CN107099617A - 一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107099617A CN107099617A CN201710184165.2A CN201710184165A CN107099617A CN 107099617 A CN107099617 A CN 107099617A CN 201710184165 A CN201710184165 A CN 201710184165A CN 107099617 A CN107099617 A CN 107099617A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- real
- pcr
- infectious laryngotracheitis
- laryngotracheitis virus
- avian infectious
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 4
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 11
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 9
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 claims description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010002449 angioimmunoblastic T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR(real‑time PCR)检测方法,涉及分子生物学领域,本发明针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF:5′‑CAATGGCTTCGGAGAAAGAG‑3′和PR:5′‑GGCAATCCTGATCCCATCTA‑3′,经PCR扩增和标准品制备,建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法,具有特异性更强,灵敏度高,操作简单快速,对PCR进程进行实时检测,对每一个循环进行定量和定性分析,并可利用建立的鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法检测出组织内的病毒含量。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种鸡传染性喉气管炎病毒的检测方法。
背景技术
传染性喉气管炎病毒(ILTV)是疱疹病毒科的一个成员。本病主要侵害家禽,可引起鸡传染性喉气管炎(AILT)是一种急性、接触性上部呼吸道传染病。其特征是呼吸困难、咳嗽和咳出含有血样的渗出物。剖检时可见喉部、气管粘膜肿胀、出血和糜烂。病死率在20%以上。本病1925年在美国首次报道后,现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快,死亡率较高,在我国较多地区发生和流行,危害养鸡业的发展。目前尚无有效的治疗药物,主要依靠疫苗进行免疫预防。
目前,在流行病学监测和致病机理研究中,对传染性喉气管炎病毒基因诊断方法经常使用的是传统PCR方法,其特异性不强,易出现假阳性,操作繁琐,易产生PCR污染问题,只能对反应的终产物进行半定量或定性分析,且结果必须通过下一步的电泳进行条带分析得到。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足,提供一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,解决传统PCR方法特异性不强,易出现假阳性,操作繁琐,易产生PCR污染,只能对反应的终产物进行半定量或定性分析的问题,具有特异性强,灵敏度高,操作简单快速,不易出现假阳性,不易产生PCR污染,对PCR进程进行实时检测,对每一个循环进行定量和定性分析,分析结果可以直接通过计算机读出的特点。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:
一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,包括如下步骤:
(1)引物设计:针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR,上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′,下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′;
(2)传统PCR扩增:首先对提取出对鸡传染性喉气管炎病毒DNA进行传统PCR扩增,通过预变性、变性、退火、延伸步骤,快速特异地在体外扩增出目的DNA片段;
(3)阳性标准品制作:将目的DNA片段连接入载体,转入感受态细胞,构建重组质粒作为阳性标准品;
(4)荧光定量PCR检测:用梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增,得到扩增曲线,并以拷贝数为x轴,以Ct值为y轴,构建real-time PCR标准曲线,建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法;
(5)对该引物进行了特异性和灵敏度检测。
传统PCR检测结果显示,引物特异性良好,ILTV的DNA 有扩增条带,大小为116bp,阴性对照ddH2O未检测到扩增条带;real-time PCR 检测结果同样表明引物特异性,该对引物对ILTV只有唯一的产物吸收峰。
进一步地,步骤(3)中所述阳性标准品制作的步骤为:将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接,转化于DH5α感受态细胞中,37℃过夜培养,挑取单菌落,转于含有Amp的LB液体培养基中,37℃环境下,以200 r/min振荡培养12h,提取重组质粒,测序,用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度,根据摩尔定律,计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度,依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释,作为标准品。
进一步地,步骤(4)中所述荧光定量PCR检测的步骤为:用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ,得到扩增曲线,并以拷贝数为x轴,以Ct值为y轴,构建real-time PCR标准曲线,建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法。
进一步地,步骤(1)中所述gB基因Gen Bank登录号为EU104985。
进一步地,步骤(2)中所述传统PCR扩增的20μL的反应体系为:2×mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
进一步地,步骤(2)中所述反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性30s,60℃退火30 s,72℃延伸30s,循环30次;最后72℃延伸5 min。
进一步地,步骤(3)中所述振荡培养的条件为37℃环境下,以200 r/min振荡培养12h。
进一步地,步骤(4)中所述real-time PCR扩增的20μL的反应体系为:2×SYBRGreenⅠ qPCR Master Mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
进一步地,步骤(4)中所述real-time PCR扩增的反应条件为:95℃预变性10min,95℃变性10s,60℃退火30s,40℃延伸30s,共40个循环;扩增反应结束后加热至95℃变性15s,降至60℃保温1min,以0.1℃/s递增加热至95℃。
进一步地,步骤(5)中所述特异性检测方法为:对提取出的病毒DNA 分别进行传统PCR和real-time PCR扩增,以ddH2O为阴性对照。
进一步地,步骤(5)中所述灵敏度检测的方法为:将10倍梯度稀释的质粒标准品用引物分别进行传统PCR和real-time PCR扩增。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:本发明鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,具有特异性更强,灵敏度高,操作简单快速,更规范不易产生假阳性,不易产生PCR污染,对PCR进程进行实时检测,对每一个循环进行定量和定性分析,并可利用建立的ILTV的实时荧光定量PCR方法检测出组织内的病毒含量,且分析结果可以直接通过计算机读出的特点。
附图说明
图1是普通PCR敏感性检测结果。
图2是Real-time PCR敏感性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1:
一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,包括如下步骤:
(1)引物设计:针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR,上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′,下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′;
(2)传统PCR扩增:首先使用病毒基因组DNA提取试剂盒提取ILTV的DNA,然后进行PCR扩增,PCR反应体系为:2×mix 10μL、上下游引物(25 μmol/μL)各0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O将体积补足至20μL。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环30次;最后72℃延伸5min,之后4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,凝胶成像仪中观察结果;
(3)阳性标准品制作:将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接,转化于DH5α感受态细胞中,37℃过夜培养,挑取单菌落,转于含有Amp的LB液体培养基中,37℃环境下,以200 r/min振荡培养12h,提取重组质粒,测序,测序结果与Gen Bank序列比对无误后,用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度,根据摩尔定律,计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度,依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释,作为标准品;
质粒拷贝数=[质粒浓度(ng. μL-1)×质粒体积(μL )×6.02×1023]/[总片段长度(bp)×660g.mol-1],总片段长度=载体长度(bp)+片段长度(bp);
(4)荧光定量PCR检测:建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法,用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ,得到扩增曲线,并以拷贝数为x轴,以Ct值为y轴,构建real-time PCR标准曲线,Real-time PCR反应体系:每个样品取2μL作为模板,上下游引物各0.5μL、ddH2O 7μL、2×SYBR GreenⅠ qPCR Master Mix 10μL,95℃预变性10min, 95℃变性10s,60℃退火30s,40℃延伸30s,共40个循环,每个循环退火结束时采用End Points荧光信号采集方式检测荧光信号,扩增反应结束后加热至95℃变性15s,然后降至60℃保温1min,开始以0.1℃/s递增加热至95℃,在温度上升过程中采用All Points荧光信号采集方式检测荧光信号;PCR实验过程全封闭有效解决PCR污染问题,仪器自动分析和获取实验结果,无后续实验操作,操作简单快速;
(5)对该引物进行了特异性和灵敏度检测:
引物特异性检测:对提取出的病毒DNA分别进行传统PCR和real-time PCR扩增,以ddH2O为阴性对照,反应体系与程序同上。
敏感性检测:将10倍梯度稀释的质粒标准品用引物分别进行传统PCR和 real-time PCR扩增,反应体系与程序同上。
结果表明传统PCR检测的最低限为3.34×10-6copies/μL(如图1所示,M:DL2000,1-5:3.34×10-3copies/μL,3.34×10-4copies/μL3.34×10-5copies/μL3.34×10-6copies/μL3.34×10-7copies/μL),real-time PCR的检测可达到为3.34×10-7copies/μL(如图2所示,1-5:3.34×10-3copies/μL,3.34×10-4copies/μL,3.34×10-5copies/μL,3.34×10- 6copies/μL,3.34×10-7copies/μL)。
本发明中建立的检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR方法可以检测出组织内的病毒含量,运用建立的real-time PCR方法检测临床送检的6份疑似病料,并且测定出各份病料的病毒载量,如表1所示。
表1 临床送检6份病料的病毒载量
由以上数据可以得出,本发明所提供的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,具有特异性更强,灵敏度高,对PCR进程进行实时检测,对每一个循环进行定量和定性分析,并可利用建立的ILTV的实时荧光定量PCR方法检测出组织内的病毒含量,且分析结果可以直接通过计算机读出的特点。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)引物设计:针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR,上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′,下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′;
(2)传统PCR扩增:首先对提取出对鸡传染性喉气管炎病毒DNA进行传统PCR扩增,通过预变性、变性、退火、延伸步骤,快速特异地在体外扩增出目的DNA片段;
(3)阳性标准品制作:将目的DNA片段连接入载体,转入感受态细胞,构建重组质粒作为阳性标准品;
(4)荧光定量PCR检测:用梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ,得到扩增曲线,并以拷贝数为x轴,以Ct值为y轴,构建real-time PCR标准曲线,建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法;
(5)对该引物进行了特异性和灵敏度检测。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(3)中所述阳性标准品制作的步骤为:将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接,转化于DH5α感受态细胞中,37℃过夜培养,挑取单菌落,转于含有Amp的LB液体培养基中,37℃环境下,以200 r/min振荡培养12h,提取重组质粒,测序,用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度,根据摩尔定律,计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度,依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释,作为标准品。
3.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(4)中所述荧光定量PCR检测的步骤为:用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ,得到扩增曲线,并以拷贝数为x轴,以Ct值为y轴,构建real-time PCR标准曲线,建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法。
4.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(1)中所述gB基因Gen Bank登录号为EU104985。
5.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(2)中所述传统PCR扩增的20μL的反应体系为:2×mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
6.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(2)中所述反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性30s,60℃退火30 s,72℃延伸30s,循环30次;最后72℃延伸5 min。
7.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(4)中所述real-time PCR扩增的20μL的反应体系为:2×SYBR GreenⅠ qPCRMaster Mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
8.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(4)中所述real-time PCR扩增的反应条件为:95℃预变性10min,95℃变性10s,60℃退火30s,40℃延伸30s,共40个循环;扩增反应结束后加热至95℃变性15s,降至60℃保温1min,以0.1℃/s递增加热至95℃。
9.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(5)中所述特异性检测方法为:对提取出的病毒DNA 分别进行传统PCR和real-time PCR扩增,以ddH2O为阴性对照。
10.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于步骤(5)中所述灵敏度检测的方法为:将10倍梯度稀释的质粒标准品用引物分别进行传统PCR和real-time PCR扩增。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710184165.2A CN107099617A (zh) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | 一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710184165.2A CN107099617A (zh) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | 一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107099617A true CN107099617A (zh) | 2017-08-29 |
Family
ID=59675108
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710184165.2A Pending CN107099617A (zh) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | 一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107099617A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107475448A (zh) * | 2017-09-07 | 2017-12-15 | 四川省畜牧科学研究院 | 传染性喉气管炎病毒的lamp法快速检测方法 |
CN110257562A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-09-20 | 河北农业大学 | 一种raa-lfd检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合及其应用 |
CN110938711A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 河北农业大学 | 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法 |
CN111910019A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-11-10 | 广东省实验动物监测所 | 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒rpa扩增方法 |
CN113403426A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-09-17 | 湖南国测生物科技有限公司 | 一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104232803A (zh) * | 2014-09-29 | 2014-12-24 | 四川农业大学 | 检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒 |
CN104232802A (zh) * | 2014-09-29 | 2014-12-24 | 四川农业大学 | 检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒 |
CN104293979A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 鸡传染性支气管炎病毒和/或鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒 |
CN106011313A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 广东省实验动物监测所 | 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂 |
CN106086241A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-09 | 广东省实验动物监测所 | 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法 |
-
2017
- 2017-03-24 CN CN201710184165.2A patent/CN107099617A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104232803A (zh) * | 2014-09-29 | 2014-12-24 | 四川农业大学 | 检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒 |
CN104232802A (zh) * | 2014-09-29 | 2014-12-24 | 四川农业大学 | 检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒 |
CN104293979A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 鸡传染性支气管炎病毒和/或鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒 |
CN106011313A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 广东省实验动物监测所 | 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂 |
CN106086241A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-09 | 广东省实验动物监测所 | 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
赵妍等: "鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107475448A (zh) * | 2017-09-07 | 2017-12-15 | 四川省畜牧科学研究院 | 传染性喉气管炎病毒的lamp法快速检测方法 |
CN110257562A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-09-20 | 河北农业大学 | 一种raa-lfd检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合及其应用 |
CN110938711A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 河北农业大学 | 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法 |
CN111910019A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-11-10 | 广东省实验动物监测所 | 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒rpa扩增方法 |
CN113403426A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-09-17 | 湖南国测生物科技有限公司 | 一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107099617A (zh) | 一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 | |
CN106947838B (zh) | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
CN106811551A (zh) | 荧光定量PCR检测FAdV‑4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法 | |
CN107841575B (zh) | 一种区分四种血清型禽腺病毒i群的纳米多重pcr方法 | |
CN105132589B (zh) | 一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的pcr-rflp引物及方法 | |
CN107385111A (zh) | 一种鹅星状病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒 | |
CN105331742A (zh) | 一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒 | |
CN105671201A (zh) | 用于鉴定***病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用 | |
CN108315483A (zh) | 一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合 | |
CN109762940A (zh) | 用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组及试剂盒 | |
CN112029891A (zh) | 一种快速鉴定伊犁贝母的特异性核酸探针、方法及用途 | |
CN109735659A (zh) | 一种利用rpa检测克氏原螯虾小rna病毒的引物及试剂盒与检测方法 | |
CN110117676A (zh) | 一种基于rpa快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法 | |
CN108796124A (zh) | 一种快速区分pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测引物组及试剂盒 | |
CN103255234B (zh) | 一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法 | |
CN106868215B (zh) | 用于鉴定牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用 | |
CN116083654A (zh) | 鲤疱疹病毒2型与3型双重pcr检测方法 | |
CN105695629A (zh) | 鉴别基因i型与ii型鸭呼肠孤病毒的引物及方法 | |
CN108998575A (zh) | 鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立 | |
CN113234860B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒和牛副流感病毒3型的双重检测引物、探针组合 | |
CN108977584A (zh) | 一种番茄斑驳花叶病毒实时荧光定量pcr检测方法 | |
CN109234451A (zh) | 一种罗非鱼细小病毒TiPV CPA检测引物及应用 | |
CN106086241B (zh) | 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法 | |
CN107267666A (zh) | 一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt‑pcr检测试剂盒 | |
CN108588275A (zh) | Btv-10型、20型、23型基因型分型的多重rt-pcr试剂盒及其检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170829 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |