化检测用试剂盒中,作为用于进行FANA法或ELISA法的试剂盒的构成可举出,例如,具备固定化DHPSes的板、进行标记的针对自身抗体的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。另外,作为用于进行乳胶凝集比浊法的试剂盒构成可举出,使DHPSes结合的乳胶粒子。再者,作为用于进行CLEIA法的试剂盒构成可举出,具备使DHPSes结合的磁性粒子、进行标记的针对自身抗体的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。其中举的这些构成被充分例示,用于进行本发明的动脉硬化检测方法2的其他实施方式的试剂盒也包括在本发明的范围内。再者,也能以进一步减少其中例示的上述的要素的构成,增加检查的外订或自身筹备的程度的方式设定,相反,也能以稀释液或试剂用的管等作为构成增加,设定动脉硬化检测用试剂盒的即时使用。另外,也能考虑根据具体的检查实施方式的其他要素。
再者,在用于进行本发明的动脉硬化检测方法3的动脉硬化检测用试剂盒中,作为试剂盒的构成可举出,例如,用于对mRNA进行逆转录的逆转录酶和逆转录用引物、用于扩增编码DHPSes的cDNA的基因扩增用引物、用于检测基因扩增产物的核酸探针、用于使所述核酸探针的信号显现的试剂等。其中举的这些构成被充分例示,用于进行本发明的动脉硬化检测方法3的其他实施方式的试剂盒也包括在本发明的范围内。再者,也能以进一步减少其中例示的上述的要素的构成,增加检查的外订或自身筹备的程度的方式设定,相反,也能以稀释液或试剂用的管等作为构成增加,设定动脉硬化检测用试剂盒的即时使用。另外,也能考虑根据具体的检查实施方式的其他要素。
[B]对于本发明的癌检测方法
(1)关于脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(DHPS)基因的材料的入手
如上所述,在人等中公知DHPS的存在,其氨基酸序列(对于人,SEQ ID NO:1)和编码其的碱基序列(例如,SEQ ID NO:2)是已经公知的。
可基于其,由公知的方法制造重组DHPS。具体而言,例如基于上述碱基序列,设计用于扩增有所述碱基序列的全部或一部分的双链DNA的核酸扩增用引物,以由使用所述扩增用引物的PCR法等的基因扩增产物作为DHPS基因的全部或一部分得到,使用其整合到适宜的载体,选择整合转化所述载体的转化体而进行克隆,再者,将作为目的的DHPS的全部或一部分在所述转化体、或者,将从所述转化体得到的DHPS基因适用于对于基因表达适宜的载体和宿主的转化体中进行DHPS基因的表达,由此可得到重组DHPS。再者,也可不如上所述使用PCR法等的基因扩增法而经基因库的制作进行DHPS基因的克隆。再者,重组DHPS,根据需要,通过在编码成为对象的DHPS的核酸中进行点突变导入法、随机突变导入法、阶段性缺失基因制作法等的基因改变法,能将其氨基酸序列从天然型改变。
另外,DHPS的全部或一部分能根据公知的肽的化学合成法制造。关于肽合成,能使用作为当今或常规方法确立的液相肽合成法、或者,固相肽合成法制造。进而,一般而言,作为作为适宜的化学合成法识别的固相肽合成法,能使用Boc固相法或Fmoc固相法。特别是,合成长链时可使用连接法。
作为如上述得到的DHPS基因的其他用途,例如,可在将针对DHPS的抗体由基因免疫法制造时利用。另外,能作为本发明的癌检测方法中使用的核酸探针利用。
再者,如上述得到的DHPS可作为制造针对DHPS的抗体时的免疫原、由自身抗体的检测进行本发明的癌检测方法时的自身抗体的结合场、再者,在本发明的癌检测方法中的标准物质等使用。
针对DHPS的抗体可使用常规的。即,可对于免疫动物给作为免疫原的DHPS、或者,DHPS基因,由此,作为多克隆抗体得到在免疫动物体内生成的抗血清方法制造。另外,单克隆抗体可通过从上述免疫动物得到B细胞,制作基于其的杂交瘤,将其再给于宿主动物,由所述宿主动物得到。
在如上述得到的DHPS基因、DHPS、及针对DHPS的抗体中,也能根据需要进行适宜的修饰或处理。作为修饰,例如,可举出荧光物质、染料、酶、放射性物质等的标记物质的附加等,作为处理,例如,可举出抗体的片段化等。
关于上述的DHPS基因的要素,能使用市售品。在市售品中,既有产品自不必说,也包括根据订单制造的外订品。
(2)对于本发明的癌检测方法1
本发明的癌检测方法1的特征在于,在受试试样中确认DHPS基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的消化***癌时,将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以所述基因所编码的DHPS的全部或一部分(以下,在本发明的癌检测方法中有时也总称为DHPSes)作为目标多肽检测来进行。
即,对受试试样中的DHPSes进行定量,当其定量值比至少未确认到消化***癌者(以下,在本发明的癌检测方法中也称为消化***癌健康者)的标准值大时,认定在受试试样提供者中的DHPS基因的表达的亢进,能以其作为指标检测所述受试试样提供者的消化***癌。作为受试试样,可使用血清受试体、血浆受试体、全血受试体等的血液受试体、再者尿受试体等,但适宜地是血液受试体。另外,血液受试体也可进行适宜适合的处理、例如肝素处理等。
在受试试样中的DHPSes量的消化***癌健康者的标准值通过设定推定为由一般的检查确认不到消化***癌的者的标本集团,求出在所述标本集团中的所述受试试样的DHPSes的定量值,对其实施统计处理而求出平均、标准偏差等,可含截止值而导出。
在受试试样中的DHPSes的定量手段无特别限定,例如,使用与DHPSes特异性结合的抗体、优选为单克隆抗体进行的定量手段、具体而言,可举出免疫沉降法、蛋白印迹法、免疫染色法、EIA法、RIA法、比浊法、散射比浊法、乳胶凝集比浊法、CLEIA法等。另外,也能使用TOF-MASS直接定量DHPSes。在EIA法中,特别适宜地是使用固定化抗体的ELISA法。任何的定量手段均可使用以定量目标物质作为受试试样中的DHPSes时的确立的手段进行。以下,对这些中的几个简单进行说明。
在定量手段是ELISA法时,例如,通过使受试试样接触于固定化在微平板上的针对DHPS的抗体,使受试试样中的DHPSes与固定化抗体结合,使用酶标记的别的针对DHPS的抗体等检测与此固定化抗体结合的DHPSes可进行定量。另外,也能使固定化抗体和受试试样及酶标记抗体同时反应,对受试试样中的DHPSes进行定量。
在定量手段是免疫沉降法时,例如,可通过使受试试样接触于固定化在珠上的针对DHPS的抗体而使DHPSes与固定化抗体结合,分离与此固定化抗体结合的DHPSes,从其分离物检测DHPSes来进行定量。进行此DHPSes的由免疫沉降法的定量,例如,可对于上述的分离物进行电泳而使用使针对DHPS的标记抗体作用于此电泳图谱的转印物,检测DHPSes的条带的蛋白印迹法进行。
再者,也能以定量手段作为以蛋白印迹法作为主体的方法。例如,将自受试试样除去细胞的细胞除外受试试样直接由电泳分离,使针对DHPS的标记抗体作用于其转印物,通过检测条带,可对受试试样中的DHPSes进行定量。
在定量手段是乳胶凝集比浊法时,例如,通过使受试试样接触于与乳胶粒子结合的针对DHPS的抗体,在液相中由抗原抗体反应形成免疫复合物的凝集块,测定其浊度的变化可进行定量。
(3)对于本发明的癌检测方法2
本发明的癌检测方法2的特征在于,在受试试样中确认DHPS基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的消化***癌时,将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过检测针对受试试样中的DHPS的抗体(自身抗体)进行。
即,对针对受试试样中的DHPS的自身抗体进行定量,当其定量值大于消化***癌健康者的标准值时,认定在受试试样提供者中的DHPS基因的表达的亢进,能以其作为指标检测所述受试试样提供者的消化***癌。作为受试试样,可使用血清受试体、血浆受试体、全血受试体等的血液受试体、再者尿受试体等,但适宜地是血液受试体。另外,血液受试体也可进行适宜适合的处理、例如肝素处理等。
在受试试样中的DHPS自身抗体量的消化***癌健康者的标准值通过设定推定为由一般的检查确认不到消化***癌的者的标本集团,求出在所述标本集团中的所述受试试样的DHPS自身抗体的定量值,对其实施统计处理而求出平均、标准偏差等,可含截止值而导出。
所述自身抗体的定量,例如,可通过使受试试样接触于含DHPSes的多肽的固定化物,以针对受试试样内的DHPS的抗体(自身抗体)与所述固定化多肽的结合作为信号检测进行。具体而言,可使用间接荧光抗体法、ELISA法、蛋白印迹法(免疫印迹法)、比浊法、散射比浊法、乳胶凝集比浊法、CLEIA法等的手段进行定量。任何的定量手段均可使用以定量目标物质作为受试试样中的DHPS自身抗体时的确立的手段进行。例如,在间接荧光抗体法(FANA)中,使受试试样接触于固定化了DHPSes的蛋白阵列,使固定化DHPSes和针对受试试样中的DHPS的抗体结合,对于形成的固定化DHPSes-抗DHPS抗体复合物,再者,使实施荧光标记的第二抗体接触,可对针对DHPS的自身抗体进行定量。在ELISA法中,以在间接荧光抗体法中使用的第二抗体的标记作为酶标记进行定量。第二抗体的标记能多样地选择。在蛋白印迹法中,可通过将DHPSes用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后,从凝胶转印到硝酸纤维素膜等的载体,使受试试样接触于所述转录载体,使所述转录载体上的DHPSes和针对受试试样中的DHPS的抗体的复合物形成,检测所述复合物来进行定量。在比浊法或散射比浊法中,可通过将通过使受试试样和DHPSes接触而形成的DHPSes-抗DHPS抗体复合物用浊度(比浊法)或散射光强度的变化(散射比浊法)检测来进行定量。在乳胶凝集比浊法中,可通过使DHPSes结合的乳胶粒子和受试试样接触,由与乳胶粒子结合的自身抗体彼此的相互作用形成所述乳胶粒子的凝集体,通过对其进行检测来进行定量。在CLEIA法中,可通过使DHPSes结合磁性粒子和受试试样接触,在磁性粒子上形成DHPSes-抗DHPS抗体复合物而进行集磁,除去未反应物,实施适宜的荧光化处理等而检测所述复合物而进行定量。
(4)对于本发明的癌检测方法3
本发明的癌检测方法3的特征在于,在受试试样中确认DHPS基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标检测受试者的消化***癌时,将作为目标基因的DHPS基因的表达的确认通过以受试试样中的DHPS基因的全部或一部分、或者与所述基因互补的核酸作为目标核酸检测进行。
例如,对受试试样中的编码DHPSes的mRNA量进行定量,当其定量值大于消化***癌健康者的标准值时,认定在受试试样提供者中的DHPSes基因的表达的亢进,能以其作为指标检测所述受试试样的提供者的消化***癌。作为受试试样,可使用血清受试体、血浆受试体、全血受试体等的血液受试体、再者尿受试体等,但适宜地是血液受试体。另外,血液受试体也可进行适宜适合的处理、例如肝素处理等。
成为受试试样中的编码DHPSes的mRNA量检测的基础的核酸可通过将受试试样中的RNA由常规方法提取,对其进行向DNA的逆转录而作为cDNA得到。对于所述cDNA,通过进行使用用于扩增DHPSes基因的基因扩增用引物的PCR法等的基因扩增方法(RT-PCR法),掌握显示成为其基础的mRNA量的程度,例如,在特定的循环数的基因扩增手段中的DHPSes基因的拷贝数或,DHPSes基因的拷贝数的增加速度等,可掌握受试试样中的DHPSes基因的表达量。
所述目标核酸的检测,例如,可通过使有与所述目标核酸的碱基序列互补的序列的核酸核酸探针与固定化的或者未固定化的作为基因扩增产物得到的目标核酸杂交,检测由所述杂交发生的信号来进行。
所述信号的检测,例如,可由DNA印迹法进行。再者,可由使用RT-PCR法的实时分析等进行本发明的癌检测方法3的一系列的工序。
(5)本发明的癌检测用试剂盒
本发明的癌检测用试剂盒是具备用于如上所述进行本发明的癌检测方法的要素的试剂盒。所述癌检测用试剂盒的内容随本发明的癌检测方法的实施方式,或目的、对于将何程度试剂盒化的意图等而不同。
例如,在用于进行本发明的癌检测方法1的癌检测用试剂盒中,作为用于进行ELISA法的试剂盒的构成可举出,具备以针对DHPS的抗体作为第一抗体固定化的板、进行标记的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。另外,作为用于进行乳胶凝集比浊法的试剂盒构成可举出,使针对DHPS的抗体结合的乳胶粒子。再者,作为用于进行CLEIA法的试剂盒构成可举出,具备使针对DHPS的抗体结合的磁性粒子、进行标记的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。其中举的这些构成被充分例示,用于进行本发明的癌检测方法1的其他实施方式的试剂盒也包括在本发明的范围内。再者,也能以进一步减少其中例示的上述的要素的构成,增加检查的外订或自身筹备的程度的方式设定,相反,也能以稀释液或试剂用的管等作为构成增加,设定癌检测用试剂盒的即时使用。另外,也能考虑根据具体的检查实施方式的其他要素。
另外,在用于进行本发明的癌检测方法2的癌检测用试剂盒中,作为用于进行FANA法或ELISA法的试剂盒的构成可举出,例如,具备固定化DHPSes的板、进行标记的针对自身抗体的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。另外,作为用于进行乳胶凝集比浊法的试剂盒构成可举出,使DHPSes结合的乳胶粒子。再者,作为用于进行CLEIA法的试剂盒构成可举出,具备使DHPSes结合的磁性粒子、进行标记的针对自身抗体的第二抗体、用于使第二抗体的标记显现的试剂的实施方式。其中举的这些构成被充分例示,用于进行本发明的癌检测方法2的其他实施方式的试剂盒也包括在本发明的范围内。再者,也能以进一步减少其中例示的上述的要素的构成,增加检查的外订或自身筹备的程度的方式设定,相反,也能以稀释液或试剂用的管等作为构成增加,设定癌检测用试剂盒的即时使用。另外,也能考虑根据具体的检查实施方式的其他要素。
再者,在用于进行本发明的癌检测方法3的癌检测用试剂盒中,作为试剂盒的构成可举出,例如,用于逆转录mRNA的逆转录酶和逆转录用引物、用于扩增编码DHPSes的cDNA的基因扩增用引物、用于检测基因扩增产物的核酸探针、用于使所述核酸探针的信号显现的试剂等。其中举的这些构成被充分例示,用于进行本发明的癌检测方法3的其他实施方式的试剂盒也包括在本发明的范围内。再者,也能以进一步减少其中例示的上述的要素的构成,增加检查的外订或自身筹备的程度的方式设定,相反,也能以稀释液或试剂用的管等作为构成增加,设定癌检测用试剂盒的即时使用。另外,也能考虑根据具体的检查实施方式的其他要素。
【实施例】
以下,公开本发明的实施例。
[A]对于本发明的动脉硬化检测方法
[参考例]DHPS作为动脉硬化标志物的筛选
(1)使固定化了约8000种蛋白质的蛋白阵列与动脉硬化患者和健康人的血清受试体接触,将在所述受试体中存在的动脉硬化患者特有的自身抗体由间接荧光抗体法检测。结果,特别指定约150种候选自身抗体,它们的候选自身抗体之一是针对DHPS的血清中的自身抗体。其中使用的动脉硬化患者的血清受试体是从接受医院及研究合作设施的诊断的颈动脉狭窄症患者得到的。
再者,在上述患者的评价中,从外来受诊者之中,选择性别-年龄(±5岁)与动脉硬化患者一致的大致同数的正常受试者作为基准(对照)。在外来受诊时或住院时,(1)向本人、家族说明研究目的或研究合作的任意性等,在得到知情同意之上,(2)进行关于家族历-既往历-饮酒或吃烟等生活方式、作业实施方式的问诊,(3)进行采血而将血清和血细胞成分分离冷冻保存。再者,(4)基于医师的诊疗录,记录临床上重症度、治疗经过、血液检查所见等。解析对象的患者血液在血清分离后于负80度冷冻保存至研究开始。关于此受试者的处理在后述的例中也基本上是同样的。
(2)在以下,对于上述的约150种候选自身抗体进行由ELISA法的筛选。在对于这些每种候选自身抗体实施ELISA法之前,含DHPS的约150种抗原蛋白质经下述的工序作为重组蛋白质得到。
首先,由PCR法制作***子。即,预先制作具有适宜于向表达载体pET28或pGEX-4T的重组的限制性内切酶识别部位的引物,以从骨肉瘤细胞株U2-OS提取的RNA作为模板进行逆转录PCR而制作cDNA,再进行PCR而得到全长的***子。对此***子及表达载体进行限制性内切酶处理,使用Ligation-Convenience试剂盒(日本Gene公司),连接***子和表达载体,制作含***子的质粒。再者,使用大肠杆菌感受态细胞BL21(日本Gene公司)转化到重组体中。将此转化体用放入抗生物质的LB培养基培养,用IPTG诱导***子DNA来源蛋白质的表达。将此状态的转化的大肠杆菌离心分离回收后,分离为可溶级分和不溶级分,再使用尿素进行不溶级分的增溶。蛋白质使用ProBond树脂(Invitrogen公司)及谷胱甘肽-Sepharose(GE Healthcare公司)纯化。
通过将这样得到的各种的纯化重组蛋白质以5μg/ml的浓度注入96孔ELISA板,于4℃保存一晚而固定化,得到固定化了在ELISA法中使用的重组蛋白质的96孔板。
在ELISA法中,将此重组蛋白质固定化板用PBS清洗、用20%糖20%合成聚合物(日本油脂公司)配合溶液封闭后,将患者血清、及对照血清(健康者的血清)稀释200倍,与固定化的蛋白质反应,接下来,PBS清洗后,加HRP标记山羊抗人IgG抗体。在最后,加酶显色底物而显色,用板读取器测定OD450nm的吸收。
通过由此ELISA法的筛选,从约150种的候选自身抗体(抗原蛋白质)筛出约40种,在这些之中含作为本发明的主题的DHPS。以下,实际上,也并行进行对于DHPS以外的自身抗体的探讨,其中仅关于DHPS进行公开。
[实施例A-1]由ELISA法的自身抗体的探讨
经3次进行由ELISA法的探讨。
(a)由ELISA法的自身抗体的探讨(1)
在医疗设施A中,使用急性期脑梗塞患者78例和健康人51例的血清受试体。结果示于图1和图2。图1显示在患者组(患者)和健康人组(正常)中的DHPS的自身抗体的抗体价的分布,图2显示在本探讨中的ROC曲线(接收者动作特性曲线)。
基于图1及图2,由检验导致的结果示于表1。如表1所示,截止值约是0.69,在图1中以虚线显示。
【表1】
P值比0.05(0.01)小,确认了关于“DHPS的血清抗体价在动脉硬化患者组中比健康人组大”的显著差异。
另外,在上述截止值中的阳性率约是69%。
(b)由ELISA法的自身抗体的探讨(2)
使用医疗设施B的急性期脑梗塞患者111例和医疗设施C的急性期脑梗塞患者46例(计157例)和医疗设施A的健康人51例的血清受试体。结果示于图3和图4。图3显示在患者组(患者)和健康人组(正常)中的DHPS的自身抗体的抗体价的分布,图4显示在本探讨中的ROC曲线(接收者动作特性曲线)。
基于图3及图4,由检验导致的结果示于表2。如表2所示,截止值约是0.69,在图3中以虚线表示。
【表2】
P值远小于0.05(0.01),确认了关于“DHPS的血清抗体价在动脉硬化患者组中比健康人组大”的显著差异。
另外,在上述截止值中的阳性率约是73%。
(c)由ELISA法的自身抗体的探讨(3)
在本例中,进行对于既有的动脉硬化标志物的阳性组和阴性组中的DHPS自身抗体标志物的动向的探讨。作为既有的动脉硬化标志物,使用CRP。CRP(C-reactive protein)是急性期蛋白质(acute phase reactant:APR)的一种,是在1930年由Tillet等发现的从肺炎双球菌提取的C多糖体和引起沉降反应的血清蛋白质。近年,已知伴随动脉硬化的血管组织的炎症、且由从浸润到动脉硬化巢的炎症性细胞分泌的炎症性细胞因子导致CRP在肝脏中产生而增加,再者,其浓度与血管内皮的功能障碍的程度相关,其增加引起心绞痛或作为心肌梗塞的危险因子(Ridker PM:Circulation 103:1813,2002)。
在本例中的CRP测定的受试体使用从医疗设施A得到的83例(急性期脑梗塞患者65例和健康人18例)的血清受试体。对于这些全部血清受试体,使用C反应性蛋白试剂盒(Nanopia积水Medical公司制)由乳胶凝集比浊法进行CRP的测定,以CRP的截止值作为0.2mg/dL分类。即,将CRP值超0.2mg/dL的组作为“CRP动脉硬化风险组”,将0.2mg/dL以下的组作为“CRP动脉硬化非风险组”分类。由这些CRP的分类别地分上述患者组和健康人组,将针对这些血清受试体中的DHPS的自身抗体价由ELISA法测定。结果示于图5,再者0.2mg/dL以下的“CRP动脉硬化非风险组”的ROC曲线示于图6。
P值是0.003,明显小于0.05(0.01)。
另外,阳性率是46%。从而确认,在CRP值中,通过在被认为动脉硬化风险小的组中也进行由DHPS的动脉硬化的测试,能伴随显著差异而检测动脉硬化。
在“CRP动脉硬化风险组”中,由于正常组的受试体数少而未进行显著差异检验,但从图5一目了然,在此组中,也是DHPS的自身抗体的定量对于动脉硬化的检测有效。
[实施例A-2]由蛋白印迹法的自身抗体的探讨
用上述参考例(2)中所示的方法制作***子,得到基于其的纯化蛋白质。即,预先制作具有适宜于向表达载体pET28或pGEX-4T的重组的限制性内切酶识别部位的引物,以从骨肉瘤细胞株U2-OS提取的RNA作为模板进行逆转录PCR而制作cDNA,再进行PCR而得到全长的***子。对此***子及表达载体进行限制性内切酶处理,使用Ligation-Convenience试剂盒(日本Gene公司),连接***子和表达载体,制作含***子的质粒。进而,使用大肠杆菌感受态细胞BL21(日本Gene公司)转化到重组体中。将此转化体用放入抗生物质的LB培养基培养,用IPTG诱导***子DNA来源蛋白质的表达。对此状态的转化的大肠杆菌进行离心分离回收后,分离为可溶级分和不溶级分,再者使用尿素进行不溶级分的增溶。蛋白质使用ProBond树脂(Invitrogen公司)及谷胱甘肽-Sepharose(GE Healthcare公司)纯化。
将此纯化的蛋白质用SDS样品缓冲液变性,作为蛋白印迹法的样品。在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳上述样品后,用转印装置向硝酸纤维素膜转印蛋白质。用5%脱脂乳封闭后,作为第一抗体加稀释500倍的患者血清(受试体1~4),温育一夜。用PBST清洗后,加稀释20000倍的HRP标记山羊抗人IgG抗体(ab98633,Abcam公司),反应30分钟。用PBST清洗后,使用发光试剂Immobilon Western(MILLIPORE公司)发光,向膜曝光而显像。
结果示于图7的电泳图。在图7中,受试体1、2、3、4是从医疗设施A提供的急性期脑梗塞患者的血清受试体,蛋白质His-DHPS(a.a.184-369)的ELISA测定值(自身抗体)是,受试体1是3.61、受试体2是3.82、受试体3是3.61、受试体4是3.47。另外,蛋白质GST-DHPS(a.a.183-369)的ELISA测定值(自身抗体)是,受试体1是3.60、受试体2是2.64、受试体3是2.33、受试体4是2.46。
下述表3-1~表3-4显示以各膜标志物75kDa的条带强度作为“1”时的检测条带强度的比率。表3-1是对于受试体1的结果,表3-2是对于受试体2的结果,表3-3是对于受试体3的结果,表3-4是对于受试体4的结果。另外,在表中,将蛋白质His-DHPS(a.a.184-369)表示为His-36C,将蛋白质GST-DHPS(a.a.183-369)表示为GST-36C。
【表3-1】
U1 | 75kDa标志物 | 1.00 |
U2 | GST-36C | 3.19 |
U3 | His-36C | 8.08 |
【表3-2】
U1 | 75kDa标志物 | 1.00 |
U2 | GST-36C | 1.20 |
U3 | His-36C | 4.52 |
【表3-3】
U1 | 75kDa标志物 | 1.00 |
U2 | GST-36C | 0.49 |
U3 | His-36C | 5.29 |
【表3-4】
U1 | 75kDa标志物 | 1.00 |
U2 | GST-36C | 0.12 |
U3 | His-36C | 2.46 |
从上述的结果得知,作为急性期脑梗塞患者受试体血清的受试体1、受试体2、受试体3、及,受试体4中的自身抗体与蛋白质His-DHPS(a.a.184-369)示强的反应性。蛋白印迹的结果,确认目的条带与自身抗体反应。另外,由此时的条带的强度确认,由ELISA法示越高的测定值的受试体,示越高的与蛋白质His-DHPS(a.a.184-369)的反应性。
接下来,将对于在这些受试体中内源性(endogenos)的DHPS的存在的探讨由使用抗DHPS抗体的蛋白印迹探讨。具体而言,将His-DHPS(SEQ ID NO:1的a.a.1-369)蛋白质(阳性对照)、及患者的血清受试体(受试体1~4)用SDS样品缓冲液变性,作为蛋白印迹法的样品。在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳上述样品后,用转印装置向硝酸纤维素膜转印蛋白质。用5%脱脂乳封闭后,加稀释500倍的抗DHPS抗体(H00001725-B02P,Abnova公司)而作为第一抗体,温育一夜。用PBST清洗后,加稀释7500倍的HRP标记绵羊抗小鼠IgG抗体(NA931,GEHealthcare公司),反应30分钟。用PBST清洗后,使用发光试剂Immobilon Western(MILLIPORE公司)发光,向膜曝光而显像。
结果示于图8的电泳图。由此,对于全部受试体确认了提示内源性的DHPS的存在的条带,强列提示在血中的内源性的DHPS的存在。
[B]对于本发明的癌检测方法
[实施例B-1]由ELISA法的自身抗体的探讨
(1)探讨方法
DHPS的自身抗体的抗原蛋白质经下述的工序而作为重组蛋白质得到。
首先,由PCR法制作***子。即,预先制作具有适宜于向表达载体pET28或pGEX-4T的重组的限制性内切酶识别部位的引物,以从骨肉瘤细胞株U2-OS提取的RNA作为模板进行逆转录PCR而制作cDNA,再进行PCR而得到全长的***子。对此***子及表达载体进行限制性内切酶处理,使用Ligation-Convenience试剂盒(日本Gene公司),连接***子和表达载体,制作含***子的质粒。再者,使用大肠杆菌感受态细胞BL21(日本Gene公司)转化到重组体中。将此转化体用放入抗生物质的LB培养基培养,用IPTG诱导***子DNA来源蛋白质的表达。对此状态的转化的大肠杆菌进行离心分离回收后,分离为可溶级分和不溶级分,再使用尿素进行不溶级分的增溶。蛋白质使用ProBond树脂(Invitrogen公司)及谷胱甘肽-Sepharose(GE Healthcare公司)纯化。
通过将这样得到的各种的纯化重组蛋白质以10μg/ml的浓度注入96孔ELISA板,于4℃保存一晚,固定化而得到固定化了在ELISA中使用的重组蛋白质的96孔板。
在ELISA法中,将此重组蛋白质固定化板用PBS清洗、用10%牛胎儿血清PBS溶液封闭后,将患者血清及对照血清(健康者的血清)稀释2000倍,与固定化的蛋白质反应,接下来,PBS清洗后,加HRP标记山羊抗人IgG抗体。在最后,加酶显色底物而显色,用板读取器测定OD450nm的吸收。
(2)由ELISA法的自身抗体的探讨
在医疗设施D中,使用食道癌患者61例和大肠癌患者19例(癌患者计80例)、而且,医疗设施A的健康人51例的血清受试体。结果示于图9和图10。图9显示在患者组(患者)和健康人组(正常)中的DHPS的自身抗体的抗体价的分布,图10显示在本探讨中的ROC曲线(接收者动作特性曲线)。
基于上述图9和图10,由检验导致的结果示于表4。如表4所示,截止值约是0.69,在图9中以虚线表示。
【表4】
P值小于0.05,确认了关于“DHPS的血清抗体价在大肠癌和食道癌的患者组中比健康人组大”的显著差异。
另外,在上述截止值中的阳性率是80%左右。
序列表
<110> Fujikura Kasei Co., Ltd.
National University Corporation Chiba University
<120> 以脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因作为指标使用的动脉硬化及癌的检测方法
<130> PFKK3PCT
<150> JP 2014-226847
<151> 2014-11-07
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 369
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Glu Gly Ser Leu Glu Arg Glu Ala Pro Ala Gly Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Val Leu Lys His Ser Ser Thr Leu Pro Pro Glu Ser Thr Gln Val Arg
20 25 30
Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Val Asn Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Ala
35 40 45
Phe Gly Thr Thr Gly Phe Gln Ala Thr Asn Phe Gly Arg Ala Val Gln
50 55 60
Gln Val Asn Ala Met Ile Glu Lys Lys Leu Glu Pro Leu Ser Gln Asp
65 70 75 80
Glu Asp Gln His Ala Asp Leu Thr Gln Ser Arg Arg Pro Leu Thr Ser
85 90 95
Cys Thr Ile Phe Leu Gly Tyr Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly Ile
100 105 110
Arg Glu Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His Asn Met Val Asp Val Leu
115 120 125
Val Thr Thr Ala Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala
130 135 140
Pro Thr Tyr Leu Gly Glu Phe Ser Leu Arg Gly Lys Glu Leu Arg Glu
145 150 155 160
Asn Gly Ile Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Lys Phe Glu Asp Trp Leu Met Pro Ile Leu Asp Gln Met Val Met
180 185 190
Glu Gln Asn Thr Glu Gly Val Lys Trp Thr Pro Ser Lys Met Ile Ala
195 200 205
Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Pro Glu Ser Val Tyr Tyr Trp Ala
210 215 220
Gln Lys Asn His Ile Pro Val Phe Ser Pro Ala Leu Thr Asp Gly Ser
225 230 235 240
Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr Lys Asn Pro Gly Leu Val
245 250 255
Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile Asn Thr Gln Ala Ile Phe
260 265 270
Ala Lys Cys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Val Val Lys His
275 280 285
His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val
290 295 300
Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg
305 310 315 320
Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Val Asp Ala Gln Pro
325 330 335
Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val Phe Pro Leu Leu Val Ala
340 345 350
Glu Thr Phe Ala Gln Lys Met Asp Ala Phe Met His Glu Lys Asn Glu
355 360 365
Asp
<210> 2
<211> 1110
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
atggaaggtt ccctggaacg ggaggcgcca gcgggggcgc tggccgccgt gctaaagcac 60
agctcgacgt tgccgcccga aagcacccag gtccggggct acgacttcaa ccgcggtgtg 120
aattaccgcg cactgctgga ggccttcggc accaccggct tccaagcaac caacttcggg 180
cgcgctgtac agcaagtcaa tgccatgatc gagaagaagc tggaaccact gtcacaggat 240
gaagaccagc acgcggacct gacccagagc cgccgcccac ttaccagctg caccattttc 300
ctgggatata catccaacct catcagttca ggcatccgtg agaccattcg ctaccttgtg 360
cagcacaaca tggtggacgt attggtgacc acagctggcg gcgtggagga agacctcatc 420
aagtgcctgg cgcccacata cttgggcgag tttagcctca gggggaagga gctccgggag 480
aacgggatca ataggatcgg aaacctgctg gtgcccaatg agaattactg caagtttgag 540
gactggctga tgcccattct ggaccagatg gtgatggagc agaacacaga gggtgtaaag 600
tggacgcctt ctaagatgat cgcccggctg ggcaaggaga tcaacaaccc agagtccgtg 660
tattactggg cccagaagaa ccacatccct gtgtttagtc ccgcacttac agacggctcg 720
ctgggcgaca tgatcttctt ccattcctac aagaacccgg gcctggtcct ggacatcgtt 780
gaggacctga ggctcatcaa cacacaggcc atctttgcca agtgcactgg gatgatcatt 840
ctgggcgggg gcgtggtcaa gcaccacatt gccaatgcca acctcatgcg gaacggggcc 900
gactacgctg tttacatcaa cacagcccag gagtttgatg gctctgactc aggtgcccga 960
ccagacgagg ctgtctcctg gggcaagatc cgggtggatg cacagcccgt caaggtctat 1020
gctgacgcct ccctggtctt ccccctgctt gtggctgaaa cctttgccca gaagatggat 1080
gccttcatgc atgagaagaa cgaggactga 1110
Claims (29)
1.动脉硬化的检测方法,其在受试试样中确认所述受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase)基因的表达,以所述基因表达的亢进作为指标来检测动脉硬化。
2.权利要求1所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,在上述检测方法中,对于作为目标基因的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的表达的确认是通过以所述基因所编码的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分作为目标多肽检测来进行的。
3.权利要求2所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,对于作为目标多肽的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的检测是使用与所述目标多肽特异性结合的抗体来进行的。
4.权利要求3所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,抗体是单克隆抗体。
5.权利要求1所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,在上述检测方法中,对于作为目标基因的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的表达的确认是通过检测针对受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的抗体来进行的。
6.权利要求5所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,通过使受试试样接触于含脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分的多肽的固定化物,以针对受试试样内的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的抗体与所述固定化多肽的结合作为信号来检测,从而检测针对受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的抗体。
7.权利要求6所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,固定化物中所含的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的一部分的多肽的氨基酸数是所述全部的多肽的氨基酸数的1/2以上。
8.权利要求1所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,在上述检测方法中,对于作为目标基因的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的表达的确认是通过以受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的全部或一部分、或者与所述基因的全部或一部分互补的核酸作为目标核酸检测来进行的。
9.权利要求8所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,目标核酸的检测是通过使有与所述目标核酸的碱基序列互补的序列的核酸的核酸探针与固定化的或者未固定化的目标核酸杂交而检测由所述杂交发生的信号来进行的。
10.权利要求8或9所述的动脉硬化的检测方法,其中以将脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的全部或一部分、或者与所述基因的全部或一部分互补的核酸由基因扩增法扩增而成的基因扩增产物作为目标核酸检测。
11.权利要求1~10之任一项所述的动脉硬化的检测方法,其特征在于,受试试样是血液受试体。
12.动脉硬化检测用试剂盒,其用于进行权利要求1~11之任一项所述的动脉硬化的检测方法。
13.固定化板的使用方法,其包括以下的步骤(a)~(d):
(a)使固定化了人工调制的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分的板与血液受试体接触,在板上进行针对所述血液受试体中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的自身抗体和所述板上的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分结合的抗原抗体结合体的形成的步骤;
(b)使人工附加了标记的抗体结合性的第二抗体与板上的上述抗原抗体结合体的自身抗体结合的步骤;
(c)为了使与自身抗体结合的上述第二抗体的标记在板上显现而检测所述显现信号而使用板的步骤;
(d)以从板得到的所述显现信号的检测值作为针对脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的自身抗体的定量值计数,以大于统计学地得到的对于动脉硬化的阈值时的所述定量值作为上述血液受试体中的动脉硬化的指标的步骤。
14.权利要求13所述的固定化板的使用方法,其特征在于,固定化在板上的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的一部分的多肽的氨基酸数是所述全部的多肽的氨基酸数的1/2以上。
15.癌的检测方法,其中在受试试样中对受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase)基因的表达进行确认,以所述基因表达的亢进作为指标来检测消化***癌。
16.权利要求15所述的癌的检测方法,其特征在于,在上述检测方法中,对于作为目标基因的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的表达的确认是通过以所述基因所编码的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分作为目标多肽检测来进行的。
17.权利要求16所述的癌的检测方法,其特征在于,对于作为目标多肽的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的检测是使用与所述目标多肽特异性结合的抗体来进行的。
18.权利要求17所述的癌的检测方法,其特征在于,抗体是单克隆抗体。
19.权利要求15所述的癌的检测方法,其特征在于,在上述检测方法中,对于作为目标基因的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的表达的确认是通过检测针对受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的抗体来进行的。
20.权利要求19所述的癌的检测方法,其特征在于,通过使受试试样接触于含脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分的多肽的固定化物,以针对受试试样内的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的抗体与所述固定化多肽的结合作为信号来检测,从而检测针对受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的抗体。
21.权利要求20所述的癌的检测方法,其特征在于,固定化物中所含的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的一部分的多肽的氨基酸数是所述全部的多肽的氨基酸数的1/2以上。
22.权利要求15所述的癌的检测方法,其特征在于,在上述检测方法中,对于作为目标基因的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的表达的确认是通过以受试试样中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的全部或一部分、或者与所述基因的全部或一部分互补的核酸作为目标核酸检测来进行的。
23.权利要求22所述的癌的检测方法,其特征在于,目标核酸的检测是通过使有与所述目标核酸的碱基序列互补的序列的核酸的核酸探针与固定化的或者未固定化的目标核酸杂交而检测由所述杂交发生的信号来进行的。
24.权利要求22或23所述的癌的检测方法,其中以将脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因的全部或一部分、或者与所述基因的全部或一部分互补的核酸由基因扩增法扩增而成的基因扩增产物作为目标核酸检测。
25.权利要求15~24之任一项所述的癌的检测方法,其特征在于,受试试样是血液受试体。
26.权利要求15~25之任一项所述的癌的检测方法,其特征在于,消化***癌是食道癌或大肠癌。
27.癌检测用试剂盒,其用于进行权利要求15~26之任一项所述的癌的检测方法。
28.固定化板的使用方法,其包括以下的步骤(a)~(d):
(a)使固定化了人工调制的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分的板与血液受试体接触,在板上进行针对所述血液受试体中的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的自身抗体和所述板上的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的全部或一部分结合的抗原抗体结合体的形成的步骤;
(b)使人工附加了标记的抗体结合性的第二抗体与板上的上述抗原抗体结合体的自身抗体结合的步骤;
(c)为了使与自身抗体结合的上述第二抗体的标记在板上显现而检测所述显现信号而使用板的步骤;
(d)以从板得到的所述显现信号的检测值作为针对脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的自身抗体的定量值计数,以大于统计学地得到的对于消化***癌的阈值时的所述定量值作为上述血液受试体中的消化***癌的指标的步骤。
29.权利要求28所述的固定化板的使用方法,其特征在于,固定化在板上的脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶的一部分的多肽的氨基酸数是所述全部的多肽的氨基酸数的1/2以上。
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