CN107019672A - 一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法 - Google Patents
一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107019672A CN107019672A CN201710222330.9A CN201710222330A CN107019672A CN 107019672 A CN107019672 A CN 107019672A CN 201710222330 A CN201710222330 A CN 201710222330A CN 107019672 A CN107019672 A CN 107019672A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liposome
- hydroxytyrosol
- verbascoside
- polyphenol extract
- rich
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/63—Oleaceae (Olive family), e.g. jasmine, lilac or ash tree
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
- A61K31/05—Phenols
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/314—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry with comparison of measurements at specific and non-specific wavelengths
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法,本发明是以油橄榄叶为原料,经30~50%乙醇提取、陶瓷膜和超滤膜分离,纳滤膜浓缩,制备油橄榄多酚提取物。将90%羟基酪醇与10~40%橄榄苦苷提取物及90%毛蕊花苷复配,制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物,以羟基酪醇和毛蕊花苷多酚为模型材料,由卵磷脂、胆固醇、吐温‑80表面活性剂等组成制成相应的脂质体。此脂质体显著增强油橄榄多酚提取物的生物利用度,包封率高,粒径分布均匀,稳定性好,有缓释性、抗氧化性和抑菌性作用。本发明的制备方法简单可行,设备简单,可扩大其医药领域的应用。
Description
一、技术领域
本发明涉及生物、化学和药品领域,特别涉及羟基酪醇脂质体的制备方法。
二、背景技术
脂质体主要是由类脂材料组成的双分子层空心小球,同时具有亲水性和疏水性两种性质,因此既能包封脂溶性物质又能包埋水溶性物质。将类脂材料分散于水中时,水溶性物质会自发地分布在脂质体的内部,而脂溶性物质分布在脂质体的亲脂端。脂质体的制备方法主要有:薄膜分散法、超声波分散法、冻融法、乙醇注入法、逆相蒸发法等。其理化性质的评价指标主要有:脂质体平均粒径及其粒径分布、包封率、物化稳定性等。制备的脂质体具有靶向性、缓释性、保护性、低剂量、长效性、低毒性等优点。
长循环脂质体又称长效脂质体,是一种表面含有天然或合成聚合物修饰的类脂衍生物的新型脂质体。在血液中驻留时间延长,从而延长药物作用时间,具有长效作用。常用的修饰物有聚乙二醇(PEG)和神经节甘酯(GM1)。GM1增强膜刚性,减少单核吞噬细胞***(MPS)的摄取,这种长循环脂质体在血液中的滞留量与被MPS摄取量的比值高于传统脂质体几十倍。但GM1难以大量获得,且有一定的免疫毒性。含有PEG的类脂衍生物,它们在脂质体表面具有高度修饰的作用,能形成空间位阻层,这种立***阻能够保护脂质体不被识别、摄取,使其消除减慢,作用时间延长。
油橄榄中包含大量的多酚类化合物,如橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等。尤其是羟基酪醇(3,4-二羟基苯乙醇,Hydroxytyrosol,简称HT),清除自由基的能力强,表现出独特的生物和药理活性,如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流、有效地抑制由丙烯醛造成视网膜上皮细胞的氧化损伤和线粒体功能失调,保护软骨和抗骨质疏松等。而且HT还能抑制人类早幼细胞白血病细胞HL-60、结肠癌细胞HT-29、女性乳腺癌细胞MCF-7等扩散,透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡,具有很好的抗癌活性。尽管HT有诸多生物和药理活性,已逐渐引起研究者的关注。但是,HT含有3个酚羟基,暴露在空气中极易被氧化,性质很不稳定。且亲水性强,难以更好地溶于细胞膜结构以增强其功效性。如果将HT制备为脂质体后,不但能保护其不受外界环境因素的影响提高稳定性,还能增强其生物利用度(抗癌、抗菌、抗氧化等生物活性)。
国内外的文献报道了从油橄榄叶或橄榄果提取分离橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等多酚类化合物,但目前采用橄榄叶提取油橄榄多酚提取物大多是10~40%橄榄苦苷提取物,羟基酪醇含量小于10%,毛蕊花苷低于5%,限制油橄榄多酚活性的多功能开发。
三、发明内容
为了解决橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等高活性多酚稳定性与生物活性,本发明找到一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物复合方法,并且加工成长循环脂质体,因此,本发明的技术方案是采用如下步骤来实现:
第一步:油橄榄多酚提取物制备
取油橄榄叶,加入30~50%乙醇提取,油橄榄叶与30~50%乙醇质量体积比(kg∶L)1∶5~20,提取两次,温度70~85℃,合并提取液,滤液过陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000Da超滤膜,再用纳滤膜浓缩滤液,滤液过纳滤膜,橄榄叶与浓缩滤液质量体积比(kg∶L)1∶1~3,浓缩液真空干燥,粉碎成粉制成油橄榄多酚提取物,HPLC分析,其中橄榄苦苷10~40%,毛蕊花苷3~6%,羟基酪醇2~7%,水溶性为100mL水溶解2~8g;
第二步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物制备
将90%羟基酪醇与10~40%橄榄苦苷提取物及90%毛蕊花苷复配,按质量比例为4~8∶2~5∶1~3,加入3~8倍无水乙醇,60~90℃加热回流10~30min,样品充分溶解后过滤,减压浓缩,制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物,其中羟基酪醇为50~70%,橄榄苦苷为10~20%,毛蕊花苷为5~15%;
第三步:薄膜分散-机械振荡法制备长循环油橄榄多酚脂质体
以富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物为包封目标,设计温度40~70℃、卵磷脂与胆固醇质量比为1∶1~8∶1,称卵磷脂与胆固醇质量3~10g,表面活性剂吐温-80体积2~10mL,PEG 200 1~5g,放人圆底烧瓶中,加入适量有机溶剂,超声振荡5~20min,溶解后减压薄膜蒸发除去溶剂,再加入1~4mg/mL羟基酪醇(HT)水溶液1~10mL,油橄榄多酚水溶液1~3mL,旋转洗膜水化时间5~50min,再超声溶解5~30min可得到脂质体。根据单因素与正交设计优化,制备均匀的乳白色长循环脂质体,具有稳定性、缓释性、抗氧化性和抑菌性等功能;
第四步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率
取脂质体于烧杯中,加入去离子水,脂质体与去离子水质量体积比浓度为2~15mg/mL,放入透析袋中,在室温下透析1~15h,HPLC分析水溶性中HT浓度(C)和透析滤液中HT浓度(C0),HT水溶性体积(V),透析滤液的总体积(V0),根据下式计算富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率为20~80%以上;
第五步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体平均粒度及其分布
将1~10mg/mL脂质体放入比色皿中,加入一定量的去离子水,用ZetaPlus型激光粒度仪在光源波长368nm和散射角90°下室温测试,制备的脂质体的粒径分布在200~1000nm。
第六步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性
1.物理稳定性:取1~8mg/mL脂质体悬浊液和相同浓度HT水溶液,分别用4 000r/min~10 000r/min离心机离心10~20min,制备的脂质体在4 000~6000r/min无沉淀和不分层,乳液稳定;于4℃~25℃下贮藏0~30d,脂质体中羟基酪醇和毛蕊花苷稳定,相同条件下比HT水溶液中HT稳定性提高20~40%;
2.水解稳定性:在薄膜分散-机械振荡法制备脂质体悬浮液,在pH值为3.0~7.0的柠檬酸缓冲液(0.1~0.5mol/L柠檬酸溶液与0.2~0.5mol/L磷酸氢二钠溶液),分别测定各脂质体的包封率,结果是,随着水化液pH值的升高,包封率增加。
第七步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的缓释性
配制HT浓度为1~8mg/mL脂质体悬液,移取悬液1~5mL放入透析袋内,将其完全浸入含有100mL生理盐水的烧杯中;将烧杯放入37℃恒温的水浴锅内,在24h内每间隔2h分析透析滤液中HT浓度。与相同浓度HT水溶液作对照,HT水溶液2h内释放了(43.66±1.82)%,脂质体释放了(28.62±1.87)%;24h后,HT溶液和脂质体释放分别为(73.41±1.72)%和(55.72±1.88)%,相同条件下脂质体提高30~65%的缓释性能。
第八步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抗氧化性
将脂质体悬液和HT水溶液样品分别配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/mL的无水乙醇待测溶液。1mL待测样品加入40mg/L DPPH醇溶液3mL,充分混匀后,室温下避光反应30min,在517nm波长下测定吸光度(Ai)。每个样品平行3次,取平均值。经计算得知HT脂质体的IC50为0.5~2μg/mL,为HT水溶液和脂质体对DPPH自由基清除效果大体一致。说明利用脂质体技术把HT制备成相应脂质体后,它对DPPH自由基的清除效果并没有受到影响。
样品溶液对DPPH自由基清除率(η)的计算公式如下:
式中:
A0——1mL待测样品与3mL无水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值);
A1——1mL无水乙醇与3mLDPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值(自由基总值);
Ai——1mL待测样品与3mL DPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值。
第九步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抑菌性
采用菌体浓度为105cfu/mL的菌悬液配制脂质体悬液和HT水溶液样品浓度浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL的样品溶液。将上述配好的溶液放置恒温恒湿培养箱内,37℃培养24h后观察结果,试管中几乎无浑浊现象对应的样品浓度作为此样品的MIC值。每种样品做3个平行测试。在MIC测定结果的基础上,选取未见细菌生长的各管培养液,移取0.1mL涂布于固体培养基上,放置37℃培养箱内,24h后观察结果,仍无细菌生长现象对应的样品浓度作为此样品的MBC值。相对于HT水溶液,脂质体的抑菌效果相当,且对金黄色葡萄球菌的MIC为4~16μg/mL,MBC值为16~64μg/mL。对大肠杆菌的MIC为16~64μg/mL,MBC值为32~128μg/mL。
橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等多酚类化合物具有较好醇溶性,目前市场生产的橄榄提取物不仅橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等多酚类化合物含量低,而且水溶性不好,为了改善橄榄苦苷提取物水溶性,有利于脂质体制备与活性,在本发明中,采用30~50%乙醇提取油橄榄叶,提取两次,温度70~85℃,采用陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000Da超滤膜过滤,再用纳滤膜浓缩滤液,去掉大分子蛋白、多糖、胶质体、单宁等,浓缩物为水溶性小分子橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等多酚类化合物,真空干燥,粉破成粉制成油橄榄多酚提取物,水溶性为100ml水溶解1~6g,具有很好的水溶性。
为了达到油橄榄多酚提取物长循环脂质体的效果,本发明采用薄膜分散-机械振荡法。旋蒸减压成膜压力-0.05~-0.1Mpa,温度50~70℃、真空冷冻干燥成膜压力2~10Mpa,温度-10~-50℃,超声机械振荡功率100~200W,时间20~40min,高速剪切功率500~1000W,时间5~10min,采用其中一种或者几种方法达到薄膜分散的效果。
为了改善油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性,采用磷脂为表面活性乳化剂,优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆磷脂中的一种或复合。为了更好的分散,也添加胆固醇质量3~10g,表面活性剂吐温-80体积2~10mL,PEG 200 1~5g,形成均一稳定的乳相。为了油橄榄多酚提取物及乳化助剂充分溶解形成均相,采用无水乙醇、丙酮、异丙酮和氯仿中的一种作为有机溶剂。
本发明的有益效果表现为:
创新性制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物,羟基酪醇为50~70%,橄榄苦苷为10~20%,毛蕊花苷为5~15%,活性多酚中羟基酪醇、橄榄苦苷和毛蕊花苷比例合理,水溶性高达100ml水溶解6g多酚提取物,浓度高,抗氧化活性更高。
2.采用薄膜分散-机械振荡法制备了油橄榄多酚提取物脂质体,包封率高、粒径分布均匀、稳定性好;
3.制备的富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体具有缓释性,可减少用药次数;
4.制备的富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体具有一定的抗氧化性和抑菌性。
四、附图说明:
附图1温度对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响;
附图2卵胆比对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响;
附图3吐温-80体积对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响;
附图4HT质量对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响。
五、具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例,不应被看做是对本发明的限定。
实施例1
油橄榄多酚提取物制备
取1kg油橄榄叶,加入30%乙醇8L提取,温度85℃,提取时间2小时,提取两次,合并提取液,分别采用陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000Da超滤膜过滤,再用纳滤膜浓缩滤液至1.5L,浓缩物真空干燥,粉破成粉制成油橄榄多酚提取物,HPLC分析,其中橄榄苦苷36.8%,毛蕊花苷5.6%,羟基酪醇3.4%,水溶性为100ml水溶解5.2g。
实施例2
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物制备
将90%羟基酪醇与36.8%橄榄苦苷提取物及90%毛蕊花苷复配,按质量比例为4~8∶2~5∶1~3,优选4~5∶2~3∶1~2,加入4倍无水乙醇,60℃加热回流20min,样品充分溶解后过滤,减压浓缩,制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物,HPLC分析,其中羟基酪醇为56%,橄榄苦苷为18%,毛蕊花苷为7%;
为了达到油橄榄多酚提取物长循环脂质体的效果,本发明采用薄膜分散-机械振荡法。旋蒸减压成膜压力-0.05~-0.1Mpa,温度50~70℃、真空冷冻干燥成膜压力2~10Mpa,温度-10~-50℃,超声机械振荡功率100~200W,时间20~40min,高速剪切功率500~1000W,时间5~10min,采用其中一种或者几种方法达到薄膜分散的效果。
为了改善油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性,采用磷脂为表面活性乳化剂,优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆磷脂中的一种或复合。为了更好的分散,也添加胆固醇质量3~10g,表面活性剂吐温-80体积2~10mL,PEG 200 1~5g,形成均一稳定的乳相。为了油橄榄多酚提取物及乳化助剂充分溶解形成均相,采用无水乙醇、丙酮、异丙酮和氯仿中的一种作为有机溶剂。
实施例3
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备
以富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物为包封目标,设计温度40~70℃,优选55℃,卵磷脂与胆固醇质量比为3∶1称卵磷脂与胆固醇质量4g,表面活性剂吐温-80体积5mL,PEG 200 3.5g,放入圆底烧瓶中,加入丙酮,超声振荡10min,溶解后减压薄膜蒸发除去溶剂,旋蒸减压成膜压力-0.05~-0.1Mpa,温度50~70℃、真空冷冻干燥成膜压力2~10Mpa,温度-10~-50℃,超声机械振荡功率100~200W,时间20~40min,高速剪切功率500~1000W,时间5~10min。再加入3mg/mL羟基酪醇(HT)水溶液6mL,油橄榄多酚提取物水溶液2mL,旋转洗膜水化时间15min,再超声溶解20min可得到脂质体。
实施例4
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的包封率
取0.05g脂质体于烧杯中,加入10mL去离子水,再放入处理过的透析袋中,在室温下透析9h后测定其中HT含量,并计算HT的包封率。脂质体包封率的计算公式:
式中:
C——HT水溶液的浓度,mg/mL;
V——HT水溶液的体积,mL;
C0——透析滤液中HT的浓度,mg/mL;
V0——透析滤液的总体积,mL。
当HT水溶液浓度为2mg/mL,HT水溶液体积为2mL,卵胆比为4∶1(卵磷脂80mg,胆固醇20mg,下同),吐温-80为6mL,制备温度为65℃,可得到HT脂质体的包封率为37.51%。
实施例4
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的缓释性
配制HT浓度为1mg/mL脂质体悬液,移取悬液2mL放入透析袋内,将其完全浸入含有100mL生理盐水的烧杯中;将烧杯放入37℃恒温的水浴锅内,在24h内每间隔2h分析透析滤液中HT浓度。与相同浓度HT水溶液作对照,HT水溶液2h内释放了(43.66±1.82)%,脂质体释放了(28.62±1.87)%;24h后,HT溶液和脂质体释放分别为(73.41±1.72)%和(55.72±1.88)%,相同条件下脂质体提高30~55%的缓释性能。
实施例5
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抗氧化性
将脂质体悬液和HT水溶液样品分别配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/mL的无水乙醇待测溶液。1mL待测样品加入40mg/L DPPH醇溶液3mL,充分混匀后,室温下避光反应30min,在517nm波长下测定吸光度(Ai)。每个样品平行3次,取平均值。经计算得知HT脂质体的IC50为0.5~2μg/mL,为HT水溶液和脂质体对DPPH自由基清除效果大体一致。说明利用脂质体技术把HT制备成相应脂质体后,它对DPPH自由基的清除效果并没有受到影响。
样品溶液对DPPH自由基清除率(η)的计算公式如下:
式中:
A0——1mL待测样品与3mL无水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值);
A1——1mL无水乙醇与3mL DPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值(自由基总值);
Ai——1mL待测样品与3mL DPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值。
实施例6
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抑菌性
采用菌体浓度为105cfu/mL的菌悬液配制HT脂质体悬液和HT水溶液样品浓度浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL的样品溶液。将上述配好的溶液放置恒温恒湿培养箱内,37℃培养24h后观察结果,试管中几乎无浑浊现象对应的样品浓度作为此样品的MIC值。每种样品做3个平行测试。在MIC测定结果的基础上,选取未见细菌生长的各管培养液,移取0.1mL涂布于固体培养基上,放置37℃培养箱内,24h后观察结果,仍无细菌生长现象对应的样品浓度作为此样品的MBC值。相对于HT水溶液,脂质体的抑菌效果相当,且对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC值分别为8和32μg/mL。对大肠杆菌的MIC和MBC值分别为32和64μg/mL。
Claims (4)
1.一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
第一步:油橄榄多酚提取物制备
取油橄榄叶,加入30~50%乙醇提取,油橄榄叶与30~50%乙醇质量体积比(kg∶L)1∶5~20,提取两次,温度70~85℃,合并提取液,滤液过陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000Da超滤膜,再用纳滤膜浓缩滤液,滤液过纳滤膜,橄榄叶与浓缩滤液质量体积比(kg∶L)1∶1~3,浓缩液真空干燥,粉碎成粉制成油橄榄多酚提取物,HPLC分析,其中橄榄苦苷10~40%,毛蕊花苷3~6%,羟基酪醇2~7%,水溶性为100mL水溶解2~8g;
第二步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物制备
将90%羟基酪醇与10~40%橄榄苦苷提取物及90%毛蕊花苷复配,按质量比例为4~8∶2~5∶1~3,加入3~8倍无水乙醇,60~90℃加热回流10~30min,样品充分溶解后过滤,减压浓缩,制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物,其中羟基酪醇为50~70%,橄榄苦苷为10~20%,毛蕊花苷为5~15%;
第三步:薄膜分散-机械振荡法制备长循环油橄榄多酚脂质体
以富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物为包封目标,设计温度40~70℃、卵磷脂与胆固醇质量比为1∶1~8∶1,称卵磷脂与胆固醇质量3~10g,表面活性剂吐温-80体积2~10mL,PEG200 1~5g,放入圆底烧瓶中,加入适量有机溶剂,超声振荡5~20min,溶解后减压薄膜蒸发除去溶剂,再加入1~4mg/mL羟基酪醇(HT)水溶液1~10mL,油橄榄多酚水溶液1~3mL,旋转洗膜水化时间5~50min,再超声溶解5~30min可得到脂质体。根据单因素与正交设计优化,制备均匀的乳白色长循环脂质体,具有稳定性、缓释性、抗氧化性和抑菌性等功能;
第四步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率
取脂质体于烧杯中,加入去离子水,脂质体与去离子水质量体积比浓度为2~15mg/mL,放入透析袋中,在室温下透析1~15h,HPLC分析水溶性中HT浓度(C)和透析滤液中HT浓度(C0),HT水溶性体积(V),透析滤液的总体积(V0),根据下式计算富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率为20~80%以上;
第五步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体平均粒度及其分布
将1~10mg/mL脂质体放入比色皿中,加入一定量的去离子水,用ZetaPlus型激光粒度仪在光源波长368nm和散射角90°下室温测试,制备的脂质体的粒径分布在200~1000nm。
第六步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性
1.物理稳定性:取1~8mg/mL脂质体悬浊液和相同浓度HT水溶液,分别用4 000r/min~10 000r/min离心机离心10~20min,制备的脂质体在4 000~6000r/min无沉淀和不分层,乳液稳定;于4℃~25℃下贮藏0~30d,脂质体中羟基酪醇和毛蕊花苷稳定,相同条件下比HT水溶液中HT稳定性提高20~40%;
2.水解稳定性:在薄膜分散-机械振荡法制备脂质体悬浮液,在pH值为3.0~7.0的柠檬酸缓冲液(0.1~0.5mol/L柠檬酸溶液与0.2~0.5mol/L磷酸氢二钠溶液),分别测定各脂质体的包封率,结果是,随着水化液pH值的升高,包封率增加。
第七步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的缓释性
配制HT浓度为1~8mg/mL脂质体悬液,移取悬液1~5mL放入透析袋内,将其完全浸入含有100mL生理盐水的烧杯中;将烧杯放入37℃恒温的水浴锅内,在24h内每间隔2h分析透析滤液中HT浓度。与相同浓度HT水溶液作对照,HT水溶液2h内释放了(43.66±1.82)%,脂质体释放了(28.62±1.87)%;24h后,HT溶液和脂质体释放分别为(73.41±1.72)%和(55.72±1.88)%,相同条件下脂质体提高30~65%的缓释性能。
第八步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抗氧化性
将脂质体悬液和HT水溶液样品分别配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/mL的无水乙醇待测溶液。1mL待测样品加入40mg/L DPPH醇溶液3mL,充分混匀后,室温下避光反应30min,在517nm波长下测定吸光度(Ai)。每个样品平行3次,取平均值。经计算得知HT脂质体的IC50为0.5~2μg/mL,为HT水溶液和脂质体对DPPH自由基清除效果大体一致。说明利用脂质体技术把HT制备成相应脂质体后,它对DPPH自由基的清除效果并没有受到影响。
样品溶液对DPPH自由基清除率(η)的计算公式如下:
式中:
A0——1mL待测样品与3mL无水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值);
A1——1mL无水乙醇与3mL DPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值(自由基总值);
Ai——1mL待测样品与3mLDPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值。
第九步:富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抑菌性
采用菌体浓度为105cfu/mL的菌悬液配制脂质体悬液和HT水溶液样品浓度浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL的样品溶液。将上述配好的溶液放置恒温恒湿培养箱内,37℃培养24h后观察结果,试管中几乎无浑浊现象对应的样品浓度作为此样品的MIC值。每种样品做3个平行测试。在MIC测定结果的基础上,选取未见细菌生长的各管培养液,移取0.1mL涂布于固体培养基上,放置37℃培养箱内,24h后观察结果,仍无细菌生长现象对应的样品浓度作为此样品的MBC值。相对于HT水溶液,脂质体的抑菌效果相当,且对金黄色葡萄球菌的MIC为4~16μg/mL,MBC值为16~64μg/mL。对大肠杆菌的MIC为16~64μg/mL,MBC值为32~128μg/mL。
2.根据权利要求书1所述的一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法,其特征在于步骤一中所述薄膜分散-机械振荡法包括:旋蒸减压成膜(压力-0.05~-0.1Mpa,温度50~70℃)、真空冷冻干燥成膜(压力2~10Mpa,温度-10~-50℃)和超声机械振荡(功率100~200W,时间20~40min)、高速剪切(功率500~1000W,时间5~10min)的一种或者几种。
3.根据权利要求书1所述的一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法,其特征在于步骤一中所述磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆磷脂中的一种。
4.根据权利要求书1所述的一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法,其特征在于步骤一中有机溶剂为无水乙醇、丙酮、异丙酮和氯仿中的一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710222330.9A CN107019672A (zh) | 2017-03-28 | 2017-03-28 | 一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710222330.9A CN107019672A (zh) | 2017-03-28 | 2017-03-28 | 一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107019672A true CN107019672A (zh) | 2017-08-08 |
Family
ID=59528010
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710222330.9A Pending CN107019672A (zh) | 2017-03-28 | 2017-03-28 | 一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107019672A (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107929324A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-04-20 | 大连工业大学 | 负载海参水煮液提取物脂质体及其制备方法 |
CN107998183A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-08 | 浙江大学 | 壳聚糖包覆的桂花苯乙醇苷脂质体及其制备方法 |
CN108314607A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-07-24 | 广西大学 | 一种高纯度固体羟基酪醇的纯化方法 |
CN109400658A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-03-01 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 从油橄榄叶中同步分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的方法 |
CN109490053A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-19 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种植物多糖含量检测的样品前处理方法 |
CN111991353A (zh) * | 2020-09-13 | 2020-11-27 | 仲恺农业工程学院 | 多囊泡型二氢杨梅素脂质体的制备方法及应用 |
CN112198269A (zh) * | 2020-04-22 | 2021-01-08 | 山东省药学科学院 | 一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法 |
CN112512500A (zh) * | 2018-04-30 | 2021-03-16 | 蒙特洛埃德尔有限公司 | 用于缓解空气污染对皮肤的多重影响的含有类黄酮的植物提取物组合物 |
CN114557963A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-05-31 | 西安海斯夫生物科技有限公司 | 一种纳米羟基酪醇脂质体及其制备方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101003557A (zh) * | 2006-12-12 | 2007-07-25 | 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 | 富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法 |
-
2017
- 2017-03-28 CN CN201710222330.9A patent/CN107019672A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101003557A (zh) * | 2006-12-12 | 2007-07-25 | 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 | 富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
原姣姣: "橄榄苦苷提取的酶解机制及酚类产物的活性构效关系研究", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技I辑》 * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107929324A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-04-20 | 大连工业大学 | 负载海参水煮液提取物脂质体及其制备方法 |
CN107929324B (zh) * | 2017-12-08 | 2020-11-13 | 大连工业大学 | 负载海参水煮液提取物脂质体及其制备方法 |
CN107998183A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-08 | 浙江大学 | 壳聚糖包覆的桂花苯乙醇苷脂质体及其制备方法 |
CN107998183B (zh) * | 2017-12-26 | 2021-05-04 | 浙江大学 | 壳聚糖包覆的桂花苯乙醇苷脂质体及其制备方法 |
CN112512500A (zh) * | 2018-04-30 | 2021-03-16 | 蒙特洛埃德尔有限公司 | 用于缓解空气污染对皮肤的多重影响的含有类黄酮的植物提取物组合物 |
CN108314607A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-07-24 | 广西大学 | 一种高纯度固体羟基酪醇的纯化方法 |
CN109400658A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-03-01 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 从油橄榄叶中同步分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的方法 |
CN109400658B (zh) * | 2018-11-26 | 2022-01-11 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 从油橄榄叶中同步分离纯化橄榄苦苷和羟基酪醇的方法 |
CN109490053A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-19 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种植物多糖含量检测的样品前处理方法 |
CN112198269A (zh) * | 2020-04-22 | 2021-01-08 | 山东省药学科学院 | 一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法 |
CN111991353A (zh) * | 2020-09-13 | 2020-11-27 | 仲恺农业工程学院 | 多囊泡型二氢杨梅素脂质体的制备方法及应用 |
CN114557963A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-05-31 | 西安海斯夫生物科技有限公司 | 一种纳米羟基酪醇脂质体及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107019672A (zh) | 一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法 | |
CN103610642B (zh) | 一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体及制备方法 | |
CN103070826B (zh) | 一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉及其制备方法和用途 | |
JP2008044939A (ja) | 藻類ネオクロリス・オレオアブンダンスのバイオマスの抽出物を含有する化粧料としての痩身組成物 | |
JP6151686B2 (ja) | 植物細胞内において安定化した活性物質およびその製造方法 | |
CN114099438A (zh) | 山萘酚脂质体凝胶及其制备方法 | |
RU2665946C2 (ru) | Композиция, содержащая луковый экстракт и липосомы | |
CN104324007A (zh) | 一种天然重组纳米脂质载体制备技术与应用 | |
KR20120086438A (ko) | 퉁퉁마디 및 해당화 추출물을 포함하는 슬리밍 화장료 조성물 | |
CN105030675A (zh) | 一种高稳定性的香茅油纳米脂质体抗菌剂及其制备方法 | |
KR101143363B1 (ko) | 키토산을 이용한 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자 및 그 제조방법, 그 나노입자를 함유한 식품 | |
RU2386446C1 (ru) | Способ получения наносуспензии бетулина и/или его производных | |
US20170172921A1 (en) | Polyphenolic compounds encapsualated in long circulating liposomes and use thereof | |
CN107095799A (zh) | 复合脂质体及其制备方法和应用 | |
KR101000470B1 (ko) | 브로콜리 나노입자 제조방법 및 브로콜리 나노입자를함유하는 식용가능 조성물 | |
CN103690556B (zh) | 一种羟基喜树碱长循环脂质体 | |
CN106074495A (zh) | 降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法 | |
CN104825404A (zh) | 一种灯盏花素长效冻干微乳及其制备方法 | |
CN117223707B (zh) | 一种无载体阿维菌素纳米农药的制备方法 | |
KR940001005B1 (ko) | 피부화장료 조성물 | |
AU2019101709A4 (en) | Tilianin loaded oxidation response nano-micelle and preparation method therefor | |
KR20190043381A (ko) | 내부에 아가위 열매 추출물이 포집된 나노입자를 함유하는 피부노화방지용 또는 피부미백용 화장료 조성물 | |
KR20130025988A (ko) | 천연물 추출물을 담지하는 리포좀 및 이의 제조방법 | |
Feng et al. | Provision and assessment properties of nanoliposomes containing macroalgae extracts of Sargassum boveanume and Padina pavonica | |
CN107811961A (zh) | 一种高丽参干细胞提取物脂质凝胶、制备方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170808 |