CN107058371B - 利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法，涉及转伸展蛋白水稻的分子生物学技术领域。本方法是：从水稻中克隆OsEXTL基因cDNA；构建含Ubi启动子的基因载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株，其转基因水稻种子EXTL(oryza sativa EXTL)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：P201701。本发明增加OsEXTL基因在水稻中的表达量，使转基因水稻茎秆抗倒伏能力提高了48％。

Description

利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法
技术领域
本发明涉及转伸展蛋白水稻的分子生物学技术领域，尤其涉及一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法。
背景技术
伸展蛋白(Extensin)是一种细胞壁结构蛋白，一般由一条多肽链组成，并富含羟脯氨酸残基[1](Tierney et al.,1987)。伸展蛋白广泛存在于植物细胞壁中，在整个植物界从单细胞的团藻、低等的苔藓植物，到高等的裸子植物、被子植物中均有表达[2](Merkouropoulos et al.,1999)。其脯氨酸残基可被羟基化,羟脯氨酸及丝氨酸残基可被糖基化，有些种类伸展蛋白还进行分子内和分子间的交联反应。伸展蛋白几乎涉及植物生长发育的各方面，包括花粉的识别与受精[3](Wu et al.,2001)，细胞***与分化，细胞伸长的停止[4](Ito et al.,1998)，衰老与脱落[5](Merkouropoulos et al.,2003)，参与生物与非生物胁迫反应[6](Showalter,1993)等。Wei[7]等(2006)证实在拟南芥中，伸展蛋白基因AtEXT1的过量表达限制了病原菌丁香假单胞菌的入侵。拟南芥AtEXT3，AtEXT18的突变体植株正常生长受到影响[8,9,10,11](Hall et al.,2002；Cannon et al.,2008；Saha etal.,2013；Choudhary et al.,2015)。Roberts[12]等(2006)在拟南芥中超表达AtEXT1，转基因植株茎粗增大，而茎的高度降低。但迄今为止，尚无伸展蛋白对提高植物抗倒伏能力的报道。
参考文献：
1.Tierney M L，Varner J E.Review the extensins.Plant Physiol 1987；84:1-2.
2.Merkouropoulos G，Barnett D C，Shirsat A H.The Arabidopsis extensingene is developmentally regulated，is induced by wounding，methyl jasmonate，abscisic and salicylic acid,and codes for aprotein with unusual motifs.Planta1999；208(2):212-219.
3.Wu H，De G B，Mariani C，et al.Hydroxyproline-rich glycoproteins inplant reproductive tissues:structure，functions and regulation.Cellular andMolecular Life Sciences 2001；58(10):1418-1429.
4.Ito M，Kodama H，Komamine A，et al.Expression of extensingenes isdependent on the stage of the cell cycle and cellproliferation in suspension-cultured Catharanthus roseus cells.PlantMolecular Biology 1998；36(3):343-351.
5.Merkouropoulos G，Shirsat A H.The unusual Arabidopsis extension geneAtEXT1 is expressed throughout plant development and is induced by a varietyof biotic and abiotic stresses.Planta 2003；217(3):356-366.
6.Showalter A M.Structure and function of plant cell wallproteins.Plant Cell 1993；5(1):9-23.
7.Wei,G.,and Shirsat,A.H.Extensin over-expression in Arabidopsislimits pathogen invasiveness.Mol.Plant.pathol.2006；7,579-592.
8.Hall Q,Cannon MC.The cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein RSHis essential for normal embryo development in Arabidopsis.Plant Cell2002；14(5):1161-72.
9.Cannon MC,Terneus K,Hall Q,Tan L,Wang Y,Wegenhart BL,et al.Self-assembly of the plant cell wall requires an extensin scaffold.PNAS 2008；105(6),2226-31.
10.Saha P,Ray T,Tang Y,Dutta I,Evangelous NR,Kieliszewski MJ,etal.Self-rescue of an EXTENSIN mutant reveals alternative gene expressionprograms and candidate proteins for new cell wall assembly inArabidopsis.Plant J,2013；75(1):104-16.
11.Choudhary P,Saha P,RayT,Tang YH,Yang D,Cannon MC.EXTENSIN18 isrequired for full male fertility as well as normal vegetative growth inArabidopsis.Front Plant Sci 2015；6.
12.Roberts K,Shirsat AH.Increased extensin levels in Arabidopsisaffect inflorescence stem thickening and height.J Exp Bot 2006；57:537-45.
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法，即利用转基因技术对水稻进行遗传改良，提高茎秆抗倒伏能力，为提高植物机械支撑力做理论以及技术上的探索。
本发明的目的是这样实现的：
一、利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法(简称方法)
本方法包括下列步骤：
①从水稻中克隆OsEXTL基因cDNA
基因编码区序列如SEQ ID NO：1，cDNA长度为844bp；
②构建含Ubi启动子的基因载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株，其转基因水稻种子EXTL(oryza sativa EXTL)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：P201701；
③将获得的转基因水稻种子EXTL开花后30天进行茎秆抗倒伏能力的测定。
本发明具有下列优点和积极效果：
增加OsEXTL基因在水稻中的表达量，使转基因水稻茎秆抗倒伏能力(开花后30天测定)提高了48％。
附图说明
图1是转OsEXTL基因水稻茎秆的抗倒伏能力的比较图片；
图2是植物表达载体的构建示意图。
转基因水稻种子EXTL(oryza sativa EXTL)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：P201701。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例详细说明：
一、实施例1：OsEXTL基因cDNA的克隆
从水稻中克隆OsEXTL基因的cDNA，如序列1，长度为844bp；PCR产物经过回收，酶切，连接载体。
——合成引物扩增OsEXTL的cDNA(844bp，包含CDS 519bp)
正向引物：CGCGGATCCACGACCATTATTCCTCCTCCTC；
反向引物：CGGGGTACCGCCTGATAGAAAGCGACAACATG。
二、实施例2：表达载体的构建
将OsEXTL的cDNA序列连接T载体后，酶切，转入表达载体pUbi-ZH2，见图2。
三、实施例3：植物表达载体转化农杆菌
1、农杆菌活化
将保存的农杆菌(EHA105)在固体LB培养基上画线(加抗生素：Kan，如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性)，抗生素浓度为：50μg/mL，28℃培养1-2天，然后转移到新的加有抗生素的固体LB培养基上再培养2天；
2、农杆菌感受态细胞的制备
将100μL接种于1mLLB液体培养基中，150rpm 28℃振荡培养过夜；
吸取1mL菌液接种到100mL液体培养基中培养至OD600＝0.5；
将菌液置冰上30min，使培养物冷却到0℃；
4℃，5000rpm离心30s，弃去上清液；
沉淀用60mL 0.1M CaCl2悬浮，冰浴30min；
5000rpm离心30s，弃去上清液；
每管用100μL含15％甘油的20mMCaCl2悬浮，用于转化；
制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200μL分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转-80℃保存，使用时从-80℃取出，置冰上融化后使用。
3、DNA直接转化农杆菌
200μL农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg(5-10μL)，之后冰浴30min；
放入液氮中7-8min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；
取出离心管，冰上放置2min，加入0.8mLLB，28℃，150rpm振荡培养3～4hr；
取出菌液于Kan抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2天左右菌落可见。
4、重组农杆菌鉴定
挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；
小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶(50μg/mL，贮藏浓度为50mg/mL或10mg/mL)；
质粒酶切或PCR鉴定。
四、实施例4：水稻成熟胚愈伤组织的诱导、分化、生根及移栽方法
1、愈伤诱导
将成熟的水稻种子去壳，先用无菌水冲洗3遍，然后用70％的乙醇处理1分钟，不时摇动；
无菌水冲洗3遍，每次30秒，不时摇动；
0.1％升汞溶液消毒12分钟(或2.5％NaClO消毒30min)，不时摇动；
无菌水冲洗5遍以上，每次30秒，不时摇动；
将种子放在灭菌滤纸上吸干水分，然后放在诱导培养基上；
28℃，暗培养4周；
2、愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤(即散落到培养基上的愈伤，不要选从种子上发出来的愈伤)，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度28℃；
3、预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4-14天，温度28℃；
4、愈伤与农杆菌共培养
1)农杆菌培养
在带有对应抗性选择的LB培养基上预培养农杆菌两天，温度28℃；
将农杆菌转移至装有悬浮培养基的带塞试管或离心管里，重悬农杆菌，调节农杆菌的悬浮液至OD600为0.8-1.0；
2)农杆菌侵染
将预培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；
将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
转移愈伤至灭菌好的滤纸上吹干(30min-1h)；
然后放置在已铺有一层滤纸的共培养基上培养3天，温度19-20℃。
5、选择培养
将共培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；
灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
浸泡在含400ppm羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；
转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干(1h以上)；
转移愈伤至选择培养基上选择培养2次，每次2周。(第一次羧苄青霉素筛选浓度为400ppm，第二次为250ppm)；
6、分化培养
将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天(可省略)；
转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃；
7、生根培养
剪掉分化时产生的根(留1-2mm)；
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2周，温度26℃；
8、移栽
待苗高10-12cm，根系发生较好，打开瓶盖，洗掉根上的残留培养基(注意不要伤根)，移栽花盆中。在最初的几天，蒙上保鲜膜，保持水分湿润。
五、实施例5：转基因阳性苗的鉴定
1、基因***鉴定
检测引物：潮霉素通用引物和基因特异性引物；
2、表达鉴定
基因特异引物。
六、实施例6：水稻秸杆抗倒伏的测定
抗倒伏指数测定：用开花后30天水稻材料进行倒四节倒伏指数测定。倒四节倒伏指数计算公式如下：倒伏指数＝(鲜重×株高)/折断力。鲜重：地上部分倒四节基部以上所有重量(包括茎秆、叶片、叶鞘、穗子)；株高：倒四节基部到穗顶端长度；折断力：将待测样品倒四节水平放置在宽带度为5cm的装置中，采用折断力仪(DIK 7401；Daiki,Osaka,Japan)对倒四节进行折断力测定，结果见图1。
<110>华中农业大学
<120>利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法
<140>
<141>
<160>3
<210>1
<211>844
<212>OsEXTL基因的cDNA
<400>
ACGACCATTATTCCTCCTCCTCTCTGGAGTCTAGTCTCCTCTCCTCACTCCTCACTCGCCCCACTCCGCCGCTTCACTCGCGAGCTCGTCGTTGGCGCCGGCGGCAATGGCGTCCCCCCGCGCGCTCTCCCTCCTCCTCGTCCTCCTGGGCATGGCCCTCGCGTCGTTCCCCTCCGCCGCCTCCGCCTCCCGCGACCTCCGCCCCCGCCGCGCGGGCTTCGTCGTCCGCGGCCGCGTCTGGTGCGACACCTGCCTCGCCGGCTTCGAGACCCCCGCCTCCACCTACATCGCCGGAGCGAAGGTAAAGGTTGAGTGCAGATCGAAATCCACTGGCGCCAAGACATGCAGCTTCGAGGGCCAGACTGACCACACTGGCACCTACAACATCCCTGTCAACGATGAGCATGAGCACGAGCTCTGCGAGTCTGTCCTTGTGAGCAGCCCGGACGCAAAGTGTGGCAAGATTGTTGCTGGACGGGAGAGGGCTCCTGTCTTCCTCACCAACAACAATGGTGTGACATCTAATGTTCGGTTGGCGAACGCTCTGGGCTTCCAGAAGGATGCTCCTCTTGCTGCGTGCGCACAAATCCTCAAGATGTACGAGGAAGTGGACGACCGCGTTTGAAGGATGTGAGTTATGTATCAATATTCGTACGTTGTTGAAATACTCTAAGAAGACTTCTATATACCTTTTACTGAGAGCAAAACTATCAGCATCAGATGTTGCGTGCTTGATAAGTTGTGATATAGCTTAGCACTTGAGTATGTTATATGTATGTTCGTCTGCAGCTGAACTGCAAAACTCATCAGTTACTAAATCGACATGTTGTGCTTTCTATCAGGC；
<210>2
<211>31
<212>正向引物
<400>
CGCGGATCCACGACCATTATTCCTCCTCCTC；
<210>3
<211>32
<212>反向引物
<400>
CGGGGTACCGCCTGATAGAAAGCGACAACATG。

Claims (1)

1.一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法，其特征在于：
①从水稻中克隆OsEXTL基因cDNA基因编码区序列如SEQ ID NO：1所示，cDNA长度为844bp；
②构建含Ubi启动子的基因载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株，其转基因水稻种子为水稻EXTL(oryza sativa EXTL)；
③将获得的转基因水稻种子EXTL长出的植株开花后30天进行茎秆抗倒伏能力的测定。
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