CN107011308B - 从瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物的方法。该方法以瓯柑果实的果皮为原料，采用超声波辅助提取，
Description
技术领域
本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化技术领域，具体涉及从瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物的方法，是以瓯柑果实果皮为原料，采用超声波辅助提取、C18固相萃取柱和HSCCC(高速逆流色谱)的联用技术同时分离纯化川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素三种多甲氧基黄酮类化合物的方法。
背景技术
瓯柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)是芸香科柑橘属的一个栽培变种，也是浙江省温州、丽水地区的传统特产，已经有两千多年的栽培历史。瓯柑在民间具有抗肿瘤、祛热生津、化痰止咳、清凉解毒等特殊食药功能，这些作用可能与瓯柑中富含多甲氧基黄酮类化合物有关。多甲氧基黄酮(Polymethoxylated Flavonoids,PMFs)是指具有4个及4个以上甲氧基取代基的黄酮类化合物，主要来源于芸香科柑橘属植物，尤其在柑橘果实的果皮中含量丰富。柑橘果实中的多甲氧基黄酮类化合物在抗肿瘤、抗炎、抗诱变和保护心血管等方面具有很好的活性，关于多甲氧基黄酮的生物活性机制研究也逐渐深入。自1934年首次分离出多甲氧基黄酮类化合物单体以来，人们对其活性进行了大量的研究。近年来研究发现，多甲氧基黄酮类化合物具有抑制癌细胞增殖、抵抗肿瘤侵袭和转移作用、促进癌细胞凋亡和自噬等生物活性。
川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素是柑橘中主要的多甲氧基黄酮类化合物。川陈皮素(nobiletin)，别名：川皮亭、蜜橘黄素，CAS：478-01-3，分子式：C21H22O8，分子量：402.395，化学名称为2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-5,6,7,8-tetramethoxy-4H-chromen-4-one。存在于瓯柑或其他柑橘类水果中一类物质，纯品白色、粉末状。橘皮素(tangeretin)，CAS：2798-20-1，分子式：C20H20O7，分子量：372.369，外观：白色粉末。5-去甲川陈皮素(5-demethylnobiletin)，CAS：2174-59-6，分子式：C20H20O8，分子量：388.368，外观：淡黄色粉末。
随着多甲氧基黄酮类化合物的物质结构确定以及对其生物活性的深入研究，多甲氧基黄酮类化合物的市场需求量逐渐增大。现有关于多甲氧基黄酮的分离主要采用大孔树脂层析和制备型高效液相色谱，其局限性为工艺复杂，成本较高，分离得到的单体纯度低或制备量，难以发展成为分离纯度高、制备量大的分离技术。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种分离纯化多甲氧基黄酮类化合物的方法，是一种从瓯柑果实果皮中分离纯化川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素的方法，利用该方法可快速有效地从瓯柑果实果皮中同时分离纯化得到纯度不低于98％的川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素，具体通过以下步骤实现：
(1)样品提取：取一定质量的冷冻干燥的瓯柑果皮粉末用95％乙醇(固液比为1：20)超声提取2次，提取温度25℃，每次45min，经真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中。
(2)C18固相萃取柱去糖和分段：取步骤(1)中得到的水溶液上样C18固相萃取柱，上样后固相萃取柱先用去离子水洗脱25倍柱床体积(BV)去掉极性较高的杂质，然后用35％甲醇12BV进行洗脱去掉杂质，然后用100％甲醇3BV洗脱，洗脱流速为1mL/min，收集洗脱液，洗脱液在旋转蒸发仪上36℃蒸干得到初步去杂质后的富含多甲氧基黄酮组分的粉末。
(3)HSCCC进一步分离纯化川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素：配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶剂体系，充分摇匀过夜，上相为固定相，下相为流动相，首先用固定相以20mL/min流速泵入HSCCC分离柱，待充满后，开启逆流色谱仪将转速调至800rpm，将流动相以2mL/min的速度泵入HSCCC分离柱，待流动相从出口稳定流出时，将初步去杂质后的100％甲醇洗脱组分50mg溶于5mL下相中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱的峰型分管收集各组分，将特定峰开始与结束之间的流出液分别收集所得到的组分，峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ的组分分别为川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素(如图3与图4所示)。
本发明纯化得到的川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素经过超高效液相色谱(UPLC)和质谱(MS)鉴定。
本发明的另一个目的是所述的方法在瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物中的应用。
本发明采用C18固相萃取和HSCCC联用技术，以瓯柑果实果皮粉末为原料同时分离纯化得到高纯度的川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素。本发明相对于过去的工艺有如下优点：(1)不需要高温高压及惰性气体的保护，工艺简单；(2)不需要使用具有较大刺鼻气味的试剂，生产流程安全易操作；(3)可用于分离纯化性质非常接近的黄酮类化合物，适用性广；(4)生产周期短，仅仅需要几个小时就可以完成整个纯化过程；(5)纯化产物回收率高，纯度高；(6)整个纯化过程通过UPLC和LC-MS进行精确定性定量，准确度高；(7)所用的溶剂可回收后重复利用，成本较低；(8)通过前期富集多甲氧基黄酮组分，可以提高HSCCC的物质分辨率和重现度。
附图说明
图1为本发明纯化工艺流程图。
图2是粗提物经固相萃取UPLC检测图谱，其中a为粗提物UPLC图谱，b和d为粗提物经固相萃取时35％甲醇洗脱液的UPLC图谱，c和e为粗提物经C18分段纯化后UPLC图谱，在UPLC图谱中，峰1为新橙皮苷，2为川陈皮素，3为橘皮素，4为5-去甲川陈皮素。
图3为实施例1的HSCCC图谱，图中组分Ⅰ川陈皮素，组分Ⅱ为橘皮素，组分Ⅲ为5-去甲川陈皮素。
图4为实施例2的HSCCC图谱，图中组分Ⅰ川陈皮素，组分Ⅱ为橘皮素，组分Ⅲ为5-去甲川陈皮素。
图5为经HSCCC纯化后的组份，组分Ⅰ(川陈皮素)，组分Ⅱ(橘皮素)，组分Ⅲ(5-去甲川陈皮素)的UPLC图谱。
图6为二级质谱鉴定图谱，其中a为C18固相萃取和HSCCC联用技术分离纯化得到的川陈皮素单体二级质谱鉴定图谱；b为C18固相萃取和HSCCC联用技术分离纯化得到的橘皮素单体二级质谱鉴定图谱；c为C18固相萃取和HSCCC联用技术分离纯化得到的5-去甲川陈皮素单体二级质谱鉴定图谱。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
本发明分离纯化川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的操作方法按照如下步骤进行，参见图1：
(1)超声波辅助提取：10.3g冷冻干燥的瓯柑果实果皮粉末用95％乙醇(固液比比1：20)超声提取三次(25℃)，每次45min，真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，得到粗提物水溶液。
(2)C18固相萃取柱去糖和分段：取步骤(1)中得到的粗提物水溶液约5mL上样C18固相萃取柱，上样后固相萃取柱先用去离子水洗脱25倍柱床体积(BV)去掉极性较高的杂质，然后用35％甲醇12BV进行洗脱去掉杂质，然后用100％甲醇3BV洗脱，洗脱流速为1mL/min，收集洗脱液约12mL，洗脱液在旋转蒸发仪上36℃蒸干得到初步去杂质后的富含多甲氧基黄酮组分的粉末。该步骤纯化后得到初步纯化后的去杂质粉末207.2mg，粉末中川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的总含量≥80％，结果见图2b和2c。
(3)HSCCC进一步分离纯化川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素：配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶剂体系，充分摇匀过夜，上相为固定相，下相为流动相，首先用固定相以20mL/min流速泵入HSCCC分离柱，待充满后，开启逆流色谱仪将转速调至800rpm，将流动相以2mL/min的速度泵入HSCCC分离柱，待流动相从出口稳定流出时，将初步去杂质后的100％甲醇洗脱组分50mg溶于5mL下相中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱(图3)分管收集各组分，用UPLC测定各组分的纯度，分别合并含有川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的离心管，在旋转蒸发仪上36℃蒸干即得到川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素。得到川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的纯度均≥98％，结果参见图5。
实施例2
本发明分离纯化川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的操作方法按照如下步骤进行，参见图1：
(1)超声波辅助提取：11.2g冷冻干燥的瓯柑果实果皮粉末用95％乙醇(固液比比1：20)超声提取三次(25℃)，每次45min，真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，得到粗提物水溶液。
(2)C18固相萃取柱去糖和分段：取步骤(1)中得到的粗提物水溶液约5mL上样C18固相萃取柱，上样后固相萃取柱先用去离子水洗脱25倍柱床体积(BV)去掉极性较高的杂质，然后用35％甲醇12BV进行洗脱去掉杂质，然后用100％甲醇3BV洗脱，洗脱流速为1mL/min，收集洗脱液约13mL，洗脱液在旋转蒸发仪上36℃蒸干得到初步去杂质后的富含多甲氧基黄酮组分的粉末。该步骤纯化后得到初步纯化后的去杂质粉末220.3mg，粉末中川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的总含量≥80％，结果参见图2d和2e。
(3)HSCCC进一步分离纯化川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素：配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶剂体系，充分摇匀过夜，上相为固定相，下相为流动相，首先用固定相以20mL/min流速泵入HSCCC分离柱，待充满后，开启逆流色谱仪将转速调至800rpm，将流动相以2mL/min的速度泵入HSCCC分离柱，待流动相从出口稳定流出时，将初步去杂质后的100％甲醇洗脱组分50mg溶于5mL下相中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱(图4)分管收集各组分，用UPLC测定各组分的纯度，分别合并含有川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的离心管，在旋转蒸发仪上36℃蒸干即得到川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素。得到川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的纯度均≥98％，结果参见图5。
实施例3本发明通过以下试验进行影响因素的筛选确定
1、纯化材料的选择
新鲜的瓯柑果实果皮，冷冻干燥至恒重，用磨样机磨成粉末。取一定质量的冷冻干燥的瓯柑果皮粉末用95％乙醇(固液比为1：20)超声提取45min(25℃)，重复2次，经真空抽滤后，合并上清液，用于多甲氧基黄酮类化合物的UPLC分析。UPLC流动相包括去离子水(溶液A)和色谱乙腈(溶液B)，采用梯度洗脱，检测波长为330nm，温度为室温(25℃)，进样量为2μl，流速为0.3ml/min，条件为：溶剂B：0-5min，20％，5-8min：20％-34％；8-20min：34％-60％，20-22min：60％-100％，22～23min：100％不变，23～24min：100％～20％，保持20％溶液B1min后结束一个循环。结果表明，瓯柑果皮中含有较高的多甲氧基黄酮类化合物含量，且杂质较少，可作为纯化材料。结果参见图2a。
2、C18固相萃取甲醇洗脱浓度的选择
C18固相萃取柱经2个柱体积(BV)100％甲醇活化柱子、2BV去离子水水平衡柱子后，1BV左右提取液上样，上样流速1mL/min。上样后的固相萃取柱先用水冲洗25BV去糖，然后分别用20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％等低浓度甲醇洗脱，每个梯度10BV，然后用100％甲醇3BV洗脱，洗脱流速为1mL/min。用UPLC检测不同浓度甲醇去杂后100％甲醇洗脱液中川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的含量，确定最适甲醇洗脱浓度。结果表明，甲醇浓度等于或高于35％条件时能高效去除粗提物中黄烷酮类杂质，经过100％洗脱后可以富集多甲氧基黄酮(参见表1)，并且在甲醇洗脱浓度为35％时可以更好地保存川陈皮素等多甲氧基组分不被洗脱掉，故本发明使用35％的甲醇条件下洗脱去杂，然后收集100％的甲醇洗脱液。经C18固相萃取分段去杂纯化粗提物可以富集多甲氧基黄酮类化合物，减少杂质。
表1
3.HSCCC溶剂体系的选择
通过测定分配系数(K)来初步筛选用于HSCCC的溶剂体系。将预先配好的不同的溶剂体系充分混匀，静置分层后，吸取同样体积的上下相，加入分段去杂后的初步纯化粉末，分别测定上下相中川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素的峰面积，上下相峰面积二者之比即为二者的分配系数。结果表明，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.1：0.8：1.1：0.9)溶剂体系中，K(川陈皮素)＝0.55，K(橘皮素)＝0.78，K(5-去甲川陈皮素)＝1.81，三者之比在0.5-2范围内(参见表2)。故本发明应用该溶剂体系进行进一步纯化。经HSCCC进一步纯化得到纯度较高的粉末(参见图5)，结果表明组份Ⅰ为高纯度川陈皮素，组份Ⅱ为高纯度橘皮素，组份Ⅲ为高纯度5-去甲川陈皮素(参见图5)。三种物质结构经二级质谱(MS/MS)鉴定。质谱条件：ESI离子源，正离子模式(+ESI)；干燥气(N2)温度：350℃；流速：10.0L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：4000V；质量扫描范围：m/z 100～500。质谱数据采集采用MRM模式。破碎方式与文献报道一致，确认为川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素(参见图6)。
表2
Claims (3)
1.一种从瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）样品提取：取冷冻干燥的瓯柑果皮粉末用95%乙醇超声提取，固液比为1：20，提取温度25 ℃，每次45 min，经真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中；
（2）Sep-pak® C18固相萃取柱去糖和分段：取步骤（1）中得到的水溶液上样Sep-pak®C18固相萃取柱，上样后固相萃取柱先用去离子水洗脱25个柱床体积，去掉极性较高的杂质，然后用甲醇进行梯度洗脱，洗脱液在旋转蒸发仪上36 ℃蒸干得到富含多甲氧基黄酮的100%洗脱组分；
（3）HSCCC进一步分离纯化川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素：配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂体系，充分摇匀过夜，上相为固定相，下相为流动相，首先用固定相以20mL/min流速泵入HSCCC分离柱，待充满后，开启逆流色谱仪将转速调至800 rpm，将流动相以2 mL/min的速度泵入HSCCC分离柱，待流动相从出口稳定流出时，将步骤（2）得到的100%洗脱组分50 mg溶于5 mL下相中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱中的峰型分管收集各组分，峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ的组分分别为川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素；
用UPLC测定各组分的组成，分别合并含有单一多甲氧基黄酮类化合物的试管，在旋转蒸发仪上36 ℃蒸干共得到三种多甲氧基黄酮类化合物，分别为川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素，产品纯度均在98%以上；
其中步骤（2）所述的梯度洗脱分别为35%甲醇溶液、100%甲醇溶液，洗脱顺序为35%甲醇12个柱体积、100%甲醇3个柱体积；
步骤（3）进行HSCCC纯化时，选择正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1.1：0.8：1.1：0.9的溶剂体系。
2.根据权利要求1所述的一种从瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物的方法，其特征在于，步骤（2）所述的固相萃取柱型号为Waters Sep-pak® Vac 12cc 2g C18Cartridges。
3.根据权利要求1所述的方法在瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物中的应用。
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