CN103149312B - 一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴儿乳粉中唾液酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴幼儿乳粉中唾液酸的方法。本发明在原有高效液相色谱法检测乳粉中唾液酸的基础上，结合超高效液相色谱(UPLC)技术，对样品中三种形式唾液酸进行提取，从而建立了灵敏度更高、更快速的超高效液相色谱串联质谱检测婴幼儿配方乳中唾液酸的方法。采用本发明的方法唾液酸的平均回收率在84.3%～98.9%之间，相对标准偏差为4.9%～8.2%；唾液酸的最低检测限为0.01μg/mL。该方法简单而方便操作，采用了较好的分离方式，基质效应较小，前处理采用了水解后高速离心的过程，简便宜于操作，有效避免了复杂样品前处理过程中唾液酸的损失，提高了回收率。

Description

一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴儿乳粉中唾液酸的方法

技术领域

本发明涉及一种分析婴儿乳粉中唾液酸的方法，特别涉及一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴儿乳粉中唾液酸的方法，属于食品检测领域。

背景技术

唾液酸，是指一系列含九个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的统称，其***命名为5-氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。它在人乳和婴儿配方乳中，分别以游离、低聚糖结合和蛋白结合形式存在，人乳低聚糖结合唾液酸约占73%，婴儿配方乳蛋白结合唾液酸约占70%，主要是N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)，所以常把N-乙酰神经氨酸称为唾液酸，牛乳和婴儿配方乳中唾液酸含量都很低。最新报道证明唾液酸也是一种天然的大脑营养素，能促进婴幼儿的记忆力和智力发育，以其在母乳中的高含量而受到广泛的关注，但在牛奶和婴儿配方乳粉中的含量却很低。这也预示着在婴幼儿配方乳粉中，特别是针对早产儿的婴幼儿配方乳粉中添加唾液酸可以有效地促进他们的神经***和大脑的发育，同时进一步提高其在生长早期的智力发育水平。

用于唾液酸分析的方法很多，酶反应、抗体、凝集素以及病毒已经用于确定总唾液酸含量或检测特定类型的唾液酸；苔黑酚、间苯二酚、定期/硫代巴比妥酸比色法，分光光度法多年来也已广泛应用于唾液酸的检测。这些方法的共同局限是他们无法区分唾液酸的类型并且要求样品净化。而比色法和色谱光度测量法等传统方法则是用离子交换柱纯化酸水解样品后的唾液酸，这种方法样品中唾液酸损失较大，影响检测的准确性。食品中唾液酸的检测方法，文献报道有高效液相色谱法(HPLC)，但其前处理繁琐，需要求对唾液酸进行衍生化后在测定，增加了实验的复杂性，并且灵敏度和准确度还不是很理想。

由于唾液酸在国内食品中应用的比较少，且乳中自身存在的基质，如蛋白质，维生素，钙，钾，镁等矿物质会对分析结果造成影响，因此关于对其检测的相关技术还不是很成熟。因此，研究一种高效快速的检测婴幼儿配方乳粉中唾液酸含量的方法，针对较低含量样品做进一步的优化处理，在其配方乳粉中提高唾液酸的含量，使其更接近母乳，从而更好的促进婴幼儿大脑的健康发育，满足婴幼儿成长的生理营养需要成为一种迫切的需要。目前，国内市场已有婴儿配方乳添加唾液酸，使其更接近人乳成分。随着添加唾液酸食品的增加，食品质量监督部门与生产企业质量控制需要也不断增多，势必要求更加准确和快速的检测方法。随着色谱柱填料技术的发展，基于1.7μm小颗粒技术的超高效液相色谱(UPLC)比传统的HPLC具有更高的分离能力，质谱联用能够进行分子量的精确测定。

栗晖等利用液相色谱-质谱法（栗晖、金一宝、刘红霞、于治国等，分析测试学报，2008,11(27):193-194）对奶粉中唾液酸含量进行了测定，以氢氧化四丁基铵水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱，三重四极杆质谱采用负离子模式，检出限为0.06mg/L，相对标准偏差小于10％。所应用的色谱及质谱条件如下：色谱柱:XBridgeC₁₈(3.5μm,2.1mm×100mm)(Waters,Massachusetts,USA);流动相:4mmol/L氢氧化四丁基铵水溶液-甲醇梯度洗脱;流速:0.2mL/min;进样量10μL;三重四极杆质谱采用负离子模式,离子源温度为110°C,离子源电离电压为3kV,雾化气流速为800L/h^-1,离子采集方式采用多反应监测模式(MRM),采集离子308.1>87.1,保留时间为6.1min。

该方法利用液相色谱串联三重四级杆质谱的方法，采用多反应负离子监测模式，流动相选择氢氧化四丁基铵水溶液-甲醇溶液进行梯度洗脱，对奶粉中的唾液酸实现了良好的分离，保留时间为6.1min，唾液酸的最低检出限为0.06mg/L，相对标准偏差小于10％。但在质谱分离，应用电喷雾离子源对母离子全扫描时，我们发现，负离子多反应监测模式下母离子的丰度值并不是很高，为此结合唾液酸的化学结构式我们大胆假设，完全可以应用正离子多反应监测模式对唾液酸标准品的母离子进行全扫描，找到在负源和正源条件下丰度值更高的可靠质谱条件，为提高检测方法的灵敏度和准确度奠定基础；其次在结合色谱柱选择流动相时，我们认为流动相应该使唾液酸在色谱柱上得到很好的分离，在保留时间方面得到最佳的响应，因此在研究流动相梯度洗脱时要弃繁从简，优中选优确定流动相及其配比，进而提高本方法的灵敏度和检出限，为建立行业标准做基础。

冯君等采用高效液相色谱法对乳中唾液酸的含量进行了测定（冯君，李宏基，韩立强，李卫华，李平，杨国宇，现代食品科技，2007，12：23），利用酸水解法把乳中的唾液酸释放出来，以邻苯二氨盐酸盐（10mg/mL）为衍生化试剂，在80℃水浴锅中衍生40min，采用Symmetry C₁₈柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相为1.0%的四氢呋喃水溶液(含0.2%磷酸)-乙腈(92:8)；流速为1.0mL/min，柱温为35℃；紫外检测波长230nm。结果表明，唾液酸在10~320μg/mL范围内线性良好，N-乙酰神经氨酸的最低检测限为0.25μg/mL，平均回收率为95.7%。

该方法利用常规的高效液相色谱法，因为大多数的糖类化合物没有发色基团，唾液酸也不例外，所以HPLC的分析需要对唾液酸进行衍生后分离测定，增加了实验的复杂性和可能的干扰因素。衍生化试剂从经济角度考虑相对昂贵，衍生化过程相对比较麻烦，繁琐；同时高效液相色谱检测的灵敏度和准确度有限，故研究方法应想办法预防前处理的繁琐，降低实验的复杂性和可能的干扰因素，进一步确定最优化最简单的前处理条件，采用合理的分离和检测技术，进而完善婴幼儿乳粉中唾液酸的检测技术和标准。该方法虽然可准确测定乳中唾液酸含量，但灵敏度和准确性还有待进一步提高。

发明内容

针对目前现有技术中存在的问题，本发明在原有高效液相色谱法检测乳粉中唾液酸的基础上，基于1.7μm小颗粒的超高效液相色谱(UPLC)技术，对样品中三种形式唾液酸进行提取，从而建立了灵敏度更高、更快速的超高效液相色谱串联质谱检测婴幼儿配方乳中唾液酸的方法，实际检测样品效果明显。

为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为：

本发明的一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴幼儿乳粉中唾液酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）绘制标准曲线；

（2）样品的前处理：对样品中三种形式唾液酸进行提取，所述的三种形式唾液酸分别为游离唾液酸、低聚糖结合唾液酸以及蛋白结合唾液酸；

提取得到的三种形式唾液酸溶液分别采用HLB聚合物填料的固相萃取柱净化，采用超纯水作为淋洗液，氨水-甲醇混合溶液作为洗脱液；

（3）将步骤（2）得到的净化后的提取物溶液混合后，调节pH值至2.5~3，用乙腈定容，0.22μm有机滤膜过滤，用UPLC-ESI-MS/MS进行测定；

（4）质谱分析条件的选择及参数：

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测***；毛细管电压：3.0KV；锥孔电压：45V；源温度：150℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：650L/hr；锥孔反吹气流量：50L/hr；碰撞气流量：0.24mL/min；光电倍增器电压：650V；

（5）色谱分离条件：

色谱柱及梯度洗脱：规格为50mm×2.1mm,1.7μm的Waters ACQUITYUltra BEH HILIC超高效液相色谱柱；柱温：30℃；样品室温度：30℃；进样量：5μL；流速：0.25mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸（v/v）水溶液。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的三种形式唾液酸是按照以下方法提取：

游离和低聚糖结合唾液酸的提取：精密称取一定量的婴幼儿乳粉，加入三氯乙酸溶液至完全溶解，达到沉淀蛋白的目的，取上清液，在4℃、15000r/min条件下，离心10min，备用；

蛋白结合唾液酸的提取：在“游离和低聚糖结合唾液酸的提取”处理后的沉淀中加入盐酸溶液，放入80℃水浴锅中1h，取出后冷却，在4℃、15000r/min条件下，离心10min，备用。

其中，优选的，所述的三氯乙酸溶液的浓度为20%（v/v），所述的三氯乙酸溶液（ml）与婴幼儿乳粉（g）的体积质量比为1:6-10；所述的盐酸溶液的浓度为0.1%（v/v），所述的盐酸溶液（ml）与婴幼儿乳粉（g）的体积质量比为1:2-5。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的HLB聚合物填料的固相萃取柱为Oasis HLB固相萃取小柱中，氨水-甲醇混合液中氨水与甲醇的体积比为25:75。

在本发明中，优选的，步骤（3）中用乙腈定容至原提取物混合溶液体积的2-5倍。

在本发明中，优选的，步骤（4）中所述的脱溶剂气为氮气，所述的碰撞气为氩气。

在本发明中，优选的，步骤（5）中所述的梯度洗脱的洗脱程序为：起始洗脱液中流动相A的体积百分比为90%，流动相B的体积百分比为10%，并维持至0.2min；0.2~0.4min，A由90%降至12%，B由10%升为88%，并维持至1.8min；1.8~2.2min，A由12%升为90%，B由88%降至10%。

实验证明，使用本发明方法测定的标准添加平均回收率为84.3%～98.9%，唾液酸的最低检出限是0.01μg/mL，可知本发明建立的方法具有更高的回收率和灵敏度。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1、建立了更加快速，灵敏度和准确度更高的超高效液相色谱串联质谱法检测婴幼儿乳粉中的唾液酸的方法；

2、采用多反应监测模式，负离子扫描方式，确定质谱条件，进而提高方法的准确性；

3、在色谱分离时，通过对色谱柱的分析选取，确定采用BEH HILIC(50mm×2.1mm,1.7μm)色谱柱，选取0.1%的甲酸水溶液和乙腈作为流动相，采用梯度洗脱方式，确保唾液酸的色谱柱上的成功保留，为进一步分析其含量奠定基础。

本产品主要技术性能指标：

1、唾液酸在0.05～5.0μg/mL范围内与唾液酸峰面积的线性关系良好；

2、唾液酸的平均回收率在84.3%～98.9%之间，相对标准偏差为4.9%～8.2%；

3、唾液酸的最低检测限为0.01μg/mL。

附图说明

图1为典型1.0μg/mL唾液酸标准品的MRM色谱图；

图2为空白奶粉样品的MRM色谱图；

图3为加标奶粉样品的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1婴幼儿乳粉中唾液酸含量的测定

方法：

1、标准曲线的绘制

准确移取适量唾液酸标准品储备液，依次稀释得到浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和5.0μg/mL的标准品溶液。根据唾液酸的定量离子测定的峰面积(Y)与唾液酸的质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，唾液酸的线性回归方程为：

Y=8514.5X－811.09，R²=0.9989

其中Y为测定的色谱峰峰面积，X为唾液酸的质量浓度(μg/mL)，得知此标准曲线的线性关系良好。

2、样品的前处理

取3份不同品牌的婴幼儿配方乳粉样品A1、B2、C3各1.0g，分别按照以下方法进行三种形式唾液酸的提取，每个样品3次平行分析，上机进行测定实验，以基质匹配曲线进行定量。

2.1游离和低聚糖结合唾液酸的提取

精密称取1.0g婴幼儿配方乳粉，加入8mL、20%的三氯乙酸溶液至完全溶解，达到沉淀蛋白的目的，取上清液装入4个2mL的离心管中，在4℃、15000r/min条件下，离心10min，合并上清液备用。

2.2蛋白结合唾液酸的提取

在“游离和低聚糖结合唾液酸的提取”处理后的沉淀中加入2mL、0.1%（v/v）的盐酸溶液，放入80℃水浴锅中1h，取出后冷却，在4℃、15000r/min条件下，离心10min。

2.3样品上清液的净化

将离心得到的样品溶液加载到Oasis HLB固相萃取小柱（北京振翔公司，3mL/60mg）中，实验采用超纯水作为淋洗液，氨水-甲醇（体积比25:75）溶液作为洗脱液，其中4mL淋洗液和3mL洗脱液即可满足净化要求。

2.4最后把净化后的两部分提取物溶液混合后，调节pH值至2.5~3左右，用乙腈定容至20mL容量瓶中，用0.22μm有机滤膜过滤，用UPLC-ESI-MS/MS进行测定。

3、质谱分析条件的选择及参数

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子(ESI+)扫描；检测方式：多反应监测***(MRM)；毛细管电压：3.0KV；锥孔电压：45V；源温度：150℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气(氮气)流量：650L/hr；锥孔反吹气流量：50L/hr；碰撞气(氩气)流量：0.24mL/min；光电倍增器电压：650V；

4、超高效液相色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY Ultra BEH HILIC超高效液相色谱柱（美国Waters公司）(50mm×2.1mm,1.7μm)；柱温：30℃；样品室温度：30℃；进样量：5μL；流速：0.25mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：起始比例A为90%，B为10%，并维持至0.2min；0.2~0.4min，A由90%降至12%，B由10%升为88%，并维持至1.8min；1.8~2.2min，A由12%升为90%，B由88%降至10%。

结果：

实际样品的确证分析：

取3份不同品牌的婴幼儿配方乳粉样品A1、B2、C3各1.0g，按照建立的方法处理后，每个样品3次平行分析，上机进行测定实验，以基质匹配曲线进行定量，得到3份不同样品的唾液酸的含量分别为107.7μg/g、72.9μg/g和55.8μg/g。与现行的方法（黄华军，奚星林等奶粉中唾液酸的测定方法.分析测试学报,2006,25(4):129～131；陈海娇，王萍等高效液相色谱法测定母乳中唾液酸含量.食品科学,2011,32(16):1002～1008）测定结果作比较，得知验证该方法的样品含量在合理的范围内。

试验例1质谱分析条件的选择及参数的优化

取唾液酸的标准溶液(质量浓度为0.5μg/mL)在ESI负源与正源条件下对母离子进行全扫描。得到不同离子源下唾液酸的母离子棒状图。实验结果表明：唾液酸在ESI正源条件下母离子棒状图的丰度远比负源的高，因此们选用了ESI正源来做电离源。

在正源模式下对唾液酸的标准溶液(质量浓度为0.5μg/mL)进行母离子全扫描，确定各种唾液酸的准分子离子并分别优化锥孔电压(cone voltage，CV)，确定最终的锥孔电压为45V；然后以其准分子离子为母离子，母离子为310.1，对其子离子进行全扫描，选择碎片离子中丰度较高的两个离子作为定性、定量特征离子，子离子为274.1和292.1，其中274.1为定量离子。唾液酸定性和定量离子流色谱图见图1。

最后以正离子多反应监测模式优化各种质谱调谐参数，最大程度的提高了检测灵敏度，结果见表1。

表1唾液酸的色谱-质谱参数

*：特征子离子

最终确定的质谱分析条件及参数：

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测***；毛细管电压：3.0KV；锥孔电压：45V；源温度：150℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：650L/hr；锥孔反吹气流量：50L/hr；碰撞气流量：0.24mL/min；光电倍增器电压：650V。

试验例2色谱分离条件的优化

色谱柱的选择：

结合唾液酸的理化性质及唾液酸在色谱柱的分配特性，分别选用基于1.7μm小颗粒技术的Waters ACQUITY Ultra BEH HILIC（2.1×50mm和2.1×100mm）、BEH C₁₈和苯基柱四种色谱柱对唾液酸进行分离，得知唾液酸的保留时间有较大的差异。采用BEH C₁₈和苯基柱进行分离，优化后唾液酸的保留时间分别为0.51min和0.60min，保留时间太短，标准品和样品检测时，信号强度差别较大，样品灵敏度均低，不适于样品检测。采用BEH HILIC（2.1×100mm），优化后唾液酸的保留时间为2.15min，保留时间较合理，但峰型拖尾，色谱行为不理想，灵敏度较低。最后选用BEH HILIC（2.1×50mm，1.7μm）进行测定分析，发现此柱对唾液酸具有良好的分离效果和较高的灵敏度，保留时间1.22min为最佳值，说明此柱比传统的色谱柱更具有较好的分离能力，响应值和灵敏度均能达到实验的要求，空白样品和加标样品图见图2和图3所示。

流动相的选择：

唾液酸是一种碳水化合物，通常以游离态或在糖蛋白或糖脂的末端以糖苷的形式存在，属于糖类。实验中分别用10%5mM甲酸氨溶液、水、0.1%甲酸溶液加90%乙腈进行实验，用1.0μg/mL的标准品在不同流动相条件下进样，结果表明0.1%甲酸溶液作流动相时，信号最强，色谱行为较好，保留时间理想。而乙腈因其有优良的溶剂性能，极性较大，可以溶解多数样品，与水和醇无限互溶，并且可以改善色谱峰的峰型。因此，流动相选择0.1%甲酸水溶液和乙腈。在等度洗脱与梯度洗脱方面进行了对比，发现等度洗脱时，色谱峰峰型拖尾，不理想。最终确定选取0.1%（v/v）甲酸水溶液和乙腈作为流动相，采用梯度洗脱的方式从而实现唾液酸的良好分离，显著提高了唾液酸在色谱柱中的分配，并具有较高的离子化效率，增强检测的灵敏度。唾液酸梯度洗脱分离程序如表2所示。

表2UPLC/MS/MS唾液酸梯度洗脱分离程序

起始比例A为90%，B为10%，并维持至0.2min；0.2~0.4min，A由90%降至12%，B由10%升为88%，并维持至1.8min；1.8~2.2min，A由12%升为90%，B由88%降至10%。

试验例3前处理条件的优化

提取条件的优化：

从不同原料中分离提取唾液酸的方法各有不同，唾液酸释放后，多数采用离子交换层析和凝胶过滤层析分离和利用HPLC纯化等步骤。由于本实验选用分离效果较好的色谱柱，前处理采用了水解后高速离心的过程，方法简便、有效。水解程序中关注的焦点是碳水化合物受到最小的破坏和唾液酸的最大释放，研究表明，80℃条件下用0.1%（v/v）的盐酸水解1h，能够使所有的唾液酸链断裂并使这些残基脱酰脱羧化，保证唾液酸的完全水解。

净化条件的优化：

由于乳粉中的成分比较复杂，离心后的上清液需进行固相萃取以除去样液中的杂质。目前乳粉类的样品常用的固相萃取方法主要采用反相和离子交换SPE柱，还有HLB固相萃取柱。研究表明，采用HLB聚合物填料的固相萃取柱净化，可以使样品达到良好的净化效果，且方法简单、重现性好。将样品溶液加载到Oasis HLB固相萃取小柱中，实验采用超纯水作为淋洗液，氨水-甲醇（体积比25:75）溶液作为洗脱液，其中4mL淋洗液和3mL洗脱液即可满足净化要求。

试验例4方法学验证

线性关系考察：

选取不含待测组分的空白奶粉样品，经前处理方法处理制备空白基质液，准确移取适量唾液酸标准品储备液，添加到空白基质液中，配浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0和5.0μg/mL的基质标准溶液。上机测定，记录峰面积。根据唾液酸的定量离子测定的峰面积(Y)与唾液酸的质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，经Masslynx v4.1数据处理软件分析处理，唾液酸的线性回归方程为：

Y=8114.5X－811.09，R²=0.9989

其中Y为测定的色谱峰峰面积，X为唾液酸的质量浓度(μg/mL)。

回收率、精密度和检出限：

称取1.0g的未知唾液酸浓度的婴儿乳粉样品，按照实施例1的方法处理后进行测定，另称1.0g样品在前处理基础上，取约7mL的上清液，并加入浓度为5.0μg/mL的标准品溶液，用乙腈定容在10mL的容量瓶中，上机测定，质谱分析条件的选择及参数、超高效液相色谱条件按照实施例1所述进行设定，得到未知样品中唾液酸的浓度。依次在原含量样品的基础上分别添加0.1、0.5、2.5和5.0μg/mL的唾液酸标样，检测后扣除空白，测定方法的回收率，数据如表3所示。

表3唾液酸的添加回收率、精密度和检出限(LOD)(n=3)

本方法在测定标准添加平均回收率为84.3%～98.9%，具有良好的回收率；本方法的线性范围下限为0.05μg/mL，其信噪比(S/N)大于10，故确定定量限为0.05μg/mL；以3倍S/N计算方法的检出限，得知唾液酸的最低检出限是0.01μg/mL，可知建立的方法具有更高的灵敏度。

Claims (6)

1.一种利用超高效液相色谱串联四级杆质谱分析婴幼儿乳粉中唾液酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)绘制标准曲线；

(2)样品的前处理：对样品中三种形式唾液酸进行提取，所述的三种形式唾液酸分别为游离唾液酸、低聚糖结合唾液酸以及蛋白结合唾液酸；

提取得到的三种形式唾液酸溶液分别采用HLB聚合物填料的固相萃取柱净化，采用超纯水作为淋洗液，氨水-甲醇混合溶液作为洗脱液；

(3)将步骤(2)得到的净化后的提取物溶液混合后，调节pH值至2.5～3，用乙腈定容，0.22μm有机滤膜过滤，用UPLC-ESI-MS/MS进行测定；

(4)质谱分析条件的选择及参数：

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测***；毛细管电压：3.0KV；锥孔电压：45V；源温度：150℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：650L/hr；锥孔反吹气流量：50L/hr；碰撞气流量：0.24mL/min；光电倍增器电压：650V；

(5)色谱分离条件：

色谱柱及梯度洗脱：规格为50mm×2.1mm,1.7μm的Waters ACQUITYUltra BEH HILIC超高效液相色谱柱；柱温：30℃；样品室温度：30℃；进样量：5μL；流速：0.25mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％v/v甲酸水溶液；梯度洗脱的洗脱程序为：起始洗脱液中流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％，并维持至0.2min；0.2～0.4min，A由90％降至12％，B由10％升为88％，并维持至1.8min；1.8～2.2min，A由12％升为90％，B由88％降至10％。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的三种形式唾液酸是按照以下方法提取：

游离和低聚糖结合唾液酸的提取：精密称取一定量的婴幼儿乳粉，加入三氯乙酸溶液至完全溶解，达到沉淀蛋白的目的，取上清液，在4℃、15000r/min条件下，离心10min，备用；

蛋白结合唾液酸的提取：在“游离和低聚糖结合唾液酸的提取”处理后的沉淀中加入盐酸溶液，放入80℃水浴锅中1h，取出后冷却，在4℃、15000r/min条件下，离心10min，备用。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的三氯乙酸溶液的浓度为20％v/v，所述的三氯乙酸溶液与婴幼儿乳粉的体积质量比为1:6-10；所述的盐酸溶液的浓度为0.1％v/v，所述的盐酸溶液与婴幼儿乳粉的体积质量比为1:2-5。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的HLB聚合物填料的固相萃取柱为Oasis HLB固相萃取小柱中，氨水-甲醇混合液中氨水与甲醇的体积比为25:75。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中用乙腈定容至原提取物混合溶液体积的2-5倍。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的脱溶剂气为氮气，所述的碰撞气为氩气。