CN107110841B - 抑制蛋白质吸附的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的抑制蛋白质非特异性吸附的方法。发现通过使用以含有磷酸胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相，使用以同时具有磷酸胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品，然后将处理后的样品加入到处理后的固相中，从而能够解决上述技术问题，完成了本发明。

Description

抑制蛋白质吸附的方法
技术领域
本发明涉及一种抑制蛋白质非特异性吸附的方法。具体而言，涉及一种使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液、以及以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液的抑制蛋白质吸附的方法。
本申请主张通过参照而被引用于此的日本专利申请第2015-031155号的优先权。
背景技术
在临床检查、诊断用药的领域中，利用了免疫反应的测定方法得到广泛运用。其中，检查的高灵敏度化受到要求，临床检查、诊断用药的灵敏度的提高成为了大的技术问题。为了高灵敏度化，检测方法逐渐由利用如过氧化物酶或碱性磷酸酶的酶反应的方法转变为利用荧光或化学发光的方法。虽然通过使检测方式为荧光或化学发光，理论上能够确认一分子的检测对象物质的存在，但是实际上并没能得到目标灵敏度。
作为影响利用免疫反应进行测定时的检测灵敏度的一个主要原因，可列举出，作为测定对象的抗体、抗原或者利用于测定的这些标记物在免疫反应容器或固相表面上的非特异性吸附。此外，作为样品使用如血清、血浆、细胞提取物以及尿的多种生物分子共存的物质时，由于如各种蛋白质的非特定大量的共存物质非特异性地吸附于免疫反应容器或固相表面而引发的噪声的生成，也是妨碍高灵敏度化的主要原因。
为了防止这些非特异性吸附，以往以来，使用了通过将不参与免疫反应的如牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶的来自生物的蛋白质吸附于免疫反应容器或固相表面，从而抑制蛋白质的非特异性吸附的方法。然而，使用如牛血清白蛋白的来自生物的蛋白质时，由于存在以BSE为代表的生物污染问题、批间偏差、保管温度以及使用期限等的限制，因此期望以能够解决这些问题的化学合成品为主要成分的蛋白质非特异性吸附抑制剂的开发。
作为以化学合成品为主要成分的蛋白质非特异性吸附抑制剂，公开了以下的物质。
专利文献1公开了“含有聚乙烯醇的阻断剂”。专利文献2公开了“含有2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱聚合物的蛋白质吸附抑制剂”。
这些方法仅通过将作为蛋白质非特异性吸附抑制剂的化学合成品物理吸附于固相表面而发挥效果。这些方法虽然在一定程度上能够避免在固相表面上的非特异性吸附，但是并不充分。并且没有公开或暗示本发明的样品处理液。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利公开平成4-19561号公报
专利文献2：日本专利公开平成7-83923号公报
发明内容
本发明要解决的技术问题
如上所述，本发明的目的在于，提供一种新的抑制蛋白质非特异性吸附的方法。
解决技术问题的技术手段
本发明的发明人们为了解决上述技术问题，进行深入研究，其结果发现，通过使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相，使用以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品，然后将处理后的样品加入到处理后的固相中，能够解决上述技术问题，完成了本发明。
即，本发明如下所述。
1.一种抑制蛋白质非特异性吸附的方法，其包括以下工序：
(i)使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相的工序；以及
(ii)使用以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品，进一步将该处理后的样品加入到(i)中处理后的固相中的工序；
或者，
(iii)使用以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品的工序；以及
(iv)使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相，进一步将(iii)中处理后的样品加入到该处理后的固相中的工序。
2.根据前项1所述的抑制蛋白质非特异性吸附的方法，其中，所述含有磷酰胆碱基的聚合物、与所述同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合，为以下的任意1种以上，
(1)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
(2)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
(3)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸丁酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合，
(4)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸丁酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
(5)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸甘油酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
以及，
(6)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸羟乙酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合。
发明效果
本发明的抑制蛋白质非特异性吸附的方法中，包含于所使用的固相处理液以及样品处理液中的聚合物，虽是化学合成品但具有高的抑制蛋白质非特异性吸附的能力。因此，可以作为虽然具有批间偏差或生物污染等问题、但仍被继续使用的来自生物的蛋白质非特异性吸附抑制剂的代替品而使用。
具体实施方式
本发明的抑制蛋白质非特异性吸附的方法(以后，有时称作“本发明的方法”)包括以下的工序。
(i)使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相的工序；以及(ii)使用以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品，进一步将该处理后的样品加入到(i)中处理后的固相中的工序；或者，
(iii)使用以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品的工序；以及(iv)使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相，进一步将(iii)中处理后的样品加入到该处理后的固相中的工序。
以下，对本发明的方法进行进一步详细地说明。
本发明的方法能够在利用酶反应、或者免疫球蛋白的抗原抗体反应进行测定的免疫学测定方法等中使用，其中所述酶反应利用了例如：蛋白质、多肽、类固醇、脂质、激素等，更具体而言，利用了各种抗原、抗体、受体、酶等。
具体而言，可以适用于公知的放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫分析法(FIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、乳胶比浊法等，特别优选适用于酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫分析法(FIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、乳胶比浊法、蛋白质印迹法等。
在这些公知的免疫学测定法中，在使抗体或者抗原结合于固相表面后，利用固相处理液处理未结合抗体或者抗原的固相表面，另一方面，利用样品处理液处理样品，从而抑制蛋白质的非特异性吸附。
本发明的“固相”是指进行免疫反应的地点(反应容器)。特别是，可以通过物理吸附、化学结合、生物学结合等，将参与免疫反应的酶、抗体、抗原、多肽等固定于固相表面。
固相的材质没有特别的限定，可列举出例如，聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、金属、陶瓷、硅橡胶、聚偏氟乙烯膜(以下PVDF膜)、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。其中，优选聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯，特别优选聚苯乙烯。此外，这些材质的形状没有特别的限定，可列举出试管、滴定板、胶乳、磁性微粒等。
本发明的“样品”是指，如全血、血清、血浆、细胞提取物、泪液、唾液、尿、粪便等的多种生物分子共存的样品，没有特别的限定。
本发明的“固相处理液”是指，将至少含有磷酰胆碱基的聚合物作为主要成分，用于处理固相(特别是用于使固相处理液与固相表面接触)的溶液。本发明的固相处理液若具有含有磷酰胆碱基的聚合物，则没有特别的限定，例如含有1种以上的如下的聚合物。
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC：含有磷酰胆碱基的聚合物)
MPC与甲基丙烯酸丁酯(BMA：具有疏水性基团的聚合物)与甲基丙烯酸甘油酯(Gr：具有羟基的聚合物)的共聚物(MPC-BMA-Gr)
MPC与BMA与甲基丙烯酸羟乙酯(HMA：具有羟基的聚合物)的共聚物(MPC-BMA-HMA)
MPC与Gr的共聚物(MPC-Gr)
MPC与HMA的共聚物(MPC-HMA)
MPC与BMA的共聚物(MPC-BMA)
MPC与甲基丙烯酸十八烷基酯(SMA：具有疏水性基团的聚合物)的共聚物(MPC-SMA)
MPC与甲基丙烯酸月桂酯(LMA：具有疏水性基团的聚合物)的共聚物(MPC-LMA)
上述含有磷酰胆碱基的聚合物中的MPC的组成比(摩尔比)没有特别的限定，为1～100％，优选为5～100％，更优选为20～80％。
作为本发明的固相处理液的溶剂，若为能够使用于免疫学测定方法的缓冲液或纯水，则均可以使用。例如可以使用，磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、生理盐水等，没有特别的限定。
此外，本发明的固相处理液的浓度优选为0.0125～5.0wt％(以全部聚合物的重量换算)，更优选为0.1～0.5wt％。
本发明的“样品处理液”，是指将至少同时具有磷酰胆碱基、羟基和疏水性基团的聚合物作为主要成分，用于处理样品的溶液。处理样品是指，利用样品处理液稀释样品，将样品加入到样品处理液中，将样品处理液加入到样品中等。
本发明的样品处理液，若含有同时具有磷酰胆碱基、羟基和疏水性基团的聚合物，则没有特别的限定，例如含有1种以上的如下的聚合物。
MPC与BMA与Gr的共聚物(MPC-BMA-Gr)
MPC与BMA与HMA的共聚物(MPC-BMA-HMA)
MPC与BMA与甲基丙烯酸羟丙酯(HPM：具有羟基的聚合物)的共聚物(MPC-BMA-HPM)
MPC与SMA与Gr的共聚物(MPC-SMA-Gr)
MPC与SMA与HMA的共聚物(MPC-SMA-HMA)
MPC与SMA与HPM的共聚物(MPC-SMA-HPM)
MPC与LMA与Gr的共聚物(MPC-LMA-Gr)
MPC与LMA与HMA的共聚物(MPC-LMA-HMA)
MPC与LMA与HPM的共聚物(MPC-LMA-HPM)
上述同时具有磷酰胆碱基、羟基和疏水性基团的聚合物中的MPC的组成比(摩尔比)没有特别的限定，为1～95％，优选为5～80％，更优选为10～60％。
作为本发明的样品处理液的溶剂，若为能够使用于免疫学测定方法的缓冲液或纯水，则均可以使用。例如可以使用，磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、tris缓冲液、HEPES缓冲液、生理盐水等，没有特别的限定。
此外，本发明的样品处理液的浓度优选为0.0125～5.0wt％(以全部聚合物的重量换算)，更优选为0.1～0.5wt％。
本发明的方法，首先将以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液添加到固相表面(免疫测定法用树脂容器(滴定板等))。更具体而言，在使抗体或者抗原结合于固相表面后，将固相处理液添加到该固相中。另一方面，利用以同时具有磷酰胆碱基、羟基和疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液稀释样品，将该样品添加到处理后的固相表面。更具体而言，也可以将样品处理液添加到测定中所添加的试剂或者样品中。具体而言，将样品处理液添加于含有待检物质的血清、或者含有标记抗体或标记抗原的试剂、或者这些的全部中，进行混合。进一步，即使在作为样品的血清中的待检物质吸附于固相不再成为问题的情况下，添加标记抗体或者标记抗原时，也可以混合样品处理液。通过这些操作，能够抑制包含于样品中的目标以外的蛋白质(待检物质以外的蛋白质)的非特异性吸附。
作为固相处理液的主要成分的含有磷酰胆碱基的聚合物与作为样品处理液的主要成分的同时具有磷酰胆碱基、羟基和疏水性基团的聚合物的组合，具体地可列举出如下的组合，但是没有特别的限定(左侧的聚合物表示含有磷酰胆碱基的聚合物，右侧的聚合物表示同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物)。
MPC与MPC-BMA-Gr
MPC与MPC-BMA-HMA
MPC与MPC-BMA-HPM
MPC与MPC-SMA-Gr
MPC与MPC-SMA-HMA
MPC与MPC-SMA-HPM
MPC与MPC-LMA-Gr
MPC与MPC-LMA-HMA
MPC与MPC-LMA-HPM
MPC-BMA-Gr与MPC-BMA-Gr
MPC-BMA-Gr与MPC-BMA-HMA
MPC-BMA-Gr与MPC-BMA-HPM
MPC-BMA-Gr与MPC-SMA-Gr
MPC-BMA-Gr与MPC-SMA-HMA
MPC-BMA-Gr与MPC-SMA-HPM
MPC-BMA-Gr与MPC-LMA-Gr
MPC-BMA-Gr与MPC-LMA-HMA
MPC-BMA-Gr与MPC-LMA-HPM
MPC-BMA-HMA与MPC-BMA-Gr
MPC-BMA-HMA与MPC-BMA-HMA
MPC-BMA-HMA与MPC-BMA-HPM
MPC-BMA-HMA与MPC-SMA-Gr
MPC-BMA-HMA与MPC-SMA-HMA
MPC-BMA-HMA与MPC-SMA-HPM
MPC-BMA-HMA与MPC-LMA-Gr
MPC-BMA-HMA与MPC-LMA-HMA
MPC-BMA-HMA与MPC-LMA-HPM
MPC-Gr与MPC-BMA-Gr
MPC-Gr与MPC-BMA-HMA
MPC-Gr与MPC-BMA-HPM
MPC-Gr与MPC-SMA-Gr
MPC-Gr与MPC-SMA-HMA
MPC-Gr与MPC-SMA-HPM
MPC-Gr与MPC-LMA-Gr
MPC-Gr与MPC-LMA-HMA
MPC-Gr与MPC-LMA-HPM
MPC-HMA与MPC-BMA-Gr
MPC-HMA与MPC-BMA-HMA
MPC-HMA与MPC-BMA-HPM
MPC-HMA与MPC-SMA-Gr
MPC-HMA与MPC-SMA-HMA
MPC-HMA与MPC-SMA-HPM
MPC-HMA与MPC-LMA-Gr
MPC-HMA与MPC-LMA-HMA
MPC-HMA与MPC-LMA-HPM
MPC-BMA与MPC-BMA-Gr
MPC-BMA与MPC-BMA-HMA
MPC-BMA与MPC-BMA-HPM
MPC-BMA与MPC-SMA-Gr
MPC-BMA与MPC-SMA-HMA
MPC-BMA与MPC-SMA-HPM
MPC-BMA与MPC-LMA-Gr
MPC-BMA与MPC-LMA-HMA
MPC-BMA与MPC-LMA-HPM
MPC-SMA与MPC-BMA-Gr
MPC-SMA与MPC-BMA-HMA
MPC-SMA与MPC-BMA-HPM
MPC-SMA与MPC-SMA-Gr
MPC-SMA与MPC-SMA-HMA
MPC-SMA与MPC-SMA-HPM
MPC-SMA与MPC-LMA-Gr
MPC-SMA与MPC-LMA-HMA
MPC-SMA与MPC-LMA-HPM
MPC-LMA与MPC-BMA-Gr
MPC-LMA与MPC-BMA-HMA
MPC-LMA与MPC-BMA-HPM
MPC-LMA与MPC-SMA-Gr
MPC-LMA与MPC-SMA-HMA
MPC-LMA与MPC-SMA-HPM
MPC-LMA与MPC-LMA-Gr
MPC-LMA与MPC-LMA-HMA
MPC-LMA与MPC-LMA-HPM
作为上述固相处理液的主要成分的含有磷酰胆碱基的聚合物中的MPC的组成比(摩尔比)，没有特别的限定，为1～100％，优选为5～100％，更优选为20～80％。除MPC以外的共聚成分的组成比，没有特别的限定，为99～0％，优选为95～0％，更优选为80～20％。
此外，作为上述样品处理液的主要成分的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物中的MPC的组成比(摩尔比)，没有特别的限定，为1～95％，优选为5～80％，更优选为10～60％。除MPC以外的共聚成分的组成比，没有特别的限定，为99～5％，优选为95～20％，更优选为90～40％。
作为固相处理液的主要成分的含有磷酰胆碱基的聚合物与作为样品处理液的主要成分的同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的更优选的组合，具体地可列举出如下的物质，但是没有特别的限定。
结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基和疏水性基团的聚合物；
结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，以及结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物；
结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸丁酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，和结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物；
结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸丁酯的含有磷酰胆碱基的聚合物、和结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物；
结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸甘油酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，和结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物；
结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸羟乙酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，和结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物。
在作为上述的固相处理液的主要成分的含有磷酰胆碱基的聚合物、与作为样品处理液的主要成分的同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的更优选的组合中，作为固相处理液的主要成分的含有磷酰胆碱基的聚合物中的MPC的组成比(摩尔比)没有特别的限定，为1～99％，优选为5～99％，更优选为20～80％。除MPC以外的共聚成分的组成比，没有特别的限定，为99～1％，优选为95～1％，更优选为80～20％。
此外，在作为上述的固相处理液的主要成分的含有磷酰胆碱基的聚合物、与作为样品处理液的主要成分的同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的更优选的组合中，作为样品处理液的主要成分的同时具有磷酰胆碱基、羟基和疏水性基团的聚合物中的MPC的组成比(摩尔比)，没有特别的限定，为1～95％，优选为5～80％，更优选为10～60％。除MPC以外的共聚成分的组成比，没有特别的限定，为99～5％，优选为95～20％，更优选为90～40％。
本发明的方法，更具体而言，例如，在使酶或抗体等蛋白质或抗原结合在各种免疫学测定法中所使用的固相表面上后，使用固相处理液对该固相表面进行处理即可。作为使用固相处理液进行处理的固相表面，例如，在使用由聚苯乙烯制造的板时，通过将蛋白质物理吸附或者化学结合于该板上，进行洗净后，将固相处理液添加于该固相中，能够得到具有抑制蛋白质非特异性吸附的效果的固相表面。
进一步，使用具有抑制蛋白质非特异性吸附的效果的固相表面进行测定时，关于使用样品处理液的处理，将含有目标物质(待检物质)的血清、标记抗体或者标记抗原，或者这些的全部混合即可。混合方法没有特别的限定，具体而言，将样品处理液加入含有目标物质的血清、或者含有标记抗体或者标记抗原的溶液中，进行搅拌即可。另外，样品处理液，在添加前，也可以利用本身公知的溶剂进行稀释。
实施例
通过以下的实施例以及比较例，对本发明进行进一步详细地说明，但是本发明不受下述实施例的范围的限定。
(共聚物的合成)
合成了本实施例中所使用的高分子化合物以及比较例中所使用的高分子化合物。具体而言，合成了2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)与甲基丙烯酸甘油酯(Gr)的共聚物(MPC-Gr)、MPC与Gr与甲基丙烯酸丁酯(BMA)的共聚物(MPC-BMA-Gr)、MPC与BMA与甲基丙烯酸羟乙酯(HMA)的共聚物(MPC-BMA-HMA)、MPC与HMA的共聚物(MPC-HMA)、以及MPC与BMA的共聚物(MPC-BMA)。
详细而言，合成了以下7种聚合物1～7。
聚合物1：MPC-BMA-Gr共聚物A(MPC/BMA/Gr＝40/20/40＝含有磷酰胆碱基的聚合物/具有疏水性基团的聚合物/具有羟基的聚合物)，重均分子量100kDa；
聚合物2：MPC-BMA-Gr共聚物B(MPC/BMA/Gr＝40/40/20＝含有磷酰胆碱基的聚合物/具有疏水性基团的聚合物/具有羟基的聚合物)，重均分子量100kDa；
聚合物3：MPC-BMA-HMA共聚物(MPC/BMA/HMA＝20/20/60＝含有磷酰胆碱基的聚合物/具有疏水性基团的聚合物/具有羟基的聚合物)，重均分子量1000kDa；
聚合物4：MPC-Gr共聚物(MPC/Gr＝50/50＝含有磷酰胆碱基的聚合物/具有羟基的聚合物)，重均分子量300kDa；
聚合物5：MPC-HMA共聚物(MPC/HMA＝70/30＝含有磷酰胆碱基的聚合物/具有羟基的聚合物)，重均分子量500kDa；
聚合物6：MPC-BMA共聚物(MPC/BMA＝80/20＝含有磷酰胆碱基的聚合物/具有疏水性基团的聚合物)，重均分子量600kDa；
聚合物7：MPC-BMA共聚物(MPC/BMA＝30/70＝含有磷酰胆碱基的聚合物/具有疏水性基团的聚合物)，重均分子量100kDa。
(括号中示出了各个聚合物的原料组成中的摩尔比、以及具有各个基团的聚合物。)
将各个聚合物的单体称量至聚合容器中。使用乙醇与水的混合溶剂作为反应溶剂，将总单体浓度调整为1.0mol/L。然后，将作为聚合引发剂的偶氮二异丁腈(AIBN)添加于称量的单体中。使聚合引发剂的浓度为1mol％。
然后，将聚合容器内部进行充分的氮气交换后，使聚合容器在60℃下保持24小时，以此进行聚合反应。此后，将得到的反应混合物进行冰浴冷却后，通过滴入二***，使聚合物沉淀。将沉淀的聚合物过滤分离，利用二***进行清洗后，减压使其干燥。由此得到了白色粉末状的各个聚合物。将得到的各个聚合物溶解于纯水中，作为5wt％的水溶液而保存。
对得到的各个聚合物进行元素分析，确认得到了与原料组成一致的共聚物。
(抑制蛋白质非特异性吸附的能力的测定方法)
将合成的聚合物1～7以及部分皂化的聚乙烯醇(PVA205，KURARA Y CO.,LTD制造)、牛血清白蛋白(BSA)分别溶解于杜氏磷酸缓冲溶液(Sigma-Aldrich Co.,LLC制造，以下记作D-PBS)中，使其为1wt％，制备了含有各个聚合物的固相处理液以及作为对照液的BSA溶液、D-P BS溶液。
然后，将调制为1wt％的含有各个聚合物的固相处理液、BSA溶液或者D-PBS溶液分别加入到由聚碳酸酯制成的96孔板中(300μL/孔)，在25℃下培育3个小时。进一步，在培育3小时后，使用吸气器将溶液完全去除，反复进行以300μL/孔的方式分别添加与去除D-PBS的操作，进行了5次清洗。
作为模拟血清溶液，制备了含有50mg/mL人血清白蛋白、10mg/mL人IgG(人免疫球蛋白G)的D-PBS模拟血清溶液。
制备10％模拟血清溶液(包括样品处理液、作为对照液的聚合物4、聚合物5、BSA溶液、或D-PBS溶液)，其中分别包含终浓度为1％的合成的聚合物1～7以及部分皂化聚乙烯醇、BSA的溶液或D-PBS。
将含有各个样品处理液的10％模拟血清溶液、含有作为对照液的聚合物4的10％模拟血清溶液、含有作为对照液的聚合物5的10％模拟血清溶液、含有作为对照液的BSA溶液的10％模拟血清溶液、或者含有作为对照液的D-PBS溶液的10％模拟血清溶液分别加入到由聚碳酸酯制成的96孔板(300μL/孔)中，在25℃下培育了1个小时。1小时后，使用吸气器将溶液完全去除，反复进行分别添加(300μL/孔)与去除D-PBS的操作，进行了5次清洗。
将稀释了5000倍的POD-抗人IgG抗体(过氧化物酶标记抗人免疫球蛋白G抗体，Rockland Co.,Ltd制造)分别添加(100μL/孔)，在25℃下培育了1个小时。1小时后，使用吸气器将溶液完全去除，反复进行以300μL/孔的方式分别添加与去除D-PBS的操作，进行了5次清洗。清洗后，以100μL/孔的方式加入TMB微孔板过氧化物酶底物(MicrowellPeroxidase Substrate)(MOS制造)，使其在25℃下反应15分钟。通过分别添加0.3mol/L的硫酸溶液(100μL/孔)，使显色反应停止，测定450nm的吸光度，检测了吸附的蛋白质。
另外，使用的固相，固相处理液以及样品处理液的组合如下所述。
[实施例1-1]
将未处理的聚碳酸酯作为固相使用，以表1中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
[实施例1-2]
将未处理的聚苯乙烯作为固相使用，以表2中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
[实施例1-3]
将未处理的聚甲基丙烯酸甲酯作为固相使用，以表3中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
[实施例1-4]
将Maxisorp(Thermo Fisher Sientific Co.,Ltd制造)作为固相使用，以表4中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
[比较例1-1]
将未处理的聚碳酸酯作为固相使用，以表1中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
[比较例1-2]
将未处理的聚苯乙烯作为固相使用，以表2中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
[比较例1-3]
将未处理的聚甲基丙烯酸甲酯作为固相使用，以表3中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
[比较例1-4]
将Maxisorp(Thermo Fisher Sientific Co.,Ltd制造)作为固相使用，以表4中所示的组合测定了抑制蛋白质吸附的能力。
将实施例1-1、1-2、1-3、1-4以及比较例1-1、1-2、1-3、1-4的抑制蛋白质非特异性吸附的能力的测定结果示于下述表1～表4中。
[表1]
Figure GDA0001337263030000161
[表2]
Figure GDA0001337263030000171
[表3]
Figure GDA0001337263030000172
[表4]
Figure GDA0001337263030000173
根据上述表1～表4的抑制蛋白质非特异性吸附的能力的测定结果，确认到，在使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液、以及以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液的、本发明的抑制蛋白质非特异性吸附的方法中，包含于所使用的固相处理液以及样品处理液中的聚合物虽是化学合成品，也具有高的抑制蛋白质非特异性吸附的能力。
另外，比较例1-1-3、1-2-3、1-3-2、1-3-3、1-4-2以及1-4-3的抑制蛋白质非特异性吸附的能力低的原因在于，样品处理液中不含有具有疏水性基团的聚合物。
工业实用性
本发明能够提供一种新的抑制蛋白质非特异性吸附的方法。

Claims (1)

1.一种抑制蛋白质非特异性吸附的方法，其包括以下工序：
(i)使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相的工序；以及
(ii)使用以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品，进一步将该处理后的样品加入到(i)中处理后的固相中的工序；
或者，
(iii)使用以同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物为主要成分的样品处理液处理样品的工序；以及
(iv)使用以含有磷酰胆碱基的聚合物为主要成分的固相处理液处理固相，进一步将(iii)中处理后的样品加入到该处理后的固相中的工序，
其中，所述含有磷酰胆碱基的聚合物、与所述同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合，为以下的任意1种以上，
(1)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
(2)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
(3)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸丁酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
(4)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸丁酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
(5)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸甘油酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸甘油酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合；
以及，
(6)结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱以及甲基丙烯酸羟乙酯的、含有磷酰胆碱基的聚合物，与结构单元为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯以及甲基丙烯酸羟乙酯的、同时具有磷酰胆碱基、羟基及疏水性基团的聚合物的组合。
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