CN107029231A - 重组***二价灭活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
重组***二价灭活疫苗及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种***病毒疫苗组合物,特别是重组***O型、A型二价疫苗组合物。本发明还涉及一种制备所述***病毒疫苗组合物的方法、以及所述***病毒疫苗组合物在制备用于预防和/或控制动物***疾病的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物制品领域,具体地,本发明涉及一种O型***病毒疫苗与非O型(例如,A型)***病毒疫苗的组合物及其制备方法和用途。
背景技术
***(Foot-and-mouth disease,FMD)是由FMD病毒(Foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)引起的猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV具有A、O、Asial、C、SAT1、SAT2和SAT3共7个不同的血清型,血清型间无交叉保护。
多年来,O型、A型两个血清型***疫情严重危害我国养殖业。Asia1型***在2007年更换疫苗毒株以后,疫情迅速得以控制,2009年之后未见临床报道,目前已经趋于消亡。2010年,O型Mya-98毒株传入我国,引发严重疫情,使得流行于我国的O型***更为复杂;A型SEA-97G1毒株和G2毒株自2009年和2013年先后传入我国,已致多省爆发疫情,损失巨大。
目前,我国主要流行的是O型和A型两个血清型,流行毒株主要有Mya-98毒株、PanAsia毒株和A型SEA-97G2毒株,鉴于国内和周边***流行的复杂现状及***各血清型之前无交叉免疫的现象,现急需研制针对O型和A型流行毒株的针对性疫苗,且要求该疫苗具备高效性,广谱性,能同时预防多个毒株,对当前流行毒株都有效保护等特点,为我国和周边流行国家提供一种高效的疫苗。
反向遗传操作技术能实现对病毒基因的修饰与改造,克服了从流行毒株驯 化疫苗株耗时费力,抗原性差,抗体应答晚等自然属性制约,实现更为主动的疫苗毒株构建和改良。因此,本研究利用已建立的具有较强细胞免疫应答毒株的反向遗传操作***为框架,制备含筛选的O型Mya-98毒株抗原骨架的疫苗株,联合利用反向遗传技术已研制成功的A型***重组疫苗株,制备***O型、A型二价灭活疫苗,获得生产性能好、抗原匹配性好,抗原谱广,能够同时预防O型和A型***,免疫效力强,免疫持续期长等为特征的二价疫苗。
发明内容
本发明涉及一种***病毒疫苗组合物、一种制备所述***病毒疫苗组合物的方法、以及所述***病毒疫苗组合物在制备用于预防和/或控制动物***疾病的药物中的用途。
一方面,本发明涉及一种***病毒疫苗组合物。
在某些实施方式中,所述***病毒疫苗组合物包含第一***病毒疫苗和第二***病毒疫苗,所述第一***病毒疫苗包含含有第一***重组核酸或由第一***重组核酸编码的第一***病毒,所述第一***重组核酸的序列包含非O/JSCZ/2013株的***病毒株的核酸序列,但是非O/JSCZ/2013株的***病毒株的核酸序列中相互毗邻的L基因、P1基因及P2基因被***病毒株O/JSCZ/2013株的核酸序列中相对应的基因片段替换,所述第二***病毒疫苗为非O型的***病毒株。
在本申请中,“非O型的***病毒株”是指***病毒的核酸的部分或全部不是来源于O型血清型的毒株,例如,可以是来自于A、Asial、C、SAT1、SAT2或者SAT3型的***病毒株。
在某些实施方式中,所述O/JSCZ/2013株的核酸序列中相对应的基因片段 与所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株的相互毗邻的L基因、P1基因及P2基因等长或者不等长。在某些实施方式中,所述O/JSCZ/2013株的核酸序列中相对应的基因片段如SEQ ID NO:1所示。在某些实施方式中,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株中被替换的L基因的序列为所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株的L基因中与P1基因相连接的至少100个连续的核苷酸序列,例如105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个或者180个连续的核苷酸序列。在某些实施方式中,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株中被替换的L基因的序列为所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株的L基因中与P1基因相连接的177个连续的核苷酸序列。在某些实施方式中,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株中被替换的P2基因的序列为所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株的P2基因中与P1基因相连接的至少1000个连续的核苷酸序列,例如1050个、1100个、1150个、1200个、1201个、1202个、1203个、1204个、1205个、1206个、1207个、1208个、1209个或者1210个连续的核苷酸序列。在某些实施方式中,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株中被替换的P2基因的序列为所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株的P2基因中与P1基因相连接的1206个连续的核苷酸序列。在某些实施方式中,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株的L基因中与P1基因相连接的177个连续的核苷酸序列、全部P1基因、以及P2基因中与P1基因相连接的1206个连续的核苷酸序列被如SEQ ID NO:1所示的序列替换。
如本领域技术人员所知,在***病毒的基因组中,L基因、P1基因和P2基因从5’端至3’端依次排列。在本申请中,“相互毗邻的L基因、P1基因及P2 基因”是指L基因的3’端与P1基因的5’端可操作地连接,P1基因的3’端与P2基因的5’端可操作地连接。
在本申请中,“L基因”是指***病毒的基因组中L基因的一部分或全部,例如,L基因中与P1基因相连接的至少100个连续的核苷酸序列,例如105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个或者180个连续的核苷酸序列。
在本申请中,“P2基因”是指***病毒的基因组中P2基因的一部分或全部,例如,P2基因中与P1基因相连接的至少1000个连续的核苷酸序列,例如1050个、1100个、1150个、1200个、1201个、1202个、1203个、1204个、1205个、1206个、1207个、1208个、1209个或者1210个连续的核苷酸序列。
在本申请中,“***病毒株O/JSCZ/2013株的核酸序列中相对应的基因片段”是指***病毒株O/JSCZ/2013株的基因组中相互毗邻的L基因、P1基因及P2基因,其中L基因可以是O/JSCZ/2013株L基因的全部或者一部分,P2基因可以是O/JSCZ/2013株P2基因的全部或者一部分。
在本申请中,“非O/JSCZ/2013株的***病毒株”是指***病毒的核酸的部分或全部不是来源于O/JSCZ/2013株的毒株,例如,可以是来自于O/CHA/99株、O/GDBY/2010株、A/GD/2013株及OIE推荐的高效疫苗株等***病毒株。在某些实施方式中,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株为O/CHA/99株。
在某些实施方式中,所述第一***病毒疫苗为O型***病毒疫苗株。在某些实施方式中,所述第一***病毒疫苗能够激发对O型***病毒株的免疫活性。在某些实施方式中,所述O型***病毒株为Mya-98、PanAsia或 Cathay谱系毒株。在某些实施方式中,所述O型***病毒株为O/BY/CHA/2010、O/0834或O/0718,并且所述第一***病毒疫苗对O/BY/CHA/2010、O/0834或O/0718的PD50值均大于6。
在某些实施方式中,所述第二***病毒疫苗包含A、Asial、C、SAT1、SAT2和SAT3型中任一血清型的***病毒疫苗株。在某些实施方式中,所述第二***病毒疫苗为A型***病毒疫苗株。在某些实施方式中,所述第二***病毒疫苗能够激发对A型***病毒株的免疫活性。在某些实施方式中,所述A型***病毒株为SEA-97G1或SEA-97G2毒株。在某些实施方式中,所述A型***病毒株为A/WH/09或A/GDMM/2013,并且所述第二***病毒疫苗对A/WH/09和A/GDMM/2013的PD50值均大于6。在某些实施方式中,所述第二***病毒疫苗为A型***病毒重组疫苗株。在某些实施方式中,所述A型***病毒重组疫苗株包含如SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
在某些实施方式中,所述A型***病毒重组疫苗株的基因组包含***病毒株O/CHA/99株的核酸序列,但是其中相互毗邻的部分L基因与P1基因片段被***病毒株A/WH/CHA/09株的核酸序列中相对应的基因片段替换。在某些实施方式中,所述A/WH/CHA/09株的核酸序列中相对应的基因片段与所述O/CHA/99株的部分L基因与P1基因片段等长或者不等长。在某些实施方式中,所述A/WH/CHA/09株的核酸序列中相对应的基因片段如SEQ IDNO:4所示。
在本申请中,“相互毗邻的部分L基因与P1基因片段”是指部分L基因的3’端与P1基因的5’端可操作地连接。
在本申请中,“***病毒株A/WH/CHA/09株的核酸序列中相对应的基因片段”是指***病毒株A/WH/CHA/09株的基因组中相互毗邻的L基因和P1基因片段,其中L基因可以是A/WH/CHA/09株L基因的全部或者一部分,P1 基因可以是A/WH/CHA/09株P1基因的全部或者一部分。
在某些实施方式中,所述第一***病毒疫苗和所述第二***病毒疫苗之间无免疫抑制。在本申请中,“无免疫抑制”是指所述第一***病毒疫苗和所述第二***病毒疫苗在免疫动物以后不会显著削弱对方的免疫效果。
在某些实施方式中,所述***病毒疫苗组合物能够激发对O型***病毒株的免疫活性。在某些实施方式中,所述O型***病毒株为Mya-98、PanAsia或Cathay谱系的流行毒株。在某些实施方式中,所述O型***病毒株为O/BY/CHA/2010、O/0834或O/0718,并且所述疫苗组合物对O/BY/CHA/2010、O/0834或O/0718的PD50值均大于6。
在某些实施方式中,所述***病毒疫苗组合物能够激发对A型***病毒株的免疫活性。在某些实施方式中,所述A型***病毒株为SEA-97G1或SEA-97G2毒株。在某些实施方式中,所述A型***病毒株为A/WH/09或A/GDMM/2013,并且所述疫苗组合物对A/WH/09和A/GDMM/2013的PD50值均大于6。
另一方面,本发明涉及一种制备***病毒疫苗组合物的方法,其包含如下步骤:(a)培养第一***病毒疫苗株并采集;(b)培养第二***病毒疫苗株并采集;(c)将步骤(a)中采集的第一***病毒疫苗株和步骤(b)中采集的第二***病毒疫苗株灭活后进行混合。在某些实施方式中,在混合之后再对***病毒疫苗株进行乳化。在某些实施方式中,所述乳化是与ISA 206佐剂以体积比1:1进行。
在某些实施方式中,所述步骤(a)包含如下步骤:
1)、用特异性引物OP12A-F和OP12A-R与O/JSCZ/2013毒株的cDNA核酸混合,以扩增得到O/JSCZ/2013毒株的L基因、P1基因及P2基因片段,将 获得的基因片段替换***真核转录质粒prO/CHA/99中,得到prO-FMDV的重组质粒,所述特异性引物分别是:
OP12A-F:5'-TTTTCCTTAAGGGACAGGAACACGCCGTGTTTGCCTGCGT-3'(SEQ ID NO:2)
OP12A-R:5'-ACTCACATCGATGTCAAAGTGAAACCTTC-3'(SEQ ID NO:3);
2)、用步骤1)得到的真核转录质粒prO-FMDV转染***病毒敏感细胞,获得第一***病毒疫苗株。
在某些实施方式中,所述O/JSCZ/2013毒株的L基因、P1基因及P2基因包含如SEQID NO:1所示的核酸序列。在某些实施方式中,所述***病毒敏感细胞为BHK-21细胞或IBRS-2细胞。在某些实施方式中,获得的所述第一***病毒疫苗株的146S抗原含量为4.0μg/mL以上(146S抗原含量的测定方法如中国发明专利ZL201310017378.8所述,其全文通过引用并入本申请)。在某些实施方式中,所述灭活用二乙烯亚胺进行。在某些实施方式中,在所述灭活之后对所述第一***病毒疫苗株进行乳化。在某些实施方式中,所述乳化是与ISA 206佐剂以体积比1:1进行。
在某些实施方式中,所述步骤(b)包含如下步骤:
1)、用特异性引物AP1-F和AP1-R与A/WH/CHA/09毒株的cDNA核酸混合,以扩增得到A/WH/CHA/09毒株的部分L基因与P1基因片段,将获得的基因片段替换***真核转录质粒prO/CHA/99中,得到prA-FMDV的重组质粒,所述特异性引物分别是:
AP1-F:5'-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3'(SEQ ID NO:5);
AP1-R:5'-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc-3'(SEQ ID NO:6);
2)、用步骤1)得到的真核转录质粒rA-FMDV转染***病毒敏感细胞,获得第二***病毒疫苗株。
在某些实施方式中,所述第二***病毒疫苗株包含如SEQ ID NO:4所示的核酸序列。在某些实施方式中,所述***病毒敏感细胞为BHK-21细胞或IBRS-2细胞。在某些实施方式中,获得的所述第二***病毒疫苗株的146S抗原含量为4.0μg/mL以上(146S抗原含量的测定方法如中国发明专利ZL201310017209.4所述,其全文通过引用并入本申请)。在某些实施方式中,所述灭活用二乙烯亚胺进行。在某些实施方式中,在所述灭活之后对所述第二***病毒疫苗株进行乳化。在某些实施方式中,所述乳化是与ISA 206佐剂以体积比1:1进行。
在某些实施方式中,所述第一***病毒疫苗株和所述第二***病毒疫苗株适于悬浮细胞培养。在某些实施方式中,所述第一***病毒疫苗株和所述第二***病毒疫苗株可以以适当的比例混合。可以将所述第一***病毒疫苗株和所述第二***病毒疫苗株分别制成具有一定病毒滴度的抗原液,灭活后再根据测得的抗原含量计算混合的比例。在某些实施方式中,所述第一***病毒疫苗株和所述第二***病毒疫苗株按抗原含量4:1到1:4的比例混合,例如,按抗原含量4:1、3:1、2:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5或1:4的比例混合。在某些实施方式中,所述混合是将所述第一***病毒疫苗株和所述第二***病毒疫苗株按抗原含量1:1的比例进行混合。在某些实施方式中,所述灭活用二乙烯亚胺进行。在某些实施方式中,在所述灭活之后对所述疫苗组合物进行乳化。在某些实施方式中,所述乳化是与ISA 206佐剂以体积比1:1进行。
另一方面,本发明涉及所述***病毒疫苗组合物在制备用于预防和/或控 制动物***疾病的药物中的用途。在某些实施方式中,所述***疾病为A、O、C、Asial、SAT1、SAT2、或者SAT3型***疾病。在某些实施方式中,所述***疾病为O型***疾病。在某些实施方式中,所述***疾病为A型***疾病。在某些实施方式中,所述动物为偶蹄类动物。在某些实施方式中,所述动物为猪、牛或羊。
本发明具有如下积极效果:
本发明利用成熟的反向遗传技术,构建了病变时间短、病毒滴度高、抗原匹配性高、病毒产量高的O型重组疫苗株,联合已经研制成功的A型***重组疫苗株,制备***O型、A型二价灭活疫苗,获得生产性能好、抗原匹配性好,抗原谱广,能够同时预防O型和A型***,増强免疫效力,延长免疫持续期等为特征的二价疫苗。解决了筛选疫苗种毒的生产和驯化的问题,实现了首例利用反向遗传技术构建的疫苗种毒研制高效二价灭活疫苗。
1)、在病毒水平上提高了***疫苗株的生产性能,O型重组疫苗株和A型重组疫苗株的病变时间降低,病毒滴度提高,降低了抗原生产成本。
2)、提高了疫苗毒株抗原匹配性和免疫应答性,本发明构的O型重组疫苗毒株和A型重组疫苗株的结构蛋白与流行毒株一致,抗原匹配性完全匹配,提高了疫苗株与流行毒株的针对性。
3)、本发明的O型***重组疫苗株和A型***重组疫苗株均能够在悬浮BHK-21细胞上快速、大量增殖,O型重组疫苗株病变收获时间集中在8~14小时,抗原含量可达4.0μg/mL以上;A型重组疫苗株接种后6~10小时抗原含量可达4.0μg/mL以上。抗原含量的提升有效地节约了生产成本。
4)、本发明的O型***重组疫苗株和A型***重组疫苗株均具有抗原谱广的特点,O型重组疫苗株的结构蛋白是从经过大量筛选的Mya98毒株中扩 增得到的,选择的毒株抗原位点与本谱系的流行毒株匹配性好,与其他谱系,PanAsia和Cathay的流行毒株抗原交叉重叠。通过交叉免疫攻毒试验表明,O型重组疫苗株能够有效保护Mya-98、PanAsia和Cathay流行毒株;A型***重组疫苗株也具有交叉免疫保护特性,能够有效保护SEA-97G1毒株和G2毒株,实现了疫苗的抗原广谱性。
5)、制备的***O型、A型二价灭活疫苗,免疫动物,能有效刺激机体产生免疫应答,O型抗原和A型抗原间具有协同增强免疫应答的作用,免疫持续期提升至6个月左右,大幅度增强了***疫苗的免疫效力。
6)、本发明技术改变了疫苗毒筛选驯化技术受病毒自然属性制约大、费时费力、成功率低的缺陷,实现了更为主动有效的疫苗毒株构建,更实现了***灭活疫苗毒种制备工艺的革新,具有重大应用价值。
附图说明
图1为实施例1中FMDV O/JSCZ/2013株L基因、P1基因及P2基因片段的电泳图,其中1为扩增片段,M为DNA marker。
图2为实施例1中O型***病毒重组质粒prO-FMDV的构建策略示意图。
图3为实施例2中重组病毒rO-FMDV感染BHK-21细胞后引起的细胞病变效应(CPE),其中A表示正常BHK-21细胞;B表示出现CPE的BHK-21细胞。
图4为SEQ ID NO:1的核酸序列。
图5为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列。
图6为SEQ ID NO:4的核酸序列。
图7为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列。
具体实施方式
本发明结合国家***参考实验室近年来的毒株积累和对其全基因组序列 的分析研究,扩增O型***病毒O/JSCZ/2013株L基因、P1及P2基因,通过选择合适的限制性内切酶位点与已经建立的O型***病毒O/CHA/99株的拯救***中相应核苷酸序列进行替换,得到一种O型***病毒重组质粒prO-FMDV,在BHK-21细胞或IBRS-2细胞上拯救后,得到O型***重组病毒rO-FMDV,其与流行毒的抗原匹配性完全匹配,且与PanAsia和Cathay谱系的流行毒株抗原交叉重叠,抗原谱广。该重组疫苗株生产性能好,用悬浮BHK-21细胞生产,其抗原含量可达4.0μg/mL以上,制备的疫苗可有效刺激机体产生强的抗体应答,具有高滴度、高抗原产能、抗原谱广、致病性降低、抗体应答水平较高、免疫保护率高的特点。将得到的O型重组疫苗株联合利用反向遗传技术构建并研制成功的A型***重组疫苗株,制备***O型、A型二价灭活疫苗,该疫苗免疫猪和牛,能够有效刺激机体产生强的免疫应答,抗体应答水平高,抗原间有协同增强免疫应答的作用,免疫保护率高,免疫持续期长。对目前流行于国内的O型Mya 98毒株、PanAsia毒株、Cathay毒株和A型SEA-97G1毒株和G2毒株均能够提供良好的免疫保护效力。
下面结合具体实施实例对本发明做进一步地描述,但具体实施并不对本发明做任何限定。
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规条件,如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.赛德曼等主编,马学军,舒跃龙译,北京:科学出版社,2004)中所述的方法进行。
实施例1.O型***重组病毒感染性克隆的构建
本发明人所用O/JSCZ/2013毒株由农业部兽医局指定国家***参考实验室保藏,公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。根据O/JSCZ/2013株基因组序列,设计合成一对扩增引物,OP12A-F (5'-TTTTCCTTAAGGGACAGGAACACGCCGTGTTTGCCTGCGT-3')和OP12A-R(5'-ACTCACATCGATGTCAAAGTGAAACCTTC-3'),用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取O/JSCZ/2013毒株的总RNA,用引物oligNot I(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反转录合成第一链cDNA,用具有极强延伸能力的PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa公司)反转录酶,按照产品说明书配制20μL反应体系,于42℃反应1h备用,以反转录的第一链cDNA为模板,用引物OP12A-F和OP12A-R与O/JSCZ/2013毒株的cDNA核酸混合,扩增获得O/JSCZ/2013毒株的基因片段。扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA(TaKaRa公司)DNA聚合酶,按照产品说明书配制50μL反应体系,扩增条件为:94℃5min,94℃30s,57℃30s,72℃3min30s,35个循环后,72℃10min,纯化回收PCR扩增产物并送测序,扩增产物的电泳结果如图1所示,大小为3591bp,与预期大小相符,测序结果显示是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
将得到的含有O/JSCZ/2013毒株L基因、P1和P2基因片段以及O型***病毒O/CHA/99株拯救***的质粒prO/CHA/99(公开于授权专利“Asia1型***重组病毒及其制备方法和应用”ZL201310175323.X和“A型***重组疫苗株及其制备方法和应用”ZL201310175324.4中,其全文通过引用并入本申请中)分别用AflII和ClaI双酶切后,纯化回收相应的目的片段,连接、转化至JM109感受态细胞中,测序鉴定阳性克隆,获得含O/JSCZ/2013毒株L基因、P1及P2基因的重组质粒prO-FMDV,构建方法如图2所示。
实施例2.O型***重组病毒的拯救
用Plasmid Plus Maxi Kit(QIAGEN公司)制备由实施例1得到的重组质粒prO-FMDV,当BHK-21细胞生长至80%时用于转染,在脂质体 LipofectamineTM2000(Invitrogen)的介导下将4μg重组质粒转染BHK-21细胞,同时设立脂质体对照和正常细胞对照,放置于含5%CO2的37℃培养箱中,转染6h后弃去上清,加入MEM培养基,继续培养,观察细胞状态及细胞病变情况,待细胞出现90%左右病变时收获病毒,反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞,直到病毒能稳定地产生细胞病变,出现细胞变圆,聚集成葡萄状分布,最终细胞崩解成碎片。将得到的O型***重组病毒命名为rO-FMDV,在图3中,A:为正常对照BHK-21细胞图片;B:拯救的重组病毒rO-FMDV感染BHK-21细胞出现的CPE的图片。
实施例3.RT-PCR鉴定O型***重组病毒
将稳定传代的重组病毒rO-FMDV感染BHK-21细胞的上清用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA,反转录后,扩增,纯化回收后送测序,结果显示获得的重组O型***病毒的L基因、P1及P2基因与O/JSCZ/2013株的基因序列是一致的。
实施例4.A型***重组病毒感染性克隆的构建
本发明人所用A/WH/CHA/09毒株由农业部兽医局指定国家***参考实验室保藏,公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取A/WH/CHA/09毒株的总RNA,用引物oligNot I(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反转录合成病毒第一链cDNA,以合成的第一链cDNA为模板,用引物AP1-F(5'-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3')和AP1-R(5'-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc-3')扩增获得A/WH/CHA/09毒株的基因片段。扩增用适合长片段扩增、性能优良的LA(TaKaRa公司)DNA聚合酶,按照产品说明书构建50μL反应体系,扩增条件为:94℃5min, 94℃30s,57℃30s,72℃2min 30s,35个循环,72℃8min,PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序,测序结果显示是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
将得到的含有A/WH/CHA/09毒株部分L基因和P1片段和O型***病毒O/CHA/99株拯救***的质粒prO/CHA/99分别用AflII和SgrAI双酶切后,纯化回收相应的目的片段,连接、转化至JM109感受态细胞中,测序鉴定阳性克隆,获得含A/WH/CHA/09毒株部分前导蛋白L和结构蛋白P1的重组质粒prA-FMDV(所用质粒与方法公开于授权专利“A型***重组疫苗株及其制备方法和应用”ZL201310175324.4,其全文通过引用并入本申请中)。
实施例5.A型***重组病毒的拯救
用Plasmid Plus Maxi Kit(QIAGEN公司)制备由实施例4得到的重组质粒prA-FMDV,当BHK-21细胞生长至80%时用于转染,在脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen)的介导下将4μg重组质粒转染BHK-21细胞,同时设立脂质体对照和正常细胞对照,放置于含5%CO2的37℃培养箱中,转染6h后弃去上清,加入MEM培养基,继续培养,观察细胞状态及细胞病变情况,待细胞出现90%左右病变时收获病毒,反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞,直到病毒能稳定地产生细胞病变,出现细胞变圆,聚集成葡萄状分布,最终细胞崩解成碎片。将得到的A型***重组病毒命名为rA-FMDV。
实施例6.RT-PCR鉴定A型***重组病毒
将稳定传代的重组病毒rA-FMDV感染BHK-21细胞的上清用RNAeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA,反转录后,扩增,纯化回收后送测序,结果显示获得的重组A型***病毒的部分L与P1基因与A/WH/CHA/09株的基因序 列是一致的。
实施例7.***O型、A型重组疫苗株对BHK-21细胞的致病力试验
7.1***O型重组疫苗株对BHK-21细胞的致病力试验
按照常规方法对BHK-21细胞进行消化,加入含10%胎牛血清的MEM细胞培养基,分散于12孔板中,于37℃含有5%CO2的培养箱中培养,待细胞单层长到90%时备用。用MEM以10倍倍比稀释病毒液,将各稀释度(10-4.0~10-9.0)的病毒液分别加入细胞板中,每个稀释度4孔,放入37℃含有5%CO2的培养箱中进行培养,观察3天,用Reed-Muench氏法测定对BHK-21细胞的半数感染量(TCID50)。按照该法测定rO-FMDV的滴度,计算O型***重组疫苗株rO-FMDV的TCID50为10-8.33/mL。
Reed-Muench计算方法是本领域的已有技术,现有文献“Reed,L.J.and Muench,H.(1938)."A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints".The AmericanJournal of Hygiene 27:493–497”中对此已经进行了详细地描述,该文献在此通过引用方式并入本申请用作参考。
7.2***A型重组疫苗株对BHK-21细胞的致病力试验
按7.1中所述的方法,测定实施例5中制备的A型***重组疫苗株rA-FMDV对BHK-21细胞的半数感染量(TCID50)。计算A型***重组疫苗株rA-FMDV的TCID50为10-8.33/mL。
实施例8.BHK-21悬浮细胞培养***O型、A型重组疫苗株
8.1 BHK-21悬浮细胞对O型***重组疫苗株的敏感性试验
将已经使用贴壁BHK-21细胞培养并收获的O型***重组疫苗株 rO-FMDV接种5L生物反应器悬浮细胞,设定适应的溶氧、温度、PH值与转速等,通过定时取样,观察细胞形态并检测样品的病毒含量(表1)。结果表明该疫苗株可以很好的适应BHK-21悬浮细胞,且病变时间短,抗原含量能够达到4.0μg/mL以上,达到制苗要求。通过连续5代的悬浮细胞传代,经RT-PCR扩增测序比对核苷酸突变现象,说明该毒株具有良好的稳定性,可以用悬浮细胞进行重组***O型、A型二价灭活疫苗中O型***抗原的生产制备。
表1 rO-FMDV疫苗株悬浮适应结果
悬浮细胞BHK-21对O型***重组疫苗株具有良好的感染、增殖敏感性,能较好地实现***病毒在细胞内的复制与增殖,出现细胞死亡、裂解等特征性病变,病毒含量高峰规律性集中在8~14小时,同时抗原146S得到提高,连续传代证明疫苗株能够稳定增殖,完全可以使用悬浮BHK-21细胞生产O型***抗原制备重组二价灭活疫苗。
8.2 BHK-21悬浮细胞对A型重组疫苗株的敏感性试验
将已经使用贴壁BHK-21细胞培养并收获的A型***重组疫苗株rA-FMDV接种5L生物反应器悬浮细胞,设定适应的溶氧、温度、PH值与转速等,通过定时取样,观察细胞形态并检测样品的病毒含量(表2)。结果表明该疫苗株可以很好的适应BHK-21悬浮细胞,且病变时间短,抗原含量能够达到4.0μg/mL以上,达到制苗要求。通过连续5代的悬浮细胞传代,经RT-PCR扩增测序比对核苷酸突变现象,结果说明该毒株具有良好的稳定性,可以用悬浮细胞进行重组***O型、A型二价灭活疫苗中A型***抗原的生产制备。
表2 rA-FMDV疫苗株悬浮适应结果
悬浮BHK-21细胞接种A型***重组疫苗株rA-FMDV后,平均7个小时左右溶氧接近于零,之后逐步病变、裂解,并产生大量具有感染性的病毒粒子,说明病毒增殖速度快,致细胞病变时间短于其他毒株。接毒后6~10小时后细胞基本死亡、崩解,活率为零,病毒粒子146S含量可达4.0μg/mL以上,最终收毒时甚至高达6.33μg/mL,说明A型***重组疫苗株rA-FMDV在悬 浮培养的BHK-21细胞中可大量增殖,且BHK-21细胞株对该重组疫苗株具有良好敏感性,通过连续5代悬浮培养,病毒毒价与146S很高,连续传代测序证明疫苗株能够稳定增殖,完全可以使用悬浮BHK-21细胞生产A型***抗原制备重组二价灭活疫苗。
实施例9.O型***重组疫苗的制备和免疫效果评价
9.1疫苗制备
将由悬浮BHK-21细胞制备的重组病毒rO-FMDV灭活,用3mmol/l二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)(Sigma公司)30℃灭活30h,加入阻断剂硫代硫酸钠溶液,4℃过夜,保存备用。灭活抗原经安检后与ISA206佐剂(法国SEPPIC)以1:1比例混合制备疫苗。具体按照《中华人民共和国药典》中兽用生物制品的***灭活疫苗规程制备。安检牛舌部皮下注射灭活病毒2ml/头,连续逐日观察6日,观察期牛健康良好,蹄部和嘴鼻均无异常。实验用牛购自非疫区,并经国家***参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O型抗体均<1:4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。
9.2疫苗免疫攻毒保护试验
将得到的安检合格的O型***重组病毒疫苗分别免疫10头牛,10头猪,同时各设2头非免疫对照,测定其免疫效力。攻毒方法及结果判定方法均按照《Manual ofdiagnostic tests and vaccines for terrestrial animals》(2009年版,世界动物卫生组织(OIE))中所述。
免疫猪28天后,用1000倍猪半数感染剂量(SID50剂量)的流行毒进行攻毒实验,连续观察10天,结果表明,免疫的动物没有临床症状,100%保护,如表3所示。
表3 O型***重组疫苗免疫猪攻毒后临床症状和保护情况
免疫牛28天后,用10000倍牛半数感染剂量(BID50剂量)的流行毒进行攻毒实验,连续观察10天,结果表明:免疫的动物没有临床症状,100%保护,如表4所示。
表4 O型***重组疫苗免疫牛攻毒后临床症状和保护情况
说明用该O型***重组病毒作为疫苗株免疫猪和牛,能有效保护当前O型***流行毒的攻击。
9.3疫苗免疫效力与交叉攻毒试验
按2015年版《中国兽药典》方法进行,***参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O抗体均<1:4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA 抗体检测为阴性。本试验所用动物均严格在ABSL-3实验室圈养。按照2015年版《中国兽药典》记载的半数保护量(PD50)测定方法来测定疫苗的半数保护量,具体方法如下。免疫组每组15头,免疫剂量分1头份、1/3头份、1/9头份,分别免疫,28d后,分别用Mya-98、PanAsia、Cathay的流行代表毒进行攻毒,攻毒剂量为1000倍SID50,每组设3头对照,攻毒方式为肌肉注射。连续观察15日,根据舌面、齿龈、蹄出现水泡等***症状判定病毒液致动物发病情况,动物发病即判为不保护。计算各组免疫动物的保护比例。最后再按照Reed-Muench法分别计算各组的PD50。
免疫效力及交叉攻毒试验测定结果表明,O型***重组毒株对Mya-98、PanAsia和Cathay的PD50分别为13.59、7.05、9.0,对O型不同拓扑型***病毒的免疫保护效力大于OIE推荐的PD50(即,6),是理想的抗O型***重组疫苗,可用于我国及其周边国家O型***病毒的预防和控制,参见表5。
表5 O型***重组疫苗株免疫效力及交叉攻毒保护结果
实施例10.A型***重组疫苗的制备和免疫效果评价
10.1疫苗制备
将由悬浮BHK-21细胞制备的重组病毒rA-FMDV灭活,用3mmol/l二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)(Sigma公司)30℃灭活30h,加入阻断剂硫代硫酸钠溶液,4℃过夜,保存备用。灭活抗原经安检后与ISA206佐剂(法国SEPPIC)以1:1比例混合制备疫苗。具体按照《中华人民共和国药典》中兽用生物制品的***灭活疫苗规程制备。安检牛舌部皮下注射灭活病毒2ml/头,连续逐日观察6日,观察期牛健康良好,蹄部和嘴鼻均无异常。实验用牛购自非疫区,并经国家***参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测A型抗体均<1:4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。
10.2疫苗免疫效力实验
试验用牛购自非疫区,并经国家***参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测A型抗体均<1:4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。本试验所用动物均严格在ABSL-3实验室圈养。实验用牛分为4组,对照组是免疫过流行毒A/WH/CHA/09制备的疫苗,实验组是免疫过重组rA-FMDV制备的疫苗,攻毒用毒为10000倍BID50的流行毒A/WH/CHA/09。攻毒方式为舌面皮内分多点注射毒液。连续观察15日,根据牛舌面、齿龈、蹄出现水泡、溃疡等***症状判定病毒液致牛发病情况。免疫效力测定结果表明,A型***重组毒株的PD50在10.81~13.59,而流行毒株制备的疫苗PD50为5.57(表6)。
表6 重组毒株与流行毒株PD50实验比较表
实施例11.重组***O型、A型二价灭活疫苗的制备和免疫效果评价
11.1疫苗制备
将由悬浮BHK-21细胞培养的重组疫苗株rO-FMDV及rA-FMDV分别灭活,用3mmol/l二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)(Sigma公司)30℃灭活30h,加入阻断剂硫代硫酸钠溶液,4℃过夜,保存备用。灭活抗原检测146S,经安检后每种抗原按146S 2.0ug/头份(共1mL),抗原溶液与ISA206佐剂(法国SEPPIC)以1:1比例混合进行乳化,制备二价灭活疫苗。具体按照《中华人民共和国药典》中兽用生物制品的***灭活疫苗规程制备。安检牛舌部皮下注射灭活病毒2ml/头,连续逐日观察6日,观察期牛健康良好,蹄部和嘴鼻均无异常。实验用牛购自非疫区,并经国家***参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O型、A型抗体均<1:4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。
11.2疫苗免疫攻毒保护试验
筛选阴性动物,***参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O型、A型抗体均<1:4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。将得到的安检合格的重组***O型、A型二价灭活疫苗免疫猪,同时各设2头非免疫对照,测定其免疫效力。免疫组每组10头,免疫剂量分1头份、1/3头份、1/9头份,O型攻毒株为2010年流行至今的Mya98毒株(O/Mya 98/BY/2010),A型攻毒株选用2013至今优势流行毒株A/GDMM。攻毒方法及结果判定方法均按照《Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals》(2009年版,世界动物卫生组织(OIE))中所述。
免疫猪28天后,用1000倍SID50毒剂量分别进行攻毒实验,连续观察15天,对照猪均至少有一蹄出现水泡或溃疡,免疫猪出现任何***症状即判为不保护。该实验重复3次,根据免疫猪的保护数,按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50(表7)。
表7 重组***O型、A型二价灭活疫苗免疫效力攻毒保护结果
通过3次的疫苗免疫效力实验,其保护效力结果均大于OIE推荐的PD50(即,6),说明用该重组***O型、A型二价灭活疫苗免疫动物,能有效保护当前O型Mya98毒株及A型SEA-97G2毒株这些流行毒株的攻击。
11.3交叉攻毒保护试验
按上述相同的检测方法,筛选阴性动物。将重组***O型、A型二价灭活疫苗免疫猪,免疫组每组15头,免疫剂量分1头份、1/3头份、1/9头份,分别免疫,28d后,O型的交叉攻毒株选用Panasia(O/0834)和Cathay(0718),A型毒株采用2009年流行的(A/WH/09)作为交叉攻毒毒株进行攻毒。攻毒剂量1000倍SID50,每组设3头对照,连续观察15日,根据舌面、齿龈、蹄出现水泡等***症状判定病毒液致动物发病情况,该实验重复3次,免疫效力及 交叉攻毒试验测定结果表明,交叉攻毒试验测得的疫苗半数动物保护数均在6个PD50以上,说明交叉攻毒动物保护效果很好。疫苗免疫动物后能抵抗这些毒株的攻击,可以作为国内预防O型和A型***的二价疫苗。结果见表8。
表8 重组***O型、A型二价灭活疫苗免疫交叉攻毒保护结果
11.4免疫持续期试验
筛选阴性动物,***参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O型、A型抗体均<1:4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。将得到的安检合格的重组***O型、A型二价灭活疫苗按2mL/头剂量免疫猪,分别在免疫后7日、14日、21日、28日、60日、90日、120日、150日、180日、210日采血分离血清进行抗体检测,同时在28日、180日、210日进行攻毒试验。检测各型抗体(表9,表10)并统计攻毒保护情况(表11),结果说明该疫苗具有非常好的抗原保护力与免疫原性,能有效激发血清中和抗体,免疫持续期提升至6个月左右(常规疫苗4个月左右),最终确定了重组***O型、A型二价灭活疫苗的免疫持续期为6个月。
表9 疫苗免疫后O型ELISA抗体水平检测结果
“/”表示未测抗体(动物已进行攻毒试验)
表10 免疫接种后A型ELISA抗体水平检测结果
“/”表示未测抗体(动物已进行攻毒试验)
免疫后7日、14日、21日、28日、60日、90日、120日、150日、180日、210日采血分离血清进行O型、A型抗体检测,于免疫后7日抗体水平开始转阳,14日抗体合格率可达到26%以上,21日抗体合格率达到78%以上,28日抗体合格率可达到98%以上,60日,90日,120日抗体水平处于维持稳定期,150日抗体水平开始下降,180日抗体合格率仍能达到75%以上,210日抗体合格率可达到65%以上。
表11 疫苗免疫后28日、180日、210日攻毒保护率
免疫后28日、180日、210日后进行攻毒试验,疫苗免疫后28日、180日免疫后各型攻毒保护百分率均不低于80%,210日免疫后各型攻毒保护百分率均达到70%。
根据7个月攻毒保护率和测定的抗体效价结果分析,重组***O型、A型二价灭活疫苗的免疫保护力良好,且免疫持续期提升至6个月,大幅度提升了***O型和A型疫苗的免疫效力。
以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可做出其它改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQ ID NO:1
CTTAAGGGACAGGAACACGCCGTGTTTGCCTGCGTCACCTCCAACGGGTGGTACGCGATCGACGACGAAGAATTCTACCCCTGGACGCCAGATCCGTCCGACGTGCTGGTCTTTGTCCCGTACGATCAAGAACCACTTAATGGAGAATGGAAAGCAAGGGTTCAGAGACGGCTCAAGGGAGCCGGACAATCCAGTCCGGCTACTGGGTCACAGAACCAATCAGGCAACACCGGGAGTATCATCAACAATTACTACATGCAGCAATACCAGAACTCCATGGACACCCAACTTGGTGACAATGCTATCAGCGGAGGCTCCAACGAGGGATCCACAGACACAACCTCCACCCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGTTGGCCAGCTCTGCCTTCAGCGGTCTTTTCGGCGCCCTCCTCGCCGATAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCACCACCCGAAACGGACACACCACCTCGACAACCCAGTCGAGTGTTGGCATAACGCACGGGTACGCAACAGCTGAGGATTTTGTGAACGGGCCAAACACCTCTGGTCTTGAGACCAGAGTTGTCCAGGCGGAACGGTTCTTTAAAACCCACCTGTTCGACTGGGTCACCAGTGATCCGTTCGGACGGTACTACTTGTTGGAGCTCCCGACTGACCACAAAGGTGTCTACGGCAGCCTGACCGACTCATACGCCTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACCGCTGTGGGGAATCAGTTCAACGGAGGCTGCCTACTGGTGGCCATGGTACCTGAACTTTGTTCCATCGAGCGGAGAGAGCTGTTCCAGCTTACGCTCTTCCCCCACCAGTTCATCAACCCCCGGACGAACATGACAGCCCACATCAAGGTGCCCTTTGTTGGCGTCAACCGTTACGATCAGTACAAGGTACACAAGCCGTGGACCCTTGTGGTTATGGTCGTAGCCCCACTGACTGTCAACACCGAAGGCGCTCCGCAGATCAAGGTGTATGCCAACATCGCACCCACCAACGTGCACGTCGCGGGTGAGTTCCCTTCCAAAGAGGGGATTTTCCCTGTGGCCTGTAGCGACGGTTATGGCGGCTTGGTGACAACTGACCCAAAGACGGCTGACCCCGTTTACGGCAAAGTGTTCAACCCCCCCCGCAACATGTTGCCGGGGCGGTTCACCAACCTCCTGGGCGTGGCTGAGGCTTGCCCCACGTTTCTGCACTTCGATGGTGACGTACCGTATGTGACCACTAAGACGGATTCGGACAGGGTGCTCGCACAATTTGACTTGTCTTTGGCAGCAAAACACATGTCAAACACCTTCCTTGCAGGTCTTGCCCAGTACTACACGCAGTACAGCGGCACCGTTAACCTGCACTTCATGTTCACAGGTCCCACTGACGCGAAAGCGCGTTACATGATTGCGTATGCCCCTCCGGGCATGGAGCCGCCCAAAACACCTGAGGCTGCTGCTCACTGCATTCACGCAGAGTGGGACACGGGTCTGAACTCAAAGTTTACCTTTTCCATCCCCTACCTCTCGGCGGCTGATTACGCGTACACCGCGTCTGACGCTGCTGAGACCACAAATGTTCAGGGATGGGTCTGCTTATTTCAAATAACACACGGGAAAGCTGAGGGTGACGCTCTTGTCGTGCTGGCCAGTGCTGGCAAAGACTTTGAGCTGCGCCTGCCTGTGGACGCTCGGCAACAGACCACTTCGACGGGCGAGTCGGCTGACCCCGTGACTGCCACCGTTGAGAATTACGGTGGCGAGACACAGGTCCAGAGGCGCCACCACACAGACGTCTCATTCATATTGGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACTCAATAAATGTATTGGACCTGATGCAGACCCCCTCCCACACCCTAGTAGGGGCGCTCCTCCGCACTGCCACTTACTATTTCGCTGATCTAGAGGTGGCAGTGAAACACAAGGGGGACCTTACCTGGGTGCCAAATGGAGCACCTGAAGCAGCCTTGGACAACACCACCAACCCAACGGCGTACTATAAGGCGCCGCTTACCCGGCTTGCATTGCCCTACACGGCACCACACCGTGTTTTGGCCACCGTTTACAACGGGAAATGCAAATACGCCGGGGGCTCACTGCCCAACGTGAGAGGCGATCTCCAAGAGCTGGCTCAGAAGGCAGCGAGGCCGCTGCCTACTTCTTTCAACTACGGTGCCATCAAAGCCACTCGGGTGACAGAACTGCTGTACCGCATGAAGAGGGCCGAGACGTACTGTCCTCGGCCCCTTTTGGCTGTTCACCCGAGTGCGGCCAGACACAAACAGAAAATAGTGGCGCCTGTAAAGCAGTCCTTGAACTTTGATCTGCTCAAGTTGGCAGGGGACGTGGAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTTCTCTGACGTCAGGTCAAACTTCACCAAACTGGTGGAAACCATCAACCAGATGCAAGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTTAACCGGTTGGTATCAGCGTTTGAGGAATTGGCCGCTGGGGTGAAAGCCATCAGGACCGGCCTCGACGAGGCCAAACCCTGGTACAAGCTCATCAAGCTCCTGAGCCGCTTGTCATGCATGGCCGCTGTAGCAGCACGGTCCAAGGACCCAGTCCTTGTGGCTATCATGCTGGCTGACACCGGTCTTGAGATTCTGGACAGCACATTTGTCGTGCAGAAAATCTCCGACTCCCTCTCCAGTCTCTTTCACGTGCCGGCCCCCGTCTTCAGTTTCGGAGCTCCGATTCTGCTAGCCGGGTTGGTCAAGGTCGCCTCGAGCTTCTTCCGGTCCACACCCGAGGATCTCGAGAGAGCAGAGAAACAGCTCAAAGCACGTGACATCAATGACATCTTCGCCATTCTCAAGAACGGCGAGTGGCTGGTCAAGTTGATCCTAGCCATCCGCGACTGGATTAAAGCATGGATCGCCTCAGAAGAGAAGTTTGTCACCATGACAGACTTGGTGCCTGGCATCCTTGAAAAGCAGCGGGACCTCAACGACCCGGCCAAGTACAAGGAAGCCAAGGAATGGCTCGACAACGCGCGCCAAACGTGTTTGAAGAGCGGGAACGTCCACATTGCCAACCTGTGCAAAGTGGTCGCCCCAGCACCGAGCAAGTCGAGACCTGAACCCGTGGTCGTGTGCCTCCGCGGCAAATCCGGTCAGGGTAAGAGTTTCCTTGCGAACGTGCTGGCACAAGCCATCTCTACCCACTTTACCGGCAGGACTGACTCAGTTTGGTACTGTCCGCCAGACCCTGACCACTTCGACGGTTACAACCAGCAGACCGTTGTTGTGATGGATGATTTGGGCCAGAATCCCGACGGCAAGGACTTCAAGTACTTCGCCCAGATGGTCTCGACCACGGGGTTCATCCCGCCCATGGCTTCACTTGAGGACAAAGGCAAGCCTTTCAACAGCAAAGTCATCATTGCCACCACCAACCTGTACTCGGGCTTCACCCCGAGAACCATGGTGTGCCCCGATGCGCTGAACCGAAGGTTTCACTTTGACATCGAT
SEQ ID NO:2
TTTTCCTTAAGGGACAGGAACACGCCGTGTTTGCCTGCGT
SEQ ID NO:3
ACTCACATCGATGTCAAAGTGAAACCTTC
SEQ ID NO:4
CTTAAGGGACAGGAACACGCAGTGTTTGCCTGTGTTACCTCCAACGGGTGGTACGCGATTGACGACGAGGACTTTTACCCCTGGACACCAGACCCGTCTGATGTCCTGGTGTTTGTCCCGTATGATCAAGAACCACTCAACGGAGAATGGAAAACAAAGGTTCAGAGGCGACTTAAAGGGGCAGGGCAATCTAGCCCCGCCACCGGGTCGCAGAACCAGTCAGGCAATACCGGCAGCATCATTAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACACAACTTGGTGACAACGCCATCAGCGGAGGATCCAACGAGGGGTCCACGGACACAACCTCTACCCACACAACCAACACCCAAAACAATGACTGGTTCTCAAAACTGGCAAGTTCTGCATTCACCGGTCTTTTCGGCGCACTGCTCGCCGACAAGAAGACCGAAGAGACAACTCTTCTGGAGGACCGTATCCTCACCACTCGTAATGGACACACCACCTCTACAACTCAGTCGAGTGTGGGGGTCACCTACGGGTATTCAACTGGTGAGGACCACGTTTCTGGACCTAACACATCAGGTTTGGAGACGCGGGTGGTACAAGCTGAAAGGTTCTTCAAGAAGCACTTGTTTGATTGGACAACGGACAAACCCTTTGGTCACATTGAAAAGCTGGAACTTCCCACTGATCACAAAGGTGTCTACGGACAGCTGGTGGACTCCTTTGCATACATGAGAAATGGCTGGGACGTGGAGGTGTCTGCTGTTGGCAACCAGTTCAACGGCGGGTGCCTTCTCGTGGCCATGGTACCTGAGTTTAAGGAGTTCACCACACGTGAAAAGTACCAGCTCACCCTGTTCCCCCACCAGTTCATTAGCCCCAGAACCAACATGACCGCGCACATCACGGTCCCGTACCTTGGTGTGAACAGGTATGACCAGTACAACAAACACAAACCCTGGACGTTGGTGGTGATGGTGGTTTCGCCACTTACCACTAGCTCCATTGGTGCATCACAGATTAAGGTCTACACCAACATCGCCCCGACCCACGTTCACGTGGCTGGCGAGCTCCCGTCGAAAGAGGGGATCGTGCCAGTCGCCTGCTCGGACGGGTACGGTGGCCTGGTGACAACAGACCCTAAAACAGCTGACCCTGCTTACGGTATGGTGTACAACCCACCTAGGACCAACTACCCCGGGCGGTTTACAAACTTGTTGGACGTGGCAGAGGCGTGCCCCACCTTCCTCTGTTTCGACGACGGGAAACCGTACGTTGTGACAAGAACGGACGAGCAGCGCCTCTTGGCCAAGTTTGACCTTTCCCTTGCTGCAAAGCACATGTCAAACACCTACCTTTCAGGGATAGCACAGTACTACGCACAGTACTCTGGCACCATCAATTTGCACTTCATGTTTACTGGTTCCACTGACTCAAAGGCCCGTTACATGGTGGCTTACGTCCCGCCCGGCGTGACAACGCCACCGGACACGCCTGAGAGAGCTGCGCACTGCATCCACGCAGAATGGGACACGGGGCTAAACTCCAAATTCACTTTTTCAATCCCATACGTATCTGCTGCAGATTACGCGTACACAGCGTCCGATGTGGCAGACACAACAAACGTACAGGGATGGGTTTGCATCTACCAAATCACCCATGGGAAGGCCGAACAAGACACTCTGGTTGTGTCGGTCAGCGCCGGCAAAGACTTTGAGCTGCGCCTCCCCATTGACCCCCGTGCGCAAACCACCGCCACCGGGGAATCAGCAGACCCCGTCACAACCACCGTCGAGAACTACGGTGGTGAGACACAAGTGCAGCGACGCCACCACACCGACGTCAGCTTCATAATGGACAGGTTTGTGCAAATCAAGCCTGTGAGCCCCACACATGTCATTGACCTCATGCAAACACACCAACACGGGCTGGTGGGCGCTATGTTGCGCGCGGCCACCTACTACTTTTCTGATCTTGAGATTGTGGTGAACCACACGGGTCGCCTAACGTGGGTACCCAATGGAGCACCTGAGGCAGCACTGGACAACACGAGCAACCCCACTGCTTACCACAAAGCACCGTTCACACGGCTTGCACTCCCTTACACCGCGCCACACCGCGTGTTGGCAACTGTGTACAACGGGAATAGCAAGTACTCTGCGCCTGCAACACGGCGAGGTGACTTGGGGTCTCTCGCGGCGAGGCTCGCCGCACAGCTTCCTGCCTCCTTCAACTACGGCGCGATTCGAGCCACGGAGATCCAAGAACTCCTCGTGCGCATGAAGCGTGCCGAGCTCTACTGCCCCAGGCCACTGCTGGCGGTGGAGGTGACGTCACAAGACAGACACAAGCAGAAAATTATTGCACCGGTG
SEQ ID NO:5
ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt
SEQ ID NO:6
tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc
Claims (10)
1.一种***病毒疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物包含第一***病毒疫苗和第二***病毒疫苗,所述第一***病毒疫苗包含含有第一***重组核酸或由第一***重组核酸编码的第一***病毒,所述第一***重组核酸的序列包含非O/JSCZ/2013株的***病毒株的核酸序列,但是非O/JSCZ/2013株的***病毒株的核酸序列中相互毗邻的L基因、P1基因及P2基因被***病毒株O/JSCZ/2013株的核酸序列中相对应的基因片段替换,所述第二***病毒疫苗为非O型的***病毒株。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物,其特征在于,所述O/JSCZ/2013株的核酸序列中相对应的基因片段如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1或2所述的疫苗组合物,其特征在于,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株的L基因中与P1基因相连接的177个连续的核苷酸序列、全部P1基因、以及P2基因中与P1基因相连接的1206个连续的核苷酸序列被如SEQ ID NO:1所示的序列替换。
4.如权利要求1-3中任一项所述的疫苗组合物,其特征在于,所述非O/JSCZ/2013株的***病毒株为O/CHA/99株。
5.如权利要求1-4所述的疫苗组合物,其特征在于,所述第一***病毒疫苗为O型***病毒疫苗株。
6.如权利要求1-5中任一项所述的疫苗组合物,其特征在于,所述第二***病毒疫苗为A型***病毒重组疫苗株。
7.如权利要求6所述的疫苗组合物,其特征在于,所述A型***病毒重组疫苗株包含如SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
8.一种制备如权利要求1-7中任一项所述的疫苗组合物的方法,其特征在于,包含如下步骤:
(a)、培养第一***病毒疫苗株并采集;
(b)、培养第二***病毒疫苗株并采集;
(c)、将步骤(a)中采集的第一***病毒疫苗株和步骤(b)中采集的第二***病毒疫苗株灭活后进行混合。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述混合是将所述第一***病毒疫苗株和所述第二***病毒疫苗株按抗原含量1:1的比例进行混合。
10.如权利要求1-7中任一项所述的疫苗组合物在制备用于预防和/或控制动物***疾病的药物中的用途。
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