CN107043725A

CN107043725A - 枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法及其用途

Info

Publication number: CN107043725A
Application number: CN201710276377.3A
Authority: CN
Inventors: 何小建
Original assignee: Xi'an Xinhanbao Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Xi'an Xinhanbao Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-08-15

Abstract

本发明公开了枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法及其用途，在改善传统液体单独发酵培养工艺上，结合固体混合发酵，综合两种菌不同的生理特性，饲喂禽类动物时，不仅增加了其对营养物质的吸收利用，而且提高了其对疾病的抵抗力，具体方法包括：种子活化培养，菌种扩大培养，液体深层发酵，固体好氧发酵，低温环保干燥，粉碎包装。

Description

枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法及其用途

技术领域

本发明涉及机械领域，尤其涉及枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法及其用途。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），它是一种嗜温的好氧型产芽孢杆状细菌(G^十)，芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著；多用于水产，畜禽类的养殖，添加方式多用于制作菌粉，但价格较贵。目前被公认为是一种有发展前景的优良益生菌。枯草芽孢杆菌，它是一类好氧或兼性厌氧的*** , 能在动物肠道内生长繁殖, 分泌产生多种酶类( 如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等) 及营养代谢产物( 如多种氨基酸和维生素类物质等)，并具有抗菌性能好、良好的稳定性及对禽类、水产动物的益生作用和改善水产品质等特点。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），我国农业部2013年12月公布的新版《饲料添加剂品种目录（2013）》将其正式列入，适用于猪、肉鸡、水产动物，除了具有耐高酸、耐高热、耐高渗透压、易培养、易保存等芽孢杆菌属的特点，是能够产生乳酸的一类特殊芽胞杆菌, 具有乳酸菌和芽胞杆菌的双重优良特性，在维持肠道微生态平衡,刺激免疫等益生功能等方面效果显著，研究显示,在育肥猪词料中添加凝结芽孢杆菌制剂能有效提高猪的平均日增重,降低饲料成本,提高了经济效益；同时，有研究发现, 凝结芽孢杆菌可显著提高广西黄鸡平均日增重( ADG)，降低料重比( F/G)，提高成活率，增大胸肌剪切力，并降低胸肌滴水损失，这些使其必将成为饲料添加剂行业中不可替代的成员。

然而，却鲜少有人将两者联合固体发酵，共同作用，本发明以提高禽类健康水平、降低饲料成本的原则，发明一种复合芽孢杆菌的发酵方法，以期为畜牧业提供新方向。

发明内容

发明的目的：为了提供一种效果更好的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法及其用途，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。

本发明的第一个目的是提供一种液固态发酵工艺的优化方法，通过发酵工艺的优化，缩短发酵周期，降低生产成本，简易控制工艺，进行大规模生产。

本发明的另一目的是通过复合芽孢杆菌，提高产品的综合功能。同时，产品适口性好，不仅能提供丰富的营养物质，并且起到保健的作用。

技术方案：

1）将菌种分别进行复壮，接种至摇瓶培养，再进行发酵罐逐级扩大好氧发酵培养，制取液体发酵培养液；

2）按比例将培养菌液与固体发酵培养基混匀，备用；

3）按比例将上述制好的混合固体培养基进行混匀，温度控制35~45℃，有氧发酵24~36h，得到固体发酵产物；

4）将得到的培养物进行低温环保干燥，粉碎，包装。

作为本发明的一个实施例，种子罐培养液以6~8%的接种量接种到7T发酵罐，接种后，发酵罐缓慢转动2小时，让菌种在恒温环境中进行充分孵育，发酵菌液pH控制在6.5~7.2，发酵20~24h时，培养液活菌数达到100~150亿/mL.

作为本发明的又一个实施例，上述步骤3)中，其有氧发酵条件为：空气相对湿度60~70%，所述液体发酵培养液与固体发酵培养基混合的水分控制为70~80%，用翻料机2~4小时翻料一次，确保好氧发酵中温度与氧气的供给。

作为本发明的又一个实施例，固体好氧发酵中活菌数可达150~200亿CFU/g。

作为本发明的又一个实施例，枯草芽孢杆菌摇瓶种子液体培养基组成：

葡萄糖: 5~15 g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~20 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，Na₂HPO₄:3~ 5g/L，调节至pH 6.5~7.5，121℃高压30min。

作为本发明的又一个实施例，凝结芽孢杆菌摇瓶种子液体培养基组成：

葡萄糖：2~5g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~15 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，NaH₂PO₄:3~5g/L，调节至pH 6.5~7.5，121℃高压30min。

作为本发明的又一个实施例，7T发酵罐发酵培养基组成：

枯草芽孢杆菌发酵罐培养基成分配比为：葡萄糖: 5~15 g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~20 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，Na₂HPO₄:3~ 5g/L，调节至pH 6.5~7.5，其中，当液体发酵10h后开始补料，补料培养基组成：葡萄糖： 1~2 g/L，蛋白胨：2~5 g/L，尿素：2~5g/L，共补料4~6次，每2~3小时一次。

凝结芽孢杆菌摇瓶种子液体培养基组成：葡萄糖：1~3g/L，蛋白胨：10~12 g/L，酵母膏：10~12 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，NaH₂PO₄:3~ 5g/L，调节至pH 6.5~7.5，121℃高压30min。其中，当液体发酵10h后开始补料，补料培养基组成：葡萄糖： 0.5~1 g/L，蛋白胨：2~5 g/L，尿素：2~5g/L，共补料4~6次，每2~3小时一次。

作为本发明的又一个实施例，所述固体发酵培养基组成：

麸皮：50~70%，豆粕：10~15%，米糠：40~60%。

从上面所述中看出，本发明提供的培养物的制备过程中，通过菌液体发酵工艺优化，不仅有效缩短生产周期，增加饲料适口性，同时，中草药提取物的药效作用也达到充分发挥，制成一种具有独特功能的培养物。

本发明的主要优点是：

1.生产工艺周期缩短，降低生产成本，并提供了丰富的蛋白质，水解酶类，维生素等营养与免疫物质；

2.该产品独特的复合芽孢菌株发酵，结合枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌两种菌各自的独特优势，添加于畜禽的饲料中，提高其对环境应激的适应能力，增强其免疫力与抗病力，提高经济效益。

具体实施方式

进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：本发明的实施实例中，制备的培养物包括以下步骤：

（1）用基础蛋白胨牛肉膏液体培养基对生产菌进行复壮：挑取一环斜面菌株，接种于种子液培养基中，150ml 三角瓶培养基装量为 50ml，37~45℃、200~ 220r/min 摇瓶培养 20~24h，此为一级种子液，将此种子液以2%的接种量接入二级种子液培养基中，1000ml 三角瓶装液量 200ml，37~45℃、200~220r/min摇瓶培养 20~24h；其中，基础液体培养基成分为：蛋白胨：10~15 g/L，牛肉膏：5~10 g/L，氯化钠：5 g/L，调节pH至7.0~7.2；二级种子枯草芽孢杆菌培养液成分为：葡萄糖: 5~15 g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~20 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，Na₂HPO₄:3~ 5g/L，调节至pH 6.5~7.5. 调节pH至7.0~7.2；凝结芽孢杆菌摇瓶种子液体培养基组成：葡萄糖：2~5g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~15 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，NaH₂PO₄:3~ 5g/L，调节至pH 6.5~7.5，121℃高压30min。上述培养基均在 121℃条件下高温灭菌 30min。

接着，将此种子培养液以 1~3％的接种量分别接入500L的种子发酵罐进行扩繁，控制温度为37~40℃，有氧发酵 20~24小时，其中，刚接入时应缓慢转动转子，调节转速为80r/min，2小时后，转速调至180~220r/min，制得发酵种子液，其中，种子罐枯草芽孢杆菌液体培养基为：葡萄糖: 5~15 g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~20 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，Na₂HPO₄:3~ 5g/L，调节pH至7.0~7.2，凝结芽孢杆菌液体培养基组成：葡萄糖：2~5g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~15 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，NaH₂PO₄:3~ 5g/L，调节至pH 6.5~7.5，上述培养基均121℃高压30min。

下面，将此种子培养液以 6~10％的接种量接入7T的发酵罐，控制温度为37~40℃，有氧发酵 20~24小时，其中7T发酵罐枯草芽孢杆菌发酵培养基组成为：葡萄糖：5~8 g/L，蛋白胨：5~15 g/L，酵母膏：5~10 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，Na₂HPO₄:3~ 5g/L；其中，当液体发酵10h后开始补料，补料培养基组成：葡萄糖：15~30 g/L，蛋白胨：2~5 g/L，尿素：2~5 g/L，共4~6次，每2~3小时定量补料一次。凝结芽孢杆菌摇瓶种子液体培养基组成：葡萄糖：1~3g/L，蛋白胨：10~12 g/L，酵母膏：10~12 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，NaH₂PO₄:3~ 5g/L，调节至pH 6.5~7.5，121℃高压30min。其中，当液体发酵10h后开始补料，补料培养基组成：葡萄糖： 0.5~1g/L，蛋白胨：2~5 g/L，尿素：2~5g/L，共补料4~6次，每2~3小时一次。

（2）将部分需要粉碎固体培养基原料提前粉碎，用孔径1.2mm筛子过滤，其中，固体培养基为麸皮：50~70%，豆粕：10~15%，米糠：40~60%。

（3）把步骤1）得到的培养液（含菌量为100~150亿CFU/mL）与步骤2）的固体培养基用混料机混匀，其水分控制在70~80%，在 35~45℃有氧发酵 24~36 小时，得到固体发酵初产物。其中，此过程中，控制空气相对湿度为60%~70%，pH 控制在 6.5~7.5。

（4）将上述固体发酵产物进行低温烘干，粉碎，包装后即为培养物，该产品具有芽孢杆菌和凝结杆菌发酵的特殊淡腥臭味，但不影响动物对其适口性。

实施例2 是在实施例 1 基础上的进一步实施例，所述以枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌液体菌株添加比例为2:1。

实施例3 是在实施例 1 基础上的进一步实施例，所述枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌液体菌株添加比例为1:2。

实施例4 是在实施例 1 基础上的进一步实施例，所述以麸皮，豆粕，米糠为固体基料发酵的配方比例调至：70~80%，豆粕：15~25%，米糠：10~20%。

实施例1~4得到的培养物检测指标对比如下表：

	粗蛋白	粗灰分	水分
				实施例 1	22.38%	5.78%	8.24%
实施例 2	23.46%	5.72%	8.07%
				实施例 3	22.78%	5.80%	7.35%
实施例 4	24.91%	5.93%	7.36%

综合两种菌不同的生理特性，饲喂鸡时，不仅增加了其对营养物质的吸收利用，而且提高了其对疾病的抵抗力。数据显示，当本发酵产品实例饲喂蛋鸡时，试验期19天其产蛋率由78.65%上升至85.9%，总产蛋重由95斤上升至102.4斤，产蛋个数由770个上升至841个,料蛋比由2.4:1下降到2.29:1。粪便由偏稀、发黄、有过料转变成基本无过料，粪便成形,颜色变成青褐色。

实例2 饲喂雏鸡上试验证明，在雏鸡料中添加后，能够促进十二指肠长度8-10cm，成活率增加1%。

实例3 饲喂肉鸡后，显著提高肉鸡的日增重，改善肉质。

实例4 通过增强蛋鸡消化酶数量和活性，改善菌群平衡，增强机体抵抗力，同时，对改善养殖场环境，减少粪臭味有明显效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

Claims

1.枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1）先将两株芽孢杆菌分别复壮活化，培养，然后接种于摇瓶种子培养基中，再通过种子罐到发酵罐进行逐级放大培养，分别得到芽孢各自液体发酵培养液；两株芽孢杆菌分别为枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌；

2）将两种菌各自培养好的液体发酵液与特定固体培养基混合均匀；

3）将上述两种菌的液体发酵液与特定固体培养基混合均匀，在温度为37~45℃的条件下好氧发酵24~30h，即为固体发酵产物。

2.如权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，经步骤 1) 的有氧发酵后，枯草芽孢杆菌活菌数达到 100-150 亿 CFU/mL，出芽率达到89%，凝结芽孢杆菌活菌数达到80-120 亿 CFU/mL，出芽率达到94%。

3.如权利要求1 所述的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，在所述步骤3) 中，所述有氧发酵条件为：空气相对湿度 60~70％，所述芽孢发酵菌液与接种的固体培养基混合后的水分控制在70~80％，接种量为20~30%，pH 控制在 6.5~7.5。

4.如权利要求1 所述的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，在所述步骤1) 中，将所述菌斜面种子接种至蛋白胨牛肉膏液体培养基中扩繁，在37~45℃条件下有氧发酵 20~24 小时，制得基础芽孢菌液体发酵菌液。

5.如权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，所述细菌液体基础培养基的组成为：蛋白胨：10~15 g/L，牛肉膏：5~10 g/L，氯化钠：5 g/L；一级摇瓶种子枯草芽孢杆菌培养基组成为：葡萄糖：5~10g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~15 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，Na₂HPO₄:3~ 5g/L；凝结芽孢杆菌培养基组成为：葡萄糖：2~5g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~15 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，NaH₂PO₄:3~ 5g/L，均调节至pH 7.0~7.2, 121℃高压30min，接种后控制该培养液转速在 180~200r/min。

6.如权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，发酵罐利用深层培养法进行扩繁，即由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法，枯草芽孢杆菌培养基成分配比为：葡萄糖: 5~15 g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~20 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，Na₂HPO₄:3~ 5g/L；凝结芽孢杆菌培养基组成为：葡萄糖：2~5g/L，蛋白胨：10~15 g/L，酵母膏：10~15 g/L，K₂HPO₄：0.5~1g/L，NaH₂PO₄:3~ 5g/L，均调节至pH 7.0~7.2。

7.如权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，在所述步骤 2) 中，将所用原料提前粉碎，用孔径1.2mm筛子过滤。

8.如权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵的方法，其特征在于，所述固体培养基由以下物质按照质量百分比组成：麸皮：50~70%，豆粕：10~15%，米糠：40~60%。

9.一种芽孢复合发酵物，其特征在于，所述芽孢培养物如权利要求 1~8 中任意一项所述的培养物的制备方法制备得到。

10.如权利要求 1~8 中任意一项所述的培养物的制备方法制备得到的发酵物在制备饲料或者是在饲养动物的过程中的用途。