CN107037219A - X‑连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种X‑连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用。所述试剂盒包括：抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体、所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体、抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的Western Blot抗体对应的二抗。基于该诊断试剂盒的检测CTL和NK细胞中SAP蛋白丰度的方法，检测快速，通量大，准确度高，且人为因素影响较小。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用。
背景技术
SAP(SLAM associated protein)蛋白是小分子的接头蛋白，有一个SH2域，在介导淋巴细胞的激活分子(SLAM)家族的信号受体中起了重要的信号转导作用。SAP蛋白作为细胞液内的信号转接器和调控开关，通过和SLAM相关因子的相互作用来调节机体的免疫细胞对EB病毒的反应。当SH2D1A基因发生突变，并影响遗传信息的转录和SAP蛋白表达时，就会改变SAP蛋白功能，这样通过SAP蛋白与SLAM家族的因子的作用关系，进一步影响免疫细胞的活化和抗病毒免疫信号的传递，使SAP蛋白不能正常的介导T/B细胞间相互作用，所以在EB病毒感染后，B淋巴细胞过度增生，而机体免疫***却无法正常控制，最终导致临床上出现XLP相应的临床表现。
X-连锁淋巴组织增殖综合征(X-linked Lymph Proliferative Disease，XLP)是一种少见的、常常是致死性的原发性免疫缺陷病，可由EB病毒(Epstein–Barr virus，EBV)感染诱发，表现为爆发性传染性单核细胞增多症、丙种球蛋白异常血症和淋巴增殖性疾病以及淋巴瘤。X-连锁淋巴增殖综合征包括XLP-1和XLP-2，以X连锁隐性方式遗传，多见于男性。本病主要由编码淋巴信号活化分子相关蛋白(SAP)、X-连锁凋亡抑制因子(XIAP)和IL-2诱导的T细胞激酶(ITK)基因的突变引起，基因序列分析是确诊XLP的依据；SAP、XIAP、ITK蛋白的表达也可以作为筛查XLP的手段。家族史是需要考虑的主要客观指标，其他诊断标准包括患儿的临床表现、EB病毒感染后的EBNA抗体检测等。
XLP-1由位于X染色体上的编码T细胞、NK，NKT细胞SAP蛋白的SH2D1A基因突变所致。被EBV感染的B细胞(B-EBV)可招募SAP蛋白及传递激活信号，从而消除B-EBV；当SH2DIA基因突变导致SAP蛋白量减少或结构改变影响功能时，就会导致淋巴细胞对EBV应答中发生无限制增殖，并且出现NK细胞功能障碍。
目前存在多种SAP蛋白的检测方法，其中靶细胞的选择，结果的确证，等问题是技术领域的核心问题，是决定检测结果是否理想的关键。目前尚缺乏统一规范的操作流程。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒以及使用该试剂盒检测SAP蛋白丰度的检测方法，所述的检测方法可解决现有技术检测速度慢、精度较低、准确性较差、检测结果容易受到检测者的主观因素影响等问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体、所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体、抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的Western Blot抗体对应的二抗。
优选的，抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体分别购自4abio公司、eBioscience公司、eBioscience公司、eBioscience公司，货号分别为FHF003-100、17-0566-42、45-0088-42、#12-9787-42；
优选的，所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体购自Abcam，货号为#ab109120；
优选的，所述抗人SAP的Western Blot抗体购自Abcam，货号为#ab97051。
优选的，如上所述的试剂盒，所述流式荧光抗体所带的荧光标记包括：FITC、Alexa350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、CY5.5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明异硫醇、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的多种。
优选的，如上所述的试剂盒，所述抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体以及所述同型对照荧光抗体上所带有的荧光标记依次为FITC、APC、Percp Cy5.5、PE、PE。
优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括抗凝剂、细胞固定剂、细胞破膜剂、流式染色缓冲液、蛋白裂解液中的一种或多种；
更优选的，所述抗凝剂选自EDTA、肝素、枸橼酸盐和草酸盐中的一种或多种；
更优选的，所述细胞固定剂购自eBioscience，货号#00-5521-00；
更优选的，所述细胞破膜剂购自eBioscience，货号#00-8333-56；
更优选的，所述流式缓冲液的配方为：含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mMEDTA的1×PBS溶液。
更优选的，所述蛋白裂解液为RIPA。
如上任一项所述的试剂盒在制备诊断X-连锁淋巴组织增殖综合征的产品中的应用；
优选的，如上任一项所述的试剂盒在制备诊断1型X-连锁淋巴组织增殖综合征的产品中的应用。
优选的，如上所述的应用，应用时对待检样本进行的预处理步骤包括：
1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；
2)、向步骤1)中的细胞中同时加入抗人CD3、CD56、CD8a的流式荧光抗体并孵育；
3)、离心，将沉淀与细胞固定剂共孵育；
4)、离心，将沉淀与细胞破膜剂共孵育；
5)、离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
6)、将重悬后的样品分为两组，分别加入抗人SAP的流式荧光抗体和同型对照荧光抗体并孵育；
7)、离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
和/或；
a)、分离待检样本中的外周血单个核细胞并用蛋白裂解液裂解收集蛋白；
b)、将蛋白使用所述抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的WesternBlot抗体对应的二抗进行Western Blot实验，读取所得条带的灰度值或荧光值；
其中步骤1)～7)与步骤a)～b)没先后顺序。
优选的，如上所述的应用，在步骤1)中，所述细胞浓度为3.5～4.5×106/ml；还可以选择4×106/ml。
优选的，如上所述的应用，在步骤2)中，孵育条件为：
室温避光孵育15～25min；还可以选择孵育20min。
优选的，如上所述的应用，在步骤2)中，CD3、CD56、CD8a的抗体的浓度分别为8～12μl/100μl、4～6μl/100μl、4～6μl/100μl；
更优选的，CD3、CD56、CD8a的抗体的浓度还可以选择10μl/100μl、5μl/100μl、5μl/100μl。
优选的，如上所述的应用，在步骤2)中，抗人SAP的流式荧光抗体和同型对照荧光抗体的抗体浓度均为4～6μl/100μl；更优选为5μl/100μl。
优选的，如上所述的应用，在步骤b)中，抗人SAP的Western Blot抗体按0.5～1.5：1000添加，室温下摇动孵育1～3h后2～6℃孵育8～16h；
更优选的，在步骤b)中，抗人SAP的Western Blot抗体按1：1000添加，室温下摇动孵育2h后4℃孵育10～14h。
一种使用如上所述的试剂盒检测CTL和NK细胞中SAP蛋白丰度的方法，包括：
1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；
2)、向步骤1)中的细胞中同时加入抗人CD3、CD56、CD8a的流式荧光抗体并孵育；
3)、离心，将沉淀与细胞固定剂共孵育；
4)、离心，将沉淀与细胞破膜剂共孵育；
5)、离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
6)、将重悬后的样品分为两组，分别加入抗人SAP的流式荧光抗体和同型对照荧光抗体并孵育；
7)、离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬，并用流式细胞仪进行检测；
和/或；
a)、分离待检样本中的外周血单个核细胞并用蛋白裂解液裂解收集蛋白；
b)、将蛋白使用所述抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的WesternBlot抗体对应的二抗进行Western Blot实验，读取所得条带的灰度值或荧光值；
其中步骤1)～7)与步骤a)～b)没先后顺序。
所述方法为非诊断用途。
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。使用流式细胞术对SAP蛋白表达丰度的变化幅度进行检测，再配合WB实验进行验证，可以快速、精度、准确地评价对SAP蛋白表达水平
CD3(cluster of differentiation 3，分化簇3)受体仅存在于T细胞表面，因而可用作T细胞的标志物；
CD56(cluster of differentiation 56，分化簇56)又称为神经细胞粘附分子(N-CAM)，广泛存在于大部分的神经外胚层来源的细胞、组织和肿瘤中，包括视网膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、小细胞癌。也表达于一些中胚层衍生的肿瘤、自然杀伤细胞和NK淋巴瘤。本发明中CD56用作NK细胞的标志物；
CD8a(cluster of differentiation 8，分化簇8)受体表达于细胞毒性T细胞上，可作为细胞毒性T细胞的标志物。
优选的，如上所述的方法，在步骤1)中，所述细胞浓度为3.5～4.5×106/ml；还可以选择4×106/ml。
优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，孵育条件为：
室温避光孵育15～25min；还可以选择孵育20min。
优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，CD3、CD56、CD8a的抗体的浓度分别为8～12μl/100μl、4～6μl/100μl、4～6μl/100μl；
更优选的，CD3、CD56、CD8a的抗体的浓度还可以选择10μl/100μl、5μl/100μl、5μl/100μl。
优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，抗人SAP的流式荧光抗体和同型对照荧光抗体的抗体浓度均为4～6μl/100μl；更优选为5μl/100μl。
优选的，如上所述的方法，在步骤b)中，抗人SAP的Western Blot抗体按0.5～1.5：1000添加，室温下摇动孵育1～3h后2～6℃孵育8～16h；
更优选的，在步骤b)中，抗人SAP的Western Blot抗体按1：1000添加，室温下摇动孵育2h后4℃孵育10～14h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明提供的基于X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒的检测CTL和NK细胞中SAP蛋白丰度的方法，检测快速，通量大，准确度高，且人为因素影响较小。
2)、本发明建立了一种用流式细胞胞仪(FACS)快速检测SAP蛋白表达的方法，继以Western Blot证实SAP蛋白的表达量。通过对流式检测和WB等关键技术流程中的细节进行优选限定，建立了稳定规范的技术规程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3流式细胞术检测结果；
图2为实施例3Western Blot验证检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
S11、流式细胞术检测NK和细胞毒性T(CTL)细胞中SAP蛋白的表达
①乙二胺四乙酸(Ethylenediamine-tetraaceticacid,EDTA)或肝素钠(HeparinSodium)抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，并计数，调整细胞浓度为3.5×106/ml悬液备用。
②每个管中加200ul已稀释细胞，此管一般作为样本管。每管加16ul CD3-FITC、12ul CD56-APC、12ul CD8a-Percp Cy5.5，室温避光孵育15分钟后，每管加2ml流式缓冲液(2.0％FBS和2.0mM EDTA的1×PBS溶液)，1200转、5分钟离心，弃上清。
③固定：将4×固定剂(eBioscience，#00-5521-00)稀释至1×，每管加2ml，震荡混匀，4度避光固定50分钟后，1200转、5分钟离心，弃上清。
④破膜：将10×破膜剂(eBioscience，#00-8333-56)稀释至1×，每管先加1ml破膜剂，震荡混匀，1200转、5分钟离心，弃上清。随后每管再加2ml破膜剂，震荡混匀，4度避光破膜40分钟，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑤每管加2ml流式缓冲液，混匀，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑥分对照管：样品管每管加200ul PBS，混匀，吸取100ul到对应的对照管。
⑦样本管中加入抗人SAP-PE抗体(eBioscience，#12-9787-42)4μl，对照管加入Rat IgG2a K同型对照-PE 5ul。室温避光孵育15min
⑧每管加2ml流式缓冲液，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑨每管加100ul流式缓冲液，上机检测。
S12、Western Blot确证SAP蛋白的表达
①EDTA或肝素钠抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。
②加入100ul预冷的蛋白裂解液(RIPA)，冰上孵育30分钟
③4℃，12000rpm离心15min取上清
④测定蛋白浓度(BCA试剂盒)
⑤蛋白煮样：按照蛋白：5×loading buffer＝4:1混合后，100℃水浴5分钟
⑥配制12％SDS-PAGE胶
⑦上样及电泳：依次加入蛋白Marker和煮好的待分析的蛋白样本(每孔10ug)。一般浓缩胶70V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下凝胶末端处，即停止。
⑧转膜：PVDF膜，恒流300mA，60分钟。
⑨封闭：将膜置于小盒子中，加入5％脱脂奶粉(TBST)，室温下在脱色摇床上封闭2小时。
⑩直接加入配好的一抗(兔抗人SAP，1:1000，Abcam，#ab109120)(用5％脱脂奶粉/TBST稀释至适当浓度),室温下脱色摇床上动2小时后4℃冰箱过夜。
取出膜，室温下在脱色摇床上用TBST洗膜，共三次，每次10分钟
加入配好的二抗(羊抗兔，1:2000，Abcam，#ab97051)(用5％脱脂奶粉/TBST稀释至适当浓度)，室温下脱色摇床上摇动1小时。
取出膜，室温下在脱色摇床上用TBST洗膜，共三次，每次10分钟
将配制好的放光液(Thermo，#34577)滴在膜的蛋白一侧，使二者充分接触
设置荧光成像分析仪程序，并运行显影。
实施例2
S21、流式细胞术检测NK和细胞毒性T(CTL)细胞中SAP蛋白的表达
①乙二胺四乙酸(Ethylenediamine-tetraaceticacid,EDTA)或肝素钠(HeparinSodium)抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，并计数，调整细胞浓度为4.5×106/ml悬液备用。
②每个管中加200ul已稀释细胞，此管一般作为样本管。每管加24ul CD3-FITC、8ul CD56-APC、8ul CD8a-Percp Cy5.5，室温避光孵育25分钟后，每管加2ml流式缓冲液(2.0％FBS和2.0mM EDTA的1×PBS溶液)，1200转、5分钟离心，弃上清。
③固定：将4×固定剂(eBioscience，#00-5521-00)稀释至1×，每管加2ml，震荡混匀，4度避光固定50分钟后，1200转、5分钟离心，弃上清。
④破膜：将10×破膜剂(eBioscience，#00-8333-56)稀释至1×，每管先加1ml破膜剂，震荡混匀，1200转、5分钟离心，弃上清。随后每管再加2ml破膜剂，震荡混匀，4度避光破膜40分钟，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑤每管加2ml流式缓冲液，混匀，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑥分对照管：样品管每管加200ul流式缓冲液，混匀，吸取100ul到对应的对照管。
⑦样本管中加入抗人SAP-PE抗体(eBioscience，#12-9787-42)6μl，对照管加入Rat IgG2a K同型对照-PE 5ul。室温避光孵育25min
⑧每管加2ml流式缓冲液，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑨每管加100ul流式缓冲液，上机检测。
S22、Western Blot确证SAP蛋白的表达
同S12。
实施例3
S31、流式细胞术检测NK和细胞毒性T(CTL)细胞中SAP蛋白的表达
①乙二胺四乙酸(Ethylenediamine-tetraaceticacid,EDTA)或肝素钠(HeparinSodium)抗凝静脉全血2ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，并计数，调整细胞浓度为4.0×106/ml悬液备用。
②每个管中加200ul已稀释细胞，此管一般作为样本管。每管加20ul CD3-FITC、10ul CD56-APC、10ul CD8a-Percp Cy5.5，室温避光孵育20分钟后，每管加2ml流式缓冲液(2.0％FBS和2.0mM EDTA的1×PBS溶液)，1200转、5分钟离心，弃上清。
③固定：将4×固定剂(eBioscience，#00-5521-00)稀释至1×，每管加2ml，震荡混匀，4度避光固定50分钟后，1200转、5分钟离心，弃上清。
④破膜：将10×破膜剂(eBioscience，#00-8333-56)稀释至1×，每管先加1ml破膜剂，震荡混匀，1200转、5分钟离心，弃上清。随后每管再加2ml破膜剂，震荡混匀，4度避光破膜40分钟，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑤每管加2ml流式缓冲液，混匀，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑥分对照管：样品管每管加200ul流式缓冲液，混匀，吸取100ul到对应的对照管。
⑦样本管中加入抗人SAP-PE抗体(eBioscience，#12-9787-42)5ul，对照管加入Rat IgG2a K同型对照-PE 5ul。室温避光孵育20分钟
⑧每管加2ml PBS，1200转、5分钟离心，弃上清。
⑨每管加100ul PBS，上机检测。
S32、Western Blot确证SAP蛋白的表达
同S12。
用实施例3的方法对XLP-1患者和正常人的SAP蛋白表达水平进行检测，流式细胞术检测见图1，Western Blot验证检测结果见图2。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体、所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体、抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的Western Blot抗体对应的二抗。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体以及所述同型对照荧光抗体上所带有的荧光标记依次为FITC、APC、Percp Cy5.5、PE、PE。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括抗凝剂、细胞固定剂、细胞破膜剂、流式缓冲液、蛋白裂解液中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述流式缓冲液的配方为：含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mM EDTA的1×PBS溶液。
5.权利要求1～4任一项所述的试剂盒在制备诊断X-连锁淋巴组织增殖综合征的产品中的应用。
6.一种使用权利要求1～4任一项所述的试剂盒检测CTL和NK细胞中SAP蛋白丰度的方法，其特征在于，包括：
1).分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；
2).向步骤1)中的细胞中同时加入抗人CD3、CD56、CD8a的流式荧光抗体并孵育；
3).离心，将沉淀与细胞固定剂共孵育；
4).离心，将沉淀与细胞破膜剂共孵育；
5).离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
6).将重悬后的样品分为两组，分别加入抗人SAP的流式荧光抗体和同型对照荧光抗体并孵育；
7).离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬，并用流式细胞仪进行检测；
和/或；
a).分离待检样本中的外周血单个核细胞并用蛋白裂解液裂解收集蛋白；
b).将蛋白使用所述抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的Western Blot抗体对应的二抗进行Western Blot实验，读取所得条带的灰度值或荧光值；
其中步骤1)～7)与步骤a)～b)没先后顺序。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述细胞浓度为3.5～4.5×106/ml。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，孵育条件为：
室温避光孵育15～25min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，CD3、CD56、CD8a的抗体的浓度分别为8～12μl/100μl、4～6μl/100μl、4～6μl/100μl；
优选的，抗人SAP的流式荧光抗体和同型对照荧光抗体的抗体浓度均为4～6μl/100μl。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，抗人SAP的Western Blot抗体按0.5～1.5：1000添加，室温下摇动孵育1～3h后2～6℃孵育8～16h。
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