CN103044510B - 桑黄菌中麦角甾醇的分离技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑黄菌（火木层孔菌<i>Phellinusigniarius</i>(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌<i>phellinuslinteus</i>(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌<i>Phellinushartigii</i>(AlleschetSchnabl)Imaz）中麦角甾醇的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用石油醚与丙酮梯度洗脱，进行TLC检测，再次使用正相硅胶层析，然后是甲醇凝胶层析，经PLC检测后，进行反相硅胶层析，适当合并洗脱液，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，既得麦角甾醇。
Description
技术领域
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术
桑黄（Phellinus），子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。
目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类：一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌中麦角甾醇的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用石油醚与丙酮梯度洗脱，进行TLC检测，再次使用正相硅胶层析，然后是甲醇凝胶层析，经PLC检测后，进行反相硅胶层析，适当合并洗脱液，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，既得5,7,22-三烯-3-麦角甾醇。
本发明的技术方案如下：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉1-5%葡萄糖1-5%
蛋白胨0.1-0.5%酵母膏0.1-0.5%
硫酸镁0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%；
(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
分离麦角甾酮的方法：
桑黄菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→正相硅胶层析→甲醇凝胶层析→TLC检测→反相硅胶层析→TLC检测→甲醇凝胶层析→减压蒸干→5,7,22-三烯-3-麦角甾醇。
具体方法为：
(1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将上述步骤（1）中所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-7次；
(3)收集步骤（2）中最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；
(4)收集上述步骤（3）中得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(5)将步骤（4）得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水；
(6)将步骤（5）得到的产物进行TLC检测，适度合并洗脱液，加压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，用洗脱剂洗脱；
(7)收集步骤（6）中得到的洗脱液，TLC检测，加压干燥，即为麦角甾醇。
本发明由桑黄菌中麦角甾醇的分离技术的显著优势：本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的麦角甾醇。技术路线成熟明确，高效精确。
（四）附图说明
图1为本发明的5,7,22-三烯-3-麦角甾醇的结构式；
图2为5,7,22-三烯-3-麦角甾醇的一维核磁共振H谱。
（五）具体实施方式
实例1：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉1%葡萄糖1%
蛋白胨0.1%酵母膏0.1%
硫酸镁0.1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25℃温度，摇瓶转速为110r/min，pH7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25℃，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55%；
(5)对步骤(4)所得提取液在70℃条件下，加热1小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
将上述粗提物称取300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高1m，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇=100:1，50:1，10:1,5:1分别洗脱3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2,Fr-3，Fr-4，Fr-5。。将Fr-5等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。减压浓缩洗脱液，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析。用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥。然后进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇：水=10%-80%。TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，用甲醇洗脱，将洗脱液进行TLC检测，展开剂为氯仿：甲醇=6:1-8:1，加压蒸干，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ5.57(d,J=3.6Hz,3H),5.52–5.15(m,10H),5.13(s,1H),3.63(d,J=4.2Hz,4H),2.46(s,2H),2.28(s,2H),1.23–1.09(m,6H),1.09–0.65(m,69H),0.63(s,7H).证明是5,7,22-三烯-3-麦角甾醇。
实例2：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉3%葡萄糖2%
蛋白胨0.5%酵母膏0.5%
硫酸镁0.5%磷酸二氢钾0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30℃温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30℃，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70%；
(5)对步骤(4)所得提取液在55℃条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
将上述粗提物称取200g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高0.8m，直径15cm，分别洗脱3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2，Fr-3，Fr-4，Fr-5。将Fr-5等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。减压浓缩洗脱液，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱。使用TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压蒸干，10%甲醇溶解，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇与水，再次进行甲醇凝胶层析，用甲醇洗脱，对洗脱液进行TLC检测，适当合并，加压干燥，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ5.57(d,J=3.6Hz,3H),5.52–5.15(m,10H),5.13(s,1H),3.63(d,J=4.2Hz,4H),2.46(s,2H),2.28(s,2H),1.23–1.09(m,6H),1.09–0.65(m,69H),0.63(s,7H).证明是5,7,22-三烯-3-麦角甾醇。
Claims (8)
1.桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其步骤顺序如下：
(1)制备桑黄粗提物；
(2)将上述步骤(1)中所得的乙醇沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-7次；
所述洗脱剂为氯仿和甲醇；
(3)收集步骤(2)中最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；
所述洗脱剂为氯仿与甲醇；
(4)收集上述步骤(3)中得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(5)将步骤(4)得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水；
(6)将步骤(5)得到的产物进行TLC检测，适度合并洗脱液，加压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，用洗脱剂洗脱；
(7)收集步骤(6)中得到的洗脱液，TLC检测，加压干燥，即为麦角甾醇；
所述桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉1-5％，葡萄糖1-5％，蛋白胨0.1-0.5％，酵母膏0.1-0.5％，硫酸镁0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.05％；
(2)所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(4)用体积百分比为60～95％的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90％；
(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(6)将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物；
所述的麦角甾醇为5,7,22-三烯-3-麦角甾醇；
步骤(4)中所述的凝胶为SephadexLH-20，SephadexLH-25，洗脱剂为甲醇。
2.如权利要求1所述的桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的拌样硅胶为100目正相硅胶。
3.如权利要求1所述的桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的层析硅胶为正相200-300目。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相材料为C-18。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的洗脱剂为甲醇：水＝10％-80％。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的洗脱剂为甲醇。
8.如权利要求1所述的桑黄菌中麦角甾醇的分离方法，其特征在于，步骤(7)所述的TLC展开剂为氯仿：甲醇＝6:1-8:1。
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