CN107034261A - 炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6‑o‑葡萄糖‑环黄芪醇的方法 - Google Patents

炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6‑o‑葡萄糖‑环黄芪醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇的方法,具体涉及一种利用炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius.CICC 41254)在适量黄芪粉为诱导物的前提下，以黄芪甲苷为底物发酵转化制得6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇，并将发酵所得发酵液经水饱和正丁醇萃取、硅胶柱层析以及乙醇重结晶，最终得到纯度达到95％以上的6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇产品。本发明是利用微生物转化法制备6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇，其特点在于底物黄芪甲苷几乎全部转化，转化率高，方法简单易行，成本低，且对环境无污染，适合工业化生产。

Description

炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的方法
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种利用炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的方法。
背景技术
黄芪是一味传统中药，其药用迄今已有2000多年的历史，具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用；环黄芪醇类皂苷是黄芪中药中的主要活性成分，属于环阿尔廷烷四环三萜类皂苷，具有加强免疫力、增加能量、抵抗疲劳、保护肝脏、清除自由基和抑制破骨细胞的作用，有很高的药用价值。
6-O-葡萄糖-环黄芪醇(CMG)属于环黄芪醇类皂苷，其结构由Isao Kitagawa于1983年首次报道，是通过橙皮苷酶水解黄芪甲苷得到。
中国已公开的专利申请中(中国专利申请公开号：CN1809364A)是以温和酸水解黄芪甲苷得到6-O-葡萄糖-环黄芪醇，但是反应得到的CMG的收率很低，仅有21％。且酸法制备的副产物多，其结构和大小与CMG类似，后期分离困难，不利于工业化生产。天津医科大学的夏广萍等人利用β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷的到6-O-葡萄糖-环黄芪醇，转化率达到90％以上，但是相较于微生物转化法，酶法制备的成本较高，且商品化的β-葡萄糖苷酶也并非黄芪甲苷特异性水解酶(夏广萍,刘鹏,等.β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷的研究[J].中草药,2012,43(6):1112－1114.
6-O-葡萄糖-环黄芪醇(CMG)结构
发明内容
本发明的目的在于选择采用一种微生物转化的方法来转化黄芪甲苷得到6-O-葡萄糖-环黄芪醇，克服现有6-O-葡萄糖-环黄芪醇制备技术中副产物多，转化率效率低，成本高，污染环境等缺点。本发明根据现有技术的不足作出创新和改进，提供一种高效的生物法制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的方法。
为实现上述发明目的，所采用的技术方案是：
A.种子液制备
将炭黑曲霉冻干粉经试管斜面活化培养后转移至PDA平面培养基中，再向平面培养基中加入无菌水制成孢子浓度为6×108个/mL炭黑曲霉孢子悬浮液。
B.发酵转化
将步骤A中的炭黑曲霉孢子悬浮液接种至液体发酵培养基中，置于摇床温度为28～30℃、摇床转速为180r/min的条件下培养6天，获得发酵液。
C.分离纯化
将步骤B中的发酵液经由水饱和正丁醇萃取三次后真空浓缩蒸干得到萃取产品，进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到6-O-葡萄糖-环黄芪醇产品。
上述步骤B中的发酵培养基配方为：底物黄芪甲苷的浓度为1mg/mL，黄芪粉浓度为2g/L，酵母粉浓度为10g/L，硫酸铵浓度为2g/L，KH2PO4浓度为4g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，吐温80体积百分比为0.1％，初始pH值为4.5，接种量和发酵培养基的体积比为1:100。
上述步骤B中的黄芪粉为80目的黄芪粉，是直接将洗净的黄芪根茎粉碎制成，在发酵过程中主要用来诱导炭黑曲霉产酶。
上述步骤B中的底物黄芪甲苷的质量百分比是10％。
上述步骤C中的硅胶柱层析的填料为100～200目的硅胶粉。
上述步骤C中硅胶柱层析的洗脱剂为体积比例为26:13:4的甲醇-氯仿-水的下层溶液。
本发明的特点是利用微生物转化的方法转化黄芪甲苷制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇。与现有技术相比，本发明显著的有益效果是：
炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的过程中不会产生任何的副产物，提高了转化效率。
与现有技术相比，炭黑曲霉转化黄芪甲苷的转化率高，底物黄芪甲苷几乎全部转化为产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇，且终产品的纯度高，降低了生产成本。
与传统化学法相比，微生物转化法是一种清洁的生物法转化，其制备条件温和，能耗降低，制备过程中对环境的伤害大大降低，适合工业化生产。
附图说明
图1是炭黑曲霉转化路径图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但这些实施例的目的并不在于限制本发明的保护范围。
实施例1
取炭黑曲霉冻干粉置于含有PDA培养基的试管斜面上活化培养，后再转移至PDA平面培养基中培养，待炭黑曲霉完全长出孢子后向平面培养基中加入无菌水制成孢子浓度为6×108个/mL的炭黑曲霉孢子悬浮液，即为菌种发酵的种子液(所有操作均在超净台中无菌操作)。
发酵液体培养基配方：底物为10％质量百分比的黄芪甲苷，浓度为1mg/mL，黄芪粉浓度为2g/L，酵母粉浓度为10g/L，硫酸铵浓度为2g/L，KH2PO4浓度为4g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，吐温80体积百分比为0.1％，初始pH值为4.5。按照培养基的配方配制液体发酵培养基。
取1mL孢子浓度为6×108个/mL炭黑曲霉孢子悬浮液接种至含有100mL液体发酵培养基的250mL的摇瓶中，并将摇瓶置于28℃的恒温摇床中培养，调节摇床转速为180r/min，在此条件下发酵培养6天。收集得到95mL的发酵液。
向发酵液中加入50mL水饱和正丁醇萃取，连续萃取三次后将得到萃取液经真空浓缩蒸干得到粗产品0.16g。后用10mL的甲醇将粗产品完全溶解，取1mL溶液过0.22μm有机滤膜，于高效液相色谱-蒸发光检测下测定，经计算粗产品的纯度为4.68％。
取上述纯度的粗产品1g于硅胶柱层析分离纯化，填料为100～200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为体积比例为26:13:4的甲醇-氯仿-水的下层溶液。收集其中含有产品的馏分并于液相检测浓度，后将所有的馏分收集旋干并称量干重，经计算得到50.32mg纯度为88.36％产品。
将硅胶柱层析后的产品通过乙醇重结晶后，最终将6-O-葡萄糖-环黄芪醇产品的纯度提高到了95％以上。
实施例2
取炭黑曲霉冻干粉置于含有PDA培养基的试管斜面上活化培养，后再转移至PDA平面培养基中培养，待炭黑曲霉完全长出孢子后向平面培养基中加入无菌水制成孢子浓度为6×108个/mL的炭黑曲霉孢子悬浮液，即为菌种发酵的种子液(所有操作均在超净台中无菌操作)。
发酵液体培养基配方：底物为10％质量百分比的黄芪甲苷，浓度为1mg/mL，黄芪粉浓度为2g/L，酵母粉浓度为10g/L，硫酸铵浓度为2g/L，KH2PO4浓度为4g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，吐温80的体积百分比为0.1％，初始pH值为4.5。按照培养基的配方配制液体发酵培养基。
取1mL孢子浓度为6×108个/mL炭黑曲霉孢子悬浮液接种至含有100mL液体发酵培养基的250mL的摇瓶中，并将摇瓶置于30℃的恒温摇床中培养，调节摇床转速为180r/min，在此条件下发酵培养6天。收集得到91mL的发酵液。
向发酵液中加入50mL水饱和正丁醇萃取，连续萃取三次后将得到萃取液经真空浓缩蒸干得到粗产品0.157g。后用10mL的甲醇将粗产品完全溶解，取1mL溶液过0.22μm有机滤膜，于高效液相色谱-蒸发光检测下测定，经计算粗产品的纯度为4.72％。
取上述纯度的粗产品1g于硅胶柱层析分离纯化，填料为100～200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，其比例为26:13:4。收集其中含有产品的馏分并于液相检测浓度，后将所有的馏分收集旋干并称量干重，经计算得到52.86mg纯度为87.36％产品。
将硅胶柱层析后的产品通过乙醇重结晶后，最终将6-O-葡萄糖-环黄芪醇产品的纯度提高到了95％以上。
实施例3
取炭黑曲霉冻干粉置于含有PDA培养基的试管斜面上活化培养，后再转移至PDA平面培养基中培养，待炭黑曲霉完全长出孢子后向平面培养基中加入无菌水制成孢子浓度为6×108个/mL的炭黑曲霉孢子悬浮液，即为菌种发酵的种子液(所有操作均在超净台中无菌操作)。
发酵液体培养基配方：底物为10％质量百分比的黄芪甲苷，浓度为1mg/mL，黄芪粉浓度为2g/L，酵母粉浓度为10g/L，硫酸铵浓度为2g/L，KH2PO4浓度为4g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，吐温80体积百分比为0.1％，初始pH值为4.5。按照培养基的配方配制液体发酵培养基。
取10mL孢子浓度为6×108个/mL炭黑曲霉孢子悬浮液接种至含有1000mL液体发酵培养基的2500mL的摇瓶中，并将摇瓶置于30℃的恒温摇床中培养，调节摇床转速为180r/min，在此条件下发酵培养6天。收集得到980mL的发酵液。
向发酵液中加入500mL水饱和正丁醇萃取，连续萃取三次后将得到萃取液经真空浓缩蒸干得到粗产品1.82g。取0.2g的粗产品于10mL的甲醇中充分溶解，取1mL溶液过0.22μm有机滤膜，于高效液相色谱-蒸发光检测下测定，经计算粗产品的纯度为4.12％。
取上述纯度的粗产品10g于硅胶柱层析分离纯化，采用干法上样，洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，其比例为26:13:4。收集其中含有产品的馏分并于液相检测浓度，后将所有的馏分收集旋干并称量干重，经计算得到464.5mg纯度为84.26％产品。
后将硅胶柱层析后的产品通过乙醇重结晶后，最终将6-O-葡萄糖-环黄芪醇产品的纯度提高到了95％以上。

Claims (5)

1.炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的方法，其特征在于：发酵菌种为炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius.CICC 41254)，依次包括以下步骤：
A.种子液制备
炭黑曲霉冻干粉经试管斜面活化培养后转移至PDA平面培养基中，再向平面培养基中加入无菌水制成孢子浓度为6×108个/mL的炭黑曲霉孢子悬浮液；
B.发酵转化
将步骤A中的炭黑曲霉孢子悬浮液接种至发酵培养基中，并置于温度为28～30℃的恒温摇床中，在摇床转速为180r/min的条件下培养6天，获得发酵液。发酵培养基配方为底物黄芪甲苷浓度为1mg/mL，黄芪粉浓度为2g/L，酵母粉浓度为10g/L，硫酸铵浓度为2g/L，KH2PO4浓度为4g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，吐温80体积百分比为0.1％，初始pH值为4.5，接种量和发酵培养基的体积比为1:100；
C.分离纯化
将步骤B中的发酵液经由水饱和正丁醇萃取三次后真空浓缩蒸干得到萃取产品，进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到6-O-葡萄糖-环黄芪醇产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵基配方中的黄芪粉是80目的黄芪粉，是直接将洗净的黄芪根茎粉碎制成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B中的黄芪甲苷的质量百分为10％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中的硅胶柱层析填料为100～200目硅胶粉。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中硅胶柱层析的洗脱剂为体积比例分别为26:13:4的甲醇-氯仿-水的下层溶液。
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