CN107014910B - 阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的分离与测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域,具体涉及阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的分离与测定方法,该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,具体为取各潜在基因毒性杂质对照品加稀释剂溶解制备成已知浓度的对照品溶液,取供试品加稀释剂溶解制备成供试品溶液,分别取对照品溶液及供试品溶液进样,采用流动相进行高效液相色谱洗脱分析,记录色谱图,比较供试品溶液与对照品溶液中对应出峰时间的杂质的峰面积,计算供试品中所含阿普斯特及潜在基因毒性杂质的含量。该方法专属性强、灵敏度高(潜在基因毒性杂质SM1的检测限为0.0004%),并且操作方法简单,具有简便、快速的优点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,具体涉及阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的分离与测定方法。
背景技术
阿普斯特为磷酸二酯酶PDE4抑制剂,用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎、Crohn病、溃疡性结肠炎。阿普斯特的中文名为:(+)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基乙基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1,3-二酮,英文名为:(+)-2-[1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-methanesulfonylethyl]-4-acetyl-aminoisoindoline-1,3-dione,其结构式如式Ⅱ所示:
基因毒性杂质是指能直接或间接损伤细胞DNA,产生致突变和致癌作用的物质。在药物活性物质中没有出现的基因毒性反应物和有基因毒性结构的物质,被称为潜在基因毒性杂质。在生产过程中,可能产生基因毒性杂质的环节包括新药合成、原料纯化、储存运输(与包装物接触)等,故在新药合成阶段应该指明涉及到的所有具有基因毒性或有致癌性的化学物质,如所用试剂、中间体、副产品等。更进一步,在药物活性物质中没有出现的基因毒性反应物和有基因毒性结构的物质,都应该被考虑。具有毒性作用的基团一般具有亲电试剂的性质,这些基团在生理条件下同体内核酸、蛋白质或其他重要成分中的亲核中心发生取代反应,使这些成分发生不可逆的损伤,表现为毒性、致突变或致癌等作用。表现为毒性、致突变或致癌等作用的基团举例如下:
在阿普斯特的合成中,其合成使用的原料SM1具有醛基警示结构,这使最终获得的阿普斯特中含有的潜在基因毒性杂质,它的结构式如式Ⅰ所示:
为了控制阿普斯特的质量,需要对阿普斯特及其潜在基因毒性杂质进行分离测定。但是,目前还没有分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的高效液相色谱方法。本发明对分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的高效液相色谱方法进行了探索。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,该方法能够有效实现阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的分离与测定。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,所述的方法是采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,进样,然后采用流动相进行洗脱分离并测定。
本发明所述的方法适用于阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的分离与测定,可用于单独分离某一种杂质,也可同时分离阿普斯特及多种潜在基因毒性杂质。
所述的阿普斯特的结构式如式Ⅱ所示:
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,所述潜在基因毒性杂质包括如式Ⅰ所示的潜在基因毒性杂质SM1:
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,所述流动相为乙腈与0.08-0.15%磷酸水溶液的混合液,优选乙腈与0.1%磷酸水溶液的混合液为流动相。
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,所述流动相中乙腈与0.08-0.15%磷酸水溶液的体积比为40-55:45-60,优选体积比为48:52。
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,所述色谱柱柱温为30℃,进样量为20μl,优选色谱柱的规格为4.6×250mm,5μm。
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,在洗脱分离后,用紫外检测器对阿普斯特及其潜在基因毒性杂质进行检测。
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,紫外检测波长为230nm±5nm。
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min,优选流动相的流速为1.0ml/min。
本发明的方法不仅能够实现阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的有效分离,而且能够准确测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的含量。
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,具体步骤如下:取各潜在基因毒性杂质对照品加稀释剂溶解制备成已知浓度的对照品溶液,取供试品加稀释剂溶解制备成供试品溶液,分别取对照品溶液及供试品溶液进样,进行高效液相色谱分析,记录色谱图,比较供试品溶液与对照品溶液中对应出峰时间的杂质的峰面积,计算供试品中所含阿普斯特及潜在基因毒性杂质的含量;所述稀释剂为流动相或乙腈。
进一步,所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,所述方法还包括如下步骤:分别取阿普斯特及潜在基因毒性杂质对照品,分别用稀释剂溶解制成阿普斯特定位溶液及各潜在基因毒性杂质的定位溶液,进行高效液相色谱分析,确定阿普斯特及各潜在基因毒性杂质的保留时间。
在本发明的一个具体实施例中,高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质SM1的方法具体步骤为:
(1)SM1对照品溶液:精密称取杂质SM1对照品9.4mg于50ml量瓶中,加稀释剂使溶解并稀释至刻度,摇匀,移取该溶液0.2ml置100ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,再移取该溶液1ml置50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得(0.00075%);
(2)供试品溶液:取供试品约50mg,精密称定,置50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得;
(3)测定方法:设置流动相流速为1.0ml/min,分别取上述溶液20μl进样,记录色谱图,比较供试品溶液与对照品溶液中杂质的峰面积;所述稀释剂采用流动相或乙腈。
本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,以乙腈-0.08-0.15%磷酸水溶液为流动相,成功解决了阿普斯特与潜在基因毒性杂质的有效分离问题,进而实现了杂质有效控制,从根本上保证了产品质量。因此,本发明还保护这种固定相与流动相的组合在分离和/或测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的色谱法中的应用。所述色谱法具体包括高效液相色谱、液质联用色谱、薄层色谱等。
本发明的有益效果在于:
本发明的方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,以乙腈-磷酸水溶液为流动相,该方法不仅能够实现阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的有效分离,还能够准确测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的含量,成功解决了阿普斯特与潜在基因毒性杂质的有效分离问题,进而实现了杂质有效控制,从根本上保证了产品质量,并且具有简便,快速,准确度高等优点;同时采用高效液相色谱法操作简单,专属性强,灵敏度高(潜在基因毒性杂质SM1的检测限为0.0004%),确保阿普斯特原料药的质量。
附图说明
图1为实施例1的稀释剂的HPLC图,图1中的色谱峰为稀释剂的色谱峰。
图2为实施例1的SM1定位溶液的HPLC图,图2中的色谱峰为SM1的色谱峰,保留时间在5.9min左右。
图3为实施例1中供试品的HPLC图,图3中的色谱峰为供试品的色谱峰保留时间在7.3min左右。
图4为实施例1中其他杂质定位溶液的HPLC图,图4中的色谱峰保留时间依次为:2.1min、2.3min、2.8min、4.6min、6.7min、10.5min。
图5为实施例1中混合定位溶液的HPLC图,图5中的色谱峰依次为保留时间依次为:2.1min、2.3min、2.8min、4.6min、5.9min(SM1)、6.7min、7.3min(阿普斯特)、10.5min。
图6为实施例1SM1检测限HPLC图。
图7为实施例1SM1检测限加入试验HPLC图。
图8为实施例1SM1对照品溶液的HPLC图,图8中的色谱峰为SM1对照品的色谱峰,保留时间在5.8min左右。
图9为实施例1样品检测HPLC图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明,但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例中采用的仪器及色谱条件如下:
仪器:SHIMADZU LC-2010AHT;
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm);
流动相:乙腈:0.1%磷酸水溶液=48:52(V:V);
波长:230nm;
柱温:30℃;
流速:1.0ml/min;
进样体积:20μl;
稀释剂:乙腈。
实验步骤及结果:
(1)专属性试验
SM1定位溶液:称取杂质SM19.4mg,置50ml量瓶中,加稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
SM1对照品溶液:移取SM1定位溶液0.2ml置100ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,再移取该溶液1ml置50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得(0.00075%)。
供试品溶液:取供试品约50mg,精密称定,置50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
其他杂质定位溶液:本实施例还对其他可能存在的潜在杂质进行了分析,其他杂质命名为A、B、C、D、F、SM2d,分别称取杂质A、B、C、D、F、SM2d各10mg,置同一50ml量瓶中,加稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀,得其他杂质混合溶液储备液;取该混合溶液1ml置50ml量瓶中,加稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
混合定位溶液:取其他杂质混合溶液储备液1.0ml、SM1定位溶液1.0ml及供试品溶液1.0ml,置同一50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
测定方法:分别取稀释剂、SM1定位溶液、供试品溶液、其他杂质混合定位溶液、混合定位溶液各20μl,按上述色谱条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图如图1-5所示。
分析专属性结果见表1,由表1可以看出,在该条件下稀释剂、供试品及其他杂质均不干扰阿普斯特中杂质SM1的测定;SM1与邻近杂质峰间分离度符合要求。
表1 专属性试验结果
由图1-5及表1数据可知,本发明的方法不仅能分离检测阿普斯特与SM1,还能够将阿普斯特、SM1与其他可能存在的潜在杂质分离开。
(2)检测限试验:
检测限溶液:精密移取杂质SM1定位溶液0.1ml置100ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,移取该溶液1.0ml至50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
测定方法:取检测限溶液进样,记录色谱图如图6所示,并以SM1峰高与噪声的比值(信噪比)为3:1时的进样量作为检测限。
检测限结果见表2,图6中保留时间为5.9min的色谱峰即为SM1的色谱峰,其检测限浓度为0.001982μg/ml,以成品中存在浓度表示为0.0004%,检测灵敏度高。
表2 检测限试验结果
(3)检测限加入试验:
检测限加入试验溶液:称取成品50mg,置50ml量瓶中,加入检测限溶液使溶解并稀释至刻度,摇匀,即得
测定方法:取检测限加入试验溶液进样,记录色谱图,如图7所示。
检测限加入试验结果见表3,图7中保留时间为5.9min的色谱峰即为加入的SM1的色谱峰,能被有效检出。
表3 检测限加入试验结果
(4)样品检测:
SM1对照品溶液:移取专属性项下SM1定位溶液0.2ml置100ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,再移取该溶液1ml置50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得(0.00075%)。
供试品溶液:取供试品约50mg,精密称定,置50ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
测定方法:取SM1对照品溶液和供试品溶液按前述色谱条件进样,记录色谱图,见图8-9,图8中保留时间为5.9min的色谱峰即为SM1对照品的色谱峰,图9中供试品溶液未检出杂质SM1。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,其特征在于,所述色谱柱柱温为30℃,进样量为20μl。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,其特征在于,在洗脱分离后,用紫外检测器对阿普斯特及其潜在基因毒性杂质进行检测。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,其特征在于,紫外检测波长为230nm±5nm。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,其特征在于,所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,其特征在于,所述的方法具体步骤包括:取潜在基因毒性杂质对照品加稀释剂溶解制备成已知浓度的对照品溶液,取供试品加稀释剂溶解制备成供试品溶液,分别取对照品溶液及供试品溶液进样,进行高效液相色谱分析,记录色谱图,比较供试品溶液与对照品溶液中对应出峰时间的杂质的峰面积,计算供试品中所含阿普斯特潜在基因毒性杂质的含量;所述稀释剂为流动相或乙腈。
7.根据权利要求6所述的高效液相色谱法分离测定阿普斯特及其潜在基因毒性杂质的方法,其特征在于,所述方法还包括如下步骤:分别取阿普斯特及潜在基因毒性杂质对照品,分别用稀释剂溶解制成阿普斯特定位溶液及潜在基因毒性杂质的定位溶液,进行高效液相色谱分析,确定阿普斯特及潜在基因毒性杂质的保留时间。
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