CN107091885B - 测定蛋白质的唾液酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种测定蛋白质的唾液酸含量的方法，该方法包括：(1)利用唾液酸酶对蛋白质样品进行消化处理，以便获得含有唾液酸的消化液；(2)对所述消化液进行沉淀处理，并分离含有所述唾液酸的上清液；(3)通过超高效液相色谱‑质谱法对所述上清进行分析，以便获得质谱图；以及(4)基于所述质谱图，确定所述蛋白质的唾液酸含量。本发明实施例所提出的方法，在无需对唾液酸进行衍生化的条件下，对蛋白样品中的总唾液酸含量进行快速定量检测，方法操作简单，灵敏度高，准确度高，耗时短，可以用于生物大分子生产的中间质量控制或者最终产品的质量检验。

Description

测定蛋白质的唾液酸含量的方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体地，本发明涉及测定蛋白质的唾液酸含量的方法。

背景技术

唾液酸是一类骨架为9个碳原子的，神经氨酸的单糖衍生物。最为常见的唾液酸为N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，广泛分布于动物组织中，主要以糖蛋白和神经节苷脂的形式存在。唾液酸在生物体内发挥多种功能，包括促进大脑发育，增强记忆力，促进肠道对维生素和矿物质的吸收等。同时，由于唾液酸带负电，在细胞上形成相对集中的负电区域，也是流感等病毒的结合受体。

近年来，以单克隆抗体和重组蛋白为代表的生物大分子在医药领域发展迅速，多种大分子药物成为重磅炸弹，全球年销售额超过数十亿美元的规模。此类生物大分子药物多由哺乳动物细胞系表达，具有丰富的糖基化修饰，包括唾液酸修饰。由于唾液酸带有较强的负电，会影响蛋白大分子在体内的半衰期，影响大分子药物在体内的药代动力学。因此，唾液酸程度往往是生物大分子药物的关键质量属性之一，在生物大分子药物的开发和生产过程中占据非常重要的地位。

然而，测定单克隆抗体和重组蛋白类生物大分子药物中唾液酸含量的方法仍有待进一步开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种操作简单，灵敏度高，耗时短，可以用于生物大分子生产的中间质量控制或者最终产品的质量检验的测定唾液酸含量的方法。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种测定蛋白质的唾液酸含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用唾液酸酶对蛋白质样品进行消化处理，以便获得含有唾液酸的消化液；(2)对所述消化液进行沉淀处理，并分离含有所述唾液酸的上清液；(3)通过超高效液相色谱-质谱法对所述上清进行分析，以便获得质谱图；以及(4)基于所述质谱图，确定所述蛋白质的唾液酸含量。现有的利用高效液相色谱或气相色谱法测定蛋白样品中的唾液酸含量的方法，由于唾液酸本身没有紫外吸收，故高效液相色谱或气相色谱法均需要对蛋白样品进行前处理，只有衍生化后的唾液酸才能被检测到，所以整个过程操作复杂，耗时较长；而现有的利用分光光度法测定蛋白样品中的唾液酸含量的方法，检测限和定量限较高。本发明实施例所提出的方法，相比于现有技术，在无需对唾液酸进行衍生化的条件下，对蛋白样品中的总唾液酸含量进行快速定量检测，方法操作简单，灵敏度高，准确度高，耗时短，可以用于生物大分子生产的中间质量控制或者最终产品的质量检验。

根据本发明的实施例，上述测定蛋白质的唾液酸含量的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述质谱采用下列条件：负离子扫描模式，离子源温度为150℃，毛细管电压为2.5kV，锥孔电压为12V，脱溶剂温度为450℃，碰撞能量为18eV，离子采集方式为多反应检测模式，采集离子为母离子308.7，子离子87.02。根据本发明的实施例，在上述质谱条件下，所得唾液酸的质谱图峰形好、峰分离度好，检测灵敏度高、准确度高。

根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱采用下列条件：色谱柱为ACQUITYUPLC BEH C18，所述色谱柱的粒径是1.7微米，大小是2.1*50mm，柱温为30℃，样品室温度为10℃，进样量1微升，流动相的A相为0.1％氨水/水溶液，流动相的B相为乙腈，洗脱程序是0～2min，90％A；2～4min，20％A；4～6min,90％A。根据本发明的实施例，在上述液相色谱条件下，上清液中的唾液酸和其它杂质高效分离，离子化程度好，进而进一步提高了下一步对唾液酸进行质谱分析的准确性和灵敏性。

根据本发明的实施例，基于4微克的所述蛋白质样品，所述唾液酸酶的用量是50U。发明人发现，上述唾液酸酶的用量是过量的，从而可以在酶的用量方面保证对蛋白质样品的充分消化。

根据本发明的实施例，所述消化处理是在37℃下进行1～12h,优选4h。发明人经过实验发现，在唾液酸酶的用量过量时，消化时间长于12h，会造成部分唾液酸降解，消化时间短于1h，又会造成水解消化不充分，优选消化时间是4h，蛋白质样品结合的唾液酸释放最为完全。

根据本发明的实施例，步骤(2)包括：所述消化液与乙腈接触并对所述消化液进行沉淀处理，并通过离心分离含有所述唾液酸的上清液。乙腈可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白(包括蛋白样品中的蛋白质成分和唾液酸酶)凝聚析出，进而通过离心去除蛋白沉淀，收集含有唾液酸的上清液。所得上清液中的蛋白杂质去除干净，排除对质谱检测的干扰，进一步提高了质谱检测结果的准确度和质谱检测的灵敏度。

根据本发明的实施例，所述乙腈预先在-20℃的条件下预冷1h。预冷的乙腈可显著提高乙腈对蛋白的变性和沉淀效率，进而所得上清液中的蛋白杂质去除更加彻底，进一步有效提高了质谱检测结果的准确度和质谱检测的灵敏度。

根据本发明的实施例，所述接触是在-20℃的条件下进行的。在-20℃的条件下进行接触可显著提高乙腈对蛋白的变性和沉淀效率，进而所得上清液中的蛋白杂质去除更加彻底，进一步有效提高质谱检测结果的准确度和质谱检测的灵敏度。

根据本发明的实施例，所述沉淀处理在-20℃的条件下进行1h。在本发明的实施例中，消化液和乙腈接触后，在-20℃的条件下静置沉淀1h，经检测，上清液中的蛋白杂质沉淀完全，有效排除了蛋白杂质对后续质谱检测的干扰，可进一步有效提高质谱检测结果的准确度和质谱检测的灵敏度。

根据本发明的实施例，所述离心是在10000×g,4℃的条件下进行10min。在上述离心条件下，沉淀的蛋白杂质被有效去除，进而有效排除了蛋白杂质对后续质谱检测的干扰，可进一步有效提高质谱检测结果的准确度和质谱检测的灵敏度。

根据本发明的实施例，所述消化液与所述乙腈的体积比是1:3。发明人发现，当消化液与乙腈的体积比为1:3时，可进一步提高乙腈沉淀蛋白的效率，进而进一步有效排除蛋白杂质对后续质谱检测的干扰，可进一步有效提高质谱检测结果的准确度和质谱检测的灵敏度。

根据本发明的实施例，在步骤(3)之前，预先利用超纯水对所述上清液进行稀释处理。根据本发明的实施例，由于在唾液酸消化蛋白质样品阶段，所用酶解缓冲液含有不挥发性盐(包括氯化钙和醋酸钠)，在步骤(3)之前，预先利用超纯水对上清液进行稀释处理，可有效减少进入质谱检测仪的不挥发性盐，避免直接进样对质谱仪造成损害，进而进一步有效提高质谱检测仪的灵敏度和质谱检测结果的准确度。

根据本发明的实施例，所述稀释处理是将所述上清液稀释至所述唾液酸的含量在0.004935～0.0987微克/毫升范围内。发明经过实验发现，稀释后的上清液中唾液酸的含量在0.004935～0.0987微克/毫升范围内，所得唾液酸的峰面积与唾液酸的浓度具有线性依赖关系，其峰面积y和唾液酸的浓度x的线性关系是y＝40002.4613x-24.5366，R²＝0.9991，即稀释后的上清液中唾液酸的含量在0.004935～0.0987微克/毫升，可通过峰面积与浓度的依赖关系，计算得出稀释后上清中的唾液酸含量，得出的唾液酸的含量值可信度和准确度高。

根据本发明的实施例，在步骤(4)中，基于下列公式确定所述蛋白质的唾液酸含量：

其中，Y表示所述蛋白质的唾液酸含量,X表示与唾液酸对应的峰面积，N表示上清液的稀释倍数，M表示上清液的体积，A表示蛋白质样品的总重量。根据本发明的实施例，当稀释处理后上清液中唾液酸的浓度在0.004935～0.0987微克/毫升范围内时，待测蛋白质样品中的唾液酸占待测蛋白质样品的百分含量可通过上述公式计算得出，得出的唾液酸占待测蛋白质样品的百分含量值可信度和准确度高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定蛋白质的唾液酸含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

1)准备样品

a)取4微克待测蛋白质样品，加入50U的唾液酸酶，加入酶切缓冲液和超纯水，配成25微升的反应体系，在37℃孵育4h，将结合在待测蛋白质样品上的唾液酸水解下来，形成的游离总唾液酸存在于溶液中；

b)向唾液酸酶水解后反应体系中加入75微升的预冷乙腈，所述乙腈在-20℃预冷1h，涡旋振荡1min后，静置于-20℃下1h，随后在10000×g，4℃的条件下离心10min，弃沉淀，游离总唾液酸存在于上清中，并放置于-20℃供随后的检测。

2)通过超高效液相色谱-质谱法对上清进行分析，确定所述上清中唾液酸的含量

a)含有游离总唾液酸的上清用超纯水经倍比稀释后，置于1.5ml的超高效液相色谱的上样瓶中，经Waters UPLC-MS Xevo TQ-S***中ACQUITY UPLC BEH C18 1.7微米，2.1*50mm分离，柱温控制在30℃，样品室温度控制为10℃，进样量1微升，流动相的A相为0.1％氨水/水溶液，流动相的B相为乙腈，洗脱程序：0～2min，90％A；2～4min，20％A；4～6min,90％A，1min后，流路切换到废液。

b)质谱设置为负离子扫描模式，离子源温度150℃，毛细管电压2.5kV，锥孔电压12V，脱溶剂温度450℃，碰撞能量18eV，离子采集方式采用多反应检测模式，采集离子是母离子308.7，子离子87.02，采集质谱数据由软件MassLynx V4.1分析。

c)在稀释后的上清中，唾液酸的浓度在0.004935～0.0987微克/毫升范围内，所述蛋白质的唾液酸含量是基于下列方程确定的：

其中，Y表示所述蛋白质的唾液酸含量,X表示与唾液酸对应的峰面积，N表示上清液的稀释倍数，M表示上清液的体积，A表示蛋白质样品的总重量。本发明实施例所提出的方法，在无需对唾液酸进行衍生化的条件下，可对蛋白样品中的总唾液酸含量进行快速定量检测，方法操作简单，灵敏度高，准确度高，耗时短，可以用于生物大分子生产的中间质量控制或者最终产品的质量检验。

附图说明

图1是根据本发明实施例的蛋白质样品经唾液酸酶水解后的蛋白沉淀的SDS-PAGE检测图；

图2是根据本发明实施例的超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)定量检测所得典型唾液酸质谱图；

图3是根据本发明实施例的UPLC-MS定量检测唾液酸含量的定量曲线图；

图4是根据本发明实施例的UPLC-MS定量检测唾液酸含量方法的检出限和定量限考察图；

图5是根据本发明实施例的测量样品稀释200倍后所测得的质谱图和定量结果；以及

图6是根据本发明实施例的测量样品稀释1000倍后所测得的质谱图和定量结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，这些实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是，除非明确指出，在下面实施例中未详细描述的材料和方法均为本领域中常规使用的。

在以下实施例中所使用的唾液酸酶为New England Biolab inc公司的α2-3,6,8唾液酸酶(货号为P0720S)；唾液酸标准品(A187000，批号：4-SCC-101-1)购自TRC(加拿大)；待测蛋白质为申请人自制的重组融合蛋白；所使用的超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)***为Waters公司的UPLC-MS Xevo TQ-S***；分离所用分析柱为Waters公司的ACQUITY UPLCBEH C18 1.7微米，2.1*50mm分离柱；数据处理***为MassLynx V4.1。

实施例1测定蛋白质的唾液酸含量的方法及相应条件筛选

1)准备样品

唾液酸酶消化水解过程中，水解时间对水解效率起决定性因素(唾液酸酶过量时)。发明人共比较了3种不同的水解时间，分别是37℃1h(01号样品)，37℃4h(02号样品)和37℃过夜水解(12h)(03号样品)。为了便于进行后续蛋白质的沉淀过程，水解体积调整到25微升。同时，发明人平行进行了仅含蛋白质样品，不添加唾液酸酶的对照(04号样品)和不含蛋白质样品的唾液酸酶对照(05号样品)。具体样品处理方案如表1所示。

表1

样品	01	02	03	04	05
						0.25毫克/毫升VEGF-Trap(微升)	16	16	16	16	0
唾液酸酶(微升)	1(50U)	1(50U)	1(50U)	0	1(50U)
						10*反应缓冲液(微升)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
去离子水(微升)	5.5	5.5	5.5	6.5	21.5
						孵育时间(小时)	1	4	过夜	过夜	过夜

唾液酸酶水解后，待测蛋白质上结合的唾液酸以游离的形式存在于溶液之中。为避免对后续质谱分析的干扰，发明人将蛋白质和不挥发性盐通过有机试剂沉淀去除。具体操作如下所述：向水解体系中加入3倍体积的冰预冷乙腈，涡旋振荡1min混匀，并放置在-20℃1h，提高蛋白质沉淀效率和除盐效率。沉淀1h后，样品放入冷冻离心机，在4℃的条件下，以10000×g的速度离心10min。离心结束后，小心吸取上清，放置在4℃作为后续UPLC-MS定量检测的样品。收集蛋白质沉淀后，将其重溶于SDS-PAGE上样缓冲液，进行SDS-PAGE检测，进而初步判定唾液酸酶水解是否完全，具体SDS-PAGE检测结果如图1所示，图1结果显示，所有加入唾液酸酶水解的蛋白质样品的分子量，相对于未添加唾液酸酶的蛋白质样品，均有明显的分子量变小的现象，表明在上述水解条件下，待测蛋白质样品均能被唾液酸酶高效地水解，进而初步判定上清可以用于下一步精确的对唾液酸的UPLC-MS定量分析。

更进一步地，唾液酸水解步骤中，由于酶解缓冲液中含有不挥发性盐(氯化钙和醋酸钠)，为避免直接进样上清会给仪器造成危害，发明人在水解阶段使用了较多的蛋白样品，从而提供足够多的游离总唾液酸；在蛋白质沉淀之后，进一步进行倍比稀释，进而减少进入质谱检测仪的不挥发性盐。在本实施例中，蛋白沉淀后的上清样品(01、02、03、04、05号样品)，经MilliQ水(超纯水)分别稀释到10倍，100倍，200倍和1000倍。由于在蛋白质沉淀过程中已经除去大部分的不挥发性盐，倍比稀释后的样品盐浓度已经能够被质谱耐受。

2)通过超高效液相色谱-质谱法对上清进行分析，确定上清中唾液酸的含量

游离总唾液酸样品用MilliQ水经适当倍比稀释后，置于1.5ml的UPLC上样瓶中，经Waters UPLC-MS Xevo TQ-S***中ACQUITY UPLC BEH C18 1.7微米，2.1*50mm分离，柱温控制在30℃，样品室温度控制为10℃，进样量1微升。由于唾液酸并不和C18的分析柱相结合，唾液酸在该柱上保留时间极短(<1min)，基于此，发明人调整色谱条件如下：流动相：A相：0.1％氨水/水溶液，B相：乙腈，洗脱程序为：0～2min，90％A；2～4min，20％A；4～6min,90％A。1min后，流路切换到废液，尽可能减少带入质谱的杂质和不挥发性盐成份。

更进一步地，发明人采用MilliQ超纯水溶解唾液酸标准品(A187000，批号：4-SCC-101-1)，配成浓度为1mg/mL的储备液，并经稀释得到浓度为0.1微克/mL的对照品溶液用以探索质谱条件。

在MassLynx V4.1操作界面下，选择Mass tune子菜单，设置电离模式为ESI(-)。首先在MS mode模式下进行母离子扫描，通过调整毛细管电压，锥孔电压等参数的调整扫描得到强度值为10^6-7的母离子m/z＝308.07。然后在MS mode下进行子离子扫描，通过设置碰撞能量，扫描得到强度值为10^6-7的子离子m/z＝87.02。进而保存上述参数文件，在子菜单MassConsole中进行自动调谐，进一步确认以此优化上述质谱条件。最终得到的质谱条件如下所示：母离子308.07，子离子87.02，锥孔电压12V，碰撞能量18eV，毛细管电压2.5kV，脱溶剂温度450℃，离子源温度150℃，所得典型唾液酸质谱图如图2所示。

实施例2建立定量曲线

对待测蛋白质样品进行质谱定量分析前，用唾液酸国际标准品建立定量曲线。唾液酸标准品：货号A187000，批号：4-SCC-101-1，分子量309.27，购自TRC(加拿大)。唾液酸标准品用MilliQ超纯水溶解配成1mg/ml的储备液之后，冻存于-80℃。将1毫克/毫升唾液酸标准品溶液用超纯水系列稀释至0.1毫克/毫升，0.01毫克/毫升，1微克/毫升，0.1微克/毫升，0.08微克/毫升，0.04微克/毫升，0.02微克/毫升，0.01微克/毫升，0.005微克/毫升，空白零点为超纯水。

建立的定量曲线如图3所示，图3结果表明：该方法专属性好，空白无干扰(如用以检测样品04，05号)；唾液酸在浓度为0.004935-0.0987微克/毫升范围内线性关系良好，线性方程为y＝40002.4613x-24.5366，R²＝0.9991(其中，x表示进样样品中唾液酸的浓度，y表示唾液酸对应的峰面积,R²表示拟合度)，满足唾液酸准确定量分析的要求；采用该方法测定唾液酸，测定完浓度为0.0987微克/毫升的对照品溶液后，空白样品中唾液酸未检出，表明采用该方法检测时，样品无残留。

实施例3检出限和定量限的测定

由图4结果可以看出，浓度为0.04微克/毫升的标准品溶液测得的信噪比(S/N)为104.6991(进样量为1微升)，由此得出该方法的检出限(LOD＝S/N＝3)约为1.0pg；定量限(LQD＝S/N＝10)约为3.5pg。因而，该方法满足蛋白质生物大分子药物总唾液酸的定量检测要求。

实施例4样品检测

样品(01，02，03，04，05号)经MilliQ水分别稀释到10倍，100倍，200倍和1000倍，其中200倍和1000倍稀释样品经实施例1所述的方法进行定量检测。稀释200倍样品的定量检测谱图和结果如图5所示，稀释1000倍样品的定量检测谱图和结果如图6所示。图5和图6结果显示，样品04、05无信号，方法的专属性良好，01、02、03号样品稀释200倍的峰面积均在实施例2得出的线性范围内，可用于样品唾液酸含量的测定，进而可根据公式

(其中，Y表示待测蛋白质的唾液酸含量,X表示与唾液酸对应的峰面积，N表示上清液的稀释倍数，M表示上清液的体积，A表示待测蛋白质样品的总重量)确定待测蛋白质中唾液酸的含量。稀释1000倍的样品中唾液酸的峰面积较小，浓度在0.0022～0.0087微克/毫升之间。因此本发明实施例样品的最终稀释倍数确定为200倍。

另外，对不同唾液酸酶水解条件下所得样品的定量检测结果发现，水解4小时的样品(02样品)，蛋白质样品结合的唾液酸释放最为完全，上清中唾液酸定量达7.2微克/毫升，相对应的水解1小时样品(01样品)和水解过夜样品(03样品)上清中定量测得的唾液酸含量分别为1.8微克/毫升和3.0微克/毫升，因此本发明实施例的待测蛋白质样品，应选取4小时水解作为唾液酸酶水解时间。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种测定蛋白质的唾液酸含量的方法，其特征在于，包括：

(1)利用唾液酸酶对蛋白质样品在37℃下进行1～12h消化处理，以便获得含有唾液酸的消化液；

(2)所述消化液与乙腈在-20℃的条件下进行接触并对所述消化液进行沉淀处理，并通过离心分离含有所述唾液酸的上清液，其中，所述乙腈预先在-20℃的条件下预冷1h，所述消化液与所述乙腈的体积比是1:3；

(3)通过超高效液相色谱-质谱法对所述上清液进行分析，以便获得质谱图；以及

(4)基于所述质谱图，确定所述蛋白质的唾液酸含量；

其中，所述超高效液相色谱采用下列条件：

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，所述色谱柱的粒径是1.7微米，大小是2.1*50mm，

柱温为30℃，

样品室温度为10℃，

进样量1微升，

流动相的A相为0.1％氨水/水溶液，

流动相的B相为乙腈，

洗脱程序是0～2min，90％A；2～4min，20％A；4～6min,90％A；

所述质谱采用下列条件：

负离子扫描模式，

离子源温度为150℃，

毛细管电压为2.5kV，

锥孔电压为12V，

脱溶剂温度为450℃，

碰撞能量为18eV，

离子采集方式为多反应检测模式，

采集离子为母离子308.7，子离子87.02。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于4微克的所述蛋白质样品，所述唾液酸酶的用量是50U。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化处理是在37℃下进行4h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀处理在-20℃的条件下进行1h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心是在10000×g,4℃的条件下进行10min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之前，预先利用超纯水对所述上清液进行稀释处理。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述稀释处理是将所述上清液稀释至所述唾液酸的含量在0.004935～0.0987微克/毫升范围内。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，基于下列公式确定所述蛋白质的唾液酸含量：

其中，Y表示所述蛋白质的唾液酸含量,X表示与唾液酸对应的峰面积，N表示上清液的稀释倍数，M表示上清液的体积，A表示蛋白质样品的总重量。

9.一种测定蛋白质的唾液酸含量的方法，其特征在于，包括：

1)准备样品

取4微克待测蛋白质样品，加入50U的唾液酸酶，加入酶切缓冲液和超纯水，配成25微升的反应体系，在37℃孵育4h，将结合在待测蛋白质样品上的唾液酸水解下来，形成的游离总唾液酸存在于溶液中；

向唾液酸酶水解后反应体系中加入75微升的预冷乙腈，所述乙腈在-20℃预冷1h，涡旋振荡1min后，静置于-20℃下1h，随后在10000×g，4℃的条件下离心10min，弃沉淀，游离总唾液酸存在于上清中，并放置于-20℃供随后的检测；

2)通过超高效液相色谱-质谱法对上清进行分析，确定所述上清中唾液酸的含量

含有游离总唾液酸的上清用超纯水经倍比稀释后，置于1.5ml的超高效液相色谱的上样瓶中，经Waters UPLC-MS Xevo TQ-S***中ACQUITY UPLC BEH C18 1.7微米，2.1*50mm分离，柱温控制在30℃，样品室温度控制为10℃，进样量1微升，流动相的A相为0.1％氨水/水溶液，流动相的B相为乙腈，洗脱程序：0～2min，90％A；2～4min，20％A；4～6min,90％A，1min后，流路切换到废液；

质谱设置为负离子扫描模式，离子源温度150℃，毛细管电压2.5kV，锥孔电压12V，脱溶剂温度450℃，碰撞能量18eV，离子采集方式采用多反应检测模式，采集离子是母离子308.7，子离子87.02，采集质谱数据由软件MassLynx V4.1分析；

在稀释后的上清中，唾液酸的浓度在0.004935～0.0987微克/毫升范围内，所述蛋白质的唾液酸含量是基于下列方程确定的：

其中，Y表示所述蛋白质的唾液酸含量,X表示与唾液酸对应的峰面积，N表示上清液的稀释倍数，M表示上清液的体积，A表示蛋白质样品的总重量。

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