CN107058371B - 利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法,涉及转伸展蛋白水稻的分子生物学技术领域。本方法是:从水稻中克隆OsEXTL基因cDNA;构建含Ubi启动子的基因载体,并转化水稻中花11,获得转基因植株,其转基因水稻种子EXTL(oryza sativa EXTL)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:P201701。本发明增加OsEXTL基因在水稻中的表达量,使转基因水稻茎秆抗倒伏能力提高了48%。
Description
技术领域
本发明涉及转伸展蛋白水稻的分子生物学技术领域,尤其涉及一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法。
背景技术
伸展蛋白(Extensin)是一种细胞壁结构蛋白,一般由一条多肽链组成,并富含羟脯氨酸残基[1](Tierney et al.,1987)。伸展蛋白广泛存在于植物细胞壁中,在整个植物界从单细胞的团藻、低等的苔藓植物,到高等的裸子植物、被子植物中均有表达[2](Merkouropoulos et al.,1999)。其脯氨酸残基可被羟基化,羟脯氨酸及丝氨酸残基可被糖基化,有些种类伸展蛋白还进行分子内和分子间的交联反应。伸展蛋白几乎涉及植物生长发育的各方面,包括花粉的识别与受精[3](Wu et al.,2001),细胞***与分化,细胞伸长的停止[4](Ito et al.,1998),衰老与脱落[5](Merkouropoulos et al.,2003),参与生物与非生物胁迫反应[6](Showalter,1993)等。Wei[7]等(2006)证实在拟南芥中,伸展蛋白基因AtEXT1的过量表达限制了病原菌丁香假单胞菌的入侵。拟南芥AtEXT3,AtEXT18的突变体植株正常生长受到影响[8,9,10,11](Hall et al.,2002;Cannon et al.,2008;Saha etal.,2013;Choudhary et al.,2015)。Roberts[12]等(2006)在拟南芥中超表达AtEXT1,转基因植株茎粗增大,而茎的高度降低。但迄今为止,尚无伸展蛋白对提高植物抗倒伏能力的报道。
参考文献:
1.Tierney M L,Varner J E.Review the extensins.Plant Physiol 1987;84:1-2.
2.Merkouropoulos G,Barnett D C,Shirsat A H.The Arabidopsis extensingene is developmentally regulated,is induced by wounding,methyl jasmonate,abscisic and salicylic acid,and codes for aprotein with unusual motifs.Planta1999;208(2):212-219.
3.Wu H,De G B,Mariani C,et al.Hydroxyproline-rich glycoproteins inplant reproductive tissues:structure,functions and regulation.Cellular andMolecular Life Sciences 2001;58(10):1418-1429.
4.Ito M,Kodama H,Komamine A,et al.Expression of extensingenes isdependent on the stage of the cell cycle and cellproliferation in suspension-cultured Catharanthus roseus cells.PlantMolecular Biology 1998;36(3):343-351.
5.Merkouropoulos G,Shirsat A H.The unusual Arabidopsis extension geneAtEXT1 is expressed throughout plant development and is induced by a varietyof biotic and abiotic stresses.Planta 2003;217(3):356-366.
6.Showalter A M.Structure and function of plant cell wallproteins.Plant Cell 1993;5(1):9-23.
7.Wei,G.,and Shirsat,A.H.Extensin over-expression in Arabidopsislimits pathogen invasiveness.Mol.Plant.pathol.2006;7,579-592.
8.Hall Q,Cannon MC.The cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein RSHis essential for normal embryo development in Arabidopsis.Plant Cell2002;14(5):1161-72.
9.Cannon MC,Terneus K,Hall Q,Tan L,Wang Y,Wegenhart BL,et al.Self-assembly of the plant cell wall requires an extensin scaffold.PNAS 2008;105(6),2226-31.
10.Saha P,Ray T,Tang Y,Dutta I,Evangelous NR,Kieliszewski MJ,etal.Self-rescue of an EXTENSIN mutant reveals alternative gene expressionprograms and candidate proteins for new cell wall assembly inArabidopsis.Plant J,2013;75(1):104-16.
11.Choudhary P,Saha P,RayT,Tang YH,Yang D,Cannon MC.EXTENSIN18 isrequired for full male fertility as well as normal vegetative growth inArabidopsis.Front Plant Sci 2015;6.
12.Roberts K,Shirsat AH.Increased extensin levels in Arabidopsisaffect inflorescence stem thickening and height.J Exp Bot 2006;57:537-45.
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足,提供一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法,即利用转基因技术对水稻进行遗传改良,提高茎秆抗倒伏能力,为提高植物机械支撑力做理论以及技术上的探索。
本发明的目的是这样实现的:
一、利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法(简称方法)
本方法包括下列步骤:
①从水稻中克隆OsEXTL基因cDNA
基因编码区序列如SEQ ID NO:1,cDNA长度为844bp;
②构建含Ubi启动子的基因载体,并转化水稻中花11,获得转基因植株,其转基因水稻种子EXTL(oryza sativa EXTL)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉武汉大学邮编:430072),保藏编号为CCTCC NO:P201701;
③将获得的转基因水稻种子EXTL开花后30天进行茎秆抗倒伏能力的测定。
本发明具有下列优点和积极效果:
增加OsEXTL基因在水稻中的表达量,使转基因水稻茎秆抗倒伏能力(开花后30天测定)提高了48%。
附图说明
图1是转OsEXTL基因水稻茎秆的抗倒伏能力的比较图片;
图2是植物表达载体的构建示意图。
转基因水稻种子EXTL(oryza sativa EXTL)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉武汉大学邮编:430072),保藏编号为CCTCC NO:P201701。
具体实施方式:
下面结合附图和实施例详细说明:
一、实施例1:OsEXTL基因cDNA的克隆
从水稻中克隆OsEXTL基因的cDNA,如序列1,长度为844bp;PCR产物经过回收,酶切,连接载体。
——合成引物扩增OsEXTL的cDNA(844bp,包含CDS 519bp)
正向引物:CGCGGATCCACGACCATTATTCCTCCTCCTC;
反向引物:CGGGGTACCGCCTGATAGAAAGCGACAACATG。
二、实施例2:表达载体的构建
将OsEXTL的cDNA序列连接T载体后,酶切,转入表达载体pUbi-ZH2,见图2。
三、实施例3:植物表达载体转化农杆菌
1、农杆菌活化
将保存的农杆菌(EHA105)在固体LB培养基上画线(加抗生素:Kan,如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失,导致农杆菌缺乏侵染性),抗生素浓度为:50μg/mL,28℃培养1-2天,然后转移到新的加有抗生素的固体LB培养基上再培养2天;
2、农杆菌感受态细胞的制备
将100μL接种于1mLLB液体培养基中,150rpm 28℃振荡培养过夜;
吸取1mL菌液接种到100mL液体培养基中培养至OD600=0.5;
将菌液置冰上30min,使培养物冷却到0℃;
4℃,5000rpm离心30s,弃去上清液;
沉淀用60mL 0.1M CaCl2悬浮,冰浴30min;
5000rpm离心30s,弃去上清液;
每管用100μL含15%甘油的20mMCaCl2悬浮,用于转化;
制备好的感受态细胞可马上使用,也可按每管200μL分装于无菌离心管中,于4℃保存48小时内使用,长期贮存时必须在液氮中速冻后转-80℃保存,使用时从-80℃取出,置冰上融化后使用。
3、DNA直接转化农杆菌
200μL农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1~1μg(5-10μL),之后冰浴30min;
放入液氮中7-8min,然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min;
取出离心管,冰上放置2min,加入0.8mLLB,28℃,150rpm振荡培养3~4hr;
取出菌液于Kan抗生素的LB平板上涂板,在培养箱中28℃条件下倒置培养,2天左右菌落可见。
4、重组农杆菌鉴定
挑取单菌落,接种于含相应抗生素的LB液体培养基中,28℃振荡培养过夜;
小量提取质粒DNA,加GTE同时加5μL溶菌酶(50μg/mL,贮藏浓度为50mg/mL或10mg/mL);
质粒酶切或PCR鉴定。
四、实施例4:水稻成熟胚愈伤组织的诱导、分化、生根及移栽方法
1、愈伤诱导
将成熟的水稻种子去壳,先用无菌水冲洗3遍,然后用70%的乙醇处理1分钟,不时摇动;
无菌水冲洗3遍,每次30秒,不时摇动;
0.1%升汞溶液消毒12分钟(或2.5%NaClO消毒30min),不时摇动;
无菌水冲洗5遍以上,每次30秒,不时摇动;
将种子放在灭菌滤纸上吸干水分,然后放在诱导培养基上;
28℃,暗培养4周;
2、愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤(即散落到培养基上的愈伤,不要选从种子上发出来的愈伤),放于继代培养基上黑暗下培养2周,温度28℃;
3、预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤,放于预培养基上黑暗下培养4-14天,温度28℃;
4、愈伤与农杆菌共培养
1)农杆菌培养
在带有对应抗性选择的LB培养基上预培养农杆菌两天,温度28℃;
将农杆菌转移至装有悬浮培养基的带塞试管或离心管里,重悬农杆菌,调节农杆菌的悬浮液至OD600为0.8-1.0;
2)农杆菌侵染
将预培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内;
将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟;
转移愈伤至灭菌好的滤纸上吹干(30min-1h);
然后放置在已铺有一层滤纸的共培养基上培养3天,温度19-20℃。
5、选择培养
将共培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内;
灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌;
浸泡在含400ppm羧苄青霉素的灭菌水中30分钟;
转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干(1h以上);
转移愈伤至选择培养基上选择培养2次,每次2周。(第一次羧苄青霉素筛选浓度为400ppm,第二次为250ppm);
6、分化培养
将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天(可省略);
转移预分化培养的愈伤至分化培养基上,光照下培养,温度26℃;
7、生根培养
剪掉分化时产生的根(留1-2mm);
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2周,温度26℃;
8、移栽
待苗高10-12cm,根系发生较好,打开瓶盖,洗掉根上的残留培养基(注意不要伤根),移栽花盆中。在最初的几天,蒙上保鲜膜,保持水分湿润。
五、实施例5:转基因阳性苗的鉴定
1、基因***鉴定
检测引物:潮霉素通用引物和基因特异性引物;
2、表达鉴定
基因特异引物。
六、实施例6:水稻秸杆抗倒伏的测定
抗倒伏指数测定:用开花后30天水稻材料进行倒四节倒伏指数测定。倒四节倒伏指数计算公式如下:倒伏指数=(鲜重×株高)/折断力。鲜重:地上部分倒四节基部以上所有重量(包括茎秆、叶片、叶鞘、穗子);株高:倒四节基部到穗顶端长度;折断力:将待测样品倒四节水平放置在宽带度为5cm的装置中,采用折断力仪(DIK 7401;Daiki,Osaka,Japan)对倒四节进行折断力测定,结果见图1。
<110>华中农业大学
<120>利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法
<140>
<141>
<160>3
<210>1
<211>844
<212>OsEXTL基因的cDNA
<400>
ACGACCATTATTCCTCCTCCTCTCTGGAGTCTAGTCTCCTCTCCTCACTCCTCACTCGCCCCACTCCGCCGCTTCACTCGCGAGCTCGTCGTTGGCGCCGGCGGCAATGGCGTCCCCCCGCGCGCTCTCCCTCCTCCTCGTCCTCCTGGGCATGGCCCTCGCGTCGTTCCCCTCCGCCGCCTCCGCCTCCCGCGACCTCCGCCCCCGCCGCGCGGGCTTCGTCGTCCGCGGCCGCGTCTGGTGCGACACCTGCCTCGCCGGCTTCGAGACCCCCGCCTCCACCTACATCGCCGGAGCGAAGGTAAAGGTTGAGTGCAGATCGAAATCCACTGGCGCCAAGACATGCAGCTTCGAGGGCCAGACTGACCACACTGGCACCTACAACATCCCTGTCAACGATGAGCATGAGCACGAGCTCTGCGAGTCTGTCCTTGTGAGCAGCCCGGACGCAAAGTGTGGCAAGATTGTTGCTGGACGGGAGAGGGCTCCTGTCTTCCTCACCAACAACAATGGTGTGACATCTAATGTTCGGTTGGCGAACGCTCTGGGCTTCCAGAAGGATGCTCCTCTTGCTGCGTGCGCACAAATCCTCAAGATGTACGAGGAAGTGGACGACCGCGTTTGAAGGATGTGAGTTATGTATCAATATTCGTACGTTGTTGAAATACTCTAAGAAGACTTCTATATACCTTTTACTGAGAGCAAAACTATCAGCATCAGATGTTGCGTGCTTGATAAGTTGTGATATAGCTTAGCACTTGAGTATGTTATATGTATGTTCGTCTGCAGCTGAACTGCAAAACTCATCAGTTACTAAATCGACATGTTGTGCTTTCTATCAGGC;
<210>2
<211>31
<212>正向引物
<400>
CGCGGATCCACGACCATTATTCCTCCTCCTC;
<210>3
<211>32
<212>反向引物
<400>
CGGGGTACCGCCTGATAGAAAGCGACAACATG。
Claims (1)
1.一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法,其特征在于:
①从水稻中克隆OsEXTL基因cDNA基因编码区序列如SEQ ID NO:1所示,cDNA长度为844bp;
②构建含Ubi启动子的基因载体,并转化水稻中花11,获得转基因植株,其转基因水稻种子为水稻EXTL(oryza sativa EXTL);
③将获得的转基因水稻种子EXTL长出的植株开花后30天进行茎秆抗倒伏能力的测定。
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