CN107028883A - 运载姜黄素纳米乳的制备方法 - Google Patents
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Abstract
运载姜黄素纳米乳的制备方法,属于姜黄素纳米乳技术领域。本发明解决现有公开的运载姜黄素的纳米乳制备方法存在安全隐患、成本高的技术问题。本发明方法:一、将β‑伴大豆球蛋白经超声、酶解或者糖基化处理制备水相;二、将水相与油相混合,所述油相是由姜黄素和中链甘油三酯配制的,然后均质,再置于超声波细胞粉碎机中处理,即得到运载姜黄素纳米乳。本发明的方法制备的运载姜黄素的纳米乳包封率高。本发明所提供的方法降低了制备成本的同时能够保证所制备姜黄素纳米乳健康安全、品质优良,更适用于工业生产。
Description
技术领域
本发明属于姜黄素纳米乳技术领域;具体涉及运载姜黄素纳米乳的制备方法。
背景技术
姜黄素是一种从姜黄属植物如姜黄、莪术、菖蒲、郁金等根茎中提取出的酸性多酚类化合物,它具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、保肝利胆、调节血脂等药理活性。
然而,姜黄素属于亲脂类物质,水溶性差,以固体颗粒、悬浮液等方式服入体内生物利用率低,难以达到应有的保健作用。
现有公开的运载姜黄素的纳米乳制备方法仍然存在着不足,如采用低能乳化法制备纳米乳,需要使用大量的乳化剂,同时受方法原理的限制只能使用合成型乳化剂,这类运载姜黄素的纳米乳投入生产商品化后存在着安全隐患问题;另外现有采用高能乳化法制备纳米乳,虽然可以使用天然生物大分子作为乳化剂,然而研究表明这些生物大分子的乳化性能不如传统合成型乳化剂,并且当投入工业生产时需要考虑成本问题。
发明内容
本发明解决现有公开的运载姜黄素的纳米乳制备方法存在安全隐患、成本高的技术问题;而提供了运载姜黄素纳米乳的制备方法。
为解决上述技术问题,本发明中运载姜黄素纳米乳的制备方法是按下述步骤实现的:
步骤一、将β-伴大豆球蛋白经超声、酶解或者糖化处理制备水相;
步骤二、将水相与油相混合,所述油相是由姜黄素和中链甘油三酯配制的,然后均质,再置于超声波细胞粉碎机中处理,即得到运载姜黄素纳米乳。
步骤一中将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL去离子水中搅拌6h,在200W功率下超声处理15min,得到水相。
步骤一中将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL去离子水中搅拌6h,加入碱性蛋白酶,在pH值为9.0,45℃的条件下酶解,冻干,溶于水,得到浓度为15mg/mL的水相。碱性蛋白酶加入量为5000U/g~20000U/g。
步骤一中将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL PBS(0.02M,pH 9.0)缓冲溶液中得到β-伴大豆球蛋白溶液,再加入葡聚糖DX-40,充分溶解,在90℃条件下反应20~160min冻干,溶于水,得到浓度为15mg/mL的水相。按葡聚糖DX-40与β-伴大豆球蛋白溶液按1:1的质量比添加至β-伴大豆球蛋白溶液中。
步骤二中油相是按下述步骤配制的将0.1g姜黄素溶于10mL中链甘油三酯中,充分搅拌,离心除去不溶物质。
步骤二中按0.618mL油相和20mL的水相混合的配比进行混合。
步骤二中采用高速剪切均质机进行均质处理,转速为10000r/min,处理时间为2min。
步骤二中以400W功率用超声波细胞粉碎仪处理15min。
本发明的方法制备的运载姜黄素的纳米乳包封率高。
本发明所选原材料β-伴大豆球蛋白属于植物蛋白,是大豆储藏蛋白质的主要成分,含量丰富,占大豆种子全蛋白含量的30%。β-伴大豆球蛋白的生产原料低温脱脂豆粕是一种工业副产物,相比其他动植物蛋白,β-伴大豆球蛋白生产成本更低,一旦投入生产将带来巨大的经济效益;相比已经商品化的大豆分离蛋白,β-伴大豆球蛋白乳化性能更好,更适宜作为纳米乳的乳化剂;另外,本发明采用酶解和糖基化的方法修饰β-伴大豆球蛋白,研究了β-伴大豆球蛋白酶解物和糖基化修饰后的β-伴大豆球蛋白为乳化剂制备β-伴大豆球蛋白运载姜黄素的纳米乳体系,这两种方法进一步优化了姜黄素纳米乳的性能。本发明所提供的方法,降低了制备成本的同时,能够保证所制备姜黄素纳米乳健康安全、品质优良,更适用于工业生产。
具体实施方式
具体实施方式一、本实施方式中运载姜黄素纳米乳的制备方法是按下述步骤实现的:
步骤一、将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL去离子水中搅拌6h,在200W功率下超声处理15min,得到水相。通过超声处理提高β-伴大豆球蛋白在水相中的溶解度,使水相中乳化剂(β-伴大豆球蛋白)的乳化能力提高,有利于纳米乳的形成。
步骤二、将20mL水相与0.618mL油相混合,然后置于高速剪切均质机内,以10000r/min的转速均质2min,再置于超声波细胞粉碎机中,以400W功率处理15min,即得到运载姜黄素纳米乳。
其中,步骤二中油相是按下述步骤配制的将0.1g姜黄素溶于10mL中链甘油三酯中,充分搅拌,离心除去不溶物质。
具体实施方式二、本实施方式中运载姜黄素纳米乳的制备方法是按下述步骤实现的:
步骤一、将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL去离子水中搅拌6h,加入碱性蛋白酶,在pH值为9.0,45℃的条件下酶解,冻干,溶于水,得到浓度为15mg/mL的水相。碱性蛋白酶加入量为5000U/g。
步骤二、将20mL水相与0.618mL油相混合,然后置于高速剪切均质机内,以10000r/min的转速均质2min,再置于超声波细胞粉碎机中,以400W功率处理15min,即得到运载姜黄素纳米乳。
其中,步骤二中油相是按下述步骤配制的将0.1g姜黄素溶于10mL中链甘油三酯中,充分搅拌,离心除去不溶物质。
具体实施方式三、本实施方式中运载姜黄素纳米乳的制备方法是按下述步骤实现的:
步骤一、将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL PBS(0.02M,pH 9.0)缓冲溶液中得到β-伴大豆球蛋白溶液,再加入葡聚糖DX-40,充分溶解,在90℃条件下反应80min冻干,溶于水,得到浓度为15mg/mL的水相。按葡聚糖DX-40与β-伴大豆球蛋白溶液按1:1的质量比添加至β-伴大豆球蛋白溶液中。
步骤二、将20mL水相与0.618mL油相混合,然后置于高速剪切均质机内,以10000r/min的转速均质2min,再置于超声波细胞粉碎机中,以400W功率处理15min,即得到运载姜黄素纳米乳。
其中,步骤二中油相是按下述步骤配制的将0.1g姜黄素溶于10mL中链甘油三酯中,充分搅拌,离心除去不溶物质。
采用下述试验验证发明效果
所述的β-伴大豆球蛋白是采用如下方法提取得到的:
低温脱脂豆粕,料:液(蒸馏水)=1:15,调节pH=8.5,45℃搅拌1h,4℃放置2h;然后离心取上清液,调节pH=6.4,4℃放置过夜,离心后取上清液,调节pH=5.4,4℃放置2h,然后离心取上清液,加一倍体积冰水,调节pH4.8,4℃放置2h,离心后沉淀得到β-伴大豆球蛋白。
所述的β-伴大豆球蛋白溶液是采用如下方法制得:
称取1.5gβ-伴大豆球蛋白,溶于100mL去离子水中搅拌6h。取20mL蛋白溶液置于50mL的PE管中,在200W功率下超声处理15min。确保蛋白质发生完全的水和作用。
所述的碱性蛋白酶β-伴大豆球蛋白酶解物溶液是采用如下方法制得:
在pH 9.0,45℃的条件下,使用碱性蛋白质酶解β-伴大豆球蛋白,按酶活大小加入蛋白酶。以5000U/g加酶量使蛋白溶液水解度达到3%、6%、9%、12%,以20000U/g加酶量使蛋白溶液水解度达到15%、18%、21%、24%,采用pH-stat法控制水解度,酶解产物冻干存储。后将酶解物干粉复溶于水,使酶解物浓度达到15mg/mL浓度。
所述的糖基化β-伴大豆球蛋白溶液是采用如下方法制得:
将葡聚糖DX-40按1:1的质量比添加至β-伴大豆球蛋白溶液(PBS 0.02M,pH 9.0)中,搅拌一段时间使其充分溶解,在90℃下反应20、40、60、80、100、120、140、160min,冻干后复溶于水中,使蛋白质含量为15mg/mL。
将1.5gβ-伴大豆球蛋白和1.5g吐温20(对比)分别溶于100mL去离子水中,搅拌均匀后以200W超声功率对蛋白溶液超声处理15min,确保蛋白质发生完全水和作用。将油相加入蛋白质溶液中,在10000rpm转速先均质2min,以超声功率400W,超声时间15min,油相比例3%制备天然β-伴大豆球蛋白纳米乳、吐温20纳米乳。
采用Malvern Nano-S90纳米激光粒度仪测定样品平均粒径Z-average、多分散系数PDI。
β-伴大豆球蛋白纳米乳的平均粒径为229.8±4.1nm,PDI值为0.180±0.016,吐温20平均粒径为195.8±7.0nm,PDI值为0.198±0.004.将4mLβ-伴大豆球蛋白纳米乳,4mL吐温20纳米乳分别放入5mL PE管中,在4000r/min离心10min,后用移液枪在底部取样0.8mL并涡旋混匀;然后取0.1mL于50mL容量瓶中,用水稀释至刻度,用紫外分光光度计于500nm处测吸光度。稳定性用离心稳定常数Ke表示,计算公式如下:
其中A0为离心前纳米乳的吸光度,而A为离心后纳米乳的吸光度。
β-伴大豆球蛋白纳米乳的Ke值为7.38±1.01%,吐温20纳米乳的Ke值为15.26±0.56%。采用Zetasizer Nano Z电位分析仪测定β-伴大豆球蛋白纳米乳、吐温20纳米乳的Zeta-电位。测试前样品用pH 7.0的缓冲溶液稀释100倍。在25℃下测定纳米乳样品的Zeta-电位。β-伴大豆球蛋白纳米乳的Zeta-电位为-30.3±0.92mV,吐温20纳米乳的-17±0.55mV。上述数据表明β-伴大豆球蛋白纳米乳平均粒径虽然大于传统合成型乳化剂吐温20稳定的纳米乳,但β-伴大豆球蛋白纳米乳稳定性更强。
在pH 9.0,45℃的条件下,使用碱性蛋白质酶解β-伴大豆球蛋白。以5000U/g加酶量使蛋白溶液水解度达到3%、6%、9%、12%,以20000U/g加酶量使蛋白溶液水解度达到15%、18%、21%、24%,采用pH-stat法控制水解度,酶解产物冻干存储。后将酶解物干粉复溶于水,使水解物浓度达到15mg/mL浓度。以超声功率400W,超声时间15min,油相体积比例3%制备酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳。采用Malvern Nano-S90纳米激光粒度仪用于测定平均粒径Z-average,水解度3-24%的碱性蛋白酶β-伴大豆球蛋白酶解物纳米乳对应的平均粒径依次为212±9.0nm、204±4.1nm、208.6±6.1nm、194.1±9.0nm、203.8±4.8nm、231.4±7.8nm、272.9±11.2nm、314.6±6.8nm,当水解度为12%所制备的纳米乳粒径最小。
将葡聚糖DX-40按1:1的质量比添加至β-伴大豆球蛋白溶液(PBS 0.02M,pH 9.0)中,搅拌一段时间使其充分溶解,在90℃下反应20、40、60、80、100、120、140、160min,冻干后复溶于水中,使蛋白质含量为15mg/mL。以超声功率400W,超声时间15min,油相体积比例3%制备糖基化改性β-伴大豆球蛋白纳米乳。采用Malvern Nano-S90纳米激光粒度仪用于测定平均粒径Z-average,反应时间由20-160min的糖基化改性β-伴大豆球蛋白纳米乳对应的平均粒径依次为227.0±6.0nm、226.9±9.3nm、222.1±3.3nm、208.7±4.7nm、215.4±3.2nm、220.3±8.4nm、219.6±1.9nm、211.9±3.7nm。其中当反应时间为80min纳米乳粒径最小。
测定运载姜黄素的β-伴大豆球蛋白纳米乳、酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳、糖基化改性β-伴大豆球蛋白纳米乳的包封率,以运载姜黄素的吐温20纳米乳作为对照。取纳米乳5mL于10mL EP管中,在15000r/min离心20min,使样品油相水相分离,用针管在离心管底部取样,使用0.22μm孔径滤膜过滤,用乙醇稀释一定倍数,在波长λ=422nm处测量吸光度。以姜黄素标准品乙醇溶液的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制得到姜黄素的标准曲线,其公式为y=0.1556x-0.0038,R2=0.9991。根据已得到的标曲公式计算清液中含量,再根据下式计算药物包封率:
其中W1为纳米乳样品中姜黄素总含量,W2为水相中姜黄素的含量。测量结果如下,β-伴大豆球蛋白纳米乳的包封率为92.2±1.1%,水解度3%、6%、9%、12%、15%酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳纳米乳包封率分别为93.0±2.3%、92.1±0.5%、91.6±0.5%、91.8±2.0%、92.9±2.3%,糖基化β-伴大豆球蛋白纳米乳包封率为92.1±1.8%,而吐温20纳米乳的包封率仅为84.6±1.7%。本发明的方法制备的运载姜黄素的纳米乳包封率高于传统乳化剂制备的运载姜黄素的纳米乳。
测定运载姜黄素的β-伴大豆球蛋白纳米乳、酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳、糖基化改性β-伴大豆球蛋白纳米乳中姜黄素的稳定性,将姜黄素纳米乳放置在避光4℃条件下保存,以相同含量姜黄素乙醇溶液和中链甘油三酯溶液为对照,通过以10倍乙醇稀释纳米乳样品使其破乳,离心除去蛋白质,在422nm下测定吸光度,以姜黄素标准曲线计算姜黄素的含量。测定一周前后纳米乳中姜黄素总含量的变化。β-伴大豆球蛋白纳米乳的姜黄素保存率为75.7%,水解度为3%、6%、9%、12%、15%的酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳的保存率分别为76.2%、73.8%、71.7%、78.2%、76.5%,糖基化改性β-伴大豆球蛋白纳米乳中姜黄素的保存率为71.4%,而姜黄素在中链甘油三酯和乙醇中的保存率分别为31.5%、26.3%。
测定运载姜黄素的β-伴大豆球蛋白纳米乳、酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳、糖基化改性β-伴大豆球蛋白纳米乳中在胃环境中的释放性能。模拟胃液:0.1mol/L HCl,0.32%(w/v)胃蛋白酶、1%(w/v)聚氧乙烯蓖麻油。将样品与模拟胃液等体积混合,等份分装于小试管中。置于37℃的恒温水浴摇床之中,振荡速率为100r/min。于0、0.5、1、1.5、2、4、6h分别取样,离心分离水相,用乙醇稀释,测量其中姜黄素含量。
其中Ct为t时刻介质中游离姜黄素的浓度(μg/mL),Vt为t时刻的介质体积,C0代表初始状态游离姜黄素浓度(μg/mL),V0代表初始状态介质体积,M为纳米乳中姜黄素总量。β-伴大豆球蛋白纳米乳在6h累计释放率为25.3±1.1%,水解度为3%、6%、9%、12%、15%酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳在6h累计释放率为29.7±0.5%、32.7±0.7%、40.0±3.0%、37.1±0.8%、44.4±2.3%,糖基化β-伴大豆球蛋白纳米乳在6h累计释放率为23.8±1.9%。
测定运载姜黄素的β-伴大豆球蛋白纳米乳、酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳、糖基化改性β-伴大豆球蛋白纳米乳中在肠环境中的释放性能。模拟肠液:PBS(pH 6.8,0.01mol/L),1%(w/v)胰酶、1%(w/v)聚氧乙烯蓖麻油。将样品与模拟肠液等体积混合等份分装于小试管中。置于37℃的恒温水浴摇床之中,振荡速率为100r/min。于0、0.5、1、1.5、2、4、6h分别取样,离心分离水相,用乙醇稀释,测量其中姜黄素含量。
其中Ct为t时刻介质中游离姜黄素的浓度(μg/mL),Vt为t时刻的介质体积,C0代表初始状态游离姜黄素浓度(μg/mL),V0代表初始状态介质体积,M为纳米乳中姜黄素总量β-伴大豆球蛋白纳米乳在6h累计释放率为26.2±1.2%,水解度为3%、6%、9%、12%、15%酶解改性β-伴大豆球蛋白纳米乳在6h累计释放率为27.4±2.6%、27.4±1.6%、28.8±1.6%、29.8±2.1%、28.2±1.4%,糖基化β-伴大豆球蛋白纳米乳在6h累计释放率为25.1±0.8%。
Claims (10)
1.运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于该方法是按下述步骤实现的:
步骤一、将β-伴大豆球蛋白经超声、酶解或者糖化处理制备水相;
步骤二、将水相与油相混合,所述油相是由姜黄素和中链甘油三酯配制的,然后均质,再置于超声波细胞粉碎机中处理,即得到运载姜黄素纳米乳。
2.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于步骤一中将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL去离子水中搅拌6h,在200W功率下超声处理15min,得到水相。
3.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于步骤一中将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL去离子水中搅拌6h,加入碱性蛋白酶,在pH值为9.0,45℃的条件下酶解,冻干,溶于水,得到浓度为15mg/mL的水相。
4.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于碱性蛋白酶加入量为5000U/g~20000U/g。
5.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于步骤一中将1.5gβ-伴大豆球蛋白溶于100mL PBS(0.02M,pH 9.0)缓冲溶液中得到β-伴大豆球蛋白溶液,再加入葡聚糖DX-40,充分溶解,在90℃条件下反应20~160min冻干,溶于水,得到浓度为15mg/mL的水相。
6.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于按葡聚糖DX-40与β-伴大豆球蛋白溶液按1:1的质量比添加至β-伴大豆球蛋白溶液中。
7.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于步骤二中油相是按下述步骤配制的将0.1g姜黄素溶于10mL中链甘油三酯中,充分搅拌,离心除去不溶物质。
8.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于步骤二中按0.618mL油相和20mL的水相混合的配比进行混合。
9.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于步骤二中采用高速剪切均质机进行均质处理,转速为10000r/min,处理时间为2min。
10.根据权利要求1所述的运载姜黄素纳米乳的制备方法,其特征在于步骤二中以400W功率用超声波细胞粉碎仪处理15min。
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