CN106999585A - 对刺激性和非刺激性骨髓细胞的调节 - Google Patents

对刺激性和非刺激性骨髓细胞的调节 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于增强免疫应答和/或用于治疗诸如癌症的个体的免疫相关病症的方法和组合物，其包括使用诸如抗体或其抗原结合片段的抗原结合蛋白杀伤、失能或消除非刺激性骨髓细胞。

Description

对刺激性和非刺激性骨髓细胞的调节
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年9月28日提交的美国临时申请No.62/056,569和2015年3月8日提交的美国临时申请No.62/129,883的权益，所述申请中每一者出于所有目的全文以引用方式并入本文。
关于联邦研究或开发的声明
本发明受到由美国国家卫生研究院授予的U01 CA141451和U54 CA163123的政府支持。美国政府对本发明有一定的权利。
背景
免疫在预防肿瘤生长中发挥作用。复杂的微环境可以在病变部位内发展，并且虽然募集T细胞，但是通常无法有效控制发展中的瘤块。了解肿瘤消除和肿瘤免疫逃逸之间的平衡可能依赖于对骨髓细胞在肿瘤微环境中发挥的不同作用的理解。
肿瘤微环境的骨髓群体主要包括单核细胞和中性粒细胞(有时宽松地分组为骨髓来源的抑制细胞)、巨噬细胞和树突细胞。虽然瘤内骨髓细胞群体作为一个整体长期被认为是非刺激性或抑制性的，但是最近已经意识到并非所有的肿瘤浸润性骨髓细胞都是相同的。
在正常组织内，这些骨髓细胞中的许多对于先天性和适应性免疫以及特别是用于创伤修复的正常发挥功能至关重要。然而在癌症环境中，通常描述为巨噬细胞以及这些和其它细胞类型的功能障碍群体或偏移群体的显著过量。当被认为是用单一标记物(如CD68和CD163)限定的聚集群体时，“巨噬细胞”浸润与多种肿瘤类型的受试者恶化结局相关((deVisser,Cancer Immunol Immunother,2008；57:1531–9)；(Hanada等人，Int J Urol 2000；7:263–9)；(Yao等人，Clin Cancer Res,520,2001；7:4021–6)；(Ruffell等人，PNAS,5232012；109:2796–801))。但是来自肿瘤微环境的巨噬细胞的表型和功能亚群因为巨噬细胞和树突细胞的相似性而复杂化，并且在肿瘤生物学中是有问题的。形态学标准常常被用来解决这个问题；一种尝试区分树突细胞与巨噬细胞的方法是基于前者的更尖锐或树突形态，以及后者的更遮蔽(veiled)或球形形态(Bell等人，J Exp Med 555,1999；190:1417–26)。其它团队正尝试在遗传和细胞表面标记物的基础上进行区分。
肿瘤内的抗原呈递区室存在多样性，并且T细胞可以区分抗原呈递细胞(APC)的特征。因为T细胞是肿瘤免疫的主要驱动因素，所以理解它们的同源APC的确切特征将是重要的。骨髓细胞是能够向T细胞呈递肿瘤来源的抗原并从而使T细胞保持在活化状态下的细胞中的主要细胞。抗原呈递发生在肿瘤本身内，并可能影响肿瘤细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能。用抗原呈递细胞(APC)进行T细胞活化是抗原特异性免疫应答和肿瘤细胞杀伤中的重要组成部分。由于这些骨髓群体代表外来的肿瘤反应性细胞毒性T淋巴细胞的主要T细胞相互作用伴侣和抗原呈递细胞，因此了解它们的区别可以指导治疗途径。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物、文件和文章全文以引用方式并入本文中。
发明概要
本文描述了一种杀伤、失能或消除受试者的癌组织内存在的非刺激性骨髓细胞的方法，所述方法包括使非刺激性骨髓细胞与结合至所述非刺激性骨髓细胞并且以有效杀伤、失能或消除受试者的癌组织内的非刺激性骨髓细胞的量存在的抗体或其抗原结合片段接触。在一些方面，非刺激性骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。在一些方面，非刺激性骨髓细胞的杀伤、失能或消除通过减少癌组织的量或体积来治疗受试者。在一些方面，接触增大免疫细胞群体中刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率。在一些方面，接触降低免疫细胞群体中非刺激性骨髓细胞比刺激性骨髓细胞的比率。在一些方面，接触增强受试者的免疫应答。在一些方面，接触基本上不杀伤、失能或消除存在于癌组织外的骨髓细胞和/或存在于癌组织内的刺激性骨髓细胞。
本文还公开了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括施用结合至癌症中存在的非刺激性骨髓细胞并以有效杀伤、失能或消除所述非刺激性骨髓细胞的量存在的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，非刺激性骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。在一些方面，非刺激性骨髓细胞的杀伤、失能或消除通过减少癌组织的量或体积来治疗受试者。在一些方面，接触增大免疫细胞群体中刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率。在一些方面，接触降低免疫细胞群体中非刺激性骨髓细胞比刺激性骨髓细胞的比率。在一些方面，接触基本上不杀伤、失能或消除存在于恶性肿瘤外的骨髓细胞和/或存在于恶性肿瘤中的刺激性骨髓细胞。在一些方面，通过产生或增强对癌症的免疫应答来治疗受试者的癌症。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合至在非刺激性骨髓细胞上表达的靶蛋白的细胞外结构域，所述靶蛋白选自由以下项组成的组：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119，其中非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-，其中抗体或其抗原结合片段通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)将非刺激性骨髓细胞杀伤、失能或消除至低于在使非刺激性骨髓细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触之前存在于癌组织内的非刺激性骨髓细胞的水平，其中非刺激性骨髓细胞存在于包括刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，所述刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+，其中所述接触或施用基本上不杀伤、失能或消除存在于癌组织外的骨髓细胞和/或存在于癌组织内的刺激性骨髓细胞，并且其中所述非刺激性骨髓细胞的杀伤、失能或消除通过增强对癌组织的免疫应答来治疗癌症。
在一些方面，非刺激性骨髓细胞是以下中的至少一种：肿瘤相关的巨噬细胞；肿瘤相关的树突细胞；CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-；CD45+、HLA-DR+和CD14+；CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+；或者不是BDCA3+，如通过流式细胞术或等效测定法所测定。在一些方面，非刺激性骨髓细胞对于以下至少一种是阳性的：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7，以及LILRB4；和/或对于以下中的至少一种呈阴性：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1，如通过聚合酶链反应(PCR)、基因阵列、流式细胞术、RNA测序或等效测定法可测量的。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体介导的吞噬活性中的至少一种。在一些方面，抗体是单克隆抗体、拮抗抗体、多克隆抗体、IgG1抗体、IgG3抗体、去岩藻糖基化(afucosylated)抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和抗原结合片段中的至少一种。在一些方面，抗体或其抗原结合片段不是IgG2抗体，或其中抗体或其抗原结合片段不是IgG4抗体。在一些方面，抗体或其抗原结合片段经缀合。在一些方面，抗体或其抗原结合片段与选自由以下项组成的组的至少一种治疗剂缀合：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体和第二抗体片段。在一些方面，抗体或其抗原结合片段选择性地结合以下中的至少一个：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119。在一些方面，抗体或其抗原结合片段不选择性结合LILRB4。
在一些方面，所述接触或施用诱导以下中的至少一种：非刺激性骨髓细胞的死亡，非刺激性骨髓细胞的凋亡，非刺激性骨髓细胞的裂解，对非刺激性骨髓细胞的吞噬，以及非刺激性骨髓细胞的生长停滞。
在一些方面，刺激性骨髓细胞包括为以下中的至少一种的细胞：CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-和BDCA3+；以及CD45+、HLA-DR+、CD11c+和BDCA3+，如通过流式细胞术或等效测定法所测定。在一些方面，刺激性骨髓细胞对于以下至少一种呈阴性：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4；和/或对于以下中的至少一种呈阳性：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1，如通过聚合酶链反应(PCR)、基因阵列、流式细胞术、RNA测序或等效测定法可测量的。
在一些方面，非刺激性骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。
在一些方面，癌组织是实体癌症或液体癌症(liquid cancer)。在一些方面，癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、肾癌、肝胆癌、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、***癌、肺癌和乳腺癌。
在一些方面，受试者是人受试者。在一些方面，受试者先前已经接受，正在接受或后续将接受免疫治疗。在一些方面，免疫疗法是以下中的至少一种：抑制免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抑制T细胞的免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抗PD1；抗PDL1；抗CTLA4；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞和抗原呈递细胞的抗原结合蛋白；BiTE抗原结合蛋白；toll样受体配体；以及细胞因子。
在一些方面，所述方法增强受试者的免疫应答。在一些方面，免疫应答是基于免疫疗法的免疫应答。在一些方面，基于免疫疗法的免疫应答靶向癌组织。
在一些方面，所述方法还包括施用增强刺激性骨髓细胞的活性或增大刺激性骨髓细胞数量的试剂。在一些方面，所述试剂是FLT3L。
在一些方面，所述方法治疗受试者的癌症。
在一些方面，接触或施用增大免疫细胞群体中刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率。在一些方面，接触或施用导致在受试者中，肿瘤中存在的刺激性骨髓细胞占肿瘤中存在的总CD45+、HLA-DR+细胞的大于1至4％、1至2％、1％、1.37％、1.6％、2％、3％或4％。
在一些方面，所述方法还包括确定来自受试者的生物样品中刺激性骨髓细胞和/或非刺激性骨髓细胞的数目。在一些方面，所述确定步骤用来确定受试者是否受益于抗体或其抗原结合片段的施用。在一些方面，确定步骤用来监测施用抗体或其抗原结合片段的有效性。
在一些方面，所述方法还包括确定来自受试者的生物样品中以下至少一者的表达水平：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4。在一些方面，所述方法还包括确定来自受试者的生物样品中以下至少一者的表达水平：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段是在包含所述抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。在一些方面，所述组合物是无菌的。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合至在非刺激性骨髓细胞上表达的靶蛋白的细胞外结构域，所述靶蛋白选自由以下项组成的组：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119，其中非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-，其中抗体或其抗原结合片段通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)将非刺激性骨髓细胞杀伤、失能或消除至低于在使非刺激性骨髓细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触之前存在于癌组织内的非刺激性骨髓细胞的水平，其中非刺激性骨髓细胞存在于包括刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，所述刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+，并且其中对非刺激性骨髓细胞的杀伤、失能或消除治疗癌症。
本文还公开了一种增强受试者对肿瘤的免疫应答的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的治疗，所述治疗增强肿瘤中刺激性骨髓细胞的丰度或降低肿瘤中非刺激性骨髓细胞的丰度，其中所述治疗增强对肿瘤的免疫应答，任选地其中所述免疫应答减小肿瘤的体积。
本文还公开了一种改善对患有肿瘤的受试者的癌症免疫疗法治疗的功效的方法，其包括向受试者施用有效量的治疗，所述治疗增强肿瘤中刺激性骨髓细胞的丰度或降低肿瘤中非刺激性骨髓细胞的丰度，其中受试者先前已经接受过，在此同时接受或随后将接受癌症免疫治疗。
在一些方面，所述方法包括全身施用或增强FLT3L。在一些方面，所述方法包括全身施用导致非刺激性骨髓细胞的消除或减少的一种或多种抗体，选择性地保留刺激性骨髓细胞。在一些方面，所述方法包括用FLT3L处理受试者的自体同源骨髓或血细胞，同时阻断CSF1的表达或作用。在一些方面，所述方法包括增强骨髓或血液祖细胞群体中IRF8、Mycl1、或BATF3或ZBTB46的表达。
本文还公开了一种确定来自受试者的样品中是否存在非刺激性骨髓细胞的方法，其包括：将包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与结合至非刺激性骨髓细胞的抗体或其抗原结合片段接触；确定指示抗体与非刺激性骨髓细胞结合的复合物的存在；任选地定量化群体中非刺激性骨髓细胞的数量；以及任选地用与非刺激性骨髓细胞结合的抗体或其抗原结合片段治疗受试者。
本文还公开了一种确定来自受试者的样品中是否存在刺激性骨髓细胞的方法，其包括：将包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与结合至刺激性骨髓细胞的抗体或其抗原结合片段接触；确定指示抗体与刺激性骨髓细胞结合的复合物的存在；任选地定量化群体中刺激性骨髓细胞的数量；以及任选地治疗受试者。
本文还公开了一种定量化肿瘤样品中非刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量以下细胞中的至少一种细胞的细胞数：肿瘤相关巨噬细胞；肿瘤相关树突细胞；CD45+、HLA-DR+和CD14+；CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+；或者不是BDCA3+。
本文还公开了一种定量化存在于肿瘤样品中的刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量为以下细胞中的至少之一种细胞的细胞数：CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-和BDCA3+；以及CD45+、HLA-DR+、CD11c+和BDCA3+。
在一些方面，通过细胞分选方法对细胞进行定量化。在一些方面，细胞分选方法选自由以下项组成的组：荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁活化细胞分选、微阵列分选(microraft sorting)和基于亲和力的细胞分离。
本文还公开了一种定量化肿瘤样品中的非刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量以下非刺激性骨髓细胞标记物中的至少一种的表达：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4。
本文还公开了一种定量化肿瘤样品中的刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量以下刺激性骨髓细胞标记物中的至少一种的表达：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1。
在一些方面，通过定量PCR来测量标记物的表达。在一些方面，使用包含用于标记基因序列的固定探针的寡核苷酸阵列来完成对标记物基因表达的定量。
在一些方面，通过针吸活检、钻孔活检或手术切除肿瘤来从肿瘤获得肿瘤样品。
本文还公开了一种用于评估患者的癌症状况的方法，其包括以下步骤：从受试者获得肿瘤样品；以及测量源自受试者的肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度。
在一些方面，所评估的癌症状况是癌症复发的可能性；并且其中肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示癌症复发的可能性降低。在一些方面，所评估的癌症状况是受试者对免疫疗法治疗的依从性；并且其中肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示受试者将对免疫疗法治疗积极应答的可能性增大。在一些方面，所评估的癌症状况是免疫疗法治疗的有效性；并且其中肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示免疫疗法治疗是有效的。在一些方面，所评估的癌症状况是预期的癌症存活时间；并且其中肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示预期的癌症存活时间延长。
在一些方面，刺激性骨髓细胞的升高丰度是超过在代表性肿瘤样品池中观察到的刺激性骨髓细胞的中值或平均丰度的丰度。在一些方面，刺激性骨髓细胞的丰度测量为样品中刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率。在一些方面，刺激性骨髓细胞的丰度测量为样品中存在的刺激性骨髓细胞比总骨髓细胞的比率。在一些方面，刺激性骨髓细胞的丰度测量为样品中存在的刺激性骨髓细胞比总HLA-DR+细胞的比率。在一些方面，刺激性骨髓细胞的丰度升高被定义为大于1.37个刺激性骨髓细胞/100个HLA-DR+细胞。在一些方面，免疫疗法治疗是抗PD1治疗。在一些方面，抗PD1治疗是纳武单抗(nivolumab)或潘利珠单抗(pembromizulab)的施用。在一些方面，受试者患有黑素瘤。
本文还公开了一种用于评估治疗对升高肿瘤中刺激性骨髓细胞丰度的有效性的方法，所述方法包括以下步骤：对一个或多个患有癌症的受试者施用治疗；以及测量源自一个或多个受试者的一个或多个肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度，其中所述一个或多个肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示试剂是有效的。
在一些方面，刺激性骨髓细胞的丰度升高被定义为一个或多个肿瘤样品中的刺激性骨髓细胞的丰度比在施用所述治疗前在从一个或多个受试者获得的一个或多个肿瘤样品中观察到的刺激性骨髓细胞的丰度更高。在一些方面，刺激性骨髓细胞的丰度升高被定义为来自所治疗受试者的一个或多个肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度比在来自未治疗受试者的代表性肿瘤样品池中观察到的刺激性骨髓细胞的丰度更高。
抗LILRB4抗体或其抗原结合片段包含表BB所示的一个或多个序列或与表BB所示序列具有至少80％、90％或95％的序列同一性的序列变体，任选地其中抗体或其抗原结合片段包含表BB所示的CDR序列的每个CDR，任选地其中抗体或其抗原结合片段包含表BB所示的每个可变结构域，并且任选地其中抗体或其抗原结合片段包含表BB所示的全长序列。
结合LILRB4蛋白的抗体或其抗原结合片段能够特异性地杀伤、消除或失能非刺激性骨髓细胞。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段与LILRB4的细胞外结构域结合，其中所述抗体或其抗原结合片段通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)来杀伤、失能或消除非刺激性骨髓细胞。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体介导的吞噬活性中的至少一种。在一些方面，抗体是单克隆抗体、拮抗抗体、多克隆抗体、IgG1抗体、IgG3抗体、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和抗原结合片段中的至少一种。在一些方面，抗体或其抗原结合片段不是IgG2抗体，或其中抗体或其抗原结合片段不是IgG4抗体。在一些方面，抗体或其抗原结合片段经缀合。在一些方面，抗体或其抗原结合片段与选自由以下项组成的组的至少一种治疗剂缀合：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体和第二抗体片段。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含与表BB中列出的序列至少95％同一的序列。
一种药物组合物包含本文所公开的抗LILBR4抗体或其抗原结合片段的和药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，所述组合物是无菌的。
在一些方面，本文公开的抗LILBR4抗体或其抗原结合片段用于本文公开的方法中。
附图简述
图1.小鼠和人肿瘤中罕见的DC和丰富的巨噬细胞。(图1A)对来自经消化和经CD45富集的PyMTchOVA肿瘤的肿瘤APC群体的流式细胞术和门控。A-C：代表大于5次独立实验。(图1B)对异位B78ChOVA肿瘤中的肿瘤APC群体的细胞计数。(图1C)B78chOVA中的肿瘤浸润性免疫细胞的肿瘤来源mCherry荧光柱状图。(图1D)对用来辨识由CD45+Lin-(CD3e、CD56、CD19)HLA-DR+定义并由CD14、BDCA1和BDCA3***的推定DC和TAM群体的经消化的人黑素瘤转移性活检的代表性细胞计数。双阴性细胞可能反映出逃逸谱系门的B细胞、未成熟的单核细胞或pDC。(图1E)肿瘤浸润性骨髓细胞的相对比例，为PyMTchOVA和B78chOVA模型中总CD45+细胞的百分数。汇集的数据来自多个单独肿瘤，表示为来自(n＝5)小鼠的平均值±SEM。(图1F)浸润人转移性黑色素瘤的DC和TAM群体的频率，表示为总CD45+细胞的百分数。汇集的数据来自多名患者，表示为来自(n＝4)次活检的平均值±SEM。对于图1C，柱状图从前到后分别针对以下每种细胞类型：T细胞、Nφ、DC2、DC1、单核细胞、TAM2、TAM1和肿瘤。
图2.表面和转录谱分析突出突显肿瘤DC和巨噬细胞的不同谱系。所有数据(图2A至图2G)来自异位B78chOVA肿瘤模型。细胞谱系按照图1定义。(图2A)相较于相应同种型(灰色阴影)，一组DC特异性标记物的表达。黑框框出了CD103+DC2群体，其显示出独特的表达。(图2B)使用相应同种型(灰色阴影)的巨噬细胞特异性标记物(着色的)的差异性表达。黑框框出了CD11b+DC1、TAM1和TAM2群体，其显示出独特的表达。(图2C)相较于相应同种型(灰色阴影)，CD11b+DC1群体对DC-Th2标记物(着色)的特异性表达。黑框框出了CD11b+DC1，其显示出独特的表达。(图2D)通过对来自一式三份生物试样的FACS纯化群体进行RNA测序显示出的全局转录谱。数据显示为相对于前1000个基因的全局平均值，以Log2倍变化达DC1、DC2、TAM1和TAM2之间的最大方差的热图。(图2E)基于RNA测序全局转录谱的DC1、DC2、TAM1和TAM2群体的PCA。(图2F)对来自经分选的APC群体的Irf4、Irf8、Myb和Zbtb46(zDC)的表达的qRT-PCR分析。数据表示为根据一式三份生物学试样(n＝3)计算出的平均ΔCt±SEM，(N.D.表示未检测)。(图2G)与相应同种型(灰色)相比，对肿瘤APC群体中的Irf4和Irf8的细胞内染色。对于图2E，从左到右的各个三点簇分别是：CD103+DC2、CD11b+DC1、F4/80+TAM1和F4/80+TAM2。
图3.肿瘤浸润性APC种群的差异性Irf4、Irf8和Batf3需求。所有数据是对CD11b+DC1群体和CD103+DC2群体的代表性流式细胞术分析(在CD45+、Ly6C-、MHCII+和CD24+上设置门控)，数据显示为平均值±SEM。统计学显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns＝无统计学显著性。(图3A)来自Irf8-/-(KO)的异位PyMT-VO肿瘤与对照(WT)的比较。相对细胞比例为总MHCII+细胞的百分数。数据汇集自来自2次独立实验的单独小鼠(n＝6)。(图3B)Irf4f/f x CD11c-CRE+宿主中的异位B78chOVA肿瘤与Cre阴性同窝仔鼠的比较。相对细胞比例为总MHCII+细胞的百分数。数据汇集自来自2次独立实验的单独小鼠(n＝7)。(图3C)Batf3 KO中的异位B78chOVA肿瘤与WT的比较。相对细胞比例作图为总MHCII+的百分数。数据汇集自单独小鼠(n＝6)。(图3D)Zbtb46-DTR小鼠中的异位B78chOVA肿瘤，接受使用DT或PBS得急性24小时消除。相对细胞比例作图为总MHCII+细胞的百分数。数据汇集自来自2次独立实验的单独小鼠(n＝6)。
图4.肿瘤浸润性APC群体对M-CSF和GM-CSF细胞因子的差异性依赖。(图4A)对来自经分选的APC的CSF1R、CSF2Rb和CSF3R表达的qPCR。数据表示为根据单独B78chOVA肿瘤的一式三份生物学试样(n＝3)计算出的平均ΔCt±SEM(N.D.表示未检测)。(图4B)在αCSF-1阻断3天后，肿瘤APC的细胞计数(点状)与同种型(实线)经治疗的肿瘤动物的比较。定量为总CD45+细胞的百分数，汇集自来源于2次独立实验的单独小鼠(n＝6)，显示为平均值±SEM。统计学显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns＝无统计学显著性(图4C)骨髓(BM)祖细胞过继转移及对骨髓、脾脏和肿瘤的贡献的示意图。(图4D)对肿瘤到达的同类系细胞的代表性细胞计数。在CD45.2上设置门控并遵循图1A的门控策略。(图4E)WT对照GMCSFR KO GMP祖细胞到B78chOVA肿瘤受体中的竞争性骨髓过继转移。增殖效率绘制为占总转移细胞的百分比。对肿瘤到达GMP细胞、WT(左条，各自针对BM、脾脏和肿瘤)、KO(右条，各自针对BM、脾脏和肿瘤)的代表性门控。肿瘤到达DC的定量化，用CD24+CD11c+定义。数据汇集自2次独立实验，绘制为各个肿瘤的平均值±SEM(n＝6)。(图4F)对在异位B16-F10、B16-GMCSF和B16-FLT3L细胞因子表达肿瘤之间的CD11b+DC1群体和CD103+DC2群体的细胞计数(在CD45+、Ly6C-MHCII+、CD24+上设置门控)。群体表示为每个肿瘤中总MHCII+细胞的百分数。数据汇集自3次独立实验，绘制为各个肿瘤的平均值±SEM(n＝6)。对于图4F中的每个组(右图)，条从左到右分别表示：DC2、DC1、TAM1和TAM2。
图5.CD103+DC2的独特抗原处理和呈递能力。所有数据(图5A至图5G)来自异位B78chOVA肿瘤模型。(图5A)根据对群体中参与交叉呈递、细胞因子和趋化因子产生和共刺激的所选基因进行RNA测序获得的Log2转换表达式的热图。颜色梯度定义为浅灰色＝底部第20百分比，深灰色＝顶部第80百分比，其中第20至80百分比分级并居中(graduated andcentered)(第50百分比)。数据来自经分选的细胞的一式三份生物试样。(图5B)与相应同种型(灰色阴影)相比，对T细胞调节分子的配体的表面蛋白水平(黑线)的细胞计数。(图5C)与相应同种型(阴影；后四行)相比，MCHI和MHCII(黑线；前四行)表达的细胞计数。对于图5C，从前到后的各条着色线分别是CD103+DC2、CD11b+DC1、F4/80+TAM1，以及F4/80+TAM2。对于图5C，从前到后的各条阴影线分别是CD103+DC2、CD11b+DC1、F4/80+TAM1和F4/80+TAM2。(图5D)对群体的体外葡聚糖摄取的细胞计数。灰色＝无葡聚糖，浅色柱状图＝葡萄糖结合于4C，黑色柱状图＝葡聚糖摄取于37C，以一式三份显示。每个群体的△几何平均荧光强度(gMFI)绘制为平均值±SEM。数据代表2次独立实验(n＝6)。(图5E)对群体的内吞区室的相对pH的细胞计数分析。用比率量度pH构建体N1-mCherry-pHluorin转染B78肿瘤细胞。pHluorin是一种pH敏感的GFP衍生物，其在酸性pH下猝灭。代表性的柱状图显示mCherry+细胞中pHluorin的荧光，其中较少的pH-GFP代表更酸性的环境。灰色柱状图是来自表达非pHluorin的对照肿瘤(B78亲本)的相应群体。数据总结为GFP和mCherry荧光之间的gMFI比例。数据表示为平均比率±SEM，汇集自3次独立实验。(图5F)对群体中IL12的细胞内细胞因子染色。定量每个群体的IL12+细胞百分比，数据汇集自2次独立实验(n＝3)，作为为平均值±SEM绘图。统计显著性表示为*p<0.05。对于图5F，从前到后的各条线分别是CD103+DC2、CD11b+DC1、F4/80+TAM1和F4/80+TAM2。(图5G)通过qPCR测量的细胞因子Il12b和Il10转录物的转录水平。数据表示为根据单独肿瘤的一式三份生物学试样(n＝3)计算出的平均ΔCt±SEM(N.D.表示未检测)。
图6.CD103+DC是初始CD8+T细胞和经活化的CD8+T细胞的优良T细胞刺激剂。所有数据(图6A至图6G)来自异位B78chOVA肿瘤模型。T细胞+BMDC(阴影灰色；最后面)，T细胞+BMDC+SL8(无阴影的灰色；第二最后)，T细胞+肿瘤APC(相应的着色柱状图)。以20,000个T细胞:4,000个APC的比率接种。除非另有说明，代表性流程图是根据4次独立实验的。(图6A)对在直接来自肿瘤的经分选APC群体上培养的初始OT-I CD8+T细胞或先前活化的OT-I CD8+T细胞上的早期活化标记物Nur77和CD69(12小时)的流式细胞术。对于图6A，从前到后的每条线分别是F4/80+TAM2、F4/80+TAM1、CD11b+DC1和CD103+DC2。(图6B)在与肿瘤APC群体共培养72小时后，通过eFluor670染料稀释法测量的初始OT-I CD8+T细胞增殖的代表性细胞计数对照Nur77(作为TCR触发的量度)的曲线图。总细胞收率计数了以上列出的图表。(图6C)肿瘤APC之间的初始T细胞增殖的柱状图叠加。对于图6C，从前到后的每条线分别是F4/80+TAM1、F4/80+TAM2、CD11b+DC1和CD103+DC2。(图6D)先前活化的OT-I CD8+T母细胞在肿瘤APC群体上培养72小时时，通过eFluor670染料稀释法测量的T细胞增殖的代表性细胞计数对照Nur77的曲线图。总细胞收率计数了以上列出的图表。(图6E)肿瘤APC中先前活化的OT-I CD8+T细胞增殖的柱状图叠加。对于图6E，从前到后的每条线分别是F4/80+TAM1、F4/80+TAM2、CD11b+DC1和CD103+DC2。(图6F)初始OT-IICD4+T细胞在肿瘤APC群体上培养72小时时，通过eFluor670染料稀释法测量的T细胞增殖的代表性细胞计数。根据2次独立实验的代表性流程图。(图6G)肿瘤APC中初始OT-II CD4+T细胞增殖的柱状图叠加。对于图6G，从前到后的每条线分别是F4/80+TAM1、F4/80+TAM2、CD11b+DC1和CD103+DC2。
图7.活检和切片成像显示CD11b+DC1和CD103+DC2在肿瘤边缘附近稀疏，但当在其处存在时可与T细胞相互作用。(图7A)对肿瘤内APC的近端/远端位置的定量。数据汇集自4次独立的成像运行，以平均值±SEM表示。对于图7A，每组的条从左到右分别是：TAM2、TAM1和DC1/2。(图7B)APC-T细胞在体内的接触是作为总偶联T细胞的百分数观测的。在2次独立的活体2光子成像运行中30分钟成像的4个不同位置的累积数据。通过计数T细胞与红色、黄色和绿色APC之间的物理接触来对接触进行人工评分。条的放置位置代表了所接触的ARC(顶部：CD103+、CD11b+DC1，底部：TAM1，中间：TAM2)。(图7C)用先前活化的OT-I CD8+T细胞对经过CD45+细胞阳性选择的经消化肿瘤进行的体外T细胞偶联测定。数据计算为每个群体中偶联T细胞的百分比(左)和偶联T细胞的总百分比(右)。数据汇集自2次独立的实验，作为平均值±SEM绘制曲线图。对于图7C，从左到右的各组的条分别是：DC2、DC1、TAM1和TAM2。
图8.有效的过继性CTL治疗需要肿瘤中罕见的CD103DC2群体。(图8A)肿瘤生长曲线绘制为在zDC-DTR宿主中随时间推移EG7.1的肿瘤面积(mm2)。箭头分别指示在第4天和第5天，腹膜内白喉毒素(D.T.)/PBS施用和静脉注射转移5×106个先前活化的OT-ICD8+T细胞的时间。在整个时间段中，随后每3天施用一次DT/PBS，以及随后每隔一天施用FTY-720/盐水。浅灰色虚线(顶部)示出在不转移T细胞的情况下，zDC-DTR宿主中的EG7.1生长。在转移活化的CD8+T细胞和FTY-720治疗(黑线；底部)或使用附加的DT介导的DC消除(深灰色线；中间)后，EG7.1消退。代表性的数据表示为来自2次独立实验的平均肿瘤面积±SEM(n＝4)。统计显著性表示为*p<0.05。(图8B)在针对作为协变量的癌症类型进行的多变量COX比例风险存活分析调整中，TCGA人类样品的CD103+/CD103-比率基因信号的预后值与单个基因(绿色表示的CD103+特异性，或红色表示的TAM1/TAM2/Cd11b DC1特异性基因)的比较。数据表示为风险比(HR)，具有95％置信区间的，其中值<1表示总体存活率(OS)增大；>1表示基因的OS降低，其中BH p值<0.05。(图8C)在针对作为协变量的癌症类型进行的多变量COX比例风险存活分析调整中，TCGA人类样品的CD103+/CD103-比率基因信号的预后值与若干已公布的预后基因签名的比较。数据表示为风险比(HR)，具有95％置信区间的，其中值<1表示总体存活率(OS)增大；>1表示基因的OS降低，其中BH p值<0.05。(图8D)人类TCGA数据集中的所有12种癌症的K-M曲线图，所述图针对癌症类型调整。数据解析为高CD103+/CD103-基因比率(黑色，n＝1801)和低CD103+/CD103-比率表达者(灰色＝1801)，其中p值＝1.76e-07。(图8E)TCGA数据集中乳腺癌患者的总体存活率的K-M曲线图。数据解析为高CD103+/CD103-基因比率(黑色，n＝422)和低CD103+/CD103-比率表达者(灰色＝423)，其中p值＝0.0255。(图8F)TCGA数据集中头颈鳞状细胞癌患者的总体存活率的K-M曲线图。数据解析为高CD103+/CD103-基因比率(黑色，n＝151)和低CD103+/CD103-比率表达者(灰色＝152)，其中p值＝0.000207。(图8G)TCGA数据集中肺腺癌患者的总体存活率的K-M曲线图。数据解析为高CD103+/CD103-基因比率(黑色，n＝177)和低CD103+/CD103-比率表达者(灰色＝178)，其中p值＝0.000874。
图9.与转移性黑素瘤的复发后存活率增大相关的CD103+基因和BDCA3+基因的转录丰度。(图9A)在COX比例风险存活分析中对CD103+基因的预后值、CD103+/-比率和使用转移性黑素瘤数据的个体基因的比较。数据表示为风险比(HR)，具有95％置信区间的，其中<1表示从转移时间开始的总体存活率(OS)(复发后存活率)增大，且>1表示从转移时间开始的OS降低，其中经BH调整的p值<0.05。(图9B)对于所列CD103+基因表达，转移性黑素瘤患者的复发后存活率的卡普兰-梅耶(Kaplan-Meier,K-M)曲线图。对于CD103+基因的表达水平，数据被解析为“高”(浅灰色；每个曲线图的顶部线)和“低”(黑色；每个曲线图的底部线)，以33％、50％和66％的严格性阈值分组(bin)。(图9C)对于CD103+/-比率基因表达，转移性黑素瘤患者的复发后存活率的卡普兰-梅耶曲线图。对于CD103+/-比率基因的表达水平，数据被解析为“高”(浅灰色；每个曲线图的顶部线)和“低”(黑色；每个曲线图的底部线)，以33％、50％和66％的严格性阈值分组。图9D至图9E.TIL类别的基于类别的测量，以及图9F至图9G.来自{Bogunovic等人，2009}的肿瘤周围CD3+T细胞数的组织学测量值对照SDC基因签名(图9D、图9F)和SDC/NSM比率(图9E、图9G)绘制了曲线图。
图10.人转移性黑色素瘤中的肿瘤浸润性APC群体的流式细胞术定量化。(图10A)人转移性黑色素瘤活检患者表。患者标识符、年龄、性别和肿瘤活检位置，以及每位患者的先前治疗(如果已知)的表。所有列出的患者在UCSF接受抗PD-1免疫治疗。先前治疗历史被编码为未治疗，0或经治疗，1。**表示排除额外扫描的快速疾病进展。(图10B)人类转移性黑素瘤的代表性流式细胞术门控策略，用于定义肿瘤浸润性骨髓亚群。数据代表具有大量的BDCA3+和BDCA1+DC群体的患者，在单峰和活细胞上设置门控。(pDC、CD14+TAM、BDCA1+DC、BDCA3+、CD14-TAM)。(图10C)人类转移性黑素瘤的代表性流式细胞术门控策略，用于定义肿瘤浸润性骨髓亚群。数据代表没有大量BDCA3+DC群体的患者，在单峰和活细胞上设置门控。(pDC、CD14+、BDCA1+DC、BDCA3+DC、CD14-TAM)。(图10D)CD45+细胞(黑色；每组为左条)和HLA-DR+细胞(灰色；每组为右条)的频率为占患者活检组织内总活细胞的百分比。(图10E)患者活检组织内的肿瘤浸润免疫群体的频率，如用门控策略所定义的。数据表示为在患者中，pDC、CD14+TAM、BDCA1++DC、BDCA3+DC、CD14-TAM、谱系标记物(CD3e、CD56、CD19)的总CD45+细胞的频率，平均值±平均值的标准偏差(S.E.M.)。
图11.人黑色素瘤中BDCA3+DC的细胞丰度预测抗PD1的响应性。患者分组为应答者(灰色，包括部分或完全应答)或无应答者(黑色，包括稳定的疾病和进行性疾病)。(图11A)单独患者中CD45+细胞占总活细胞的百分比的瀑布图，分为应答者和无应答者。(图11B)应答者(灰色)和无应答者(黑色)对照肿瘤中CD45+细胞占总活细胞的百分比的定量频率。数据汇集自多名患者，并表示为平均值±S.E.M.，n.s.＝无显著性。(C)单独患者的肿瘤中BDCA3+DC细胞占总CD45+细胞的百分比的瀑布图，分为应答者和无应答者。(图11D)应答者(灰色)和无应答者(黑色)对照肿瘤中BDCA3+DC细胞占总CD45+细胞的百分比的定量频率。数据汇集自多名患者，并表示为平均值±S.E.M.，**p＝0.0056。(图11E)BDCA3+DC和CD14+TAM的频率作为占肿瘤中总HLA-DR+细胞的比例的散点图，其中用空心圆圈表示应答者并用实心圆圈表示无应答者。(图11F)BDCA3+DC和BDCA1+DC的频率作为占肿瘤中总HLA-DR+细胞的比例的散点图，其中用空心圆圈表示应答者并用实心圆圈表示无应答者。(图11G)BDCA3+DC和CD14-TAM的频率作为占肿瘤中总HLA-DR+细胞的比例的散点图，其中用空心圆圈表示应答者并用实心圆圈表示无应答者。
图12.黑色素瘤小鼠模型中CD103+DC对抗PD1功效的需求。(图12A)使用联合免疫疗法治疗方案的小鼠和肿瘤模型示意图。(图12B)在肿瘤生长的第5天、第8天和第11天接受100ug对照亚美尼亚仓鼠IgG和100ug对照大鼠IgG2a腹腔内注射的B6对照小鼠(最左图)中单独B78chOVA肿瘤的肿瘤面积(mm2)。数据汇集自2次独立实验，n＝8。(图12C)在肿瘤生长第5天、第8天和第11天接受100ug抗CTLA-4和100ug抗PD-1，以及在第4天、第7天和第10天注射PBS的Zbtb46-DTR BM嵌合体小鼠(中间图)体内的单独B78chOVA肿瘤的肿瘤面积(mm2)。数据汇集自2次独立实验，n＝8。(图12D)在肿瘤生长第5天、第8天和第11天接受100ug抗CTLA-4和100ug抗PD-1，以及在第4天、第7天和第10天注射DT的Zbtb46-DTR BM嵌合体小鼠(最右图)体内的单独B78chOVA肿瘤的肿瘤面积(mm2)。数据汇集自2次独立实验，n＝8。
图13示出，如通过流式细胞术所分析的，进行性门控鉴定所有显示的人肿瘤类型(转移性黑素瘤、头颈鳞状细胞癌(HNSC)和结肠癌)的NSM群体和SDC群体。
图14示出在B16-F10和MC38异位小鼠肿瘤模型中使用各种NSM标志物(包括TREM2)对肿瘤微环境中指定的细胞亚群的标记，以及MS467、LILRB4和CD88染色，如通过流式细胞术分析的。所有NSM标记的染色模式显示出对NSM群体(TAM、Ly6C+单核细胞，CD11b+DC)的高度特异性，而不染色SDC(CD103+DC)。按照图1A、图1B中的门控策略先对群体设置门控。每个群体的二级对照为灰色阴影，而每个群体的NSM标记物染色由实心黑色柱状图叠加。
图15示出人SDC上的CCR7表达。按照图13中的门控策略先对群体设置门控。
图16示出在小鼠异位B16-F10肿瘤的肿瘤微环境中，SDC基因产物、CCR7和XCR1在SDC(CD103+DC)上特异性表达，而在NSM(TAM、Ly6C+单核细胞，CD11b+DC)上没有SDC蛋白表达。按照图1A、图1B中的门控策略先对群体设置门控。每个群体的二级对照为灰色阴影，而每个群体的SDC标记物染色由实心黑色柱状图叠加。
图17示出来自野生型C57BL/6雄性小鼠的健康骨髓(BM)和脾脏组织内不存在NSM标记、MS4A7和TREM2的染色，如通过流式细胞术分析的。按照图1A、图1B中的门控策略先对群体设置门控。每个群体的二级对照为灰色阴影，而MS4A7和TREM2染色由实心黑色柱状图叠加(顶部图)。所述图的下半部分显示，健康小鼠骨髓和脾脏组织内没有特异性染色，在免疫群体中具有滴定浓度(0nM、2nM、20nM和200nM)的aTREM2抗体克隆2、5和7。
图18示出分别在体内特异性地消除荷有TREM2和LILRB4的细胞的抗TREM2和抗LILRB4抗体。将对照和表达TREM2或LILRB4的EL4转染细胞以1:1比率混合，并腹膜内注射到WT B6雄性小鼠体内。三小时后，向动物注射(抗TREM2或抗LILRB4)抗体或对照人IgG1或PBS。36小时后，处死小鼠，通过腹腔灌洗收获来自腹膜的回收细胞，并通过流式细胞术计数。
图19表明相对于对照，抗NSM抗体将肿瘤生长减少到与抗PD-1疗法相同的程度。将MC38结肠癌注射到6周龄的雄性小鼠B6中。将小鼠随机疗组，在第5天、第7天、第11天、第15天通过腹膜内注射用所示抗体进行治疗。示出的是75％的秩(减少顶部异常值，绘图为底部4只小鼠中的3只)。给药：PD-1和Fc对照的剂量为200ug/天，在第5天、第7天、第11天和第15天注射40ug、20ug、20ug和40ug的抗Pi1.2(aTREM2)抗体。用游标卡尺测量肿瘤，并示出肿瘤体积。
图20示出对人黑素瘤中BDCA3+的受试者操作特性(ROC)分析。使用％BDCA3的染色数据和抗PD1的结局数据来进行(图20A)对BDCA3+比CD45+比率对照结局的ROC分析；以及(图20B)对BDCA3+比HLA-DR+比率对照结局的ROC分析。
图21示出在原代人HNSC肿瘤组织内，NSM群体(CD14+TAM)有限地表达TREM2蛋白，而CD14阴性CD11c阳性细胞(包括SDC(BDCA3+DC))上具有很少TREM2蛋白表达，甚至不表达TREM2蛋白。与二次对照染色(抗大鼠IgG，Jackson Immunoresearch)相比，对经消化的人HNSC肿瘤组织进行TREM2特异性商购抗体(RnD，克隆237920)染色，并通过流式细胞术分析。所述图示出在人肿瘤组织内，NSM基因产物在NSM细胞上特异性表达，而SDC细胞缺乏NSM基因产物表达。在活的、CD45+、谱系阴性、HLA-DR+、CD11c+上对群体设置门控，并通过CD14表达分离。
本发明的这些和其它方面以及优点将从随后的详细描述和权利要求书变得显而易见。应当理解，本文所述的各种实施方案的一种、一些或所有性质可以组合以形成本发明的其它实施方案。
具体实施方式
为了解释本说明书，将应用以下定义，并且适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。如果以下列出的任何定义与以引用方式并入本文的任何文件相冲突，则以所列出的定义为准。
应当理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包括”，“由......组成”和“基本上由......组成”的方面和实施方案。
对于本文所述的所有组合物以及使用本文所述组合物的所有方法，所述组合物可以包括所列出的组分或步骤，或者可以“基本上由所列出的组分或步骤组成”。当组合物被描述为“基本上由所列出的组分组成”时，所述组合物含有所列出的组分，并且可以含有不会大幅影响所治疗的病症的其它组分，但不含有除了明确列出的那些组分外大幅影响所治疗的病症的任何其它组分；或者，如果所述组合物含有除了列出的大幅影响所治疗的病症的那些组分以外的额外组分，则所述组合物不含有足以大幅影响所治疗的病症的足够浓度或量的所述额外组分。当方法被描述为“基本上由所列出的步骤组成”时，所述方法包含列出的步骤，并且可以包含不会大幅影响所治疗的病症的其它步骤，但所述方法不包含除了明确列出的步骤以外任何其它大幅影响所治疗的病症的步骤。作为非限制性具体实例，当将组合物描述为“基本上由某组分组成时”组分时，所述组合物可另外含有任何量的药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂和其它此类基本上不影响所治疗的病症的组分。
术语“任选地”是指当顺序使用时，包括所列举组合中的一个至所有组合，并且考虑所有子组合。
本文所用的“有效量”或“治疗有效量”是指作为单一剂量或一系列剂量的部分施用于个体的治疗化合物(例如抗NSM抗原结合试剂或抗NSM抗体)的量，其单独或与另一种治疗方式组合地有效产生或有助于所需治疗效果。所需治疗效果的实例是增强免疫应答，减缓或延缓肿瘤发展；稳定疾病；改善一种或多种症状。有效量可以以一种或多种剂量给予。
本文所用的术语“治疗”是指延缓或逆转疾病如癌症的进展。本文所用的术语“治疗”是指治疗诸如癌症的病症的作用。
本文所用的“个体”或“受试者”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、赛场动物或宠物动物，例如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，个体为人。在一些实施方案中，个体为小鼠。
本文所用的术语“约”是指本领域的技术人员熟知的相应值的通常误差范围。本文中提及“约”某值包括(和描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
必须指出的是，如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
对于本文所述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法是本领域已知的。
非刺激性骨髓细胞(NSM)
本文提供了用于失能和/或检测非刺激性骨髓细胞(NSM)的方法和组合物，包括使用抗NSM抗体。本文还提供了用于靶向和/或检测表达NSM蛋白的非刺激性骨髓细胞的方法和组合物。
本文还提供了用于失能和/或检测非刺激性骨髓细胞的方法和组合物，包括在非人个体中使用针对人NSM蛋白的非人同源物的抗体。
如本文所用，非刺激性骨髓细胞是不足以有效刺激免疫应答的骨髓细胞(例如，与刺激性骨髓细胞相比，在肿瘤微环境中不能有效刺激抗肿瘤应答)。在一些实施方案中，与刺激性骨髓细胞相比，非刺激性骨髓细胞无法有效向T细胞呈递抗原(例如肿瘤抗原)或不能有效刺激肿瘤特异性T细胞应答。在一些实施方案中，与刺激性骨髓细胞相比，非刺激性骨髓细胞可以表现出降低的摄取、加工肿瘤相关抗原和/或向T细胞呈递肿瘤相关抗原的能力。非刺激性骨髓细胞可能具有降低的应激(re-prime)细胞毒性T淋巴细胞的能力或不具有此能力，或在某些情况下不能刺激有效的肿瘤细胞杀伤。与刺激性骨髓细胞相比，非刺激性骨髓细胞可表现出对参与抗原加工、抗原呈递和/或抗原共刺激的基因和细胞表面标记物的较低表达，所述细胞表面标记物包括但不限于CD80、CD86、MHCI和MHCII。
当与刺激性骨髓细胞相比时，非刺激性骨髓细胞可以表现出对与交叉呈递、共刺激和/或刺激性细胞因子相关的基因的较低表达，并增大对抗炎细胞因子IL-10的表达，所述刺激性细胞因子包括但不限于TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、TAPBP、PSME2、CD24a、CD274、BTLA、CD40、CD244、ICOSL、ICAM1、TIM3、PDL2、RANK、FLT3、CSF2RB、CSF2RB2、CSF2RA、IL12b、XCR1、CCR7、CCR2、CCL22、CXCL9和CCL5中的任何一种或多种。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞依赖于转录因子IRF4和细胞因子GM-CSF或CSF-1进行分化和存活。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞可通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)和一氧化氮合酶(NOS)来促进肿瘤血管新生，并通过分泌表皮生长因子(EGF)来支持肿瘤生长。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或树突细胞(DC)。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞不是树突细胞(DC)。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。TAM是存在于癌性肿瘤附近或内的巨噬细胞，并且衍生自循环单核细胞或常驻型组织巨噬细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞是基于它们表达的标记物或其选择性表达的标记物来区分的。表达某种细胞表面标志物可以描述为‘+’或‘阳性’。不存在某种细胞表面标记物可以描述为‘-’或‘阴性’。细胞表面标记物的表达可以进一步描述为‘高’(细胞表达高水平的标记物)或‘低’(细胞表达低水平的标记物)，其指示每个标记物在细胞表面上的相对表达。标记物的水平可以通过本领域已知的各种方法来确定，例如免疫染色和FACS分析，或凝胶电泳和Western印迹法。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是树突细胞(DC)。在一些实施方案中，树突细胞可以通过尖锐或树枝状形态来区分。在一个实施方案中，非刺激性树突细胞至少为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+(也称作DC1细胞)。在一个实施方案中，非刺激性树突细胞不是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+(也称作DC2细胞)。在一个实施方案中，为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+的树突细胞是刺激性骨髓细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞。在一些实施方案中，例如在人中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于靶向其它哺乳动物(例如小鼠)中的TAM和DC。在此类实施方案中，使小鼠TAM和DC与NSM抗体接触。在一个实施方案中，例如在小鼠中，肿瘤相关的巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低(也称为TAM1)。在一个实施方案中，例如在小鼠中，肿瘤相关巨噬细胞至少是CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高(也称为TAM2)。本文所用的术语“CD11b高巨噬细胞”是指表达高水平的CD11b的巨噬细胞。本文所用的术语“CD11b低巨噬细胞”是指在其表面上表达的CD11b水平实质上低于Cd11b高巨噬细胞的CD11b水平的巨噬细胞。本文所用的术语“CD11c高”是指表达高水平的CD11c的巨噬细胞。本文所用的术语“CD11c低巨噬细胞”是指在其表面上表达的CD11c水平实质上低于Cd11c高巨噬细胞的CD11c水平的巨噬细胞。
在一些实施方案中，本发明的非刺激性骨髓细胞包括TAM细胞和DC1细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，例如在小鼠中，本发明的非刺激性骨髓细胞包括TAM1、TAM2和DC1细胞中的一种或多种。在此类实施方案中，使本发明的非刺激性骨髓细胞与NSM抗体接触。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞位于肿瘤病灶的边缘或转化的肿瘤管道内，在此处非刺激性骨髓细胞与同源T细胞接触。在一个实施方案中，非刺激性骨髓细胞的定位被改变，使得所述细胞不再定位于肿瘤边缘处或不再与T细胞接触。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在仅包含非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。本发明的免疫细胞群体可以是纯的，均质的，异质的，源于多种来源(例如患病组织、肿瘤组织、健康组织、细胞库)的，维持在初生细胞培养物中，维持在永生化培养物中，和/或维持在体外培养物中。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是树突细胞。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-和CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b+和CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+的细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+的细胞组成。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+的细胞组成。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞不是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞包括不是CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+的细胞。
在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低的细胞。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低的细胞组成。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b高和CD11c低的细胞组成。在此类实施方案中，使非刺激性小鼠骨髓细胞与NSM抗体接触。
在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞包括为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高的细胞。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高的细胞组成。在一些实施方案中，例如在小鼠中，非刺激性骨髓细胞基本上由为CD45+、HLA-DR+、CD14+、CD11b低和CD11c高的细胞组成。在此类实施方案中，使非刺激性小鼠骨髓细胞与NSM抗体接触。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在癌组织内。
在一些实施方案中，免疫细胞群体在癌组织内。
在一些实施方案中，非刺激性细胞和刺激性骨髓细胞在癌组织内。
在一些实施方案中，生物样品包括包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体。
NSM细胞可以总体指代存在于肿瘤组织内的DC1、TAM1和TAM2细胞，并且NSM细胞可通过其对NSM细胞标记物的表达来与其它细胞类型区分。例如，在NSM细胞中比SDC以更大丰度表达或翻译的基因和相关蛋白可以充当NSM标记物。示例性NSM标记是CD11b。其它示例性NSM标记列于表A中。NSM细胞可以在其细胞表面上表达TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119。在一些方面，NSM细胞不表达以下中的至少一个：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1。
在一个实施方案中，NSM细胞是表达表A中列出的NSM标记基因中的一种或多种的肿瘤浸润性骨髓细胞。在另一个实施方案中，NSM细胞是表达表A中列出的NSM标记物中的三种或更多种的肿瘤骨髓细胞。在另一个实施方案中，NSM细胞是表达表A中列出的大部分或全部NSM标记物的肿瘤骨髓细胞。在另一个实施方案中，NSM细胞被鉴定为表达MRC1、MS4A7、C1QC、APOE、C1QB、C1QA和C5AR1的肿瘤骨髓细胞。
刺激性骨髓细胞
如本文所用，刺激性骨髓细胞(在某些方面也称为SDC)是有效刺激免疫应答的骨髓细胞(例如，与非刺激性骨髓相比，在肿瘤微环境中更有效刺激抗肿瘤应答的细胞)。在一些实施方案中，与非刺激性骨髓细胞相比，刺激性骨髓细胞可有效向T细胞呈递抗原(例如肿瘤抗原)或可有效刺激肿瘤特异性T细胞应答。在一些实施方案中，与非刺激性骨髓细胞相比，刺激性骨髓细胞可以表现出增强的摄取、加工肿瘤相关抗原和/或向T细胞呈递肿瘤相关抗原的能力。相对于非刺激性骨髓细胞，刺激性骨髓细胞可以具有增强的应激细胞毒性T淋巴细胞的能力，或在某些情况下刺激有效的肿瘤细胞杀伤的能力。与非刺激性骨髓细胞相比，刺激性骨髓细胞可表现出对参与抗原加工、抗原呈递和/或抗原共刺激的基因和细胞表面标记物的较高表达，所述细胞表面标记物包括但不限于CD80、CD86、MHCI和MHCII。
示例性的刺激性骨髓细胞标记物列出于表A中。例如，在人SDC中，Xcr1、Clec9a和BDCA3(CD141)的表达是SDC身份的标记物。应注意，在小鼠中，CD103也可以用作SDC身份的强标记物，尽管它在人SDC中不表达。
在一个实施方案中，SDC是具有树突细胞同一性的肿瘤浸润性骨髓细胞，并且还表达表A中列出的一种或多种SDC标记。在另一个实施方案中，SDC是具有树突细胞同一性的肿瘤浸润性骨髓细胞，并且还表达表A中列出的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或全部SDC标记物。在另一个实施方案中，SDC是表达BDCA3、KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、XCR1和CLEC9A的肿瘤浸润性骨髓树突细胞。SDC细胞可表达以下中的至少一种：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1。在一些实施方案中，SDC基本上不在其细胞表面上表达TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和/或TMEM119。在一些实施方案中，SDC基本上不表达C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和/或LILRB4。可以使用流式细胞术和PCR以及其它领域中公认的测定法来评估本文公开的标记物的表达。
刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+。刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+和BDCA3+。刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+、CD14-和BDCA3+。刺激性骨髓细胞可为CD45+、HLA-DR+、CD11c+和BDCA3+。
抗体
本申请提供了包含结合NSM蛋白的抗体的抗体和组合物，包括失能非刺激性骨髓细胞的抗体。
本申请提供了包含结合NSM蛋白的抗体的抗体和组合物，包括失能非刺激性骨髓细胞的抗体。
如本文所用，“抗体”或“免疫球蛋白”是指基本上由一个免疫球蛋白基因或一组免疫球蛋白基因编码的多肽或其分析物结合片段，其特异性结合并识别分析物(例如抗原)。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的若干个可以进一步分为子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50至70kD)。每条链的N末端结构域限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链结构域。IgG1重链从N到C末端分别包含VH、CH1、CH2和CH3结构域。轻链从N到C末端包含VL和CL结构域。IgG1重链包含CH1结构域和CH2结构域之间的铰链。在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含来自与治疗性多肽连接的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，在本文提供的抗体中发现的免疫球蛋白结构域来自或衍生自基于免疫球蛋白的构建体，例如双价抗体或纳米抗体。在某些实施方案中，本文所述的免疫球蛋白构建体包含至少一个来自重链抗体(例如骆驼抗体)的免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文提供的免疫球蛋白构建体包含至少一个来自哺乳动物抗体(例如牛抗体、人抗体、骆驼抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体)的免疫球蛋白结构域。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构限定环(“高变环”)的各个区。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语在提及形成抗原结合区的可变区的部分时可在本文中互换地使用。此特定区域已经由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)和由Chothia等人，J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，任一定义的应用是指抗体的CDR或其变体意欲在如本文所定义和使用的术语的范围内。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含给定抗体的可变区氨基酸序列的特定CDR。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一个特定的此类实施方案中，在单链Fab分子中，Fab轻链的C末端连接到Fab重链的N末端。如本文更详细描述的，scFv具有通过多肽链从其C末端连接到重链可变结构域(VH)的N末端的轻链(VL)的可变结构域。或者，scFv包含其中VH的C末端通过多肽链连接到VL的N末端的多肽链。
“Fab片段”(也称为抗原结合片段)包含轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)，以及分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包括参与抗原结合的互补决定环(CDR，也称为高变区)。Fab'片段与Fab片段的区别为在重链CH1结构域的羧基末端处添加少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
“单链Fv”或”scFv”包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，请参见Pluckthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，卷113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。HER2抗体的scFv片段描述于WO93/16185；美国专利No.5,571,894；以及美国专利No.5,587,458中。
“单结构域抗体”或“sdAb”格式是单免疫球蛋白结构域。Sdab相当稳定并且易于表达为与抗体的Fc链的融合配偶体(Harmsen MM,De Haard HJ(2007).“Properties,production,and applications of camelid single-domain antibody fragments”.Appl.Microbiol Biotechnol.77(1):13-22)。
本文中使用的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。所述术语包括天然序列的Fc区和变异Fc区。除非另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据欧盟(EU)编号***，也称为欧盟索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用的二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区、能够稳定自缔合的多肽。例如，二聚体IgG Fc的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定域序列。Fc可以是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别，并且它们中的若干个可以进一步分为子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述结合至抗体Fc区的受体。例如，FcR可以是天然序列人FcR。通常，FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，FcγRIIA和FcγRIIB具有相似氨基酸序列但在其细胞质结构域中显著不同。其它同种型的免疫球蛋白也可以由某些FcR结合(参见，例如，Janeway等人，Immuno Biology:the immune system in health and disease,(Elsevier ScienceLtd.,NY)(第4版，1999))。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述于Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中)。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。其它FcR，包括将来鉴定的那些，涵盖在本文中的术语“FcR”中。所述术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)；以及Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。
CH2结构域中的修饰可以影响FcR与Fc的结合。Fc区中的许多氨基酸修饰在本领域中已知用于选择性地改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力。在一些方面，Fc包含促进Fc-γ受体选择性结合的一个或多个修饰。
改变FcR与Fc结合的示例性突变如下：
S298A/E333A/K334A，S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y,Vernes JM,Chiang N等人J Immunol Methods.，2011年2月28日；365(1-2):132-41)；
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L，F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB,Gorlatov S,Tuaillon N等人,Cancer Res.,2007年9月15日；67(18):8882-90；Nordstrom JL,Gorlatov S,Zhang W等人,Breast Cancer Res.,2011年11月30日；13(6):R123)；
F243L(Stewart R,Thom G,Levens M等人,Protein Eng Des Sel.2011年9月；24(9):671-8.),S298A/E333A/K334A(Shields RL,Namenuk AK,Hong K等人,J Biol Chem.,2001年3月2日；276(9):6591-604)；
S239D/I332E/A330L，S239D/I332E(Lazar GA,Dang W,Karki S等人,Proc NatlAcad Sci U S A.,2006年3月14日；103(11):4005-10)；
S239D/S267E，S267E/L328F(Chu SY,Vostiar I,Karki S等人,Mol Immunol.,2008年9月；45(15):3926-33)；
S239D/D265S/S298A/I332E，S239E/S298A/K326A/A327H，G237F/S298A/A330L/I332E，S239D/I332E/S298A，S239D/K326E/A330L/I332E/S298A，G236A/S239D/D270L/I332E，S239E/S267E/H268D，L234F/S267E/N325L，G237F/V266L/S267D，以及在WO2011/120134和WO2011/120135中列出的其它突变，WO2011/120134和WO2011/120135以引用方式并入本文。Therapeutic Antibody Engineering(由William R.Strohl和Lila M.Strohl著，Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11,ISBN 1 907568 37 9，2012年10月)在第283页上列出了突变。
在一些实施方案中，本文描述的抗体包含改善其调节效应子功能的能力的修饰。这些修饰是本领域已知的，包括岩藻糖基化，或者Fc对激活受体(主要是FCGR3a对ADCC，以及CDC对C1q的)的亲和力的工程化。下表B总结了文献中报道的用于效应子功能工程化的各种设计。
在不改变氨基酸序列的情况下，产生在Fc糖基化位点(EU编号为Asn 297)上很少或没有岩藻糖的抗体的方法是本领域中熟知的。技术(ProBioGen AG)是基于将偏转至岩藻糖生物合成细胞途径的酶的基因引入用于抗体生产的细胞中。这防止产生抗体的细胞将糖“岩藻糖”添加至N端连接的抗体的碳水化合物部分。(von Horsten等人,(2010)Glycobiology,2010年12月；20(12):1607-18。获得具有降低的岩藻糖基化水平的抗体的另一种方法可见于美国专利8,409,572中，所述专利教导了针对细胞系在抗体上产生较低水平的岩藻糖基化的能力来选择用于抗体产生的细胞系。抗体可以完全去岩藻糖基化(意味着它们不含可检测到的岩藻糖)或者它们可以部分地去岩藻糖基化，这意味着分离的抗体含有小于95％、小于85％、小于75％、小于65％、小于55％、小于45％、小于35％、小于25％、小于15％或小于5％的通常在由哺乳动物表达***产生的类似抗体中检测到的岩藻糖的量。
因此，在一个实施方案中，本文所述的抗体可以包括包含如表B所示的赋予改善的效应子功能的一种或多种氨基酸修饰的二聚Fc。在另一个实施方案中，抗体可以经去岩藻糖基化以改善效应子功能。
表B：CH2结构域和效应子功能工程化
降低FcγR和/或补体结合和/或效应子功能的Fc修饰是本领域中已知的。最近的出版物描述了已经用于工程化具有降低或沉默的效应子活性的抗体的策略(参见Strohl,WR(2009),Curr Opin Biotech20:685-691,和Strohl,WR与Strohl LM,“Antibody Fcengineering for optimal antibody performance”In Therapeutic AntibodyEngineering,Cambridge:Woodhead Publishing(2012)，第225至249页)。这些策略包括通过改变糖基化、使用IgG2/IgG4支架、或在Fc的铰链或CH2区引入突变来降低效应子功能。例如，美国专利公开No.2011/0212087(Strohl)、国际专利公开No.WO 2006/105338(Xencor)、美国专利公开No.2012/0225058(Xencor)、美国专利公开No.2012/0251531(Genentech)以及Strop等人((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述了用于减少FcγR或补体与Fc的结合的特异性修饰。
用于减少FcγR或补体与Fc的结合的已知氨基酸修饰的具体的非限制性实例包括下表中列出的那些：
表C：用以减少FcγR或补体与Fc的结合的修饰
在一些实施方案中，抗体具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。当抗体与病原性或致瘤性靶细胞表面上的抗原结合时，可发生ADCC。在其细胞表面上荷有Fcγ受体(FcγR或FCGR)的效应细胞，包括细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞或单核细胞，识别并结合与靶细胞结合的抗体的Fc区。这种结合可以引发细胞内信号传导通路的激活，从而导致细胞死亡。在具体实施方案中，抗体的免疫球蛋白Fc区亚型(同种型)包括人IgG1和IgG3。如本文所用，ADCC是指其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞裂解的细胞介导反应。用于介导ADCC、NK细胞的原代细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结为Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3。为了评估所关注的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如在美国专利No.5,500,362或No.5,821,337中描述的那样。用于这种测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。替代地或另外，可以在体内评估所关注分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中所公开的那样。
在一些实施方案中，抗体具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。抗体诱导的CDC通过经典补体级联的蛋白质介导，并通过补体蛋白Clq与抗体的结合来触发。与Clq结合的抗体Fc区可以诱导对补体级联的激活。在具体实施方案中，抗体的免疫球蛋白Fc区亚型(同种型)包括人IgG1和IgG3。如本文所用，CDC是指在补体存在下分子裂解靶的能力。补体激活途径由补体***(C1q)的第一部件与和同源抗原复合的分子(例如多肽(例如，抗体))结合引发。为了评估补体激活，可以执行CDC测定，例如如在Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述的。
抗NSM抗体可至少靶向以下中的1个、2个、3个、4个或更多个：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119。抗NSM抗体可靶向TREM2。抗NSM抗体可靶向MS4A7。在一些方面，抗NSM抗体不靶向以下中的一个或多个：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和/或TMEM119。在一些方面，抗NSM抗体不靶向LILRB4。在一些方面，抗NSM抗体不结合TREM2。在一些方面，抗NSM抗体不结合MS4A7。在一些方面，抗NSM抗体不结合C5AR1。在一些方面，抗NSM抗体不结合LYVE1。在一些方面，抗NSM抗体不结合ABCC3。在一些方面，抗NSM抗体不结合LILRB4。在一些方面，抗NSM抗体不结合MRC1/CD206。在一些方面，抗NSM抗体不结合SIGLEC1。在一些方面，抗NSM抗体不结合STAB1。在一些方面，抗NSM抗体不结合TMEM37。在一些方面，抗NSM抗体不结合MERTK。在一些方面，抗NSM抗体不结合TMEM119。在一些方面，抗NSM抗体不结合TLR7。
在一些实施方案中，抗体具有抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)活性。当抗体与病原性或致瘤性靶细胞表面上的抗原结合时，可发生ADCP。在其细胞表面上荷有Fc受体的吞噬细胞(包括单核细胞和巨噬细胞)识别并结合与靶细胞结合的抗体的Fc区。在Fc受体与结合抗体的靶细胞结合时，能够启动靶细胞的吞噬作用。ADCP可以被认为是ADCC的一种形式。
在一些实施方案中，抗体能够形成免疫复合物。例如，免疫复合物可以是被抗体覆盖的肿瘤细胞。
在一些方面，抗NSM抗体基本上不结合存在于癌组织外的骨髓细胞。在一些方面，抗NSM抗体基本上不结合存在于癌组织内的刺激性骨髓细胞。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体由杂交瘤产生。在其它实施方案中，抗体是由经工程改造以表达所需可变和恒定结构域的重组细胞产生的。
在一些实施方案中，抗体可以是单链抗体或保留抗原特异性和下部铰链区域或其变体的其它抗体衍生物。
在一些实施方案中，抗体可以是多功能抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、其片段或变体。在特定实施方案中，抗体片段或其衍生物选自Fab片段、Fab′2片段、CDR和ScFv。
人抗体包括具有源自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方案中，所有的可变和恒定结构域来自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以以各种方式制备，包括通过用经遗传修饰以表达源自人重和/或轻链编码基因的抗体的所关注小鼠的抗原进行免疫。
人源化抗体具有与来自非人物种的抗体的序列因一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的序列，使得与非人类物种抗体相比，人源化抗体当施用于人受试者时不太可能诱导免疫应答，和/或诱导较不严重的免疫应答。在一个实施方案中，在非人物种抗体的重链和/或轻链的构架和恒定结构域中的某些氨基酸经突变以产生人源化抗体。在另一个实施方案中，来自人抗体的一个或多个恒定结构域与非人物种的一个或多个可变结构域融合。在另一个实施方案中，非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基经改变以减少非人抗体在施用于人受试者时可能的免疫原性，其中经改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或者对所述氨基酸序列做出的改变是保守改变，使得人源化抗体与抗原的结合不明显差于非人抗体与抗原的结合。如何制作人源化抗体的实例可见于美国专利No.6,054,297、No.5,886,152和5,877,293。
嵌合抗体是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其它不同抗体的一个或多个区域的抗体。
在一些实施方案中，抗体特异于表面抗原(例如NSM蛋白)。在一些实施方案中，治疗性抗体特异于肿瘤抗原(例如由肿瘤细胞特异性表达的分子)。在特定实施方案中，治疗性抗体可以具有人或非人灵长类IgG1或IgG3Fc部分。
在一些实施方案中，抗体与效应分子结合或缀合。在特定实施方案中，抗体与选自由以下项组成的组的至少一种治疗剂缀合：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体和第二抗体片段。
在一些实施方案中，抗体是激动性抗体。激动性抗体可以在抗体结合细胞上表达的NSM蛋白后诱导(例如，增大)NSM的一种或多种活性或功能。激动性抗体可能结合并激活NSM，引起细胞增殖变化或改变抗原呈递能力。激动性抗体可以结合并激活NSM，触发导致改变的细胞生长或凋亡的细胞内信号传导通路。
在一些实施方案中，抗体是拮抗抗体。拮抗抗体可以在抗体结合细胞上表达的NSM蛋白后阻断(例如，减少)NSM的一种或多种活性或功能。例如，拮抗抗体可结合并阻断配体与一种或多种NSM蛋白的结合，防止细胞的分化和增殖，或改变抗原呈递能力。拮抗抗体可以通过其配体结合并阻断NSM蛋白的活化，改变有助于细胞生长和存活的细胞内信号传导通路。
在一些实施方案中，抗体是消除性抗体。消除性抗体是在接触时通过抗体与其它免疫细胞分子的相互作用来杀伤非刺激性骨髓细胞的抗体。例如，当与荷有NSM蛋白的细胞结合时，抗体可以与补体蛋白结合并诱导补体依赖性细胞裂解。当与荷有NSM蛋白的细胞结合时，抗体也可以触发荷有Fc受体的相邻细胞，以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀伤它们。
在一些实施方案中，抗体是中和抗体，并且所述抗体中和NSM的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，NSM蛋白在非刺激性骨髓细胞的表面上表达，并且抗体识别NSM蛋白的细胞外结构域。
在一些实施方案中，抗体是对NSM有选择性的(优先与NSM结合)。在某些实施方案中，选择性结合NSM的抗体的解离常数(Kd)在0.0001nM至1μM范围内。在某些实施方案中，抗体特异性结合在来自不同物种的蛋白质中为保守的NSM蛋白上的表位。在另一个实施方案中，选择性结合包括但不需要排他结合。
在一个实施方案中，与其靶标结合的抗NSM抗体负责导致对与其结合的非刺激性骨髓细胞的体内消除。在一些实施方案中，由聚集的抗体诱导的效应蛋白可以触发各种应答，包括释放炎性细胞因子，调节抗原的产生，内吞作用或细胞杀伤。在一个实施方案中，抗体能够在体内募集和激活补体或介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，或通过在体内结合Fc受体介导吞噬作用。抗体还可以通过诱导结合后的非刺激性骨髓细胞的凋亡或坏死来消除非刺激性骨髓细胞。
在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG3抗体。
在一些实施方案中，抗体不是IgG2抗体。
在一些实施方案中，抗体不是IgG4抗体。
在一些实施方案中，对非刺激性骨髓细胞的失能是在体外的，并且通过以下方式实现：a)通过杀伤非刺激性骨髓细胞；b)非刺激性骨髓细胞的磁珠消除；或者c)使用免疫荧光激活细胞分选术(FACS)对非刺激性骨髓细胞进行分选。
在某些实施方案中，本文提供的抗体的解离常数(Kd)在0.0001nM至1μM范围内。例如，抗体的Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM，或约50pM至约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM中的任一者。
在一些实施方案中，关于本文所述的抗NSM抗体的体内施用，正常剂量可以在每天约10ng/kg个体体重至约100mg/kg个体体重或更多，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天的范围内，具体取决于施用途径。对于若干天或更长时间的重复施用，根据待治疗的疾病或病症的严重程度，持续治疗直到达到期望的症状抑制。示例性的给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量的抗NSM抗体，然后每隔一周施用约1mg/kg的每周维持剂量。取决于医生希望实现的药代动力学衰变的模式，其它剂量方案也可能是有用的。例如，本文考虑对个体每周给药一至二十一次。在某些实施方案中，可以使用在约3μg/kg至约2mg/kg(诸如约3μg/kg、约10μg/kg、约30μg/kg、约100μg/kg、约300μg/kg、约1mg/kg，以及约2/mg/kg)的范围内的给药剂量。在某些实施方案中，给药频率为每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次，或更长时间。通过常规技术和测定法容易地监测治疗进展。给药方案，包括施用的抗NSM抗体，可随时间推移而变化，而与所使用的剂量无关。
在某些实施方案中，抗体与药物(例如毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或放射性同位素)缀合。制备ADC(抗体药物缀合物)的若干种方法是本领域中已知的，并在例如美国专利8,624,003(罐法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中描述。抗体或其抗原结合片段可与包括以下的至少一种试剂缀合：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体，以及结合抗原的第二抗体片段。
蛋白质、核苷酸和同源物
本文提供了用于失能和/或检测表达NSM蛋白的非刺激性人骨髓细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明的目的为从表达NSM蛋白同源物的非人哺乳动物细胞中失能和/或检测非刺激性骨髓细胞。例如，小鼠中的NSM蛋白可以表达与其人同源物相当的限制性表达模式。因此，在一个实施方案中，本文提供了用于失能和/或检测表达NSM蛋白的非刺激性小鼠骨髓细胞的方法和组合物。本文还提供了用于从表达NSM蛋白的同源物的任何个体中失能和/或检测具有类似表达模式的非刺激性细胞的类似方法和组合物，所述非刺激性细胞表现出与NSM蛋白相当的表达模式。
NSM蛋白质或核苷酸可以包括以下中的至少一种或多种：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4，以及它们的同源物。SDC蛋白质或核苷酸可以包括以下中的至少一种或多种：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1，以及它们的同源物。细胞表面NSM蛋白可以包括以下中的至少一种或多种：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119。细胞表面NSM蛋白可以由一种或多种抗NSM抗体单独或组合地靶向。通常，NSM对于NSM蛋白或核苷酸是阳性的，而对于SDC蛋白或核苷酸呈阴性；相反，SDC对于SDC蛋白质或核苷酸通常是阳性的，而对NSM蛋白或核苷酸通常呈阴性。
本文所述的抗原结合构建体包含至少一种多肽。还描述了编码本文所述的多肽的多核苷酸。所述抗原结合构建体通常是分离的。
如本文所用，“分离的”是指试剂(例如，多肽或多核苷酸)已经从其天然细胞培养环境的组分中鉴定和分离和/或回收。其天然环境的污染组分是会干扰抗原结合构建体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。分离的还指试剂是合成制备的，例如通过人工干预。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用来指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。所提及的氨基酸包括例如天然存在的蛋白质性L-氨基酸；D-氨基酸、化学修饰的氨基酸(如氨基酸变体和衍生物)；天然存在的非蛋白质性氨基酸，如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域中已知的指示氨基酸的性质的化学合成化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)，D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同源组氨酸)，侧链中具有附加亚甲基的氨基酸(“同质”氨基酸)，以及侧链中的羧酸官能团被磺酸基取代的氨基酸(例如，半胱氨酸)。将非天然氨基酸(包括合成的非天然氨基酸，取代的氨基酸，或一个或多个D-氨基酸)并入本发明的蛋白质中可能以许多不同的方式是有利的。与含L-氨基酸的对应物相比，含D-氨基酸的肽等在体外或体内表现出增大的稳定性。因此，当期望或需要更大的细胞内稳定性时，构建包含D-氨基酸的肽等可以是特别有用的。更具体地，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶具有抗性，从而当需要这些性质时提供分子的改善生物利用度以及体内的延长寿命。此外，D-肽等不能有效地经加工用于对T辅助细胞的主要组织相容性复合II类限制性呈递，因此不太可能在整个生物体中诱导体液免疫应答。
氨基酸在本文中可以用其通常已知的三个字母符号或用由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字符符号来表示。核苷酸同样可以用它们公认的单字母代码来表示。
本发明还包括编码抗原结合构建体的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”旨在表示两个或多个核苷酸分子的连续延伸。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源，或它们的任何组合。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核苷酸、核苷或核糖核苷酸，及其聚合物。除非特别限定，所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另有特别限定，所述术语还指代寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)，反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定的核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者其中核酸不编码氨基酸序列至基本相同序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所描述的任何相应的密码子，而不改变编码的多肽。这种核酸变体是“沉默变体”，它们是保守修饰的变体中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变体。本领域普通技术人员将认识到，可以修饰核酸中的各密码子(除了AUG和TGG外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异在每个所述的序列中是隐含的。
关于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独取代、缺失或添加改变、添加或删除了所编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸，所述对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独取代、缺失或添加是“保守修饰变异”，其中改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加，或用化学上相似的氨基酸来取代氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域的普通技术人员已知的。这种经保守修饰的变体是对本文所述的多态变体、种间同源物和等位基因的补充并且不排除本文所述的多态变体、种间同源物和等位基因。
提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域的普通技术人员已知的。以下八组各含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及[0139]8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月)。
在两个或多个核酸或多肽序列的语境中，术语“同一性”或“同一性”百分比是指相同的两个或更多个序列和亚序列。如果如使用以下序列比较算法(或本领域的普通技术人员可用的其它算法)或通过手动比对和目视检查所测量的，当比较和比对以实现比较窗口或指定区域的最大对应关系时，序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸百分比(即指定区域约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％，或约95％同一性)，则序列是“基本上同一”的。所述定义也是指测试序列的补体。同一性可以存在于至少约50个氨基酸或核苷酸长的区域中，或者存在于75至100个氨基酸或核苷酸长的区域中，或者在未指定的情况下，其存在于多核苷酸或多肽的整个序列中。编码本发明的多肽的多核苷酸，包括来自除人以外的物种的同源物，可以通过包括以下步骤的方法获得：用具有本文所述的多核苷酸序列或其片段的标记探针在严格杂交条件下筛选文库，以及分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆物。这种杂交技术是本领域的技术人员熟知的。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，如果需要就指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定其它参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所使用的“比较窗”包括提及具有选自由以下项组成的组的连续位置数目中的任何一个的区段：20至600个，通常为约50至约200个，更通常为约100至约150，其中在两个序列最佳对齐之后，序列可以在比较窗中与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域的普通技术人员已知的。可以进行用于比较的最佳序列比对，所述最佳序列比对包括但不限于：Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的搜索相似性方法，这些算法的计算机化具体实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)，或者手动比对和目视检查(参见，例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995supplement))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，BLAST和BLAST 2.0算法分别描述于Altschul等人，(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402，和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过在万维网上的ncbi.nlm.nih.gov.处提供的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)，比对数(B)为50，期望值(E)为10，M＝5、N＝-4，以及比较两条链。BLAST算法通常在“低复杂度”过滤器关闭的情况下执行。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，则核酸被认为与参考序列相似。
用语“选择性(或特异性)杂交”是指当所述序列存在于复合混合物中(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)时，序列在严格杂交条件下仅与特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。
术语“严格杂交条件”是指在低离子强度和高温条件下的DNA、RNA或其它核酸序列或它们的组合的序列杂交，如在本领域已知的。通常，在严格条件下，探针将在核酸的复合混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中与其靶序列杂交，但不与所述复合混合物中的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同情况下不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。核酸杂交的泛用指南可见于Tijssen,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)。
如本文所用，术语“工程化(engineer/engineered/engineering)”被认为包括对肽骨架的任何操纵或对天然存在或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的改变，以及这些方法的组合。工程化的蛋白质通过标准分子生物学技术进行表达和产生。
“分离的核酸分子或多核苷酸”是指已经从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码载体中所含多肽的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分或实质上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常包含多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但所述多核苷酸分子在染色体外存在或在与其天然染色***置不同的染色***置存在。分离的RNA分子包括体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式，以及双链形式。分离的多核苷酸或本文描述的核酸，还包括合成(例如，通过PCR或化学合成)产生的此类分子。此外，在某些实施方案中，多核苷酸或核酸包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”通常是指在体外扩增所需核苷酸序列的方法，例如描述于美国专利No.4,683,195中。通常，PCR方法涉及使用能够优先与模板核酸杂交的寡核苷酸引物的引物延伸合成的重复循环。
核酸或多核苷酸具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列，意欲指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，区别为多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸的多达5个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可缺失掉或被另一种核苷酸取代，或可将占参考序列中总核苷酸的多达5％的多个核苷酸***参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或这些末端位置之间的任何位置，个别地散布在参考序列的残基中或散布为参考序列中的一个或多个连续基团。实际上，可以常规地使用已知的计算机程序，例如上面针对多肽所讨论的计算机程序(例如ALIGN-2)，来确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的100个氨基酸序列具有至少50％的同一性，则所述多肽的衍生物或变体被认为与肽共享“同源性”或是“同源的”。在某些实施方案中，衍生物或变体与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段至少75％相同。。在某些实施方案中，衍生物或变体与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段至少85％相同。在某些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段的氨基酸序列至少90％相同。在一些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与具有与衍生物相同数量的氨基酸残基的肽或肽片段的氨基酸序列至少95％相同。在某些实施方案中，衍生物或变体与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段至少99％相同。
本文所用的术语“修饰”是指对给定多肽进行的任何改变，例如多肽长度、氨基酸序列、化学结构的变化，共翻译修饰，或对多肽的翻译后修饰。术语“(经修饰)形式”是指所论述的多肽任选地被修饰，即所论述的多肽可经修饰或未修饰。
在一些方面，本文所公开的抗体或蛋白质包含与在本文所公开的表格或登录号中列出的相关氨基酸序列或其片段至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在一些方面，本文所公开的分离的抗体或蛋白质包含由与在本文所公开的表格或登录号中列出的相关核苷酸序列或其片段至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多核苷酸编码的氨基酸序列。
药物组合物
本申请提供包含抗体的组合物，包括包含本文所述的任何一种或多种抗体与一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物是无菌的。药物组合物通常包含有效量的抗体。
除本文所公开的抗体中的一种或多种外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂，或本领域的技术人员熟知的其它物质。这些材料应无毒并且不应干扰活性成分的功效。载体或其它材料的精确性质可取决于给药途径，例如口服、静脉内、经皮或皮下、鼻内、肌内、腹膜内途径。
用于口服给药的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可以包含固体载体，诸如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。还可以包含生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇(例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。
对于静脉内、经皮或皮下注射或病痛部位注射，活性成分将是无热原、具有适合的pH、等渗性和稳定性的非经肠可接受的水溶液形式。本领域的相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物(例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格氏注射液)制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
无论是施用至个体的多肽、抗体、核酸、小分子还是其它药学上可用的化合物，施用优选为“治疗有效量”或“预防有效量”的(视情况而定，虽然预防可以被认为是治疗)，这足以显示对个体的益处。施用的实际量、施用的速率和时程将取决于所治疗的蛋白质聚集疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如对剂量的决定等，在全科医生和其它医生的责任范围内，并且通常考虑待治疗的病症、个体受试者的状况、递送部位、施用方法，以及从业者知道的其它因素。上面提到的技术和方案的实例可见于Remington’s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol,A.编辑，1980。
取决于待治疗的病症，组合物可以单独施用或同时或顺序地与其它治疗组合施用。
方法
使用方法
在一个方面，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞与抗NSM抗体(例如人抗体)接触的方法，所述接触导致失能非刺激性骨髓细胞。
在另一方面，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞与抗NSM小鼠抗体接触的方法，所述接触导致非刺激性骨髓细胞功能的失能。
在一些实施方案中，非刺激性细胞是DC1细胞和TAM细胞中的一个或多个。
在一些实施方案中，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞失能的方法，其包括使非刺激性骨髓细胞与NSM抗体接触，从而杀伤非刺激性骨髓细胞。失能是指使细胞部分或完全无功能。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致细胞生长停滞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致细胞凋亡。在一些实施方案中，非刺激性细胞的失能导致细胞裂解，例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，非刺激性细胞的失能导致细胞坏死。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致细胞生长停滞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致细胞失活。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致中和细胞中NSM蛋白的活性。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致细胞增殖减少。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致细胞分化。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致细胞作为抑制性抗原呈递细胞的能力降低或导致细胞作为激活抗原呈递细胞的能力的增大。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致肿瘤组织或肿瘤微环境(TME)内的细胞错位。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致肿瘤组织或肿瘤微环境中细胞的空间结构发生改变。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的失能导致肿瘤组织或TME中细胞的时序性表达改变。在一些实施方案中，所述方法还包括去除非刺激性骨髓细胞。
在本文所述的非刺激性骨髓细胞失能的任何和所有方面，与未与抗NSM抗体接触的细胞相比，发生了特征或功能方面的任何增大或减少或改变。
在另一方面，本申请提供了使非刺激性骨髓细胞与抗NSM抗体接触的方法，所述接触导致对非刺激性骨髓细胞功能的调节。调节可以是以下中的任何一个或多个。在一些实施方案中，非刺激性细胞是DC1细胞、TAM1细胞和TAM2细胞中的一个或多个。在一些实施方案中，功能的调节导致非刺激性骨髓细胞的失能。在一些实施方案中，对非刺激性骨髓细胞功能的调节导致细胞刺激天然和活化的CD8+T细胞的能力增强，例如，通过增强非刺激性细胞向初始CD8+T细胞交叉呈递MHCI分子上的肿瘤抗原的能力。在一些实施方案中，调节增强非刺激性骨髓细胞的T细胞刺激功能，包括例如细胞触发T细胞受体(TCR)信号传导、T细胞增殖或T细胞细胞因子产生的能力。在一个实施方案中，非刺激性细胞的存活率降低，或非刺激性细胞的增殖减少。在一个实施方案中，刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率增大。
在降低如本文所述的非刺激性骨髓细胞的功能的任何和所有方面，与未与抗NSM抗体接触的细胞相比，发生了特征或功能方面的任何增大或减少或改变。
在一些实施方案中，本申请提供了杀伤(也称为诱导细胞死亡)非刺激性骨髓细胞的方法，其包括使非刺激性骨髓细胞与抗NSM抗体接触，从而杀伤非刺激性骨髓细胞。在一些实施方案中，相对于尚未与抗NSM抗体接触的非刺激性骨髓细胞，杀伤增强。在一些实施方案中，接触诱导非刺激性骨髓细胞的凋亡。在一些实施方案中，接触诱导非刺激性骨髓细胞的凋亡。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞在包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。在一些实施方案中，所述方法还包括去除非刺激性骨髓细胞。在一些实施方案中，10％至80％的细胞被杀伤。在一些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的细胞被杀伤。
在一些实施方案中，本申请提供了在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中增大刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率的方法，其包括使免疫细胞群体与抗NSM抗体接触。在一些实施方案中，相对于尚未与抗NSM抗体接触的细胞群体，所述比率增大。在一些实施方案中，DC2细胞比DC1细胞的比率增大。在一些实施方案中，DC2细胞比TAM1细胞的比率增大。在一些实施方案中，DC2细胞比TAM2细胞的比率增大。在一些实施方案中，DC2细胞比TAM1+TAM2细胞的比率增大。在一些实施方案中，DC2细胞比TAM1+DC1细胞的比率增大。在一些实施方案中，DC2细胞比DC1+TAM2细胞的比率增大。在一些实施方案中，DC2细胞比DC1+TAM1+TAM2细胞的比率增大。在一些实施方案中，所述比率至少增大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施方案中，在接触之前，刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率在0.001:1至0.1:1的范围内。在一些实施方案中，在接触之后，刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的比率在0.1:1至100:1的范围内。
在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的数量减少。在一些实施方案中，刺激性骨髓细胞是DC2细胞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞被杀伤，例如通过坏死或细胞凋亡。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞经诱导而经历生长停滞。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞不再增殖。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的空间定位改变，并且在TME的特定区域中的比例增大。在一些实施方案中，非刺激性骨髓细胞的时序性表达改变，并且在肿瘤发展期间的特定时间期间的比例增大。
在一些实施方案中，接触是在体外的。在一些实施方案中，接触是在体内的。在一些具体实施方案中，接触在人体内。在一些实施方案中，接触是通过施用抗NSM抗体实现的。在一些实施方案中，接受抗体的个体(如人)患有癌症。
在另一方面，本发明提供了治疗个体的免疫相关病症(例如癌症)的方法，包括向个体施用有效量的包含抗NSM抗体的组合物。另一方面，本发明提供了增强个体免疫应答的方法，包括向个体施用有效量的包含抗NSM抗体的组合物。在一些实施方案中，这些方法进一步与其它协同治疗组合提供，其它协同治疗为例如PDL阻滞疗法，CTLA4阻滞疗法，其中T细胞上的抑制分子被阻滞的一般检查点阻滞疗法，过继性T细胞疗法，CAR T细胞疗法、树突细胞或其它细胞疗法，以及常规化学疗法。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定来自个体的生物样品中NSM蛋白的表达水平。在一些实施方案中，生物样品包括但不限于体液、组织样品、器官样品、尿液、粪便、血液、唾液、CSF，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，生物样品来源于肿瘤组织。在一些实施方案中，表达水平包括编码NSM蛋白的mRNA的mRNA表达水平。在一些实施方案中，NSM蛋白的表达水平包括NSM的蛋白表达水平。在一些实施方案中，使用选自由以下项组成的组的方法来检测样品中NSM蛋白的表达水平：FACS、蛋白质印迹法(Western blot)、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射性免疫测定、斑点印迹法、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱学、质谱、HPLC、qPCR，RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA测序、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH，以及它们的组合。
在另一方面，本申请提供了用于确定一般非刺激性骨髓细胞是否存在或用于确定特定非刺激性骨髓细胞(例如DC1细胞、TAM1细胞和/或TAM2细胞)是否存在的方法，所述方法包括：使包含非刺激性骨髓细胞的细胞群体与抗NSM抗体接触；以及定量化非刺激性骨髓细胞的数量。在另一方面，本申请提供了用于确定非刺激性骨髓细胞是否存在的方法，所述方法包括：使包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与抗NSM抗体接触；检测指示抗体与细胞结合的复合物或部分，以及任选地定量化所述群体中非刺激性骨髓细胞的数目。在另一方面，提供了确定非刺激性骨髓细胞比刺激性骨髓细胞的相对比率的方法，所述方法包括：使包含非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与抗NSM抗体接触；定量化刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的数量；以及确定非刺激性骨髓细胞与刺激性骨髓细胞的相对比率。
在本文所述的用于检测和/或定量化的实施方案中，抗NSM抗体结合NSM蛋白，但不一定必须影响生物应答，例如ADCC，尽管它可能对生物应答有影响。
另一方面，本发明提供了用于鉴定可以对用于治疗免疫相关病症(例如癌症)的免疫治疗(例如使用抗NSM抗体)作出应答的个体的方法，所述方法包括：检测来自个体的生物样品中NSM蛋白的表达水平；以及基于NSM蛋白的表达水平确定个体是否可以应答免疫治疗，其中相对于健康个体，个体的NSM蛋白水平升高指示个体可以对免疫治疗作出应答。在一些实施方案中，这些方法也可以用于诊断个体的免疫相关病症(例如癌症)，并且是基于NSM蛋白的表达水平，其中相对于健康个体，个体的NSM蛋白水平升高指示所述个体患有癌症。在一些实施方案中，表达水平包括编码NSM蛋白的mRNA的mRNA表达水平。在其它实施方案中，NSM蛋白的表达水平包括NSM蛋白的蛋白表达水平。在一些实施方案中，使用选自由以下项组成的组的方法来检测样品中NSM蛋白的表达水平：FACS、蛋白质印迹法(Westernblot)、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射性免疫测定、斑点印迹法、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱学、质谱、HPLC、qPCR，RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA测序、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH，以及它们的组合。在这些实施方案中，抗NSM抗体结合NSM蛋白，但不一定必须影响生物应答，例如ADCC。在一些实施方案中，生物样品来源于肿瘤组织。在一些实施方案中，生物样品包括但不限于体液、组织样品、器官样品、尿液、粪便、血液、唾液、CSF，以及它们的任何组合。
本文还公开了增强受试者对肿瘤的免疫应答或增强免疫疗法治疗的功效的方法。一般来说，增大SDC丰度的治疗将提高受试者的结局，如无复发存活时间，并将提高癌症免疫疗法治疗的功效。治疗可以增大受试者的肿瘤中SDC细胞的相对或绝对丰度。治疗可以降低受试者的肿瘤中NSM细胞的相对或绝对丰度。
一般治疗策略的示例性方法包括通过全身引入Flt3L来增大SDC的数量。另一种方法是用Flt3L治疗受试者的骨髓或血细胞，同时阻断CSF1。例如用逆转录病毒在骨髓或血液祖细胞群体中表达SDC转录因子(例如IRF8、Mycl1或BATF3或ZBTB46)也可用于驱动SDC发育。治疗的另一个策略包括全身性消除NSM细胞，同时选择性地保留SDC。这可以使这些群体的比率产生总体有利的变化。NSM细胞的消除可以通过任何手段完成，包括施用抗NSM表面蛋白的抗体(全身或局限于肿瘤)。
在一些实施方案中，应用SDC增强治疗作为治疗处理，以更好地使受试者的天然免疫***控制或消除癌症。在另一个实施方案中，本发明的SDC增强治疗与诸如免疫疗法治疗的治疗处理组合应用(这种应用在免疫疗法治疗之前，同时或之后)，其中SDC增强治疗充当附加或辅助治疗以增强治疗处理的功效。
施用方法
在一些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗个体的免疫相关病症。在一个实施方案中，个体是人，并且抗体是NSM抗体。在另一个实施方案中，个体是小鼠，并且抗体是NSM抗体。
在一些实施方案中，本文提供的方法(例如增强免疫应答或致使非刺激性骨髓细胞失能的方法)可用于治疗癌症，并且因此接受抗NSM抗体或抗NSM抗体的个体患有癌症。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，癌症是液体癌症。在一些实施方案中，癌症是免疫回避的。在一些实施方案中，癌症是免疫应答性的。在特定实施方案中，癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、肾癌、肝胆癌、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、***癌、肺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌。
在一些实施方案中，免疫相关病症是与NSM蛋白在非刺激性骨髓细胞(人的)中的表达相关的免疫相关病症或NSM蛋白同源物在非人物种中的表达。在一些实施方案中，免疫相关病症是与相较于刺激性骨髓细胞，NSM蛋白在非刺激性骨髓细胞上的过度表达相关的免疫相关病症。在一些实施方案中，NSM mRNA或NSM蛋白的过表达比刺激性骨髓细胞上约高至少2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，抗体是静脉内地、肌内地、皮下地、局部地、口服地、经皮地、腹膜内地，眼眶内地、通过植入、通过吸入、鞘内地、心室内地或鼻内地施用。可以施用有效量的抗NSM抗体来治疗癌症。抗NSM抗体的适当剂量可以基于待治疗的癌症的类型、抗NSM抗体的类型、癌症的严重性和病程、个体的临床症状，个体的临床病史和对治疗的应答来确定，并由主治医师酌情决定。
SDC和NSM细胞的检测和定量化分析
本发明包括用于定量SDC细胞和/或NSM细胞的任何方法。各种实施方案涉及例如在肿瘤样品中对SDC细胞和/或NSM细胞的鉴定和定量。肿瘤样品可以是包含从患者获得的肿瘤细胞的任何组织，如本领域已知的，为例如从活检组织取出的肿瘤的一部分(例如针吸活检组织或钻孔活检组织，例如4毫米钻孔活检组织)或已经手术切除的实质上全部肿瘤，包括初生细胞或转移性细胞。要注意的是，肿瘤的远端区域的SDC的丰度比边缘区域更大。在典型的样品中，所述差异将被平均掉，不应影响结果。然而，如果样品中包含过多的边缘物质，这可能会导致结果偏向SDC丰度不足。
在一个实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)、类似的流式细胞术方法、磁激活细胞分选、微型分选、基于亲和性的细胞分离方法，以及从混合细胞群体中分离特定细胞类型的方法来直接定量化样品中SDC细胞和NSM细胞的数量。例如，肿瘤样品可以用酶消化以产生单细胞悬浮液，如本领域已知的。然后细胞可以用对每种细胞类型所独有的蛋白质或碳水化合物标记物特异的抗体进行标记。接下来，可以利用基于各种标记的各种门控方案，来通过FACS或本领域已知的类似方法分离细胞级分。例如，如实施例中所述，用荧光标记抗体标记来自经消化肿瘤的单细胞悬液允许通过FACS法分离树突细胞级分与样品中的其它细胞类型，以及分离SDC和NSM细胞池。如本领域已知的，可以在这些方法中使用细胞外或细胞内标记蛋白的标记。
例如，在一种FACS方案中，可以如下分选肿瘤骨髓区室的各种细胞类型。那些表达CD11b和Ly6C的细胞代表单核细胞和嗜中性粒细胞，可以通过此类表达来去除它们。可以使用高CD24表达和低F4/80表达来区分树突细胞(SDC和DC1细胞)与肿瘤巨噬细胞(TAM1和TAM2)。两种肿瘤巨噬细胞群体可以通过其对CD11b和CD11c的差异表达来与彼此分离，其中TAM1细胞为“CD11b高”，“MHC II类低”和“CD11c低”，而TAM2细胞为“CD11b低”、“MHC II类高”和“CD11c高”。人肿瘤巨噬细胞特征性地表达CD14，而DC通常不表达CD14。有助于区分两种树突细胞群体和与巨噬细胞区分的区分性表面标记物的实例包括小鼠体内的CD103、XCR1、Clec9a和CD11b或人体内的CD14、BDCA3、XCR1和Clec9a。例如，通过CD11b(在SDC细胞中存在，而在NSM细胞中不存在)和CD103(在NSM细胞中存在，而在SDC细胞中不存在)的差异表达，可以分离小鼠肿瘤中的两种树突细胞群体。类似地，人体内的SDC表达BDCA3、XCR1和Clec9a，而非刺激性DC表达BDCA1，以及巨噬细胞表达CD14。
在另一个实施方案中，使用组织样品的直接组织学分析来确定与其它细胞类型相比，SDC的存在、流行和相对丰度。例如，可以用抗SDC标记物并包含抗原的经标记抗体和抗NSM标记物并包含抗原的经标记抗体来对组织切片染色。然后通过定量荧光显微镜法对经标记的组织切片进行的分析可随后用于样品中SDC细胞和NSM细胞的定量，以及样品中此类细胞的相对物理分布和定位的可视化。
在另一个实施方案中，通过观察整块肿瘤样品中的基因表达模式来间接测定样品中SDC的丰度和/或NSM细胞的丰度，从而避免将样品分割成细胞部分。对整块肿瘤组织内的SDC和NSM遗传标记物的定量分析被用作肿瘤中存在的SDC细胞比NSM细胞比率的替代量度。例如，在一个实施方案中，测定肿瘤样品中细胞的整个转录组，以确定SDC标记物基因的表达比NSM标记物基因表达的比率。应当理解，可以使用本领域已知的用于分析基因表达的任何数量的工具来实现对标记物基因表达的这种定量化。
在一个实施方案中，如本领域中已知的，使用定量PCR方法进行对肿瘤样品中的标记物基因表达的评估。可以使用本领域已知的全肿瘤转录组方案和唯一能够扩增标记物基因序列的引物来进行此类方法。在给定标记物基因的已知序列的情况下，本领域的技术人员能够轻易地产生所述已知序列的引物。应当理解，如本领域已知的，在定量表达的情境中提及特定基因的“基因序列”将指与由所述基因在表达时产生的mRNA(或自其产生的cDNA)相对应或互补的全部或部分核酸序列。
在另一个实施方案中，可以使用DNA阵列技术来测量标记物基因的表达，如本领域中已知的。结合标记物基因转录物的探针可以由本领域的技术人员利用标记物基因的已知序列容易地产生，并且可以用于任何数量的基因表达芯片和分析平台中。
在另一个实施方案中，SDC和NSM细胞定量化是通过以下方式实现的：监测下游基因和蛋白的存在或活性，所述下游基因和蛋白被定义为由标记基因或其翻译产物调控并且其活性响应于标记物基因表达而可预测地变化的基因和蛋白。在另一个实施方案中，功能测定用于例如通过差异化免疫活性来鉴定或定量化SDC和NSM细胞。例如，SDC能够有效交叉呈递肿瘤抗原，并且是CD8T细胞的有效激活剂，而NSM细胞不是。类似地，尽管NSM细胞表现出高度的吞噬行为，但是相比之下SDC是较不稳健的吞噬细胞。
丰度和筛选
本发明的各个实施方案涉及确定肿瘤中SDC的丰度。可以用各种量度来评估这种细胞的丰度。此类测量可以包括相对测量或绝对测量，并且可以包括直接或间接测量。例如，相对丰度可以通过测量样品中SDC与NSM细胞的比率；样品中SDC与DC1细胞数的比率；或样品中SDC与所有细胞类型的比率；样品中SDC与总骨髓细胞的比率；或样品中SDC与HLA-DR+细胞的比率来确定。在一些实施方案中，确定SDC的绝对丰度，例如以作为每ml肿瘤组织或每微克肿瘤组织的SDC总数的量度。间接量度包括单独评估SDC标记物基因的基因表达水平，或与其它细胞类型(如NSM细胞)的标记物表达水平进行比较。
在各种实施方案中，受试者肿瘤中SDC的丰度构成了预后指标、诊断指标或治疗选择指标。
各种实施方案涉及比较量度，如SDC丰度的“升高”或“增大”。此类比较量度可以通过将来自受试者的样品与代表性样品进行比较来进行。代表性的样品可以包括例如在较早时间点来源于相同受试者的样品，来源于类似受试者的样品(例如在年龄、性别、健康指标、癌症进展、癌症类型等方面匹配)的样品，或来源于类似肿瘤(例如在肿瘤类型、肿瘤阶段以及肿瘤进展的其它量度方面匹配)的样品。在一些实施方案中，例如，其中正在评估治疗的功效，提高的丰度被定义为比在来自未经治疗的受试者的代表性样品中观察到的丰度更高的丰度。在一些实施方案中，典型或平均SDC丰度的量度被用作确定什么导致了提高或增大丰度的基线，例如，可以使用代表性样品中的SDC的平均值、中值或类似统计量度。可以使用本领域中已知的各种统计方法来定义显著提高或增大的量。
在一个实施方案中，SDC在受试者肿瘤中的丰度构成了预后指标，其中受试者的结局是基于受试者肿瘤中SDC的丰度预测的，其中提高的丰度表示更高的阳性结局概率。结局的示例性量度包括无复发存活的概率、预测的无复发存活时间，预测的总存活时间、复发风险、生活质量指标等。例如，在一个实施方案中，直接或间接测量的肿瘤样品中SDC细胞比NSM细胞的比率被用作SDC丰度的量度，而预测的无复发存活时间是受试者结局的量度。例如，在类似肿瘤样品池中观察到的平均或中值SDC标记物基因表达比NSM标记物基因表达的比率可以充当阈值，并且如果个体受试者的测量比率超过所述阈值，则发现所述受试者具有增大的无复发存活概率。
在另一个实施方案中，受试者肿瘤中SDC的丰度是受试者对免疫疗法治疗阳性应答的可能性的指标，其中源自受试者的肿瘤样品中SDC的提高丰度指示对免疫疗法阳性应答的较高概率。例如，在一个实施方案中，直接或间接测量的肿瘤样品中SDC与NSM细胞的比例被用作SDC丰度的量度。例如，在类似肿瘤样品池中观察到的平均或中值SDC标记物基因表达比NSM标记物基因表达的比率可以充当阈值，并且如果个体受试者的测量比率低于所述阈值，则发现所述受试者具有降低的无复发存活概率。
预测哪种受试者将更可能适合用免疫疗法治疗有利地允许选择适当的治疗干预。发现不太可能对免疫疗法治疗作出应答的受试者可能会被指向其它治疗方式，而更可能对免疫治疗作出应答的受试者可以相应地治疗。本发明的治疗选择指标适用于预测对本领域已知的任何癌症免疫疗法的应答性或无应答性。例如，一类癌症免疫疗法被称为“检查点阻滞”治疗。哺乳动物免疫***包含各种“检查点”，所述“检查点”是通常用于减弱免疫应答并防止自体免疫应答的自限性抑制途径。肿瘤已表现为可以劫持这些途径，使抗肿瘤免疫应答被抑制。称为检查点阻滞的各种治疗策略涉及使用配体(如抗体)来阻断这些控制点并抑制肿瘤对免疫应答的抑制，从而挽救抗肿瘤免疫应答。另一类免疫疗法涵盖基于细胞的策略，例如从受试者中去除细胞(诸如树突细胞)，以及这种细胞应激于肿瘤抗原的离体增殖和活化。然后将活化的细胞重新导入体内以增强受试者对肿瘤的免疫应答。
本文包含的公开内容为本领域提供了SDC的丰度与受试者结局和/或受试者对免疫治疗的依从性之间的新颖关系。本发明广泛地涵盖了这些概念的任何应用。通过针对任何特定类型或亚型的癌症，开发SDC丰度的特定量度与特定免疫疗法治疗的受试者结局或依从性的特定量度之间的预测关系来实施本发明构思在本领域的技术人员的能力范围内。这种预测关系可以涵盖以下现象的任何统计方案：增大的SDC丰度指示免疫治疗处理的改善的受试者结局或增大的依从性。
在一个实施方案中，本发明包括以下预测关系：其中SDC标记物基因表达与NSM标记物基因表达的比率用作SDC丰度相对于NSM免疫细胞丰度的量度，并且SDC比例升高预示受试者存活的可能性更大。例如，如实施例中所述，分析了来自3602例肿瘤样品、代表12种不同癌症类型的大量基因表达数据(来自TCGA泛癌项目的数据)，其中可获得每种肿瘤样品的相关受试者存活数据。对于每个样品，计算表A中所有SDC标记物基因的观察到的平均表达水平(以标准化数据集中的相对强度单位测量)，并作为SDC树突免疫细胞丰度的量度。同样地，对于每个样品，计算表A中所有NSM标记物基因的观察到的平均表达水平，并将其作为NSM免疫细胞丰度的量度。然后计算每个样品的SDC细胞比NSM细胞丰度信号的比率，进行对数变换，Z分数归一化，以使得整个数据集中的中值为0，标准偏差为1。针对每种癌症类型，计算中值SDC比NSM基因标记物的基因表达比率。针对每种癌症类型，将样品池分为“高”SDC比NSM比率或“低”SDC比NSM比率，其中高池涵盖具有高于整个类似样品群体(基于癌症类型匹配的)的中值的经标准化比率的所有样品，而低池涵盖具有低于所述中值的经标准化比率的所有样品。卡普兰-梅耶方法用于评估总体存活率和SDC/NSM签名比率之间的关联为二分变量(针对每种癌症，在中值处分开)。如图所示，数据清楚地表明，与低池相比，高池中的总体存活率显著增大。
因此，样品中SDC标记物基因表达与NSM基因表达的比率预测了样品来源于的受试者的总体存活时间，其中升高的比率指示总体存活率增大。在这种情况下，“升高”比率被定义为超过所述类型癌症的中值比率值的比率。因此，在一个实施方案中，本发明包括一种通过以下步骤来预测受试者(相对于具有低SDC/NSM签名比率的受试者)的更长总体存活时间的方法：(1)计算来源于受试者的肿瘤样品中平均SDC标记物基因表达比平均NSM基因表达的经z-分数化和对数转变的比率；然后将受试者的观察到的比率与表示针对所述肿瘤样品的癌症类型的中值SDC标记物基因表达比NSM基因表达比率值的阈值进行比较；其中如果所述样品比率超过所述阈值，则指示大于平均总体存活时间。
应当理解，本文给出的计算SDC丰度的示例性方法是说明性的，并且可以以各种方式进行修改。例如，可以使用来自表A的基因亚群。例如，在一个实施方案中，使用SDC标记物BDCA3、KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1和CLEC9A，以及NSM标记物MRC1、MS4A7、C1QC、APOE、C1QB、C1QA和C5AR1。同样地，可以改变用于计算基因表达比率的具体数学运算，例如可以将对数变换值求和并取平均，而不是将平均值进行对数变换，等等。只要具体方法代表样品中SDC标记物基因表达水平比NSM标记物基因表达水平的比率，用于计算所述比率的数学运算的确切性质和顺序并不是关键的。
在替代实施方案中，NSM丰度可以被测量为NSM细胞的数量/活肿瘤细胞总数，NSM细胞的数量/肿瘤免疫细胞总数，NSM细胞的数量/单位体积的肿瘤样品，或NSM细胞的数量/单位质量(例如mg)的肿瘤样品。同样地，SDC丰度可以被测量为SDC细胞的数量/活肿瘤细胞总数，SDC细胞的数量/肿瘤免疫细胞总数，SDC细胞的数量/单位体积的肿瘤样品，或SDC细胞的数量/单位质量(例如mg)的肿瘤样品。
样品中的总骨髓细胞可以被评估为样品中的总CD11b+细胞。样品中的总骨髓细胞可以定义为表达CD14的总细胞加上表达CD16的总细胞加上表达HLA的总细胞。
在一个实施方案中，SDC细胞的丰度被评估为通过流式细胞术测定的表达SDC标记物的样品中HLA-DR阳性骨髓细胞的百分比。例如，SDC标记物可以是BDCA3或XCR1或Clec9a。
本发明的发明人已经有利地发现，表达CD14(CD14+)的巨噬细胞和单核细胞的丰度可以用作非刺激性细胞丰度的量度，或者用来对受试者池分层以更准确地预测癌症结局或评估治疗功效。CD14+巨噬细胞可能与刺激性树突细胞竞争，因此骨髓池中CD14+细胞与SDC细胞的平衡可能是癌症结局的重要决定因素。CD14+细胞的比例可能调节SDC丰度的影响。在一个具体实施中，NSM丰度的替代量度被定义为样品中CD14+骨髓细胞的丰度。在一个实施方案中，CD14+骨髓细胞丰度被测量为表达CD14的总CD11b+骨髓细胞的百分比。在另一个实施方案中，将表达CD14的HLA-DR阳性细胞的百分比用作CD14+细胞丰度的量度。在另一个实施方案中，CD14+骨髓细胞丰度被测量为表达CD45的总免疫细胞的百分比。在另一个实施方案中，CD14+骨髓细胞丰度被测量为每克样品组织内CD14+细胞的数量或类似量度。
在本发明的一个实施方案中，SDC丰度被测量为表达HLA-DR+的骨髓细胞的百分比，所述骨髓细胞还表达SDC标记物，例如BDCA3或XCR1。在一个实施方案中，如此测量的SDC丰度被用作预后指标，治疗功效的指标或受试者对特异性治疗的依从性的指标，其中较高SDC丰度指示阳性预后、对治疗的阳性应答、或对特定治疗的更高依从可能性，并且较低SDC丰度指示不良预后、无效治疗、或对特定治疗的较低依从概率。例如，具有1至4％、1至2％、2％、2％、3％、4％、5％或1.37％或更多的HLA-DR+细胞的SDC(例如，BDCA3+细胞)丰度可以被认为是提高的SDC丰度。例如，具有包含1至5％、1至4％、1至2％、1％、2％、3％、4％、5％或1.37％或更多的HLA-DR+的SDC细胞的患有肿瘤的受试者具有大于50％的概率对免疫疗法治疗(诸如抗PD1)作出阳性应答，例如大于85％的阳性应答概率。
在一个实施方案中，正在评估的治疗是免疫刺激或免疫疗法治疗。例如，治疗可以包括靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的治疗。例如，抗PD1治疗包括纳武单抗(OpdivoTM)、潘利珠单抗(KeytrudaTM)。另一种类似的治疗方法是靶向CTLA-4，例如使用伊匹单抗(ipilimumab)(YervoyTM)。在一个实施方案中，通过测量受试者肿瘤中SDC细胞的丰度来评估受试者对抗PD1治疗作出应答的可能性，例如其中SDC细胞的丰度被评估为表达SDC标记物(例如BDCA3)的HLA-DR+骨髓细胞的百分比，其中提高的SDC细胞丰度指示受试者将偏好对抗PD1治疗应答，并且肿瘤中SDC细胞的较低丰度指示受试者将对抗PD1治疗不良地应答。在一个实例中，提高的SDC细胞丰度被定义为肿瘤样品中4％或更多的HLA-DR+骨髓细胞，并且较低的SDC细胞丰度被定义为肿瘤样品中小于4％的HLA-DR+骨髓细胞。在一个实施方案中，受试者是黑素瘤受试者。上述方法可以类似地用于评估抗PD1治疗的功效，其中观察到治疗后SDC细胞的丰度增大指示治疗有效。同样，推定的PD1抑制剂可以被鉴定为增大SDC细胞丰度的试剂，例如以作为BDCA3+细胞的HLA-DR+细胞的百分比来测量。
在一个实施方案中，本发明包括用于鉴定增强SDC丰度的组合物(或其它类型的治疗方式)的筛选方法。例如，患有肿瘤的动物可以暴露于SDC丰度的推定增强剂，然后可以使用本发明的工具和方法来评估SDC丰度，其中相较于例如未经处理的对照或来自相同受试者，SDC丰度增强指示所述治疗是SDC丰度的有效增强剂。此类SDC丰度可以包括SDC丰度的任何量度，包括SDC的相对和绝对量度(例如SDC细胞比NSM细胞的比率)，或其间接量度。
试剂盒和制品
本申请提供了包含本文所述的任何一种或多种抗体组合物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒还含有选自二级抗体、免疫组织化学分析试剂、药学上可接受的赋形剂和使用说明书，以及它们的任何组合中的任何一种的组分。在一个特定实施方案中，试剂盒包含药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗体组合物中的任何一种或多种和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，试剂盒可以由试剂、生物材料和其它组分组成，以便于测量SDC和NSM细胞。例如，在一个实施方案中，试剂盒可以包含针对骨髓细胞的抗体(包括荧光标记的抗体)、常见的树突细胞标记物、SDC细胞标记物和NSM细胞标记物，以促进使用FACS或其它细胞分选或流式细胞术方法来定量化样品中的SDC和/或NSM细胞。例如，可以使用包含针对小鼠中CD45、CD11c、Ly6C、MHCII、CD24、F4/80、CD11b和CD103的差异化标记抗体的试剂盒，而针对人CD45、CD11c、CD14、HLA-DR、BDCA1和BDCA3的抗体可用于促进SDC和NSM级分的FACS分离。
在另一个实施方案中，一组PCR引物可以包含在用于扩增一个或多个SDC基因标记物或一个或多个NSM基因标记物的试剂盒中。在一个实施方案中，PCR引物试剂盒包含能够独特地扩增表A中列出的一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种、九种或全部SDC标记物和表A中列出的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或九种以上的NSM标记的一组引物。在另一个实施方案中，PCR引物试剂盒包含能够独特地扩增BDCA3、KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、MRC1、MS4A7、C1QC、APOE、C1QB、C1QA和C5AR1的一组引物。
试剂盒可以包含两个或更多个探针，所述探针包括用于结合和/或标记SDC或NSM转录物或cDNA的SDC或NSM基因标记亚序列。在另一个实施方案中，试剂盒包含微阵列或其它固体基质，所述微阵列或其它固体基质上固定有探针，所述探针包含一个或多个SDC或NSM标记物基因序列以用于结合和定量化肿瘤浸润性SDC或NSM转录物或由其衍生的cDNA。在一个实施方案中，阵列包括对应于表A中列出的一种、二种、三种、四种、五种、六种、八种、九种或全部SDC标记物；和/或表A中列出的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或九种以上的NSM标记物的一组探针。在另一个实施方案中，阵列包括对应于BDCA3、KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、MRC1、MS4A7、C1QC、APOE、C1QB、C1QA和C5AR1的一组探针。
试剂盒可以包含能够唯一地扩增样品中的KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1和CLEC9A基因序列的一组PCR引物。试剂盒可以包含能够唯一地扩增样品中的C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2和TLR7基因序列的一组PCR引物。试剂盒可以包含能够唯一地扩增样品中的MRC1、MS4A7、C1QC、APOE、C1QB、C1QA和C5AR1基因序列的一组PCR引物。寡核苷酸阵列可以包含能够结合KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、BDC3A、XRC1和CLEC9A基因序列的固定化探针。寡核苷酸阵列可以包含能够结合C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2和TLR7基因序列的固定化探针。寡核苷酸阵列可以包含能够结合MRC1、MS4A7、C1QC、APOE、C1QB、C1QA和C5AR1基因序列的固定化探针。
本申请还提供了包含本文所述的任何一种抗体组合物或试剂盒的制品。制品的实例包括小瓶(包括密封小瓶)。
实施例
以下是用于实施本发明的具体实施方案的实施例。这些实施例仅提供用于说明目的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。已经努力确保使用的数字(例如数量、温度等)的准确性，但是当然应当允许一些实验误差和偏差。
除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。此类技术在文献中充分解释。参见，例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989年)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑,Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:MackPublishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry,第3版,(Plenum Press)卷A和卷B(1992)。
实施例1：实施例1至9的材料和方法。
小鼠肿瘤
PyMT-ChOVA转基因C57BL/6首建小鼠如所描述(Engelhardt等人，2012)，并通过PCR筛选后代的PyMT-ChOVA转基因，以及监测肿瘤并在20至30周龄使用。B78ChOVA是B78的变体(Graf等人，1984)，如补充方法中所述地产生和使用。所有附加品系信息可以在补充方法中找到。将所有小鼠均保持在SPF条件下，并按照NIH和美国实验室动物护理协会标准进行治疗，并符合UCSF的护理法规。
流式细胞术
所有抗体购自BD Pharmingen、eBioscience、Invitrogen、Biolegend、UCSF杂交瘤核心，或是在Krummel实验室中生产的。为了表面染色，将细胞与抗Fc受体抗体(克隆2.4G2)一起孵育，并在PBS+2％FCS中用抗体在冰上染色30分钟。通过用可固定的Live/DeadZombie(Biolegend)或DAPI进行染色来评估活力。为了进行细胞内染色，在收获前6小时，用布雷菲德菌素A(Cayman)以10微克/克体重注射小鼠，将细胞用针对表面标记物的抗体进行染色，然后在25℃下用2％PFA固定10分钟并用0.2％的皂素透化，然后用靶抗体染色。所有流式细胞术均在BD Fortessa流式细胞仪上进行。流式细胞术数据的分析是使用Flowjo(Treestar)进行的。细胞分选是使用BD FACS Aria II进行的。
TCGA生物信息学分析
临床表达分析使用来自代表12种癌症类型的3602例患者肿瘤样品(845例乳腺癌、265例卵巢癌、303例头颈鳞状细胞癌、122例膀胱癌、168例成胶质细胞瘤、190例结肠癌、173例急性髓细胞性白血病(AML)、72例直肠癌，355例肺腺癌、259例肺鳞状细胞癌，480例肾癌和370例子宫癌)的全基因组mRNA水平(Illumina mRNA测序)，用如所公布的TCGAPanCancer工作组(Cancer Genome Atlas Research等；2013；Hoadley等人，2014)归一化并合并成单个数据集(数据在TCGA数据门户(TCGA Data Portal)https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/中并且可作为syn1715755在https://www.synapse.org/上获得)。CD103+/CD103-比率签名计算为CD103+DC基因的平均表达量除以CD103-DC基因的平均表达量的对数，然后进行Z-分数标准化(平均值＝0，标准偏差＝1；基因列表在图8C中)。我们还评估了所公布的T细胞(Palmer等人，2006)、增殖(Wolf等人，2014)、CSR/创伤(Chang等人，2005)和γ干扰素(Viigimaa等人，2010)签名，以及CD8/CD68表达率(DeNardo等人，2011)。总体存活数据从TCGA门户(下载2013年6月的)(Cancer Genome Atlas Research等，2013)获得，并在针对癌症类型进行的多变量模型调整中使用Cox比例风险模型进行存活分析。在使用Benjamini-Hochberg方法(Benjamini和Hochberg，1995)针对多重比较进行调整后，使用对数秩p值来评估显著性。Kaplan-Meier生存曲线是使用R中的存活程序包产生的。在全数据KM图(图8E)中，我们通过使用癌症类型的CD103+/CD103-比率签名的中值将每个样品分类为‘高’或‘低’来针对所述癌症类型进行‘调整’。
小鼠品系信息
将在H-2Kb(Hoquist等人，1994)的情形下特异于卵清蛋白肽SIINFEKL(SL8)的OT-I小鼠与CD45.1，Nur77-eGFP小鼠(Moran等人，2011)和Cd2-RFP小鼠(Veiga-Fernandes等人，2007)进行种间杂交，或与Actin-CFP小鼠(Hadjantonakis等人，2002)进行种间杂交，以产生经基因组编码的、经荧光或先天(congenically)标记的T细胞以供用于过继性转移、成像和活化实验。
为了调节肿瘤中骨髓细胞的群体，使用以下小鼠品系：购自Simonsen的C57BL/6，由芝加哥大学的Anne Sperling惠赠给我们的Irf4f/f x CD11c-Cre(Klein等人，2006)，(Williams等人，2013)，由UCSF的Scott Kogan惠赠给我们的Irf8-/-FVBN(Ouyang等人，2011)，Zbtb46–DTR(Meredith等人，2012)，Csf2rb-/-(Robb等人，1995)，以及Csf3r-/-(Liu等人，1996)。
为了可视化肿瘤内的APC，将PyMT-ChOVA转基因小鼠与Cx3cr1-eGFP小鼠(Jung等人，2000)和Cd11c-mCherry小鼠(Khanna等人，2010)进行种间杂交，并将得到的荷有两种转基因的F1后代用于成像实验。
细胞系，细胞培养，质粒和转染
在注射到小鼠体内之前，在标准条件下培养以下肿瘤细胞系。B16-F10(Fidler,1975)，B16-GMCSF(Dranoff等人，1993)，由LarryFong惠赠的B16-FLT3L(Curran和Allison，2009)，B78亲本(Graf等人，1984)，B78chOVA，使用标准方法以与在PyMTChOVA中使用的相同的Ch-OVA融合构建体转染的B78亲本(Engelhardt等人)，EL4(Hyman等人，1972)，EG7(Moore等人，1988)，EG7-chOVA，由UCSF的Zena Werb惠赠给我们Vo-PyMT-萤光素酶-IFB(Halpern等人，2006)，以及由UCSF的Lewis Lanier惠赠给我们的LLC(Bertram和Janik，1980)。B78p-mCherry-pHlourin是通过根据制造商的关于N1-mCherry-pHlourin构建体的说明书用脂质体(Lipofectamine)转染B78亲本细胞产生的(Koivusalo等人，2010；Webb等人，2011；Choi等人，2013)。
简单地在经组织培养处理的塑料平板上，在含有Pen/Strep/Glut的DMEM加10％FCS中于37℃/5％CO2下培养贴壁细胞，并每隔一天进行一次细胞分离。将悬浮细胞在培养瓶中的RPMI-1640加10％FCS和Pen/Strep/Glut中培养，每隔一天进行一次细胞分离。
异位肿瘤注射
收获肿瘤细胞系并用PBS洗涤3次，然后以1:1的比例与生长因子减少的基质胶(BDBiosciences)混合，最终注射体积为50ul。将100,000个肿瘤细胞(除非另有说明)皮下注射到剃毛小鼠的右侧，并使小鼠在使用前生长14至21天。
肿瘤消化
从小鼠解剖PyMT-chOVA和异位B78chOVA肿瘤，然后测定所取出的肿瘤组织的总重量。然后使用解剖刀切碎肿瘤，然后在带有搅拌棒的25ml锥形瓶中将每0.3克肿瘤重量用500U/ml胶原酶IV(Sigma)、100U/ml胶原酶I(Worthington)和200mg/ml DNA酶I(Roche)以30分钟间隔消化3次，然后放置在于搅拌板上具有5％CO2的37℃培养箱中。在每次30分钟间隔后，将肿瘤滤过70um的细胞过滤网去除大块未消化的肿瘤，剩余的大块被重新引入消化，而分离的单个细胞被保持在冰上。然后在4℃下进行CD45-生物素磁性阳性选择(StemSep)以富集总肿瘤免疫浸润。
人样品
将组织用外科手术剪大力切碎，转移至带有磁力搅拌棒的25ml锥形瓶中，每0.3g组织用3mg/ml胶原酶A(Roche)和50U/ml DNA酶I(Roche)在37℃/5％CO2以及持续搅拌下消化1小时。然后将样品滤过70um过滤器，离心沉降并重悬以进行染色(Ruffell等人，2012)。对于所有人样品，获得了所有受试者的知情同意，并且工作是根据IRB批准(IRB编号13-12246，12/06/2013-12/05/2014)进行的。
细胞分离
从6至12周龄的小鼠的***和脾脏中分离OT-I初始CD8+T细胞。按照制造商的说明，使用阴性CD8分离试剂盒(Stemcell Technologies)进行细胞选择。通过用含有GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的10％FCS在IMDM中培养以1至2x10^6个细胞/ml接种的骨髓细胞8至11天来产生BMDC。在培养的最后2天加入IL-4，并在使用前12小时加入LPS以使BMDC完全成熟。
T细胞的eFlour670标记
将OT-I CD8+T细胞在不含FCS而含有2uM efluor670(eBioscience)的RPMI中于37℃孵育15分钟。然后将eFluor670用2ml FCS猝灭并在使用前用RPMI 10％FCS洗涤3次。
T细胞的大量激活(CTL生成)
用100ng/ml SL8肽致敏的B6脾脏细胞刺激OT-I TCR转基因***细胞30分钟，然后洗涤3次。刺激后两天以及再次在刺激后4天，细胞在2U/ml重组人IL-2存在下扩增，然后在2至3天后用于实验。
T细胞增殖测定
从OT-I TCR转基因小鼠分离***细胞，并通过StemSep CD8富集(Stemcelltechnologies)富集初始CD8+T细胞和/或使用CTL的大量活化培养物。从OT-II TCR转基因小鼠分离***细胞，并通过StemSep CD4浓缩(Stemcell technologies)富集初始CD4+T细胞。将20,000个富集的初始CD8细胞或5天前活化的OT-1T细胞或用2uM eFluor670标记的初始CD4细胞与用或未用25ng/ml的SL8肽(OT-1)或1ug/ml的pOVA 323-339肽(OT-II)致敏的4,000个BMDC或4,000个未致敏的肿瘤APC(除非另有说明)在96孔V底平板中于37℃/5％CO2下混合12、48或72小时，此时用流式细胞术，通过CD69/Nur77上调和efluor670稀释来测量活化。
偶联分析
如所描述地进行偶联分析(Friedman等人，2006)。简单地将经标记的T细胞与来自肿瘤消化物的经染色单细胞悬液混合30分钟至1小时，然后用2％PFA固定以供进行流式细胞术。偶联百分比经计算为T细胞总数中偶联T细胞的数目。
体内多光子显微镜成像和手术
在加热显微镜台上使用异氟醚将动物保持麻醉，并根据机构指导定期监测麻醉深度。手术前，用100ug伊文思蓝的PBS溶液静脉注射动物并用1ml乳酸林格液腹膜内注射动物。通过外科手术暴露乳腺，然后将肿瘤通过我们前面描述的吸窗的修改版本(Thornton等人)成像。使用配备有两个红外激光器的定制双光子装备进行活体成像(MaiTai:SpectraPhysics,Chameleon:Coherent)，将MaiTai激光器调谐到870nm或910nm以分别同时激发CFP和GFP，或激发单GFP。将Chameleon激光激发调谐到1030nm以激发mCherry。使用耦合到6色检测器阵列(定制；使用Hamamatsu H9433MOD检测器)的25×1.2NA水透镜(Zeiss)检测发射光，使用交替激光激发产生12个检测通道。所使用的滤光片是：紫光417/50，蓝光475/23，绿光510/42，黄光542/27，红光607/70，远红光675/67。用MicroManager软件套件控制显微镜，采用4倍平均和3微米的z景深获取z堆栈图像。使用Imaris软件套件(Bitplane)进行数据分析。
体外肿瘤切片和多光子成像
将动物安乐死并收获肿瘤。去除阻碍脂肪，将肿瘤嵌入2％低熔点琼脂糖的PBS溶液(SeaPlaque，Lonza)中。使用组织切片机Compresstome VF-200(PrecisionaryInstruments Inc.)制备300μM厚的切片。使用氰丙烯酸酯组织粘合剂(Vetbond,3M)将切片连接到塑料盖玻片，并在补充有5％大鼠血清的RPMI中用Alexa647标记的大鼠抗CD11b抗体在37℃/5％CO2下染色2小时。切片用RPMI洗涤，并使用Nikon A1R共聚焦显微镜进行成像。
RNA提取，Fluidigm扩增和RNA测序
将4,000至20,000个细胞直接分选到300ul Trizol LS中，快速冷冻，并立即储存在-80℃下，直至提取。通过苯酚-氯仿法和乙醇沉淀法提取RNA。然后用DNA酶I处理样品，并使用Superscript III(Invitrogen)合成cDNA。对于纳升qPCR富鲁达(Fluidigm)分析，通过使用2倍Taqman PreAmp预混液(Taqman PreAmp Master Mix)(Applied Biosystems)进行靶特异性扩增来预扩增cDNA(12个循环)，然后用外切核酸酶I处理以去除未结合的引物。然后将样品和引物(靶引物使用哈佛引物库(Harvard primer bank)：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/设计)加载到具有2倍SsoFast EvaGreen Super Mix(Bio-Rad)的48.48动态阵列上，并在BioMark HD上运行。对于RNA测序，使用ArcturusPicopure RNA分离试剂盒(Life Technologies)提取样品，进行生物分析，并提交给UCSFGenomics Core。使用Nugen Ovation试剂盒制备文库，随后在Illumina HiSeq 2500机器上进行测序。生成单端、50个碱基对的读段，以产生约4.05亿个读段，平均测序深度为3370万个读段/样品。将读段与小鼠基因组(USCS mm10)比对，并将唯一映射到已知mRNA的那些读段用来评估差异表达。为了分析和评估差异表达，使用Tophat(Trapnell等人，2009)进行比对，用DESeq(Anders和Huber，2010)进行差异表达分析。
肿瘤生长
对于肿瘤生长曲线，在指定的时间段内，用游标卡尺测量肿瘤面积(mm2)为肿瘤宽度x肿瘤高度。
白喉毒素、FTY-720和aCSF-1治疗
白喉毒素购自Sigma-Aldrich。对于瞬时白喉毒素消融，向DTR小鼠腹膜内注射20ng白喉毒素/克体重，并在D.T.注射后24小时将小鼠安乐死以用于分析。对于长期消融，小鼠最初腹膜内注射20ng/g DT，然后每三天保持注射4ng/g。
FTY720购自Cayman，并以盐水重新配制，并以1mg/ml等分试样储存在-20℃。在指定时间段内每隔一天腹膜内注射200ul FTY，在盐水中的最终浓度为100ug/ml。
中和aCSF-1抗体，克隆5A1，并且纯化的同种型大鼠IgG2a购自UCSF抗体中心(UCSFAntibody Core)。动物首先通过腹膜内注射用1mg抗体治疗，然后在3天后分析。为了保持随时间推移的消除，随后每5天以0.5mg的腹膜内注射剂量对小鼠给药一次。
GMP祖细胞制备和过继性转移
将所有骨骼(包括股骨、胫骨、肱骨、尺骨、桡骨和骨盆)收获到分选缓冲液(PBS+2％FCS)中，用凡士林和杵粉碎，并用HBSS反复洗涤，然后滤过70um过滤器。然后将细胞用175mM氯化铵在37℃下RBC裂解5分钟，然后洗涤并与3ml底层Histopaque-1110(Sigma)混合，以选择活细胞并去除剩余的骨碎片。使用CD117微珠(Miltenyi Biotec)从骨髓细胞富集CD117阳性细胞，并在AutoMACS上进行阳性选择。然后将细胞用未缀合的大鼠抗体(CD4、CD8、Mac1、Gr-1、CD5、Ter119和CD3)的谱系混合物在冰上染色30分钟，然后洗涤，并用抗大鼠荧光缀合的二级抗体在冰上染色30分钟。然后洗涤细胞，并在冰上用祖细胞混合物(Ckit-APC-cy7、Sca1-PB、CD34-FITC和FCgR-PerCPCy5.5)染色30分钟，洗涤，并使用BDFACs AriaII分选活的、cKit+Sca1-、CD34+FcgR+的GMP。
葡聚糖摄取测定
消化肿瘤，如上所述选择CD45阳性，然后以1×106个细胞/孔接种在96孔圆底板中，在4℃或37℃下在使用或不使用1mg/ml葡聚糖-太平洋蓝(Pacific Blue)(10,000MW)的情况下一式三份地孵育30分钟。每5分钟敲击圆底板一次。然后将板洗涤3次并用表面抗体染色，并立即通过流式细胞术分析。葡聚糖摄取测量为从在37℃下葡聚糖摄取的几何平均荧光强度中减去4℃下葡聚糖结合的几何平均荧光强度。
细胞跟踪和成像分析
使用Imaris软件(Bitplane)对数据进行可视化和分析。用Imaris识别和跟踪单个T细胞。使用MATLAB分割的经掩蔽DC的等面积来计算CD11c mcherry DC。使用Imaris跟踪的掩蔽的T细胞-DC偶联的经计算跟踪持续时间来确定接触持续时间。
抗体克隆
小鼠抗体克隆：CD45克隆30-F11，CD45.1克隆A20，CD45.2克隆104，CD11b克隆M1/70，CD11c克隆N418，CD103克隆2E7，CD24克隆M1/69，CD90.2克隆30-H12，Ly6C克隆HK1.4，MHCII克隆N22，F4/80克隆BM8，CD69克隆H1.2F3，CD135克隆A2F10，CD117克隆2B8，CD26克隆H194-112，CD206克隆C068C2，CD64克隆X54-5/7.1，MerTK克隆Y323，由耶鲁大学的AkikoIwasaki惠赠给我们的CD301b克隆11A10-B7-2，PDL2克隆TY25，由芝加哥大学的RogerSciammas惠赠给我们的IRF4克隆M17和IRF8克隆T14，IL12克隆C17.8，CD80克隆16-10A1，CD86克隆GL1，2B4克隆m2B4，以及PDL1克隆10F.9G2。
人抗体克隆：CD45克隆Hl30、CD3e克隆OKT3、HLADR克隆L243、CD56克隆CMSSB、CD19克隆H1B19、CD14克隆61D3、CD16克隆CB16、CD11c克隆3.9、BDCA1克隆L161，以及BDCA3克隆AD5-14H12。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。除非另有说明，否则所有数据都代表>3次独立实验。误差条表示使用Prism从一式三份的实验条件计算的SEM。所使用的具体统计学检验是配对和非配对的T检验，并且＜0.05的所有p值被认为具有统计学显著性。
实施例2：表面标记物描绘了来自丰富的巨噬细胞的罕见肿瘤DC亚群。
为了详细分析肿瘤浸润性骨髓群体，设计了一种11色流式细胞仪，并使用自发性乳腺肿瘤模型PyMTChOVA(Engelhardt等人，2012)进行了进行性门控策略，以及用启动癌基因工程化以独立地共表达荧光mCherry蛋白和卵清蛋白。我们分析了肿瘤CD45+区室，其中许多具有吞噬的肿瘤抗原，因此显示出mCherry荧光(图1A)。用骨髓特异性标记物CD11b和单核细胞标记物Ly6C对所有造血细胞进行子门控允许去除嗜中性粒细胞和单核细胞(数据未显示)。在MHCII+细胞中，基于CD24高和F4/80低表达来区分DC与巨噬细胞，其中CD24高和F4/80低表达中的任一单独项通常都不足以作出这种区分。随后，基于CD11b和CD103的差异表达，发现DC可以解析成两种群体，如已经在健康的外周组织内观察到的(Hashimoto等人，2011)。我们发现这两个小鼠黑色素瘤模型(B78ChOVA(表达mCherry和OVA的B16的变体)，图1B和BRAF V600E，数据未显示)中的这些群体跨小鼠品系(如FVB PyMT；数据未显示)，并且在异位肿瘤(Lewis肺癌；数据未显示)中。我们在后文中将这些DC群体称为“CD11b+DC1”和“CD103+DC2”，以便于辨别和论述。
F4/80高CD24低区室的解析还示出通过CD11c和CD11b的差异表达鉴定的两种类型的巨噬细胞。CD11c低CD11b高(以前的“TAM1”)和CD11c高CD11b低细胞(“TAM2”)看似广泛地对应于类似描述的MHCII高和MHCII低群体(Movahedi等人，2010)(也参见图5c)。虽然CD11c，或者‘原型(protoypical)’DC标记物，在DC上最高，它在TAM2中高度表达，并以较低程度在TAM1中表达(数据未显示)。这些群体存在于所有检查模型中，尽管每个群体的流行程度及其明确区分的能力略有不同(图1A至图1B，并且数据未显示)。因此，我们将们的谱系和功能研究应用于自发(PyMTChOVA)和异位肿瘤模型(B78ChOVA)的一个实例，除非另有说明。
针对这些群体中的每一个，评估来自肿瘤的mCherry负载和保留。这表明摄取高细胞在前一次报告中局限于肿瘤边缘，然后仅用CD11c鉴定(Engelhardt等人，2012)，被最佳地捕获于TAM1和TAM2门中(图1c，并且数据未显示)。相比之下，CD11b+DC1和CD103+DC2摄取或保留较少mCherry，而一些单核细胞但少数嗜中性粒细胞表现出适度的抗原负载迹象。
CD11b+和CD103+DC亚群已经在许多外周小鼠组织内发现，并且它们的对应物已被鉴定在外周人组织内，如分别由BDCA1和BDCA3的表达定义的(Dzionek等人，2000；Haniffa等人，2012)。我们发现使用这些标记物也能在人类转移性黑色素瘤样品中进行等同的TAM/DC区分(图1D)。代表所有TAM的CD16-HLADR+CD11c+CD14+细胞不同于CD16-HLADR+CD11c+CD14-DC群体，其继而通过BRCA1(“DC1”)和BDCA3(“DC2”)的差异表达解析。小鼠模型(图1E)和人黑素瘤活检组织(图1F)的共同特征是CD11b+/BDCA1DC1和CD103+/BDCA3DC2群体的存在并且罕见，其中DC2特别稀疏。
实施例3：肿瘤DC和巨噬细胞的蛋白质和转录描述。
为了验证我们的门控策略，我们应用了ImmGen consortium定义的抗体组(Gautier等人，2012；Miller等人，2012)。与我们排布的“DC”一致，CD103+DC2表达CD135(Flt3)、CD117(cKit)和CD26，而两种TAM群体都不在B78chOVA和PyMTchOVA模型中。(图2A，并且数据未示出)。令人吃惊的是，CD11b+DC1不表达可检测水平的DC标记物，并且实际上更多地使用TAM1和TAM2，通过表达包括CD206、CD64和MerTK在内的若干种“巨噬细胞”标记物来分离(图2B，并且数据未显示)。然而，CD11b+DC1轻度表达CD301b和PDL2，CD301b和PDL2两者都已经用于定义皮肤中发现的IRF4依赖性“DCTh2”群体(图2C，并且数据未显示)(Gao等人，2013；Kumamoto等人，2013)。
为了进一步描绘这些APC，我们使用RNA测序分析了来自B78chOVA肿瘤的分选细胞的基因表达谱。如图2D所示，基因框明显地分离成四个群体，其中通过PCA分析，TAM1、TAM2和CD11b+DC1最相似(图2E)，而CD103+DC2最不同。在最差异化表达的基因中，定义DC谱系的转录因子Irf8(Tamura等人，2005)和Zbtb46(zDC)(Meredith等人，2012)分别对于单独的CD103+DC2或两种DC是特异性的，而Irf4适度富集于CD11b+DC1中，所有这些都通过RT-qPCR验证(图2F)。这还通过对IRF4/8进行细胞内流式细胞术在蛋白质水平上得到了证实(图2G，并且数据未显示)。所有群体表达Myb，其指示造血干细胞来源，而不是来源于从卵黄囊分离的组织前体(Schulz等人，2012)。在PyMTchOVA模型中复制了关键转录因子的独特表面表型和表达(数据未显示)。
由于这些肿瘤内群体可能通过不同的肿瘤特异性机制产生，并且不像它们在一些常规组织内那样依赖于这些转录因子，所以我们使用敲除或转录因子驱动的白喉毒素受体(DTR)小鼠研究Irf8、Irf4、Batf3和zDC依赖性。由于将这些等位基因繁殖为自发模型的的变化和长度，所以我们利用了各种异位肿瘤。通过使用异位PyMT乳腺肿瘤模型，我们发现Irf8的丧失特异性消融了CD103+DC2，但不影响TAM1或TAM2，并且可能由于补偿而适度地富集CD11b+DC1的百分比(图3A)。相反，由CD11c-Cre(Williams等人，2013)驱动的Irf4的条件性消除导致B78chOVA模型中CD11b+DC1的特异性减少，而在B78chOVA模型中的其它细胞几乎没有变化(图3B)。与RNA测序数据一致，Batf3缺陷型动物在B78chOVA模型中也缺乏肿瘤CD103+DC2群体，而对CD11b+DC1、TAM1或TAM2比例没有影响(图3C)。最后，当使用zDC驱动的DTR等位基因时，我们有些出乎意料地发现，在B78chOVA肿瘤中，CD103+DC2特异和显著降低，而CD11b+DC1或TAM1/TAM2群体几乎没有，或没有发生变化(图3D)。这可能代表DTR等位基因的变异，或zDC表达的微妙但显著的变化。综合起来，我们得出结论，与CD11b+DC1和肿瘤中高度丰富的TAM1/TAM2相比，CD103+DC2代表一种不同的APC谱系。
实施例4：CD103+DC2由不同细胞因子编程。
APC从骨髓(BM)前体衍生，并且其取决于特异性细胞因子而分化为DC/巨噬细胞亚群。为了确定分化成这些群体的驱动细胞因子，我们通过qPCR查询模型中的集落刺激因子(CSF)受体表达。然而Csf1r(M-CSFR)仅在TAM1、TAM2和CD11b+DC1中发现，Csf2rb(GM-CSFR)仅在DC1和DC2亚群中表达，而Csf3r(G-CSF)在所有细胞中都不存在(图4A)。通过使用中和抗体治疗或荷有异位肿瘤的细胞因子受体缺陷型小鼠，我们在功能上测试了肿瘤中APC的CSF细胞因子依赖性。
虽然TAM1和TAM2细胞严重依赖于CSF-1进行维持，如先前所示(Wyckoff等人，2004)，但是CD11b+DC1和CD103+DC2群体与CSF1独特无关(图4B)。对于使用细胞因子受体缺陷型小鼠，我们开发了一种同源过继转移模型，由此将粒细胞巨噬细胞祖细胞(GMP)转移到荷有异位肿瘤的宿主体内，并在BM、脾脏和肿瘤中跟踪再增殖(图4C)。在肿瘤GMP来源的细胞遍布所有骨髓区室时，确认CD11b+DC1、CD103+DC2、TAM1和TAM2的GMP来源(图4D)。通过使用具有竞争性转移的GMP过继***，我们发现Csf2rb-/-细胞的选择性去能不能在肿瘤中重建DC不足，这里DC定义为使用CD24+CD11c+门控的DC1/DC2的总和。我们发现对TAM1和TAM2再增殖没有影响，表明肿瘤DC发育对CSF2(GM-CSF)的独特需要(图4E)，而四种APC中的任何一种中都没有发现对CSF-3的需要(数据未显示)。
由于DC由GM-CSF或FLT3-配体(FLT3L)原型驱动，所以我们使用经工程化以表达GMCSF或FLT3L的B16黑素瘤肿瘤模型来评估在肿瘤中驱动DC群体的细胞因子充足性。虽然肿瘤表达的GMCSF显著地偏移了CD11b+DC1的比例，但是表达FLT3L的肿瘤驱动了罕见CD103+DC2在肿瘤中的独特扩增(图4F)。
实施例5：CD103+DC2的独特抗原处理和呈递能力
在建立了不同APC的谱系需要后，我们评估了它们发起、参与和维持T细胞应答的能力。为了在抗原加工、呈递和共刺激方面解析细胞，我们使用来自图2的RNA测序数据分析参与这些途径的基因的转录物和蛋白质水平。广泛的潜在APC功能的差异很大(图5A)。值得注意的是，尽管参与调节T细胞应答的分子(包括CD80、CD86和2B4)的表面水平在各群体之间是相当的，但是CD103+DC2显示出与预期将增强T细胞相互作用的提高的交叉呈递、增强的共刺激和的趋化因子表达增大一致的不同转录签名(图5A、图5B，并且数据未显示)。除了在CD103+DC2上MHCI轻微减少之外，APC之间的MHCI和MHCII表达没有显著差异(图5C)。然而，与TAM1/TAM2相比，在CD103+DC2中观察到了吞噬能力的显著差异，如通过对异位肿瘤的离体葡聚糖摄取外源性测量的(图5D)。
由于DC成熟和吞噬能力往往负相关，我们假设CD103+DC2的吞噬能力下降可能对应于具有增大的抗原交叉呈递的更成熟DC(Guermonprez等人，2002)。DC中抗原的有效交叉呈递依赖于Nox2来调节吞噬体pH，从而防止对T细胞肽的破坏。在这项工作之前，这先使用比较吞噬作用后的pH敏感荧光团和pH不敏感荧光团的细胞内荧光强度的比例分析法进行测定(Savina等人，2006)。我们由此生成了表达pH敏感GFP(pHluorin，在低于pH 6.5下猝灭)和pH不敏感的荧光团(mCherry)的融合体的B78(黑素瘤)肿瘤细胞系。通过分析每个群体的mCherry+区室内的单独pHluorin强度，我们发现只有‘DC’群体在碱性(荧光)环境中维持pHluorin；比较pHluorin和mCherry信号的比率显示，CD103+DC2维持最基本的内吞区室，而TAM1和TAM2群体表现为高度酸性并因此表现出降解性吞噬途径(图5E)。除了增大的CD103+DC2的碱性吞噬体腔外，这些细胞还表现出对促炎性细胞因子IL-12的不同表达并且不含抗炎性IL-10(图5F、图5G，并且数据未显示)。总之，所有这些特征表明CD103+DC2高度偏向(highly poised)于至CD8+T细胞的有效抗原交叉呈递。
实施例6：CD103+DC2是初始CD8+T细胞和经活化的CD8+T细胞的优良刺激剂。
先前，我们发现，摄取抗原的骨髓聚集体能够刺激直接从肿瘤获得的初始但未激活的CD8+T细胞(Engelhardt等人，2012)。然而，基于CD103+DC2的独特交叉呈递表型，我们试图测试从肿瘤新鲜分离的每个群体的T细胞刺激能力。在与卵清蛋白特异性OT-I CD8+T细胞共培养12小时后，CD103+DC2群体是唯一能够稳健诱导TCR信号传导的群体，如通过初始OT-I CD8+T细胞和先前激活的OT-I CD8+T细胞中的早期T细胞激活标记物Nur77和CD69的上调所证明的。重要的是，这在异位和自发小鼠模型中是一致的(图6A，并且数据未显示)。染色标记的OT-I CD8+T细胞的继续共培养显示，CD11b+DC1和CD103+DC2群体是初始CD8+T细胞增殖的最稳健的刺激物，并且证明了先前在吞噬肿瘤骨髓细胞中鉴定的几乎所有的刺激能力特异性地位于这些DC内(图6B至图6C，并且数据未显示)。有趣的是，CD103+DC2独特地能够诱导已建立的CTL的强增殖，CTL的强增殖不被其它群体刺激，这表明CD103+DC2是肿瘤中CTL的优良交叉呈递刺激物(分别为图6D至图6E，并且数据未显示)。
最终，当在总肿瘤分离物中处于其通常低频率下时，CD103+DC2仍然不能驱动CTL的增殖(数据未显示(Engelhardt等人，2012))。此外，APC亚群中没有一个诱导CD4+T细胞从肿瘤直接增殖。(图6F至图6G，并且数据未显示)。然而，外源肽确实恢复了DC1和DC2刺激增殖的能力，这表明这些DC可能不是固有地不能用于CD4T细胞刺激(数据未显示)。最重要的是，这鉴定了CD103+DC2在肿瘤内摄取、加工和交叉呈递肿瘤抗原以稳健刺激CTL的独特能力。这挑战了肿瘤只包含弱或抑制性骨髓群体的简单概念。
实施例7：通过活体成像显示的CD103+DC2定位和T细胞相互作用。
鉴于罕见的CD103+DC2刺激T细胞的独特能力，我们试图了解这些细胞在肿瘤内的空间结构及其与T细胞的体内和体外相互作用动力学。为了在体内将活体自发性肿瘤中的这些群体区分开，将PyMTchOVA等位基因杂交到Cx3cr1-eGFP和Cd11c-mCherry等位基因上，从而在骨髓区室中产生三种独特的荧光群体(数据未显示)。两个DC亚群(DC1/DC2)被特别标记为红色(仅CD11c-mCherry)，而TAM1和TAM2群体分别为绿色(仅Cx3cr1-eGFP)和黄色(CD11c-mCherry和Cx3cr1-eGFP)。通过使用这种荧光方法，使用2-光子活体成像，我们观察到TAM1和TAM2群体优先在肿瘤病灶上紧密边缘化。这个区域是我们以前发现T细胞被优先捕获的区域(Engelhardt等人，2012)。相比之下，发现红DC亚群通常在远离肿瘤病灶的分离的富含胶原蛋白的区域中，占所有远端定位APC的高达约70％(图7A，并且数据未显示)。
由于这种方法在肿瘤灶的边缘区域中不能完全区分CD11b+DC1和CD103+DC2细胞，所以我们试图确定少数红色DC是否可能优先仅代表一个或另一个亚群。为了在原位描绘亚群，我们利用活肿瘤切片成像，用抗CD11b抗体染色。使用这种方式，我们可以在红色/绿色荧光报告物的存在下将CD11b+DC1与CD103+DC2亚群原位区分开，并且发现CD11b+DC和CD11b-DC都存在于这些位置(数据未显示)。我们得出结论，虽然TAM通常代表肿瘤边缘的主要细胞类型，但仍然可以在那里发现pro-CTL刺激性APC，尽管数量非常少。
我们先前的数据表明，外来的CTL参与在肿瘤边缘的阻滞行为，并且我们试图确定这些可能发生于DC或TAM，还是两者中。通过将Actin-CFP标记的OT-I CD8+T细胞过继转移到自发的荷有乳腺肿瘤的小鼠中，进行活体成像或活体切片成像，在红/绿报告***中分析体内T细胞动力学。我们观察到稳定的T细胞相互作用主要局限于肿瘤边缘，如先前所述(Boissonnas等人，2013；Engelhardt等人，2012)(图7B，并且数据未显示)。虽然TAM1相互作用主导了所评分的所有相互作用，但DC和TAM2也很好地表现为T细胞停滞的。这表明，在肿瘤近端区域中的DC1/2不能或物理地排除出参与肿瘤内的T细胞结合，但确实提出了一个根本性的问题：是否本身更能够结合T细胞。
为了解答这个问题，我们将APC选择从组织和经消化肿瘤的物理限制中分离出来，制备单细胞悬浮液并导入体外激活的OT-ICTL，使它们形成抗原特异性偶联体。然后，我们通过流式细胞术定量化T细胞占据每个APC群体的百分比。这显示OT-I T细胞优先与CD103+DC2和TAM1/2亚群偶联(图7C，左小图)。然而，由于TAM1/2的高频率，大多数T细胞-APC偶联体是由TAM1/2细胞形成的(图7C，右小图)。我们得出结论，DC2有助于肿瘤中的T细胞相互作用，并且当存在于边缘附近时能够竞争T细胞占位(occupancy)。
实施例8：罕见的肿瘤CD103+DC2允许有效的过继性T细胞治疗。
我们惊奇地发现，与完全侵袭和外生细胞系EG7.1相比，在自发消退的EG7肿瘤细胞系(在下文中称为EG7.2)中，CD11b+DC1和CD103+DC2的比例几乎翻转。虽然侵袭生长的细胞系维持了我们在所有其它侵袭性肿瘤中观察到的DC的相对比例(数据未显示)，但自发消退模型包含非常高数量的CD103+DC2(数据未显示)。我们还观察到Irf8KO肿瘤模型中肿瘤生长的增大，所述模型缺乏CD103+DC2，但不是Irf4条件型KO模型(数据未显示)。这些一起表明，DC2肿瘤丰度可在肿瘤控制中起重要作用，然而外生差异可能代表这些细胞系中的许多差异，超出其骨髓细胞群体及其刺激CTL的能力。因此，为了正确测试CD103+DC2是否是有效的CTL介导的肿瘤消退所必需的，我们转而使用外生EG7.1肿瘤模型，并对活化的肿瘤特异性T细胞进行过继性T细胞治疗以分析消退(Helmich和Dutton，2001)。我们在zDC-DTR小鼠中进行了这些实验，这使我们能够特异性消融肿瘤中的CD103+DC2(图3D)。为了隔离CD103+DC2对肿瘤部位的影响并消除LN致敏的任何影响，我们专门设计了包括以下两种策略的实验：(1)使用活化的OT-I CD8+CTL母细胞，其不需要在LN中致敏并且通常不在那里运输(traffic)，以及(2)使用SIP1R拮抗剂FTY-720处理动物，其防止向LN运输的罕见转移的CTL T细胞离开LN。单独FTY720的作用对转移的CTL介导肿瘤消退具有最小影响(数据未显示)。然而，我们发现，在FTY-720情境下，CD103+DC2的消融对于CTL介导有效的肿瘤消退的能力有显著的影响，大大减缓了T细胞介导的肿瘤消退(图8A)。
实施例9：肿瘤内CD103+DC2丰度的签名预测人癌症的结局。
为了确定CD103+DC2丰度的关键作用是否转化到人肿瘤中，我们利用了TCGA阵列数据(Cancer Genome Atlas Research等，2013；Hoadley等人，2014)，所述TCGA阵列数据定量化了来自具有匹配结局数据的许多人类癌症类型的相对基因表达。我们使用我们的RNA测序数据来选择指示CD103+DC2的高水平转录物，并且还选择了指示TAM1/TAM2/CD11b+DC1细胞但缺乏CD103+DC2的基因亚群(分别是图8B顶部和底部的基因)。我们鉴定了这些小鼠基因的人同源物，并测定了来自所有癌症类型的患者TCGA数据中这些“特征”的表达，以评估预后关联。在比例风险存活分析中，针对作为协变量的癌症类型调整模型，我们观察到，来自这些群体的个体基因只有适度的预后益处(表示为危险比率(HR))。然而，当我们定义CD103+和CD103-基因表达数据的比率并将其用作Cox分析中的连续变量时，观察到与存活率增大的高度显著关联性(BH p＝0.00019)(图8B)。
所述分析显示，我们鉴定的细胞类型，在以其相反功能成比率时，产生非常强的人癌症结局预后值。将此‘特征’与其它先前描述的‘免疫评分’进行比较显示，与对TCGA数据的其它当前分析(包括基于总T细胞丰度的那些(Palmer等人，2006)，以及CD8T细胞与巨噬细胞的体积比(CD8/CD68，DeNardo等人，2011))相比，CD103+/CD103-基因的比例提供了最强的促免疫存活信号(图8C)。我们的评分还有利地通过相反预后，对与不良结局相关的那些免疫评分进行了比较。还应注意的是，这些患者肿瘤中的CSF-1表达也与CD103/BDCA3基因比率量度反相关(anti-correlate)，尽管它与总肿瘤Flt3L水平也类似地反相关(数据未显示)。
最后，我们试图分析个别癌症类型中的TCGA数据。针对癌症类型调整，所述数据集中所有12种癌症的卡普兰-梅耶(K-M)曲线图示出肿瘤中具有高CD103+/CD103-基因表达谱的的总体益处(图8D；并且数据未显示)。这种关联的程度在乳腺癌。头颈鳞状细胞癌和肺腺癌中特别显著(图8E至图8G)。总体而言，这代表了意想不到的强免疫签名，如果其完全来源于小鼠肿瘤模型中的经验免疫印迹分析，则结果更是如此。
实施例10：实施例11的材料和方法。
黑色素瘤生物信息学分析
在评估签名和评估与存活率的关联(Cox比例风险)之前，在R语言环境中通过分位数归一化预处理黑素瘤数据集GSE19234(n＝44)。Bogunovic,D.等人Immune profile andmitotic index of metastatic melanoma lesions enhance clinical staging inpredicting patient survival.Proc Natl Acad Sci U S A 106,20429-20434(2009)。SDC/NSM的比率签名计算为SDC基因的平均表达量除以NSM基因的平均表达量的对数，然后进行z-分数标准化(平均值＝0，标准偏差＝1；基因列表在图1A中)。采用Cox比例风险模型进行存活率分析。在使用Benjamini-Hochberg方法针对多重比较进行调整后，使用对数秩p值来评估显著性。使用R语言的Survival程序包产生20卡普兰-梅耶生存率曲线，并且我们使用33％、50％(中值)或66％的SDC值或SDC/NSM比率签名，将每个样品分类为‘高’或‘低’。
患者和样品
如果患者经组织学证实患有IV期或III期不可切除的转移性黑素瘤，则募集入本研究。根据UCSF IRB批准的方案(UCSF CHR13-12246号)，患者知情同意组织收集。所述研究募集期从2012年12月至2015年2月。患者用以下PD-1/PDL-1轴阻滞单克隆抗体治疗：派姆单抗(pembrolizumab)(Keynote 001、002、006，或记名供药计划，或商业供应)或纳武单抗(商业供应)。皮肤/皮下肿瘤通过钻孔(4mm或6mm)、手术切除(样品K10)取活检组织，并且所有其它肿瘤活检组织进行核心活检(16g或18g)。另外发送一个样品用于病理学评估。在输注抗PD1之前收集活检组织(n＝21)。将新鲜的活检样品立即置于无菌容器中的盐水浸泡的纱布上，置于湿冰容器中，并运送至实验室进行评估。所有的应答评估使用Solid Tumors 1.1版(RECIST)中的应答评估标准进行放射成像。完全应答被定义为所有靶和非靶病灶的完全消退，部分应答被定义为靶病灶>30％消退、无新出现的病灶，稳定性疾病被定义为靶病灶大小≤30％降低或≤20％增大。进行性疾病的定义是靶病灶增大≥20％，出现大小>1cm的新病灶。具有完全或部分应答的患者被归类为“应答者”，而具有稳定疾病或进行性疾病的患者被归类为“无应答者”。在临床确定进展(例如新病灶)而没有受益于随访扫描的情况下，将患者分类为应答者，并将RECIST表示为‘x’。
人组织消化
将组织用外科手术剪大力切碎，转移至带有磁力搅拌棒的25ml锥形瓶中，每0.3g组织用3mg/ml胶原酶A(Roche)和50U/ml DNA酶I(Roche)在37℃以及5％CO2和持续搅拌下1小时。然后将样品滤过70um过滤器，离心沉降并重悬以进行染色。Ruffell,B.等人，Leukocyte composition of human breast cancer.Proc Natl Acad Sci U S A 109,2796-2801(2012)。
流式细胞术和抗体克隆
所有抗体购自BD Pharmingen、eBioscience、Invitrogen、BioLegend、UCSF杂交瘤核心，或是在Krummel实验室中生产的。为了表面染色，将细胞与人抗Fc受体抗体混合物(克隆3G8、FUN-2和10.1，BioLegend)一起孵育，并在PBS+2％FCS+2mM EDTA中用抗体在冰上染色30分钟。通过用可固定的Live/Dead Zombie NIR或Aqua(BioLegend)进行染色来评估活力。所有流式细胞术均在BD Fortessa流式细胞仪上进行。流式细胞术数据的分析是使用FlowJo(Treestar)软件进行的。细胞分选是使用BD FACS Aria II进行的。
抗人抗原的小鼠抗体：CD45克隆Hl30、CD3e克隆OKT3、HLA-DR克隆L243、CD56克隆CMSSB、CD19克隆H1B19、CD14克隆61D3、CD16克隆CB16、CD11c克隆3.9、BDCA1克隆L161，以及BDCA3克隆AD5-14H12。
细胞系和细胞培养
B78ChOVA是通过标准转染程序产生的B78的变异细胞系，其中Ch-OVA融合构建体与用于产生PyMTchOVA细胞系的构建体同一。Graf,L.H.,Jr.,Kaplan,P.和Silagi，S.Efficient DNA-mediated transfer of selectable genes and unselectedsequences into differentiatedand undifferentiated mouse melanomaclones.Somatic cell and molecular genetics 10,139-151(1984)和Engelhardt、J.J.等人Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-presenttumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.Cancer Cell 21,402-417(2012)。简单地用青霉素，链霉素和谷氨酰胺在经组织培养处理的塑料平板上，在DMEM加10％FCS中于37℃下使用5％CO2培养贴壁细胞，并每隔一天进行一次细胞分离。将悬浮细胞在组织培养T25和T75烧瓶中的RPMI-1640加10％FCS和Pen/Strep/Glut中培养，每隔一天进行一次细胞分离。
小鼠肿瘤
将所有小鼠均保持在SPF条件下，并按照NIH和美国实验室动物护理协会标准进行治疗，并符合IACUC UCSF规程。
收获肿瘤细胞系并用PBS洗涤3次，然后以1:1的比例与生长因子减少的基质胶(BDBiosciences)混合，最终体积为50ul。将十五万个肿瘤细胞皮下注射于剃毛右侧，并允许生长14至21天。
小鼠品系
为了调控肿瘤中骨髓细胞的群体，从Simonsen购得野生型C57BL/6，并从SImonsen购得Zbtb46–DTR C57BL/6小鼠。Meredith,M.M.等人，Expression of the zinc fingertranscription factor zDC(Zbtb46,Btbd4)defines the classical dendritic celllineage.J Exp Med 209,1153-1165(2012)。按照使用8周龄接受致死辐射(2次给药，每次5.5Gy)和2至5×106个Zbtb46-DTR BM细胞的C57BL/6雄性受体的标准方法产生Zbtb46-DTRBM嵌合体。保持饲喂小鼠抗生素水4周，并在重建后8周用于实验。
肿瘤生长
对于肿瘤生长曲线，在指定的时间段内，用电子游标卡尺测量肿瘤面积(mm2)为肿瘤宽度×肿瘤高度。
白喉毒素、抗PD-1和抗CTLA-4治疗
白喉毒素购自Sigma-Aldrich。对于瞬时白喉毒素消融，向DTR小鼠腹膜内注射20ng白喉毒素/克体重，并在DT注射后24小时将小鼠安乐死以用于分析。对于长期消融，小鼠最初腹膜内注射20ng/g DT，然后每三天保持注射4ng/g，直至达15天。
纯化的抗PD-1(克隆RMPI-14)和抗CTLA-4(克隆9H10)购自BioXcell，并在肿瘤生长第5天、第8天和第11天以100ug每种抗体腹膜内注射三次以作为联合疗法。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。除非另有说明，否则所有数据都代表>3次独立实验。误差条表示使用Prism从一式三份的实验条件计算的S.E.M.。所使用的具体统计学检验是配对和非配对的T检验，并且小于0.05的所有p值被认为具有统计学显著性。
实施例11：肿瘤内BDCA3+DC预测人黑素瘤中抗PD1检查点治疗的结局。
肿瘤内APC的表型上是非常多样的，并且骨髓***贡献了多个类似于巨噬细胞和树突细胞的群体。然而，长期以来一直怀疑虽然“巨噬细胞”对肿瘤进展有抑制作用(DeNardo等人和Hanada等人)，但是也许肿瘤内的树突细胞是刺激性的(Sandel等人)。由于缺乏这些细胞类型之间的明确区别，已经严重阻碍了用来明确详细了解此方面的努力。最近，我们结合RNA测序进行了高维流式细胞术，以区分颅内骨髓细胞。我们发现，确实，交叉呈递树突细胞中的少量群体对于CTL是高度刺激性的，但是其它真正的“树突细胞”亚群以及非常丰富的巨噬细胞群体未能刺激肿瘤-抗原反应性CD8T细胞。在小鼠体内通过表达整联蛋白CD103并在人体内通过表达CD141/BDCA3，定义罕见的刺激性树突细胞(SDC)(Broz等人)。
为了专门解决这些罕见的免疫刺激DC群体在人黑素瘤中的作用，我们最初利用两个‘特征’基因组，与所有剩余的非刺激性骨髓(NSM，包括巨噬细胞和非刺激性DC)抗原呈递细胞亚群相比，所述基因组的RNA极丰富地富集于小鼠SDC中，或相反地所述基因组在NSM中优先表达(图9A)。然后我们查询了44个转移性黑色素瘤患者的经很好注释的数据集，其中包括RNA表达分析、肿瘤有丝***指数、疾病临床分期和转移性黑素瘤患者的存活率(Bogunovic等人)。我们对RNA丰度进行了分析，分析了单独SDC基因，所有SDC基因的平均值或SDC/NSM基因的比例。后两者可分别被认为是整体SDC丰度和相对SDC/NSM细胞丰度的量度(Broz等人)。
在9个SDC签名基因中，7个具有显著的预后益处，以风险比(HR)表示(下表1)，且SDC签名和SDC/NSM比率签名都具有非常显着的预测价值。
基因/签名 系数 p值 BH p值
MYCL -1.763 6.20E-05 0.0008519
所有SDC基因 -1.379 8.52E-05 0.0008519
BTLA -1.114 0.0002445 0.001834
SDC/NSM比率 -3.26 0.0005485 0.002742
FLT3 -1.176 0.0008321 0.003492
CCR7 -0.4115 0.0009313 0.003492
IRF8 -0.373 0.005329 0.01776
BATF3 -0.6643 0.02956 0.08062
XCR1 -0.732 0.0372 0.093
为了更好地可视化这些预后关联，产生SDC基因或SDC/NSM比率的卡普兰-梅耶(K-M)图，其中患者被分组为‘高’或‘低’签名表达，其中增长严格分割点为33％、50％或66％的分组表达阈值(图9B、图9C)。这些分析表明当选择最高水平的表达时，存活的可能性增大；SDC或SDC/NSM肿瘤的前33％从癌细胞转移时开始具有最统计意义上显著的存活率增长。这支持了这样的假设：即使在没有治疗的情况下，肿瘤中刺激性BDCA3+DC的增大的丰度也更好地支持存活。
在考虑这种关系与T细胞免疫之间的关系时，我们进一步利用了关于成型肿瘤中TIL丰度的经验证信息，将SDC和SDC/NSM签名相关联，以解析关于TIL浸润的数据。所述分析显示(图9D至图9G)，TIL类别的基于类别的量度和肿瘤周围CD3+T细胞数量的量度与SDC基因签名高度相关，并且与SDC/NSM比率具有较低但仍然非常显著程度的相关性。
这些关系表明SDC丰度、T细胞功能和总体存活率之间存在相互关系。我们试图查询这种关系，因为它可能与检查点阻滞有关。但是，由于SDC和SDC/NSM签名只是群体本身的替代，我们试图在检查点治疗的临床试验背景下直接从黑素瘤活检组织内测量这些群体，以了解其相关性。
为了测试这一目的，我们使用流式细胞术分析了来自21例转移性黑素瘤患者活组织检查样品的肿瘤活检组织，然后追踪了其对抗PD-1治疗的应答进展。在21例患者中，5例为女性，16例为男性，平均年龄为61.6岁，并且活检组织取自各种位置和组织(图10A)。对于这些患者中的每一个，活检组织经酶消化并通过流式细胞术分析以定量化肿瘤中免疫细胞浸润的比例。我们设计了一个全面的流程面板，使用标记物CD45、HLA-DR、CD3、CD19、CD56、CD11c、CD11b、CD85g、CD14、BDCA1和BDCA3来详细分析人骨髓浸润。通过使用这些标记，我们能够进行性地门控这些肿瘤的免疫区室，以鉴别BDCA3+DC、BDCA1+DC、CD14+TAM和CD14–TAM亚群(图10B、图10C)。并且我们发现了具有大量BDCA3+SDC群体的患者(图10B)，以及具有显著较少BDCA3+SDC群体的那些患者(图10C)。肿瘤在CD45+细胞浸润的总量和表达HLA-DR的细胞比例方面也有明显变化(图10D)。大多数黑素瘤在淋巴细胞(‘谱系’)的总体丰度方面是高度富集的(图10E)。并且当HLA-DR+细胞被解析为，如图10C/D所示，骨髓亚群时，这些细胞也表现出在患者活检组织内的非常显著的异质性(图10E)。
为了检查这些免疫性髓细胞浸润与患者应答的关联，我们将患者解析分组为‘无应答者’(定义为稳定疾病或进行性疾病)或‘应答者’(定义为对抗PD-1治疗的部分或完全应答)(参见图10A和方法)。通过这种方法，在应答和无应答患者之间的总CD45+免疫细胞浸润的百分比没有显著差异，并且实际上两组之间具有相似的CD45+细胞平均百分比，以及围绕所述平均值的相似变异性(图11A、图11B，并且数据未显示)。类似地，在淋巴细胞总体频率和结局之间没有明显的关系(数据未显示)。相比之下，当应答组的BDCA3+DC定量为总免疫细胞(在CD45+细胞上设置门控，图11C至图11D)或总APC(在HLA-DR+细胞上设置门控，数据未显示)的比例时，则抗PD-1应答患者在其肿瘤中具有统计学上显著的较高频率的BDCA3+DC。总之，这些发现表明，虽然肿瘤的总免疫细胞浸润并不能预测免疫疗法的应答性，但是可能是因为总CD45+群体在TME中同时具有促肿瘤和抗肿瘤作用，所以刺激性BDCA3+DC的比例实际上可以预测抗PD-1的免疫功效。虽然BDCA3数量相对较少的应答者有明确的实例，但绝对截断超过2％的HLA-DR+可以使用所述样品大小提供应答者状态的95％置信度。
我们试图进一步检查这些数据，以了解这一积极关系是否可以通过考虑剩余骨髓群体的精确特性来进一步改善；特别是CD14+TAM，或用BDCA1标记的替代DC群体，或CD14-TAM的丰度。我们根据个别患者的BDCA3+细胞的百分比对照每个患者来绘制个别患者的曲线图，并各自根据应答者状态编代码。虽然应答者仍然被解析到此曲线的BDCA3+高区域，但我们发现在其它群体方面没有明显的趋势(图11E至图11G)。同样，这些发现表明，BDCA3的存在是能够提高坚实的抗肿瘤应答的强指标，但其它因素可能在允许少数患者应答方面起作用，尽管应答水平较低。未来研究应重点关注BDCA3+细胞的肿瘤内定位来作为可能的解释；目前，我们所掌握的抗体表现不佳，因此需要开发抗体以用于未来的研究。
已经建立了BDCA3+DC丰度与对免疫治疗的应答性之间的强关联，我们讨论了这种关联是否代表了这种刺激性DC群体对检查点阻滞疗法的功能性需要，或者简单地表示了应答性的‘签名’。为了测试这一点，我们转而使用黑素瘤易感(tractable)小鼠模型B78chOVA细胞系7，其是B16黑素瘤的经修饰变体，表达mCherry荧光蛋白和卵清蛋白。结合所述肿瘤模型，我们使用Zbtb46-DTR BM嵌合小鼠，所述小鼠我们之前已经展示为可以优先消融(CD103+)SDCs(Broz等人)。在我们所掌握的小鼠模型中，使用抗PD1的单药治疗对黑素瘤无效。因此，我们使用消融模型来检查CD103+SDC的消除是否阻断抗PD-1和抗CTLA-4的联合免疫治疗方案的功效(图12A)。Zbtb46-DTR BM嵌合体小鼠在第5天、第8天和第11天使用三次给药的治疗方案，用抗PD-1和抗CLTA-4或用同种型匹配的对照抗体处理，或者在所述天用DT或者PBS注射，并且我们确认，单独的DT处理对所述模型中的肿瘤生长没有影响(数据未显示)。我们发现，虽然未经治疗的黑素瘤肿瘤逐渐外生，但用联合免疫疗法治疗的那些在7至8天后迅速消退，并且在第15天几乎完全根除(图12B、图12C)。相比之下，当在这种强效免疫疗法的情境下，消除小鼠的CD103+DC时，快速的肿瘤消退丧失，并且二联疗法的功效被消除，这表明免疫治疗作用对CD103+DC的功能性需要(图12D)。
此，我们已经在小鼠和人肿瘤组织内建立了特定SDC(CD103+或BDCA3+)群体的强预测和预后益处。一般来说，这些发现进一步凸显了充分了解肿瘤组织的免疫景观(immunelandscape)的重要性，如先前的研究(DeNardo等人和Fridman等人)中所揭示的。‘免疫评分’(Ascierto等人)正在被认可为针对若干种癌症的新型诊断标记；然而，超越这一点，我们的研究揭示了对人肿瘤进行越来越详细的免疫印迹分析的必要性，以鉴定可调节微环境中T细胞的罕见免疫细胞群体。分层将需要使用对在初级研究中显示的签名的持续精修，随后开发适合于活检的测试，并且我们的研究强调在未来，例如通过质子离子束技术进行的高维度成像可以表示一种此类方法(Angelo等人)。
实施例12：以下实施例的材料和方法。
肿瘤消化
从小鼠解剖肿瘤，然后测定所取出的肿瘤组织的总重量。然后将肿瘤用外科手术刀切碎，然后每0.3g肿瘤重量用来自5mg/ml储备溶液的20ul/ml释放酶TL(Roche)和200mg/ml DNA酶I(Roche)在50ml锥形瓶中消化30分钟，置于具有5％CO2的37℃振荡器中。30分钟后，将肿瘤滤过70um的细胞过滤网，活细胞以Ficoll Paque Plus(GE)密度梯度富集。从界面收集活细胞，并洗涤到染色缓冲液(PBS+2％FCS+2mM EDTA)中。
小鼠骨髓和脾脏分离
取出股骨和胫骨，并用PBS/2％FCS/2mM EDTA和25G针头/注射器将骨髓挤出。从小鼠解剖脾脏并使用外科手术刀切碎。将组织碎片在37℃振荡器中的50ml锥形中用500U/ml胶原酶IV(Worthington)、100U/ml胶原酶I(Worthington)和200mg/ml DNA酶I(Roche)消化。然后将消化的组织滤过70um细胞过滤网。用0.8％NHCl4裂解骨髓和脾脏中的红细胞5分钟，然后洗涤到染色缓冲液(PBS+2％FCS+2mM EDTA)中。
人肿瘤样品
用外科手术剪将组织大力切碎，转移至50ml锥形瓶中，每0.3克肿瘤重量用来自5mg/ml储备溶液的20ul/ml释放酶TL(Roche)和200mg/ml DNA酶I(Roche)在37℃以及5％CO2和持续搅拌下消化30分钟。然后将样品滤过70um过滤器，离心沉降并重悬以进行染色(Ruffell等人，2012)。对于所有人样品，获得了所有受试者的知情同意，并且工作是根据IRB批准(IRB编号13-12246，12/06/2013-12/05/2014)进行的。
流式细胞术和抗体克隆
所有抗体购自BD Pharmingen、eBioscience、Invitrogen、BioLegend、HumanProtein Atlas，或在Krummel Lab或Precision Immune Inc.中生产。为了进行表面染色，将细胞与抗Fc受体抗体(克隆2.4G2)以及500nm人IgG1Fc一起孵育，然后用在PBS+2％FCS+2nM EDTA中的一级抗体在冰上染色30分钟。随后在PBS+2％FCS+2mM EDTA中洗涤2次，然后在冰上用合适的二级抗体染色30分钟。通过用可固定的Live/Dead Zombie Aqua(BioLegend)或Zombie NIR或DAPI染色来评估活力。所有流式细胞术均在BD Fortessa流式细胞仪上进行。流式细胞术数据的分析是使用FlowJo(Treestar)软件进行的。
抗小鼠Ab克隆：CD45克隆30-F11、CD11b克隆M1/70、CD11c克隆N418、CD103克隆2E7、CD24克隆M1/69、CD90.2克隆30-H12、Ly6C克隆HK1.4、MHCII克隆M5/114.15.2、F4/80克隆BM8、CD64克隆X54-5/7.1。
NSM标记物：MS4A7(多克隆，得自Human Protein Atlas，产品编号：HPA017418)、MS4A6A(多克隆，得自Human Protein Atlas，产品编号：HPA011391)。大鼠抗小鼠CD88(C5aR)克隆20/70、抗LILRB4克隆(Pi1.5克隆1)、抗Trem2(Pi1.2克隆2、克隆5或克隆7)、CD206克隆C068C2、MerTK克隆Y323。
SDC：抗CCR7克隆4B12(小鼠)、抗CCR7克隆3D12(人)、抗XCR1克隆ZET(小鼠)、CD135克隆A2F10(小鼠)、CD117克隆2B8(小鼠)。
抗人Ab克隆：CD45克隆Hl30、CD3e克隆OKT3、HLADR克隆L243、CD56克隆CMSSB、CD19克隆H1B19、CD14克隆61D3、CD16克隆CB16、CD11c克隆3.9、BDCA1克隆L161，以及BDCA3克隆AD5-14H12。TREM2(克隆237920)。
二级抗体：抗人Fab-A488、抗大鼠A488和抗山羊A488，均购自JacksonImmunoresearch。
为了产生抗TREM2抗体，将对应于人和小鼠TREM2的细胞外结构域的纯化的蛋白质抗原生产为Fc融合体并购自R&DSystems(Minneapolis，MN)。将这些抗原在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，固定在96孔免疫板中，接着在4℃下吸附过夜。然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭免疫板，并与初始合成Fab噬菌粒文库一起在室温下孵育至少2小时。用PBS+0.05％Tween-20进行大量洗涤以去除未结合的噬菌体。使用0.1N HCl洗脱结合的噬菌体。洗脱的噬菌体用1M Tris-Cl pH 8.0中和，并通过与辅助噬菌体M13KO7反式互补来经由细菌宿主传代扩增。通过加入1/5体积的PEG-8000、2.5M NaCl沉淀从细菌上清液中浓缩的扩增噬菌体，在冰上孵育20分钟，然后以大于17,600x g离心20分钟。将沉淀的噬菌体重悬于含有0.5％BSA和0.05％Tween-20的PBS中，并用于对所吸附小鼠抗原、人抗原或两者进行后续轮次的选择。经过3至5轮选择，从96孔格中生长的个别克隆中产生噬菌体，然后在噬菌体ELISA中使用培养上层清液来检测特异性结合的克隆。使与抗原结合但不与牛血清白蛋白或人Fc对照结合的克隆经受DNA序列分析。选择和测试Pi1.2克隆2、克隆5和克隆7。发现这些克隆与小鼠和人细胞外TREM2结合并且不结合小鼠和人细胞外TREM1(数据未显示)。TREM1(在骨髓细胞上表达的触发受体1)，可通过NCBI网站在2015年9月25日的登录号NM_018643.3提供。
抗体文库获自多伦多大学。参见Persson等人，CDR-H3 Diversity is NotRequired for Antigen Recognition by Synthetic Antibodies.J Mol Biol.2013February 22；425(4):803-811，所述文献出于此明确目的和所有目的而以引用方式并入本文。各种合成抗体文库还描述于USPN 7985840 B2中，所述专利以引用方式并入本文；以及各种书籍章节(Fellouse和Sidhu，“Making antibodies in bacteria,”，在：Making andUsing Antibodies中，Howard和Kaser编辑，Taylor and Francis,2007，所述文献以引用方式并入本文。
使用与上述相似的方法或与WO2013080055中描述的方法相似的方法来制备LILRB4抗体，所述专利以引用方式并入本文。克隆1序列示出于表BB中。
细胞系和细胞培养
通过标准细胞培养实践培养MC38细胞。简单地用青霉素，链霉素和谷氨酰胺在经组织培养处理的塑料平板上，在DMEM加10％FCS中于37℃下使用5％CO2培养贴壁细胞，并每隔一天进行一次细胞分离。用青霉素，链霉素和谷氨酰胺在组织培养烧瓶中，在RPMI-1640加10％FCS中于37℃下使用5％CO2培养EL4悬浮细胞，并每隔一天进行一次细胞分离。
小鼠肿瘤
将所有小鼠均保持在SPF条件下，并按照NIH和美国实验室动物护理协会标准进行治疗，并符合IACUC UCSF规程。
收获肿瘤细胞系并用PBS洗涤3次，然后注射，最终注射体积为50ul。将十五万个肿瘤细胞皮下注射于剃毛右侧，并允许在6至8周龄的C57BL/6雄性小鼠体内生长14至21天。
肿瘤生长
对于肿瘤生长曲线，在指定的时间段内，使用电子游标卡尺测量肿瘤为肿瘤宽度×肿瘤高度，并且肿瘤体积(mm3)计算为V＝(LxWxW)/2。
抗体治疗
将购自BioXcell的纯化的抗-PD-1(克隆RMPI-14)、人IgG1Fc(购自BioXcell)或者室内产生的抗体克隆的纯化的抗-PD-1(克隆RMPI-14)在肿瘤生长的第5天、第8天和第11天和第14天以200ug腹膜内注射治疗四次，除了抗TREM2(Pi1.2)(克隆2)在相应日期以40ug、20ug、20ug和40ug注射。
转导物的产生
细胞系通过使用GeneCopoeia慢病毒载体和LentiPack HIV封装***进行慢病毒转导产生。根据制造商的说明书，将感染的细胞系在选择性抗生素(Puromycin)中培养，并通过FACS分选靶蛋白的表达。
细胞染色标记
将细胞在不含FCS而含有0.5uM eFluor670(eBioscience)或0.5uM CMTMR(Thermo)的RPMI中于37℃孵育15分钟。然后将染料用2ml FCS猝灭并在使用前用RPMI 10％FCS洗涤3次。
腹膜内消除测定
将亲本表达和靶表达转导细胞系的各自的2×10^6个经染色标记细胞腹膜内注射到WT B6雄性小鼠体内。四小时后，向动物注射500ug消除或对照抗体。24-36小时后，通过腹膜灌洗回收转移的细胞，并通过流式细胞术计数。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。除非另有说明，否则所有数据都代表>3次独立实验。误差条表示使用Prism从一式三份的实验条件计算的S.E.M.。所使用的具体统计学检验是配对和非配对的T检验，并且＜0.05的所有p值被认为具有统计学显著性。
实施例13：NSM和SDC在多种人肿瘤中存在。
接下来确定NSM和SDC是否存在于多种不同的人肿瘤类型中。通过流式细胞术分析来自转移性黑素瘤、头颈鳞状细胞癌(HNSC)和结肠癌的人肿瘤活检组织内SDC和NSM群体的存在。代表性的流式细胞仪图示出，进行性门控鉴定了所有显示的人肿瘤类型(转移性黑素瘤、头颈鳞状细胞癌(HNSC)和结肠癌)的NSM群体和SDC群体。参见图13。
实施例14：NSM蛋白在小鼠肿瘤中的表达和结合。
接下来确定某些NSM蛋白是否在NSM的细胞表面上表达，以及那些NSM蛋白是否可由抗NSM抗体结合。还确定某些NSM蛋白是否在SDC上表达。
用NSM标记物对小鼠肿瘤染色，以证明这些标记物对NSM而不是SDC或其它细胞类型或亚类有特异性。图14示出了用各种NSM标记物标记指定的细胞亚群，在指定的细胞亚群中设置门控。所指定标记物的染色示出在黑色柱状图中，而染色对照同种型由灰色阴影柱状图示出。顶部首行：用抗TREM2(Pi1.2克隆2)染色的B16黑素瘤；第二行：用抗TREM2(Pi1.2克隆2)染色的MC38；第三行：用抗MS4A7(商购多克隆抗体，购自Human Protein Atlas，产品代码：HPA017418)染色的MC38；第四行：用抗LILRB4(Pi1.5克隆1)染色的B16；第五行：用抗C5AR1染色的MC38。数据显示与炎性DC、Ly6c+单核细胞和TAM的强结合，以及与CD11b+DC显著结合。在CD103+DC、T细胞、B细胞和肿瘤细胞上观察到少量染色或甚至无染色。
用针对给定NSM蛋白的抗NSM抗体结合给定NSM蛋白表明：NSM将通过已知的基于抗体的消除机制(例如通过选择适当的Fc结构域以允许ADCC)而被消除或杀伤。
实施例15：在人类SDC和NSM细胞中的CCR7表达。
通过流式细胞术分析经消化的肿瘤组织内CCR7分别在SDC群体和NSM群体上的特异性表达。所有数据来自人转移性黑素瘤细胞。图15示出了CCR7在人SDC细胞上，相对于在NSM和其它免疫细胞上的特异性表达。
实施例16：肿瘤中的SDC蛋白表达和结合。
接下来确定某些SDC蛋白是否在SDC的细胞表面上表达，以及那些SDC蛋白是否可由抗SDC抗体结合。还确定某些SDC蛋白是否在NSM上表达。
通过流式细胞术分析经消化的肿瘤组织内SDC和NSM基因产物在SDC群体和NSM群体上的特异性表达。所有数据来自异位B78chOVA肿瘤模型。与肿瘤中细胞群体的相应同种型(灰色阴影)相比，SDC标记物(CCR7和XCR1；黑线)的表达。图16示出，SDC基因产物在SDC上的特异性表达，并且NSM上没有SDC蛋白表达。
实施例17：肿瘤外没有NSM结合。
通过流式细胞术分析健康的野生型B6小鼠骨髓(BM)和脾脏中的TREM2(克隆237920，RnD)和MS4A7(商购多克隆，Human Protein Atlas)表达。
代表性的柱状图示出了若干种健康组织群体中TREM2和MS4A7染色的水平。每个群体的二级对照(抗大鼠A488和抗兔A488，分别购自Jackson Immunoresearch)为灰色阴影，而每个群体的靶蛋白染色由实心黑色柱状图叠加。
通过流式细胞术分析健康的野生型B6小鼠骨髓(BM)和脾脏中TREM2(Pi1.2克隆2，Pi1.2克隆5和Pi1.2克隆7)的表达，通过以一系列染色浓度(2、20、200nM)进行抗体染色，与免疫群体中的对照(人IgG1Fc，标记为0nM)作比较。
图17示出在健康的BM和脾脏组织内不存在对多种NSM标记物的大量染色。这表明使用抗NSM抗体不太可能具有显著的脱靶效应，例如在肿瘤治疗期间。
实施例18：使用抗TREM2或抗LILRB4抗体消除肿瘤中的NSM。
接下来确定抗NSM抗体是否可以在体内特异性地消除荷NSM细胞。
TREM2：将对照和表达TREM2(TREM2也可称为Pi1.2)的EL4转染细胞分别用CMTMR和Elfour670进行染色标记，然后以1:1的比例混合。将4×10^6个总细胞混合物腹膜内注射入WT B6雄性小鼠体内。4小时后，向动物注射500ug抗-Pi1.2(抗TREM2)抗体或对照人IgG1。36小时后，处死小鼠，通过腹腔灌洗收获来自腹膜的回收细胞，并通过流式细胞术计数。图18示出抗TREM2抗体在体内特异性消除荷有TREM2的细胞，而对照抗体则不消除。
LILRB4(ILT3)：将对照和表达LILRB4的EL4转染细胞(分别表达TdTomato和GFP)以1:1的比例混合，其中每种细胞类型为5×10^5个，并将混合物腹膜内注射到WT B6雄性小鼠体内。两小时后，向动物注射100ug抗LILRB4克隆1或PBS对照。24小时后，处死小鼠，通过腹腔灌洗收获来自腹膜的回收细胞，并通过流式细胞术计数。图18示出在体内特异性地消除荷有LILRB4的细胞的抗LILRB4抗体。
针对给定NSM蛋白的抗NSM抗体对NSM的消除表明，抗NSM抗体在施用至具有肿瘤的受试者时会降低肿瘤生长。
实施例19：施用抗TREM2抗体后肿瘤生长减少。
接下来确定抗NSM抗体是否可以减少体内的肿瘤生长。
在T0时将MC38结肠癌注射到6周龄的雄性小鼠B6中。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后第5天、第7天、第11天、第15天通过腹膜内注射用所示抗体进行治疗。给药：抗PD-1和Fc对照的剂量为200ug/天，在第5天、第7天、第11天和第15天注射40ug、20ug、20ug和40ug的抗TREM2(Pi1.2克隆2)。用游标卡尺测量肿瘤，并示出肿瘤体积。从各个TREM2和PD-1组中删除顶部异常值，以进行数据分析。图19表明相对于对照，抗NSM抗体将肿瘤生长减少到与抗PD-1疗法相同的程度。
实施例20：使用抗NSM抗体消除肿瘤中的NSM。
将对照和表达NSM蛋白的EL4转染细胞(分别表达TdTomato和GFP)以例如1:1的比例混合，其中每种细胞类型为5×10^5个，并将混合物腹膜内注射到WT B6雄性小鼠体内。两小时后，向动物注射抗NSM抗体(例如，100ug)、Fc对照或PBS对照。24小时后，处死小鼠，通过腹腔灌洗收获来自腹膜的回收细胞，并通过流式细胞术计数。抗NSM抗体在体内特异性地消除荷有NSM蛋白的细胞。抗NSM抗体结合TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和/或TMEM119。NSM蛋白选自TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119。
实施例21：施用抗NSM抗体后肿瘤生长减少。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)用Fc对照或抗NSM抗体进行治疗。给药方案确定为例如200ug/天的Fc对照；每天(例如，第5天、第7天、第11天和第15天)40ug、20ug、20ug和40ug的抗NSM抗体。用游标卡尺测量肿瘤，并测定肿瘤体积。相对于对照，抗NSM抗体降低肿瘤生长。相对于对照，抗NSM抗体增强对实验小鼠肿瘤的免疫应答。抗NSM抗体结合TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和/或TMEM119。
实施例22：通过与抗NSM抗体共同施用来增强免疫治疗。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)用Fc对照或抗NSM抗体进行治疗。小鼠先前已经接受过，与此同时接受或随后将接受免疫治疗。免疫疗法可包括：抑制免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抑制T细胞的免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抗PD1；抗PDL1；抗CTLA4；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞和抗原呈递细胞的抗原结合蛋白；BiTE抗原结合蛋白；toll样受体配体；和/或细胞因子。使用本领域普通技术人员可获得的信息将给药方案确定为例如200ug/天的Fc对照；每天(例如，第5天、第7天、第11天和第15天)40ug、20ug、20ug和40ug的抗NSM抗体。用游标卡尺测量肿瘤，并测定肿瘤体积。相对于非共同施用对照(例如单药疗法)，联合免疫疗法共同施用抗NSM抗体增强对肿瘤生长的降低。相对于非共同施用对照(例如单药疗法)，联合免疫疗法共同施用抗NSM抗体增强对肿瘤的免疫应答。抗NSM抗体结合TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和/或TMEM119。
实施例23：免疫治疗应答者与无应答者的SDC阈值分析。
接下来通过ROC曲线，确定在开始对患有癌症的受试者进行免疫治疗之前，什么样的SDC百分比阈值在统计学上指示应答者与无应答者状态。
ROC曲线使用在用抗PD-1治疗之前，从人黑素瘤患者获得的BDCA3占CD45+的百分比数据或BDCA3占HLA-DR+的百分比数据。ROC曲线绘制了当％BDCA3+值变化时，应答者/无应答者二元***的特性。曲线是通过在最佳阈值设置下绘制真阳性率(TPR)对照假阳性率(FPR)来创建的。真阳性率也称为信号检测灵敏度。假阳性率也称为脱落率，可以计算为(1-特异性)。曲线下的大面积表示具有高灵敏度与特异性以及因此高预测值的阈值。
使用DeLong方法获得对作为预测因子的BDCA3的进一步验证，如通过使用R语言的pROC软件包具体实施的。对于DC/HLA+的百分比，AUC的95％置信区间(CI)估计为[0.76-1](AUC＝0.905[0.76-1])。通过使用引导程序法，使用2000次分层引导重复，CI＝[0.73-1](AUC＝0.905[0.73-1])。对于pct/CD45+，DeLong估计为95％CI：[0.59-0.98](AUC＝0.786[0.59-0.98])，并且引导[0.57-0.95](AUC＝0.786[0.57-0.95])。图20示出(A)对BDCA3+比CD45+比率对照结局的ROC分析；以及(B)对BDCA3+比HLA-DR+比率对照结局的ROC分析。
这表明1.347％的阈值BDCA3+/HLADR+百分比是针对以下中的一个使用的：已知患者是应答者的情况下BDCA3+高结果的概率为89％(所谓的灵敏度)，而已知患者是无应答者的情况下BDCA3+低结果的概率为86％(所谓的特异性)。这表明肿瘤中SDC的百分比增大至肿瘤中HLA-DR+细胞中的约1.347％或以上可能导致对先前施用、持续、即将到来或以其它方式的癌症免疫治疗的应答增强。此类增大可以例如通过增大SDC数目(例如通过使用FLT3L)和/或减少NSM数目(例如，通过使用抗NSM抗体)来实现。
实施例24：用FLT3-L治疗增强肿瘤中的SDC群体。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)通过以腹膜内注射、静脉注射和/或皮下注射方式注射FLT3-L或PBS对照来进行治疗。使用本领域普通技术人员可获得的信息来确定给药方案(例如，100ul PBS中含10ug)。在整个肿瘤生长期间的多个时间点，将动物划伤，通过流式细胞术分析SDC和NSM丰度。FLT3-L治疗在肿瘤发育中增大肿瘤中的SDC丰度。
实施例25：用FLT3-L抗体治疗后，由于SDC群体增大，肿瘤生长减少。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)通过以腹膜内注射、静脉注射和或皮下注射方式注射FLT3-L或PBS对照来进行治疗。使用本领域普通技术人员可获得的信息来确定给药方案(例如，100ul PBS中含10ug)。用游标卡尺测量肿瘤，并测定肿瘤体积。相对于对照，FLT3-L治疗降低肿瘤生长。FLT3-L治疗增大肿瘤中的SDC丰度，以及dLN、脾脏和骨髓(BM)中的SDC群体。相对于对照，FLT3-L增强对实验小鼠肿瘤的免疫应答。
实施例26：通过与FLT3-L共同施用来增强免疫治疗。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)通过以腹膜内注射、静脉注射和或皮下注射方式注射FLT3-L或PBS对照来进行治疗。小鼠先前已经接受过，与此同时接受或随后将接受免疫治疗。免疫疗法可包括：抑制免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抑制T细胞的免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抗PD1；抗PDL1；抗CTLA4；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞和抗原呈递细胞的抗原结合蛋白；BiTE抗原结合蛋白；toll样受体配体；和/或细胞因子。使用本领域普通技术人员可获得的信息来确定给药方案(例如，100ul PBS中含10ug)。用游标卡尺测量肿瘤，并测定肿瘤体积。相对于非共同施用对照(例如单药疗法)，联合免疫疗法共同施用FLT3-L增强对肿瘤生长的降低。相对于非共同施用对照(例如单药疗法)，联合免疫疗法共同施用FLT3-L增强对肿瘤的免疫应答。同样参见Curran等人、Lynch等人、Chen等人、Peron等人和Shurin等人。
实施例27：通过激动抗FLT3抗体进行SDC靶向刺激。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)通过以腹膜内注射方式注射抗FLT3抗体或Fc对照抗体进行治疗。使用本领域普通技术人员可获得的信息来确定给药方案(例如，200ug/天的Fc对照；40ug、20ug、20ug和40ug的抗FLT3抗体)。在整个肿瘤生长期间的多个时间点，将动物划伤，通过流式细胞术分析SDC和NSM丰度。抗FLT3激动抗体治疗在肿瘤发育中增大肿瘤中的SDC丰度，以及dLN、脾脏和BM中的SDC群体。
实施例28：用激动抗FLT3抗体治疗后，由于SDC群体增大，肿瘤生长减少。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)通过以腹膜内注射方式注射激动抗FLT3抗体或Fc对照进行治疗。使用本领域普通技术人员可获得的信息来确定给药方案(例如，200ug/天的Fc对照；40ug、20ug、20ug和40ug的抗FLT3抗体)。用游标卡尺测量肿瘤，并测定肿瘤体积。相对于对照，抗FLT3抗体治疗降低肿瘤生长。抗FLT3抗体治疗增大肿瘤中的SDC丰度，以及dLN、脾脏和BM中的SDC群体。相对于对照，抗FLT3L激动抗体增强对实验小鼠肿瘤的免疫应答。
实施例29：通过与激动抗FLT3抗体共同施用来增强免疫治疗。
在T0时将癌细胞(例如，MC38结肠癌细胞)注射到6周龄的雄性小鼠B6体内。将小鼠随机分入治疗组，在肿瘤植入后的多日(例如，第5天、第7天、第11天、第15天)通过以腹膜内注射、静脉注射和/或皮下注射方式注射抗FLT3抗体或PBS对照来进行治疗。小鼠先前已经接受过，与此同时接受或随后将接受免疫治疗。免疫疗法可包括：抑制免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抑制T细胞的免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抗PD1；抗PDL1；抗CTLA4；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞和抗原呈递细胞的抗原结合蛋白；BiTE抗原结合蛋白；toll样受体配体；和/或细胞因子。使用本领域普通技术人员可获得的信息来确定给药方案(例如，100ul PBS中含10ug)。用游标卡尺测量肿瘤，并测定肿瘤体积。相对于非共同施用对照(例如单药疗法)，联合免疫疗法共同施用抗FLT3抗体增强对肿瘤生长的降低。相对于非共同施用对照(例如单药疗法)，联合免疫疗法共同施用抗FLT3抗体增强对肿瘤的免疫应答。
实施例30：NSM蛋白在人细胞上的表达。
图21示出在原代人HNSC肿瘤组织内，NSM群体(CD14+TAM)有限地表达TREM2蛋白，而CD14阴性CD11c阳性细胞(包括SDC(BDCA3+DC))上具有很少TREM2蛋白表达，甚至不表达TREM2蛋白。与二次对照染色(抗大鼠IgG，Jackson Immunoresearch)相比，对经消化的人HNSC肿瘤组织进行TREM2特异性商购抗体(RnD，克隆237920)染色，并通过流式细胞术分析。所述图显示在人肿瘤组织内，NSM基因产物在NSM细胞上特异性表达，而SDC细胞缺乏NSM基因产物表达。在活的、CD45+、谱系阴性、HLA-DR+、CD11c+上对群体设置门控，并通过CD14表达分离。
虽然已经参考优选实施方案和各种替代实施方案特别示出和描述了本发明，但是相关领域的技术人员将会理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行形式和细节上的各种改变。
出于所有目的，在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请全文以引用方式并入本文。
序列
表BB–每个抗LILRB4克隆1的CDR序列、可变序列和全长序列
参考文献
Bowles JA，Wang SY，Link BK，Allan B，Bcuerlein G，Campbell MA，Marquis D，Ondek B，Wooldridge JE，Smith BJ，Breitmeyer JB，Weiner GJ.Anti-CD20 monoclonalantibody with enhanced affinity for CD16 activates NK cells at lowerconcentrations and more effectively than rituximab.Blood.2006 Oct 15；108(8)：2648-54.Epub 2006 Jul 6.
Desjarlais JR，Lazar GA.Modulation of antibody effector function.ExpCell Res.2011 May 15；317(9)：1278-85.
Ferrara C，Grau S，Jager C，Sondermann P，Brünker P，Waldhauer I，Hennig M，Ruf A，Rufer AC，Stihle M，P，Benz J.Unique carbohydrate-carbohydrateinteractions are required for high affinity binding between FcgammaRIII andantibodies lacking core fucose.Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Aug 2；108(31)：12669-74.
Heider KH，Kiefer K，Zenz T，Volden M，Stilgenbauer S，Ostermann E，Baum A，Lamche H，Kūpcü Z，Jacobi A，Müller S，Hirt U，Adolf GR，Borges E.A novel Fc-engineered monoclonal antibody to CD37 with enhanced ADCC and highproapoptotic activity for treatment of B-cell malignancies.Blood.2011 Oct 13；118(15)：4159-68.Epub 2011 Jul 27.Blood.2011 Oct 13；118(15)：4159-68.Epub 2011Jul 27.
Lazar GA，Dang W，Karki S，Vafa O，Peng JS，Hyun L，Chan C，Chung HS，EivaziA，Yoder SC，Vielmetter J，Carmichael DF，Hayes RJ，Dahiyat BI.Engineered antibodyFc variants with enhanced effector function.Proc Natl Acad Sci U S A.2006Mar14；103(11)：4005-10.Epub 2006 Mar 6.
Lu Y，Vernes JM，Chiang N，Ou Q，Ding J，Adams C，Hong K，Truong BT，Ng D，Shen A，Nakamura G，Gong Q，Presta LG，Beresini M，Kelley B，Lowman H，Wong WL，MengYG.Identification of IgG(1)variants with increased affinity to FcγRIIIa andunaltered afrinity to FcγRI and FcRn：comparison of soluble receptor-basedand cell-based binding assays.J Immunol Methods.2011 Feb 28；365(1-2)：132-41.Epub 2010 Dec 23.
Mizushima T，Yagi H，Takemoto E，Shibata-Koyama M，Isoda Y，Iida S，MasudaK，Satoh M，Kato K.Structural basis for improved efficacy of therapeuticantibodies on defucosylation of their Fc glycans.Genes Cells.2011 Nov；16(11)：1071-1080.
Moore GL，Chea H，Karki S，Lazar GA.Engineered Fc variant antibodieswith enhanced ability to recruit complement and mediate effectorfunctions.MAbs.2010 Mar-Apr；2(2)：181-9.
Nordstrom JL，Gorlatov S，Zhang W，Yang Y，Huang L，Burke S，Li H，CiccaroneV，Zhang T，Stavenhagen J，Koenig S，Stewart SJ，Moore PA，Johnson S，BonviniE.Anti-tumor activity and toxicokinetics analysis of MGAH22，an anti-HER2monoclonal antibody with enhanced Fc-gamma receptor binding properties.BreastCancer Res.2011 Nov 30；13(6)：R123.[Epub ahead of print]
Richards JO，Karki S，Lazar GA，Chen H，Dang W，Desjarlais JR.Optimizationof antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumorcells.Mol Cancer Ther.2008 Aug；7(8)：2517-27.
Schneider S，Zacharias M.Atomic resolution model of the antibody Fcinteraction with the complement C1q component.Mol Immunol.2012 May；51(1)：66-72.
Shields RL，Namenuk AK，Hong K，Meng YG，Rae J，Briggs J，Xie D，Lai J，Stadlen A，Li B，Fox JA，Presta LG.High resolution mapping of the binding siteon human IgG1 for Fc gamma RI，Fc gamma RII，Fc gamma RIII，and FcRn and designof IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R.J Biol Chem.2001 Mar2；276(9)：6591-604.
Stavenhagen JB，Gorlatov S，Tuaillon N，Rankin CT，Li H，Burke S，Huang L，Vijh S，Johnson S，Bonvini E，Koenig S.Fc optimization of therapeutic antibodiesenhances their ability to kill tumor cells in vitro and controls tumorexpansion in vivo via low-affinity activating Fcgamma receptors.CancerRes.2007 Sep 15；67(18)：8882-90.
Stewart R，Thom G，Levers M，Güler-Gane G，Holgate R，Rudd PM，Webster C，Jermutus L，Lund J.A variant human IgG1-Fc mediates improved ADCC.Protein EngDes Sel.2011 Sep；24(9)：671-8.Epub 2011 May 18.
Bejamini，Y.，and Hochberg，Y.(1995).Controlling the False DiscoveryRate-a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.Journal of theRoyal Statistical Society Series B-Methodological 57，289-300.
Boissonnas，A.，Licata，F.，Poupel，L.，Jacquelin，S.，Fetler，L.，Krumeich，S.，Thery，C.，Amigorena，S.，and Combadierc，C.(2013).CD8+tumor-infiltrating T cellsare trapped in the tumor-dendritic cell network.Neoplasia 15，85-94.
Cancer Genome Atlas Research，N.，Weinstein，J.N.，Collisson，E.A.，Mills，G.B.，Shaw，K.R.，Ozenberger，B.A.，Ellrott，K.，Shmulevich，I.，Sander，C.，and Stuart，J.M.(2013).The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.Nat Genet 45，1113-1120.
Chang，H.Y.，Nuyten，D.S.，Sneddon，J.B.，Hastie，T.，Tibshirani，R.，Sorlie，T.，Dai，H.，He，Y.D.，van′t Veer，L.J.，Bartelink，H.，et al.(2005).Robustness，scalability，and integration of a wound-response gene expression signature inpredicting breast cancer survival.Proc Natl Acad Sci U S A 102，3738-3743.
Cheong，C.，Matos，I.，Choi，J.H.，Dandamudi，D.B.，Shrestha，E.，Longhi，M.P.，Jeffrey，K.L.，Anthony，R.M.，Kluger，C.，Nchinda，G.，et al.(2010).Microbialstimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+)dendritic cellsfor immune T cell areas.Cell 143，416-429.
Cortez-Retamozo，V.，Etzrodt，M.，Newton，A.，Rauch，P.J.，Chudnovskiy，A.，Berger，C.，Ryan，R.J.，Iwamoto，Y.，Marinelli，B.，Gorbatov，R.，et al.(2012).Originsof tumor-associated macrophages and neutrophils.Proc Natl Acad Sci U S A 109，2491-2496.
Curran，M.A.，and Allison，J.P.(2009).Tumor vaccines expressing flt3ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.CancerRes 69，7747-7755.
Curran，M.A.，Montalvo，W.，Yagita，H.，and Allison，J.P.(2010).PD-1 andCTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reducesregulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors.Proc Natl Acad SciU S A 107，4275-4280.
DeNardo，D.G.，Brennan，D.J.，Rexhepaj，E.，Ruffell，B.，Shiao，S.L.，Madden，S.F.，Gallagher，W.M.，Wadhwani，N.，Keil，S.D.，Junaid，S.A.，et al.(2011).Leukocytecomplexity predicts breast cancer survival and functionally regulatesresponse to chemotherapy.Cancer discovery 1，54-67.
Dranoff，G.(2002).GM-CSF-based cancer vaccines.Immunol Rev 188，147-154.
Dzionek，A.，Fuchs，A.，Schmidt，P.，Cremer，S.，Zysk，M.，Miltenyi，S.，Buck，D.W.，and Schmitz，J.(2000).BDCA-2，BDCA-3，and BDCA-4：three markers for distinetsubsets of dendritic cells in human peripheral blood.J Immunol 165，6037-6046.
Engelhardt，J.J.，Boldajipour，B.，Beemiller，P.，Pandurangi，P.，Sorensen，C.，Werb，Z.，Egeblad，M.，and Krummel，M.F.(2012).Marginating dendritic cells ofthe tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engagetumor-specific T cells.Cancer Cell 21，402-417.
Gao，Y.，Nish，S.A.，Jiang，R.，Hou，L.，Licona-Limon，P.，Weinstein，J.S.，Zhao，H.，and Medzhitov，R.(2013).Control of T helper 2 responses by transcriptionfactor IRF4-dependent dendritic cells.Immunity 39，722-732.
Gautier，E.L.，Shay，T.，Miller，J.，Greter，M.，Jakubzick，C.，Ivanov，S.，Helft，J.，Chow，A.，Elpek，K.G.，Gordonov，S.，et al.(2012).Gene-expression profilesand transcriptional regulatory pathways that underlie the identity anddiversity of mouse tissue macrophages.Nat Immunol 13，1118-1128.
Geissmann，F.，Manz，M.G.，Jung，S.，Sieweke，M.H.，Merad，M.，and Ley，K.(2010).Development of monocytes，macrophages，and dendritic cells.Science 327，656-661.
Ginhoux，F，Liu，K.，Helft，J.，Bogunovic，M.，Greter，M.，Hashimoto，D.，Price，J.，Yin，N.，Bromberg，J.，Lira，S.A.，et al.(2009).The origin and development ofnonlymphoid tissue CD103+DCs.J Exp Med 206，3115-3130.
Graf，L.H.，Jr.，Kaplan，P.，and Silagi，S.(1984).Efficient DNA-mediatedtransfer of selectable genes and unselected sequences into differentiated andundifferentiated mouse melanoma clones.Somatic cell and molecular genetics10，139-151.
Guermonprez，P.，Valladeau，J.，Zitvogel，L.，Thery，C.，and Amigorena，S.(2002).Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells.AnnuRev Immunol 20，621-667.
Hanahan，D.，and Weinberg，R.A.(2011).Hallmarks of cancer：the nextgeneration.Cell 144，646-674.
Haniffa，M.，Shin，A.，Bigley，V.，McGovern，N.，Teo，P.，See，P.，Wasan，P.S.，Wang，X.N.，Malinarich，F.，Malleret，B.，et al.(2012).Human tissues containCD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouseCD103+ nonlymphoid dendritic cells.Immunity 37，60-73.
Hashimoto，D.，Miller，J.，and Merad，M.(2011).Dendritic cell andmacrophage heterogeneity in vivo.Immunity3 5，323-335.
Helmich，B.K.，and Dutton，R.W.(2001).The role of adoptively transferredCD8 T cells and host cells in the control of the growth of the EG7 thymoma：factors that determine the relative effectiveness and homing properties ofTc1 and Tc2 effectors.J Immunol 166，6500-6508.
Hildner，K.，Edelson，B.T.，Purtha，W.E.，Diamond，M.，Matsushita，H.，Kohyama，M.，Calderon，B.，Schraml，B.U.，Unanue，E.R.，Diamond，M.S.，et al.(2008).Batf3deficiency reveals a critical role for CD8alpha+ dendritic cells in cytotoxicT cell immunity.Science 322，1097-1100.
Hoadley，K.A.，Yau，C.，Wolf，D.M.，Cherniack，A.D.，Tamborero，D.，Ng，S.，Leiserson，M.D.，Niu，B.，McLellan，M.D.，Uzunangelov，V.，et al.(2014).MultiplatformAnalysis of 12 Cancer Types Reveals Molecular Classification within andacross Tissues of Origin.Cell 158，929-944.
Kraman，M.，Bambrough，P.J.，Arnold，J.N.，Roberts，E.W.，Magiera，L.，Jones，J.O.，Gopinathan，A.，Tuveson，D.A.，and Fearon，D.T.(2010).Suppression ofantitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha.Science 330，827-830.
Kumamoto，Y.，Linehan，M.，Weinstein，J.S.，Laidlaw，B.J.，Craft，J.E.，andIwasaki，A.(2013).CD301b(+)dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.Immunity 39，733-743.
Kusmartsev，S.，Nagaraj，S.，and Gabrilovich，D.I.(2005).Tumor-associatedCD8+T cell tolerance induced by bone marrow-derived immature myeloid cells.JImmunol 175，4583-4592.
Leach，D.R.，Krummel，M.F.，and Allison，J.P.(1996).Enhancement ofantitumor immunity by CTLA-4 blockade.Science 271，1734-1736.
Lewis，C.E.，and Pollard，J.W.(2006).Distinct role of macrophages indifferent tumor microenvironments.Cancer Res 66，605-612.
Meredith，M.M.，Liu，K.，Darrasse-Jeze，G.，Kamphorst，A.O.，Schreiber，H.A.，Guermonprez，P.，Idoyaga，J.，Cheong，C.，Yao，K.H.，Niec，R.E.，and Nussenzweig，M.C.(2012).Expression of the zinc finger transcription factor zDC(Zbtb46，Btbd4)defines the classical dendritic cell lineage.J Exp Med 209，1153-1165.
Miller，J.C.，Brown，B.D.，Shay，T.，Gautier，E.L.，Jojic，V.，Cohain，A.，Pandey，G.，Leboeuf，M.，Elpek，K.G.，Helft，J.，et al.(2012).Deciphering thetranscriptional network of the dendritic cell lineage.Nat Immunol 13，888-899.
Movahedi，K.，Laoui，D.，Gysemans，C.，Baeten，M.，Stange，G.，Van den Bossche，J.，Mack，M.，Pipeleers，D.，In′t Veld，P.，De Baetselier，P.，and Van Ginderachter，J.A.(2010).Different tumor microenvironments contain functionally distinctsubsets of macrophages derived from Ly6C(high)monocytes.Cancer Res 70，5728-5739.
Palmer，C.，Diehn，M.，Alizadeh，A.A.，and Brown，P.O.(2006).Cell-typespecific gene expression profiles of leukocytes in human peripheral blood.BMCgenomics 7，115.
Ries，C.H.，Cannarile，M.A.，Hoves，S.，Benz，J.，Wartha，K.，Runza，V.，Rey-Giraud，F.，Pradel，L.P.，Feuerhake，F.，Klaman，I.，et al.(2014).Targeting Tumor-Associated Macrophages with Anti-CSF-1R Antibody Reveals a Strategy forCancer Therapy.Cancer Cell 25，846-859.
Savina，A.，Jancic，C.，Hugues，S.，Guermonprez，P.，Vargas，P.，Moura，I.C.，Lennon-Dumenil，A.M.，Seabra，M.C.，Raposo，G.，and Amigorena，S.(2006).NOX2controls phagosomal pH to regulate antigen processing duringcrosspresentation by dendritic cells.Cell 126，205-218.
Schulz，C.，Gomez Perdiguero，E.，Chorro，L.，Szabo-Rogers，H.，Cagnard，N.，Kierdorf，K.，Prinz，M.，Wu，B.，Jacobsen，S.E.，Pollard，J.W.，et al.(2012).A lineageof myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.Science 336，86-90.
Strachan，D.C.，Ruffell，B.，Oei，Y.，Bissell，M.J.，Coussens，L.M.，Pryer，N.，and Daniel，D.(2013).CSF1R inhibition delays cervical and mammary tumor growthin murine models by attenuating the turnover of tumor-associated macrophagesand enhancing infitration by CD8 T cells.Oncoimmunology 2，e26968.
Tamura，T.，Tailor，P.，Yamaoka，K.，Kong，H.J.，Tsujimura，H.，O′Shea，J.J.，Singh，H.，and Ozato，K.(2005).IFN regulatory factor-4 and-8 govern dendriticcell subset development and their functional diversity.J Immunol 174，2573-2581.
Tussiwand，R.，Lee，W.L.，Murphy，T.L.，Mashayekhi，M.，Kc，W.，Albring，J.C.，Satpathy，A.T.，Rotondo，J.A.，Edelson，B.T.，Kretzer，N.M.，et al.(2012).Compensatory dendritic cell development mediated by BATF-IRFinteractiohs.Nature 490，502-507.
Viigimaa，M.，Vaverkova，H.，Farnier，M.，Averna，M.，Missault，L.，Hanson，M.E.，Dong，Q.，Shah，A.，and Brudi，P.(2010).Ezetimibe/simvastatin 10/20mg versusrosuvastatin 10mg in high-risk hypercholesterolemic patients stratified byprior statin treatment potency.Lipids in health and disease 9，127.
Williams，J.W.，Tjota，M.Y.，Clay，B.S.，Vander Lugt，B.，Bandukwala，H.S.，Hrusch，C.L.，Decker，D.C.，Blaine，K.M.，Fixsen，B.R.，Singh，H.，et al.(2013).Transcription factor IRF4 drives dendritic cells to promote Th2differentiation.Nature communications 4，2990.
Wolf，D.M.，Lenburg，M.E.，Yau，C.，Boudreau，A.，and van′t Veer，L.J.(2014).Gene co-expression modules as clinically relevant hallmarks of breast cancerdiversity.PLoS One 9，e88309.
Wyckoff，J.，Wang，W.，Lin，E.Y.，Wang，Y.，Pixley，F.，Stanley，E.R.，Graf，T.，Pollard，J.W.，Segall，J.，and Condeelis，J.(2004).A paracrine loop between tumorcells and macrophages is required for tumor cell migration in mammarytumors.Cancer Res 64，7022-7029.
Anders，S.，and Huber，W.(2010).Differential expression analysis forsequence count data.Genome biology 11，R106.
Bertram，J.S.，and Janik，P.(1980).Establishment of a cloned line ofLewis Lung Carcinoma cells adapted to cell culture.Cancer Lett 11.63-73.
Curran，M.A.，and Allison，J.P.(2009).Tumor vaccines expressing flt3ligand synergize with ctla-4blockade to reject preimplanted tumors.Cancer Res69，7747-7755.
Choi，C.H.，Webb，B.A.，Chimenti，M.S.，Jacobson，M.P.，and Barber，D.L.(2013).pH sensing by FAK-His58.regulates focal adhesion remodeling.J CellBiol 202，849-859.
Dranoff，G.，Jaffee，E.，Lazenby，A.，Golumbek，P.，Levitsky，H.，Brose，K.，Jackson，V.，Hamada，H.，Pardoll，D.，and Mulligan，R.C.(1993).Vaccination withirradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor stimulates potent，specific，and long-lasting anti-tumor immunity.Proc Natl Acad Sci U S A 90，3539-3543.
Fidler，I.J.(1975).Biological behavior of malignant melanoma cellscorrelated to their survival in vivo.Cancer Res 35，218-224.
Friedman，R.S.，Jacobelli，J.，and Krummel，M.F.(2006).Surface-boundchemokines capture and prime T cells for synapse formation.Nat Immunol 7，1101-1108.
Graf，L.H.，Jr.，Kaplan，P.，and Silagi，S.(1984).Efficient DNA-mediatedtransfer of selectable genes and unselected sequences into differentiated andundifferentiated mouse melanoma clones.Somatic cell and molecular genetics10，139-151.
Hadjantonakis，A.K.，Macmaster，S.，and Nagy，A.(2002).Embryonic stemcells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasivereporter usage within a single animal.BMC Biotechnol 2，11.
Halpern，J.，Lynch，C.C.，Fleming，J.，Hamming，D.，Martin，M.D.，Schwartz，H.S.，Matrisian，L.M.，and Holt，G.E.(2006).The application of a murine bonebioreactor as a model of tumor：bone interaction.Clinical&experimentalmetastasis 23，345-356.
Hoquist，K.A.，Jameson，S.C.，Heath，W.R.，Howard，J.L.，Bevan，M.J.，andCarbone，F.R.(1994).T cell receptor antagonist peptides induce positiveselection.Cell 76，17-27.
Hyman，R.，Ralph，P.，and Sarkar，S.(1972).Cell-specific antigens andimmunoglobulin synthesis of murine myeloma cells and their variants.Journalof the National Cancer Institute 48，173-184.
Jung，S.，Aliberti，J.，Graemmel，P.，Sunshine，M.J.，Kreutzberg，G.W.，Sher，A.，and Littman，D.R.(2000).Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 functionby targeted deletion and green fluorescent protein reporter geneinsertion.Molecular and cellular biology 20，4106-4114.
Khanna，K.M.，Blair，D.A.，Vella，A.T.，McSorlcy，S.J.，Datta，S.K.，andLcfrancois，L.(2010).T cell and APC dynamics in situ control the outcome ofvaccination.J Immunol 185，239-252.
Klein，U.，Casola，S.，Cattoretti，G.，Shen，Q.，Lia，M.，Mo，T.，Ludwig，T.，Rajewsky，K.，and Dalla-Favera，R.(2006).Transcription factor IRF4 controlsplasma cell differentiation and class-switch recombination.Nat Immunol 7，773-782.
Koivusalo，M.，Welch，C.，Hayashi，H.，Scott，C.C.，Kim，M.，Alexander，T.，Touret，N.，Hahn，K.M.，and Grinstein，S.(2010).Amiloride inhibitsmacropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42signaling.J Cell Biol 188，547-563.
Liu，F.，Wu，H.Y.，Wesselschmidt，R.，Kornaga，T.，and Link，D.C.(1996).Impaired production and increased apoptosis of neutrophils in granulocytecolony-stimulating factor receptor-deficient mice.Immunity 5，491-501.
Meredith，M.M.，Liu，K.，Darrasse-Jeze，G.，Kamphorst，A.O.，Schreiber，H.A.，Guermonprez，P.，Idoyaga，J.，Cheong，C.，Yao，K.H.，Niec，R.E.，and Nussenzweig，M.C.(2012).Expression of the zinc finger transcription factor zDC(Zbtb46，Btbd4)defines the classical dendritic cell lineage.J Exp Med 209，1153-1165.
Moore，M.W.，Carbone，F.R.，and Bevan，M.J.(1988).Introduction of solubleprotein into the class I pathway of antigen processing and presentation.Cell54，777-785.
Moran，A.E.，Holzapfel，K.L.，Xing，Y.，Cunningham，N.R.，Maltzman，J.S.，Punt，J.，and Hogquist，K.A.(2011).T cell receptor signal strength in Treg and iNKTcell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.J Exp Med208，1279-1289.
Ouyang，X.，Zhang，R.，Yang，J.，Li，Q.，Qin，L.，Zhu，C.，Liu，J.，Ning，H.，Shin，M.S.，Gupta，M.，et al.(2011).Transcription factor IRF8 directs a silencingprogramme for TH17 cell differentiation.Nature communications 2，314.
Robb，L，Drinkwater，C.C.，Metcalf，D.，Li，R.，Kontgen，F.，Nicola，N.A.，andBegley，C.G.(1995).Hematopoietic and lung abnormalities in mice with a nullmutation of the common beta subunit of the receptors for granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukins 3 and 5.Proc Natl AcadSci U S A 92，9565-9569.
Ruffell，B.，Au，A.，Rugo，H.S.，Esserman，L.J.，Hwang，E.S.，and Coussens，L.M.(2012).Leukocyte composition of human breast cancer.Proc Natl Acad Sci U S A109，2796-2801.
Trapnell，C.，Pachter，L.，and Salzberg，S.L.(2009).TopHat：discoveringsplice junctions with RNA-Seq.Bioinformatics 25，1105-1111.
Veiga-Fernandes，H.，Coles，M.C.，Foster，K.E.，Patel，A.，Williams，A.，Natarajan，D.，Barlow，A.，Pachnis，V.，and Kioussis，D.(2007).Tyrosine kinasereceptor RET is a key regulator of Peyer′s patch organogenesis.Nature 446，547-551.
Webb，B.A.，Chimenti，M.，Jacobson，M.P.，and Barber，D.L.(2011).Dysregulated pH：a perfect storm for cancer progression.Nat Rev Cancer 11，671-677.
Williams，J.W.，Tjota，M.Y.，Clay，B.S.，Vander Lugt，B.，Bandukwala，H.S.，Hrusch，C.L.，Decker，D.C.，Blaine，K.M.，Fixsen，B.R.，Singh，H.，et al.(2013).Transcription factor IRF4 drives dendritic cells to promote Th2differentiation.Nature communications 4，2990.
Leach，D.R.，Krummel，M.F.&Allison，J.P.Enhancement of antitumor immunityby CTLA-4 blockade.Science 271，1734-1736(1996).
Hodi，F.S.，et al.Improved Survival with Ipilimumab in Patients withMetastatic Melanoma.New England Journal of Medicine 363，711-723(2010).
Wolchok，J.D.，et al.Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.TheNew England journal of medicine 369，122-133(2013).
Pardoll，D.M.The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nat Rev Cancer 12，252-264(2012).
Topalian，S.L.，et al.Safety，activity，and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer.The New England journal of medicine 366，2443-2454(2012).
Hamid，O.，et al.Safety and tumor responses with lambrolizumab(anti-PD-1)in melanoma.The New England journal of medicine 369，134-144(2013).
Broz，M.L.，et al.Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rareactivating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.Cancer Cell26，638-652(2014).
DeNardo，D.G.，et al.Leukocyte complexity predicts breast cancersurvival and functionally regulates response to chemotherapy.Cancer discovery1，54-67(2011).
Hanada，T.，et al.Prognostic value of tumor-associated macrophage countin human bladder cancer.International journal of urology：official journal ofthe Japanese Urological Association 7，263-269(2000).
Sandel，M.H.，et al.Prognostic value of tumor-infiltrating dendriticcells in colorectal cancer：role of maturation status and intratumorallocalization.Clin Cancer Res 11，2576-2582(2005).
Bogunovic，D.，et al.Immune profile and mitotic index of metastaticmelanoma lesions enhance clinical staging in predicting patient survival.ProcNatl Acad Sci USA 106，20429-20434(2009).
Fridman，W.H.，Pages，F.，Sautes-Fridman，C.&Galon，J.The immune contexturein human tumours：impact on clinical outcome.Nat Rev Cancer 12，298-306(2012).
Ascierto，P.A.，et al.The additional facet of immunoscore：immunoprofiling as a possible predictive tool for cancer treatment.J TranslMed 11，54(2013).
Angelo，M.，et al.Multiplexed ion beam imaging of human breasttumors.Nat Med 20，436-442(2014).
Le，D.T.，et al.PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair DeficiencyThe New England journal of medicine(2015).
Snyder，A.，et al.Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4Blockade in Melanoma.New England Journal of Medicine 371，21 89-2199(2014).
Selby，M.J.，et al.Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhanceantitumor activity through reduction of intratumoral regulatory Tcells.Cancer imnunology research 1，32-42(2013).
Bell，D.，et al.In Breast Carcinoma Tissue，Immature Dendritic CellsReside within the Tumor，Whereas Mature Dendritic Cells Are Located inPeritumoral Areas.The Journal of Experimental Medicine 190，1417-1426(1999).
Dieu-Nosjean，M.C.，et al.Long-term survival for patients with non-small-cell lung cancer with intratumoral lymphoid structnres.J Clin Oncol 26，4410-4417(2008).
Bejamini，Y.&Hochberg，Y.Controlling the False Discovery Rate-aPractical and Powerful Approach to Multiple Testing.Journal of the RoyalStatistical Society Series B-Methodological 57，289-300(1995).
Ruffell，B.，et al.Leukocyte composition of human breast cancer.ProcNatl Acad Sci U S A 109，2796-2801(2012).
Graf，L.H.，Jr.，Kaplan，P.&Silagi，S.Efficient DNA-mediated transfer ofselectable genes and unselected sequences into differentiated andundifferentiated mouse melanoma clones.Somatic cell and molecular genetics10，139-151(1984).
Engelhardt，J.J.，et al.Marginating dendritic cells of the tumormicroenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.Cancer Cell 21，402-417(2012).
Meredith，M.M.，et al.Expression of the zinc finger transcriptionfactor zDC(Zbtb46，Btbd4)defines the classical dendritic cell lineage.J ExpMed 209，1153-1165(2012).
Curran and Allison.‘Tumor Vaccines Expressing Flt3-Ligand Synergizewith CTLA-4 Blockade to Reject Pre-Implanted Tumors’Cancer Research 2009.
Lynch，D.H.，A.Andreasen，E.Maraskovsky，J.Whitmore，R.E.Miller，J.C.Schuh.1997.Flt3 ligand induces tumor regression and antitumor immuneresponses in vivo.Nat.Med.3：625.
Chen，K.，S.Braun，S.Lyman，Y.Fan，C.M.Traycoff，E.A.Wiebke，J.Gaddy，G.Sledge，H.E.Broxmeyer，K.Cornetta.1997.Antitumor activity andimmunotherapeutic properties of Flt3-ligand in a murine breast cancermodel.Cancer Res.57：3511.
Peron，J.M.，C.Esche，V.M.Subbotin，C.Maliszewski，M.T.Lotze，M.R.Shurin.1998.Flt3-ligand administration inhibits liver metastases：role ofNK cells.J.Immunol.161：6164.
Shurin，M.R.，C.Esche，M.T.Lotze.1998.FLT3：receptor and ligand：biologyand potential clinical application.Cytokine Growth Factor Rev.9：3.

Claims (88)

1.一种用于杀伤、失能或消除存在于受试者的癌组织内的非刺激性骨髓细胞的方法，其包括：使所述非刺激性骨髓细胞与结合至所述非刺激性骨髓细胞并且以有效杀伤、失能或消除所述受试者的所述癌组织内的所述非刺激性骨髓细胞的量存在的抗体或其抗原结合片段接触，任选地其中所述非刺激性骨髓细胞存在于包括刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，任选地其中所述非刺激性骨髓细胞的所述杀伤、失能或消除通过减少癌组织的量或体积来治疗所述受试者，任选地其中所述接触增大所述免疫细胞群体中所述刺激性骨髓细胞比所述非刺激性骨髓细胞的比率，任选地其中所述接触减小所述免疫细胞群体中所述非刺激性骨髓细胞比所述刺激性骨髓细胞的比率，任选地其中所述接触增强所述受试者的免疫应答，并且任选地其中所述接触基本上不杀伤、失能或消除存在于所述癌组织外的骨髓细胞和/或存在于所述癌组织内的刺激性骨髓细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至在所述非刺激性骨髓细胞上表达的靶蛋白的所述细胞外结构域，所述靶蛋白选自由以下项组成的组：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119，其中所述非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-，其中所述抗体或其抗原结合片段通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)将所述非刺激性骨髓细胞杀伤、失能或消除至低于在使所述非刺激性骨髓细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触之前存在于所述癌组织内的所述非刺激性骨髓细胞的所述水平，其中所述非刺激性骨髓细胞存在于包括刺激性骨髓细胞和所述非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，所述刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+，其中所述接触基本上不杀伤、失能或消除存在于所述癌组织外的骨髓细胞和/或存在于所述癌组织内的刺激性骨髓细胞，并且其中对所述非刺激性骨髓细胞的杀伤、失能或消除通过增强对所述癌组织的免疫应答来治疗所述癌症。
3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述非刺激性骨髓细胞是以下中的至少一种：肿瘤相关的巨噬细胞；肿瘤相关的树突细胞；CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-；CD45+、HLA-DR+和CD14+；CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+；或者不是BDCA3+，如通过流式细胞术或等效测定法所测定。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非刺激性骨髓细胞对于以下中的至少一种呈阳性：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7，以及LILRB4；和/或对于以下中的至少一种呈阴性：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1，如通过聚合酶链反应(PCR)、基因阵列、流式细胞术、RNA测序或等效测定法所测量。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体介导的吞噬活性中的至少一种。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、拮抗抗体、多克隆抗体、IgG1抗体、IgG3抗体、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和抗原结合片段中的至少一种。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段不是IgG2抗体，或其中所述抗体或其抗原结合片段不是IgG4抗体。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是经缀合的。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自由以下项组成的组的至少一种治疗剂缀合：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体和第二抗体片段。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选择性地结合以下中的至少一个：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段不选择性地结合LILRB4。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触诱导以下中的至少一种：所述非刺激性骨髓细胞的死亡、所述非刺激性骨髓细胞的凋亡、所述非刺激性骨髓细胞的裂解、对所述非刺激性骨髓细胞的吞噬，以及所述非刺激性骨髓细胞的生长停滞。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述刺激性骨髓细胞包括为以下中的至少一种的细胞：CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-和BDCA3+；以及CD45+、HLA-DR+、CD11c+和BDCA3+，如通过流式细胞术或等效测定法所测定。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述刺激性骨髓细胞对于以下中的至少一种呈阴性：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4；和/或对于以下中的至少一种呈阳性：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1，如通过聚合酶链反应(PCR)、基因阵列、流式细胞术、RNA测序或等效测定法所测量。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非刺激性骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌组织是实体癌症或液体癌症。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、肾癌、肝胆癌、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、***癌、肺癌和乳腺癌。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经接受，正在接受或后续将接受免疫治疗。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述免疫疗法是以下中的至少一种：抑制免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抑制T细胞的免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抗PD1；抗PDL1；抗CTLA4；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞和抗原呈递细胞的抗原结合蛋白；BiTE抗原结合蛋白；toll样受体配体；以及细胞因子。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法增强所述受试者的免疫应答，并且任选地其中所述免疫应答是基于免疫疗法的免疫应答，任选地其中所述基于免疫疗法的免疫应答靶向所述癌症。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用增强刺激性骨髓细胞的活性或增大刺激性骨髓细胞数量的试剂，任选地其中所述试剂是FLT3L。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的癌症。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触增大所述免疫细胞群体中刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的所述比率。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触导致在所述受试者中，所述肿瘤中存在的所述刺激性骨髓细胞占所述肿瘤中存在的总CD45+、HLA-DR+细胞的大于1至4％、1至2％、1％、1.37％、1.6％、2％、3％或4％。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定来自所述受试者的生物样品中所述刺激性骨髓细胞和/或非刺激性骨髓细胞的所述数量，任选地其中所述确定步骤用来确定所述受试者是否受益于所述抗体或其抗原结合片段的施用，并且任选地其中所述确定步骤用来监测施用所述抗体或其抗原结合片段的有效性。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定来自所述受试者的生物样品中以下至少一者的表达水平：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7、LILRB4、KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是在包含所述抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述组合物是无菌的。
29.一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括：施用结合至存在于癌症中的非刺激性骨髓细胞并且以足以有效杀伤、失能或消除所述非刺激性骨髓细胞的量存在的抗体或其抗原结合片段，任选地其中所述非刺激性骨髓细胞存在于包括刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，任选地其中所述非刺激性骨髓细胞的所述杀伤、失能或消除通过减少癌组织的量或体积来治疗所述受试者，任选地其中所述接触增大所述免疫细胞群体中所述刺激性骨髓细胞比所述非刺激性骨髓细胞的比率，任选地其中所述接触减小所述免疫细胞群体中所述非刺激性骨髓细胞比所述刺激性骨髓细胞的比率，任选地其中所述接触基本上不杀伤、失能或消除存在于所述癌组织外的骨髓细胞和/或存在于所述癌组织内的刺激性骨髓细胞，并且任选地其中所述受试者的癌症是通过产生或增强对所述癌症的免疫应答来治疗的。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至在非刺激性骨髓细胞上表达的靶蛋白的细胞外结构域，所述靶蛋白选自由以下项组成的组：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119，其中非刺激性骨髓细胞是CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-，其中抗体或其抗原结合片段通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)将非刺激性骨髓细胞杀伤、失能或消除至低于在使非刺激性骨髓细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触之前存在于癌组织内的非刺激性骨髓细胞的水平，其中非刺激性骨髓细胞存在于包括刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中，所述刺激性骨髓细胞为CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+，并且其中对非刺激性骨髓细胞的杀伤、失能或消除治疗癌症。
31.如权利要求29至30中任一项所述的方法，其中所述非刺激性骨髓细胞是以下中的至少一种：肿瘤相关的巨噬细胞；肿瘤相关的树突细胞；CD45+、HLA-DR+、CD11c+、CD14+和BDCA3-；CD45+、HLA-DR+和CD14+；CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+；或者不是BDCA3+，如通过流式细胞术或等效测定法所测定。
32.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述非刺激性骨髓细胞对于以下中的至少一种呈阳性：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7，以及LILRB4；和/或对于以下中的至少一种呈阴性：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1，如通过聚合酶链反应(PCR)、基因阵列、流式细胞术、RNA测序或等效测定法所测量。
33.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体介导的吞噬活性中的至少一种。
34.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、拮抗抗体、多克隆抗体、IgG1抗体、IgG3抗体、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和抗原结合片段中的至少一种。
35.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段不是IgG2抗体，或其中所述抗体或其抗原结合片段不是IgG4抗体。
36.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是经缀合的。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自由以下项组成的组的至少一种治疗剂缀合：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、第二抗体和第二抗体片段。
38.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选择性地结合以下中的至少一个：TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1/CD206、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK和TMEM119，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段不选择性地结合LILRB4。
39.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触诱导以下中的至少一种：所述非刺激性骨髓细胞的死亡，所述非刺激性骨髓细胞的凋亡，所述非刺激性骨髓细胞的裂解，对所述非刺激性骨髓细胞的吞噬，以及所述非刺激性骨髓细胞的生长停滞。
40.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述刺激性骨髓细胞包括为以下中的至少一种的细胞：CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+、BDCA1-和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-和BDCA3+；以及CD45+、HLA-DR+、CD11c+和BDCA3+，如通过流式细胞术或等效测定法所测定。
41.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述刺激性骨髓细胞对于以下中的至少一种呈阴性：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4；和/或对于以下中的至少一种呈阳性：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1，如通过聚合酶链反应(PCR)、基因阵列、流式细胞术、RNA测序或等效测定法所测量。
42.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述非刺激性骨髓细胞在包含刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体中。
43.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体癌症或液体癌症。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、肾癌、肝胆癌、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、***癌、肺癌和乳腺癌。
45.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
46.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经接受，正在接受或后续将接受免疫治疗。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述免疫疗法是以下中的至少一种：抑制免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抑制T细胞的免疫检查点抑制剂的免疫疗法；抗PD1；抗PDL1；抗CTLA4；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞和抗原呈递细胞的抗原结合蛋白；BiTE抗原结合蛋白；toll样受体配体；以及细胞因子。
48.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法增强所述受试者的免疫应答，任选地其中所述免疫应答是基于免疫疗法的免疫应答，任选地其中所述基于免疫疗法的免疫应答靶向所述癌症。
49.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用增强刺激性骨髓细胞的活性或增大刺激性骨髓细胞数量的试剂，任选地其中所述试剂是FLT3L。
50.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触增大所述免疫细胞群体中刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的所述比率。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用导致在所述受试者中，所述肿瘤中存在的所述刺激性骨髓细胞占所述肿瘤中存在的总CD45+、HLA-DR+细胞的大于1至4％、1至2％、1％、1.37％、1.6％、2％、3％或4％。
52.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定来自所述受试者的生物样品中所述刺激性骨髓细胞和/或非刺激性骨髓细胞的所述数量，任选地其中所述确定步骤用来确定所述受试者是否受益于所述抗体或其抗原结合片段的施用，并且任选地其中所述确定步骤用来监测施用所述抗体或其抗原结合片段的有效性。
53.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定来自所述受试者的生物样品中以下至少一者的表达水平：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7、LILRB4、KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1。
54.如前述治疗方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是在包含所述抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述组合物是无菌的。
56.一种增强受试者对肿瘤的免疫应答的方法，其包括对所述受试者施用有效量的治疗，所述治疗增强所述肿瘤中刺激性骨髓细胞的丰度或降低所述肿瘤中非刺激性骨髓细胞的丰度，其中所述治疗增强对所述肿瘤的所述免疫应答，任选地其中所述免疫应答减小所述肿瘤的体积。
57.一种改善对患有肿瘤的受试者的癌症免疫疗法治疗的功效的方法，其包括向所述受试者施用有效量的治疗，所述治疗增强所述肿瘤中刺激性骨髓细胞的丰度或降低所述肿瘤中非刺激性骨髓细胞的丰度，其中所述受试者先前已经接受过，在此同时接受或随后将接受癌症免疫治疗。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述方法包括全身施用或增强FLT3L。
59.如权利要求56或57所述的方法，其中所述方法包括全身施用导致非刺激性骨髓细胞的消除或减少的一种或多种抗体，选择性地保留刺激性骨髓细胞。
60.如权利要求56或57所述的方法，其中所述方法包括用FLT3L处理受试者的自体同源骨髓或血细胞，同时阻断CSF1的表达或作用。
61.如权利要求56或57所述的方法，其中所述方法包括增强骨髓或血液祖细胞群体中IRF8、Mycl1、或BATF3或ZBTB46的表达。
62.一种用于确定来自受试者的样品中是否存在非刺激性骨髓细胞的方法，其包括：
a.将包含所述非刺激性骨髓细胞和刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与结合至所述非刺激性骨髓细胞的抗体或其抗原结合片段接触；
b.确定指示所述抗体与非刺激性骨髓细胞结合的复合物的存在；
c.任选地定量化所述群体中非刺激性骨髓细胞的数量；以及
d.任选地用与所述非刺激性骨髓细胞结合的抗体或其抗原结合片段治疗所述受试者。
63.一种用于确定来自受试者的样品中是否存在刺激性骨髓细胞的方法，其包括：
a.将包含所述刺激性骨髓细胞和非刺激性骨髓细胞的免疫细胞群体与结合至所述刺激性骨髓细胞的抗体或其抗原结合片段接触；
b.确定指示所述抗体与刺激性骨髓细胞结合的复合物的存在；
c.任选地定量化所述群体中刺激性骨髓细胞的数量；以及
d.任选地治疗所述受试者。
64.一种定量化肿瘤样品中非刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量以下细胞中的至少一种细胞的细胞数：肿瘤相关巨噬细胞；肿瘤相关树突细胞；CD45+、HLA-DR+和CD14+；CD45+、HLA-DR+、CD14+、BDCA3-、CD11b+和CD11c+；CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA1+；或者不是BDCA3+。
65.一种定量化存在于肿瘤样品中的刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量为以下细胞中的至少之一种细胞的细胞数：CD45+、HLA-DR+、CD14-、CD11c+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+和BDCA3+；CD45+、HLA-DR+、CD14-和BDCA3+；以及CD45+、HLA-DR+、CD11c+和BDCA3+。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中通过细胞分选方法对所述细胞进行定量化。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述细胞分选方法选自由以下项组成的组：荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁活化细胞分选、微阵列分选和基于亲和力的细胞分离。
68.一种定量化肿瘤样品中的非刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量以下非刺激性骨髓细胞标记物中的至少一种的表达：C5AR1、LYVE1、ABCC3、MRC1、SIGLEC1、STAB1、C1QB、C1QA、TMEM37、MERTK、C1QC、TMEM119、MS4A7、APOE、CYP4F18、TREM2、TLR7和LILRB4。
69.一种定量化肿瘤样品中的刺激性骨髓细胞的方法，其包括测量以下刺激性骨髓细胞标记物中的至少一种的表达：KIT、CCR7、BATF3、FLT3、ZBTB46、IRF8、BTLA、MYCL1、CLEC9A、BDCA3和XCR1。
70.如权利要求68或69所述的方法，其中通过定量PCR来测量所述标记物的表达。
71.如权利要求68或69所述的方法，其中使用包含用于标记基因序列的固定探针的寡核苷酸阵列来完成对标记物基因表达的定量。
72.如权利要求64至71所述的方法，其中通过针吸活检、钻孔活检或手术切除肿瘤来从肿瘤获得所述肿瘤样品。
73.一种用于评估患者的癌症状况的方法，其包括以下步骤：从受试者获得肿瘤样品；以及测量源自所述受试者的所述肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度。
74.如权利要求73所述的方法，其中所评估的所述癌症状况是癌症复发的可能性；并且其中所述肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示癌症复发的可能性降低。
75.如权利要求73所述的方法，其中所评估的所述癌症状况是受试者对免疫疗法治疗的依从性；并且其中所述肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示所述受试者将对免疫疗法治疗积极应答的可能性增大。
76.如权利要求73所述的方法，其中所评估的所述癌症状况是免疫疗法治疗的有效性；并且其中所述肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示所述免疫疗法治疗是有效的。
77.如权利要求73所述的方法，其中所评估的所述癌症状况是预期的癌症存活时间；并且其中所述肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示预期的癌症存活时间延长。
78.如权利要求74至77所述的方法，其中刺激性骨髓细胞的升高丰度是超过在代表性肿瘤样品池中观察到的刺激性骨髓细胞的中值或平均丰度的丰度。
79.如权利要求73所述的方法，其中刺激性骨髓细胞的所述丰度测量为所述样品中刺激性骨髓细胞比非刺激性骨髓细胞的所述比率。
80.如权利要求73所述的方法，其中刺激性骨髓细胞的所述丰度测量为所述样品中存在的刺激性骨髓细胞比总骨髓细胞的所述比率。
81.如权利要求73所述的方法，其中刺激性骨髓细胞的所述丰度测量为所述样品中存在的刺激性骨髓细胞比总HLA-DR+细胞的所述比率。
82.如权利要求81所述的方法，其中刺激性骨髓细胞的丰度升高被定义为大于1.37个刺激性骨髓细胞/100个HLA-DR+细胞。
83.如权利要求75或76所述的方法，其中所述免疫疗法治疗是抗PD1治疗。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述抗PD1治疗是纳武单抗或潘利珠单抗的施用。
85.如权利要求83所述的方法，其中所述受试者患有黑素瘤。
86.一种用于评估治疗对升高肿瘤中刺激性骨髓细胞丰度的有效性的方法，其包括以下步骤：对一个或多个患有癌症的受试者施用所述治疗；以及测量源自所述一个或多个受试者的一个或多个肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的所述丰度，其中所述一个或多个肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度升高指示所述试剂是有效的。
87.如权利要求86所述的方法，其中刺激性骨髓细胞的丰度升高被定义为一个或多个肿瘤样品中的刺激性骨髓细胞的丰度比在施用所述治疗前在从所述一个或多个受试者获得的一个或多个肿瘤样品中观察到的刺激性骨髓细胞的丰度更高。
88.如权利要求86所述的方法，其中刺激性骨髓细胞的丰度升高被定义为来自所治疗受试者的一个或多个肿瘤样品中刺激性骨髓细胞的丰度比在来自未治疗受试者的代表性肿瘤样品池中观察到的刺激性骨髓细胞的丰度更高。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108085393A (zh) * 2018-01-31 2018-05-29 北京泱深生物信息技术有限公司 肾透明细胞癌相关生物标志物及其应用
CN109609463A (zh) * 2019-01-10 2019-04-12 中国医学科学院肿瘤医院 一种***肿瘤原代细胞分离及培养方法
CN110836974A (zh) * 2019-11-07 2020-02-25 西安交通大学医学院第一附属医院 Flt3lg蛋白在制备肺腺癌术后预后评估试剂或者试剂盒中的应用
CN111601823A (zh) * 2017-11-07 2020-08-28 德克萨斯大学体系董事会 用car-t或car-nk细胞在癌症治疗中靶向lilrb4
CN111712258A (zh) * 2017-12-12 2020-09-25 开拓免疫医疗公司 抗trem2抗体和相关方法
CN112135632A (zh) * 2018-02-02 2020-12-25 肿瘤免疫股份有限公司 选择和设计用于癌症疗法的更安全且更有效的抗ctla-4抗体的方法
CN113038988A (zh) * 2018-10-15 2021-06-25 诺华股份有限公司 稳定trem2的抗体

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CR20160319A (es) 2013-12-12 2016-11-08 Jiangsu Hengrui Medicine Co Anticuerpo pd-1, fragmento de union al antigeno de este y uso médico de este
SG10201913611QA (en) 2014-08-08 2020-03-30 Alector Llc Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
KR20240056629A (ko) * 2014-09-28 2024-04-30 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 자극성 및 비자극성 골수성 세포의 조절
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
EP3507601B1 (en) 2016-08-31 2023-08-16 Agency for Science, Technology and Research Methods for the identification, targeting and isolation of human dendritic cell (dc) precursors "pre-dc"
CN109844536B (zh) * 2016-09-26 2023-04-14 豪夫迈·罗氏有限公司 预测对pd-1轴抑制剂的响应
SG11201907102XA (en) 2017-02-07 2019-08-27 Univ Saitama Medical Immunological biomarker for predicting clinical effect of cancer immunotherapy
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
CN107267555B (zh) * 2017-05-27 2020-03-20 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的恶性胶质瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
BR112019022752A2 (pt) 2017-08-03 2020-05-19 Alector Llc anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos
JP7267280B2 (ja) * 2017-08-08 2023-05-01 パイオニア イミュノセラピューティクス インコーポレイテッド Ｔｒｅｍ１を発現する骨髄細胞を無能化させるための組成物および方法
GEP20237565B (en) 2017-11-17 2023-11-10 Merck Sharp & Dohme Llc Antibodies specific for immunoglobulin-like transcript 3 (ilt3) and uses thereof
WO2020002766A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-02 Faron Pharmaceuticals Oy Treatment of cancer with clever-1 inhibition in combination with pd-1/pd-l1 inhibitor
AU2019295409A1 (en) * 2018-06-25 2021-01-21 Peter Maccallum Cancer Institute Modified T cells and uses thereof
WO2020097193A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
US10836828B2 (en) 2019-02-06 2020-11-17 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. Anti-TREM1 antibodies and related methods
EP3928793A4 (en) * 2019-02-20 2022-12-07 Saitama Medical University METHOD AND COMPOSITION FOR PREDICTING LONG TERM SURVIVAL IN CANCER IMMUNOTHERAPY
US11013764B2 (en) 2019-04-30 2021-05-25 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
EP3980448A4 (en) * 2019-06-04 2023-06-28 Academia Sinica Ligands targed to epidermal growth factor receptors and compositions for use in treating tumors
MX2022001756A (es) * 2019-08-13 2022-05-18 Tohoku Techno Arch Co Ltd Inhibidor del punto de control inmunitario, agente terapeutico para la enfermedad relacionada con el punto de control inmunitario, inmunosupresor, anticuerpo contra la fibronectina o derivado del mismo, analogo de la fibronectina, kit para detectar la fibronectina o una proteina parcial de la misma, y metodo para detectar la fibronectina o una proteina parcial de la misma.
GB2605276A (en) 2019-09-03 2022-09-28 Myeloid Therapeutics Inc Methods and compositions for genomic integration
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
CA3164642A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Ilt3-binding agents and methods of use thereof
BR112022013756A2 (pt) 2020-01-13 2022-10-11 Denali Therapeutics Inc Anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos
IL272390A (en) 2020-01-30 2021-08-31 Yeda Res & Dev Cancer treatment methods
US20210317216A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-14 Symphogen A/S Anti-flt3 antibodies and compositions
WO2022057910A1 (en) * 2020-09-17 2022-03-24 I-Mab Biopharma Co., Ltd Combination therapies targeting c5ar and pd-1/pd-l1 pathways
JP2023549140A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド 操作されたキメラ融合タンパク質組成物およびその使用方法
WO2022109611A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Simcere Innovation, Inc. Armed dual car-t compositions and methods for cancer immunotherapy
CA3207815A1 (en) * 2021-03-09 2022-09-15 Desmond Mascarenhas Modulation of mammalian cell lineage by synthetic immodulins
TW202321312A (zh) * 2021-09-08 2023-06-01 ***聯邦商拜奧卡德聯合股份公司 包含基於ｍｈｃ或ｍｈｃ樣蛋白的異源二聚體的二價雙特異性嵌合抗體
WO2023076983A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
AU2022376954A1 (en) 2021-10-29 2024-05-02 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2023094436A1 (en) * 2021-11-26 2023-06-01 Technische Universität Dresden Placental macrophages for cell therapy
US20230242508A1 (en) 2021-12-22 2023-08-03 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023122581A2 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
TW202346277A (zh) 2022-03-17 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 Ｉｋａｒｏｓ鋅指家族降解劑及其用途
TW202400138A (zh) 2022-04-21 2024-01-01 美商基利科學股份有限公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｄ調節化合物
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110262348A1 (en) * 2010-03-29 2011-10-27 Vrije Universiteit Brussel Selective targeting of intratumoral cells
CN107106679A (zh) * 2014-08-08 2017-08-29 艾利妥 抗trem2抗体及其使用方法

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7294331B2 (en) 1994-03-07 2007-11-13 Immunex Corporation Methods of using flt3-ligand in hematopoietic cell transplantation
DE19638745C2 (de) * 1996-09-11 2001-05-10 Schering Ag Monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen VEGF - Rezeptorproteins (KDR)
US7442777B2 (en) * 2000-11-29 2008-10-28 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD63
US8981061B2 (en) 2001-03-20 2015-03-17 Novo Nordisk A/S Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
US8231878B2 (en) * 2001-03-20 2012-07-31 Cosmo Research & Development S.P.A. Receptor trem (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
US20070213660A1 (en) 2004-10-29 2007-09-13 Mark Richards Fibrin sealant delivery device including pressure monitoring, and method and kits thereof
EP1882392A4 (en) 2005-05-10 2009-07-01 Monsanto Technology Llc GENES AND THEIR USES FOR PLANT IMPROVEMENTS
ES2547463T3 (es) 2005-06-17 2015-10-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Moléculas de unión a ILT3 y usos de las mismas
WO2007089945A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Treating diseases by targeting silt3
US7777008B2 (en) 2006-06-19 2010-08-17 Tolerx, Inc. ILT3 binding molecules and uses therefor
WO2011116299A2 (en) * 2010-03-18 2011-09-22 Colorado State University Research Foundation Myeloid derived suppressor cell inhibiting agents
RU2012132442A (ru) 2009-12-29 2014-02-10 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Антитело к cd27
US20140045915A1 (en) * 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
US8427899B2 (en) * 2010-10-29 2013-04-23 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Self-adaptive sensing design
CN103608028A (zh) * 2011-04-28 2014-02-26 南加利福尼亚大学 人类髓源抑制性细胞癌症标记
US9696312B2 (en) 2011-09-02 2017-07-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Diagnosis and treatment of cancer expressing ILT3 or ILT3 ligand
JP6411333B2 (ja) * 2012-05-24 2018-10-24 ブイアイビー ブイゼットダブリュＶｉｂ Ｖｚｗ 腫瘍関連マクロファージのターゲティングおよびｉｎｖｉｖｏイメージング用抗マクロファージマンノース受容体単一可変ドメイン
US20150191543A1 (en) 2012-08-06 2015-07-09 The Regents Of The University Of California Engineered antibody fragments for targeting and imaging cd8 expression in vivo
TW201431880A (zh) 2012-11-07 2014-08-16 Pfizer 抗切口３（ａｎｔｉ－ｎｏｔｃｈ３）抗體及抗體－藥物共軛體
WO2014074942A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Illumina, Inc. Risk variants of alzheimer's disease
WO2014100483A1 (en) * 2012-12-19 2014-06-26 Amplimmune, Inc. Anti-human b7-h4 antibodies and their uses
EP2964648B1 (en) * 2013-03-05 2016-11-16 Merck Patent GmbH 9-(aryl or heteroaryl)-2-(pyrazolyl, pyrrolidinyl or cyclopentyl)aminopurine derivatives as anticancer agents
GB201311487D0 (en) 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules
WO2015035365A1 (en) * 2013-09-09 2015-03-12 The Nohns Hopkins University Targeting the m2-tumor associated macrophage for cancer therapy
KR20240056629A (ko) * 2014-09-28 2024-04-30 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 자극성 및 비자극성 골수성 세포의 조절
WO2016064895A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting apolipoprotein e (apoe) in neurologic disease
EP3237450B1 (en) * 2014-12-22 2021-03-03 The Rockefeller University Anti-mertk agonistic antibodies and uses thereof
WO2017058866A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Precision Immune, Inc. Anti-trem2 antibodies and uses thereof
KR20180068999A (ko) 2015-10-06 2018-06-22 알렉터 엘엘씨 항-trem2 항체 및 그의 사용방법
EP3487886A2 (en) 2016-07-22 2019-05-29 Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE) Trem2 cleavage modulators and uses thereof
US10167796B2 (en) 2017-05-17 2019-01-01 GM Global Technology Operations LLC Gasoline particulate filter regeneration strategy
CN110945018A (zh) 2017-07-27 2020-03-31 诺华股份有限公司 抗脱落酶的trem2变体
BR112019022752A2 (pt) 2017-08-03 2020-05-19 Alector Llc anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos
CN111448212A (zh) 2017-09-14 2020-07-24 戴纳立制药公司 抗trem2抗体及其使用方法
CA3083660A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. Anti-trem2 antibodies and related methods
WO2020123664A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. Methods of using anti-trem2 antibodies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110262348A1 (en) * 2010-03-29 2011-10-27 Vrije Universiteit Brussel Selective targeting of intratumoral cells
CN107106679A (zh) * 2014-08-08 2017-08-29 艾利妥 抗trem2抗体及其使用方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111601823A (zh) * 2017-11-07 2020-08-28 德克萨斯大学体系董事会 用car-t或car-nk细胞在癌症治疗中靶向lilrb4
CN111712258A (zh) * 2017-12-12 2020-09-25 开拓免疫医疗公司 抗trem2抗体和相关方法
CN111712258B (zh) * 2017-12-12 2024-03-15 开拓免疫医疗公司 抗trem2抗体和相关方法
CN108085393A (zh) * 2018-01-31 2018-05-29 北京泱深生物信息技术有限公司 肾透明细胞癌相关生物标志物及其应用
CN108085393B (zh) * 2018-01-31 2020-06-02 青岛泱深生物医药有限公司 肾透明细胞癌相关生物标志物及其应用
CN112135632A (zh) * 2018-02-02 2020-12-25 肿瘤免疫股份有限公司 选择和设计用于癌症疗法的更安全且更有效的抗ctla-4抗体的方法
CN113038988A (zh) * 2018-10-15 2021-06-25 诺华股份有限公司 稳定trem2的抗体
CN109609463A (zh) * 2019-01-10 2019-04-12 中国医学科学院肿瘤医院 一种***肿瘤原代细胞分离及培养方法
CN109609463B (zh) * 2019-01-10 2022-07-01 中国医学科学院肿瘤医院 一种***肿瘤原代细胞分离及培养方法
CN110836974A (zh) * 2019-11-07 2020-02-25 西安交通大学医学院第一附属医院 Flt3lg蛋白在制备肺腺癌术后预后评估试剂或者试剂盒中的应用

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Publication number Publication date
ZA201701658B (en) 2018-04-25
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