CN106928170B - 一种二氢呋喃联苯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/78—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans
    • C07D307/79—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring

Abstract

本发明公开了一种二氢呋喃联苯类化合物及其制备方法和应用，所述的联苯类化合物分子式为C18H18O4，该化合物命名为2‑isopropenyl‑6‑methoxy‑7‑hydroxy‑(4‑hydroxyphenyl)‑dihydrobenzofuran，具有下述结构式：
Figure 972352DEST_PATH_IMAGE001
所述制备方法是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离步骤。所述的应用为联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。经抗轮状病毒活性实验，选用病毒唑作为对照，2‑isopropenyl‑6‑methoxy‑7‑hydroxy‑(4‑hydroxyphenyl)‑dihydrobenzofuran对轮状病毒的CC50和EC50值分别为164.2和12.9μmol/L，其具有较好的抗轮状病毒活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗轮状病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。

Description

一种二氢呋喃联苯类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种二氢呋喃联苯类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
藤黄科(Garcinia L.)植物全球约450种，产亚洲、非洲南部及波利尼西亚西部，我国有 21 种，分布于广东、广西、云南等南部省区。藤黄科植物还是天然呫吨酮（xanthones）类成分的主要资源之一，富含异戊烯基取代的呫吨酮（xanthones），这类成分结构新颖多样，且具有广泛的药理活性，尤以藤黄酸(gambogic acid)最具代表性，具有广谱强效的抗肿瘤活性，是近年来抗肿瘤天然产物的研究热点之一，我国学者正在开发其注射液为抗肿瘤一类新药。除呫吨酮（xanthone）类外，苯甲酮类(benzophenones)、双黄酮类(bioflavonoids)和联苯类(biphenyls)等化合物也是本科植物的特征性成分，也具有多种生物活性。为了更有效地利用我国藤黄科植物资源，从中寻找具有开发前景的活性成分，我们选择对藤黄科植物开展较***的活性成分研究工作。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种联苯类化合物；第二目的在于提供所述联苯类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的联苯类化合物是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C18H18O4，命名为2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，具有下述结构式：
Figure 640753DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的联苯类化合物的制备方法，是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将藤黄科乔木枝条、叶或果实粗粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~4次，每次40~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏 a 中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的100~200目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为100~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 7:3 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-8、C-18、ODS或MCI装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量55~80%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14mL/min，21.2× 250 mm，5um 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~60uL，收集16~32min的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
本发明联苯类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和其他波谱技术测定方法确定为联苯类化合物，并表征其具体结构为：
Figure 49738DEST_PATH_IMAGE001
化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，为橙黄色胶状物；紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max（log ε）：570 (1.79),266 (3.69), 226 (3.82), 204 (3.96) nm；红外光谱（溴化钾压片）V max 3432, 2924,2852, 1630, 1503, 1450, 1374, 1243, 1173, 1096, 1054, 1027, 905, 855, 824,591 cm–1； HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 298.1202 [M]+（计算值为298.1205），结合13C 和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见图4）给出其分子式为C18H18O4。1H NMR（C5D5N，500 MHz）和13C NMR（C5D5N，125 MHz）数据，见图4。
HRESIMS 显示其准分子离子峰为298.1202 [M]+ (计算值 298.1205)，结合 13CNMR谱确定分子式为 C18H18O4，不饱和度为10。红外吸收光谱在 3432 cm-1 表明羟基的存在，在1630、1503 cm-1表明苯环的存在，紫外光谱在204、226、266 nm有最大吸收也证实了苯环的存在。13C NMR和1H NMR 谱数据显示了联苯结构的特征信号。1H NMR 数据显示有一个芳香质子δ H 6.81 (1H, s)，表明该化合物是具有五取代的联苯结构。芳香质子δ H 6.81 (1H,s) 为H-5，是因为在HMBC中显示它和C-4 (δ C 128.8)、C-9 (δ C 118.7)、C-7 (δ C 132.1)、C-6 (δ C 150.0) 和C-1′′ (δ C 132.5)有相关。1H NMR 数据显示了一个对位取代的苯环 [δ H7.58 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′′, H-6′′) 和 7.33 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′′,5′′)]，一个异丙烯基香豆酮的部分信号 [δ H 3.44 (1H, dd, J = 15.2, 9.0 Hz, H-3),3.23 (H, dd, J = 15.2, 8.6 Hz, H-3), 5.30 (1H, t, J = 8.6 Hz, H-2), 4.88 (1H,s, H-2′), 5.22 (1H, s, H-2′) 和 1.72 (3H, s, H-3′)]，还有一个甲氧基 (δ H 3.84,3H, s, 6-OMe)。在HMBC中，H-3和 C-4、C-9、C-8 (δ C 149.1) 相关，H-2 和 C-8、C-9相关，可以知道异丙烯基香豆酮和C-8、C-9相连。甲氧基 (δ H 3.84) 的取代在C-6位，可由它与C-6的HMBC的相关确认。根据其分子式可知两个羟基分别位于C-7、C-4′′位。至此，该化合物的结构得到确定，命名为2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。经抗轮状病毒活性实验，选用病毒唑作为对照，2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran对轮状病毒的 CC50和 EC50值分别为164.2 和 12.9 μmol/L，其具有较好的抗轮状病毒活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗轮状病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
附图说明
图1为化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran的核磁共振碳谱（13C NMR）。
图2为化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran的核磁共振氢谱（1H NMR）。
图3为化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran的主要HMBC（→）相关。
图4为化合物的碳谱氢谱数据归属。
图5为化合物的抗轮状病毒活性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的联苯类化合物是以干燥的藤黄科乔木的枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C18H18O4，命名为2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，具有下述结构式：
Figure 88363DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明所述的联苯类化合物的制备方法，其特征在于是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将藤黄科乔木枝条、叶或果实粗粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~4次，每次30~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为100~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以7:3配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-8、C-18、ODS或MCI装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量55~80%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14mL/min，21.2×250 mm，5um 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~60uL，收集16~32min的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran：
A步骤所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇或甲醇；
B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、***、石油醚或苯；
C步骤所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；
C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。
本发明所述的联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
本发明所述的藤黄科植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
实施例1
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实 5.7 kg，粗粉碎至 40 目，用70%的丙酮超声提取 5次，每次60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成368g浸膏a；在浸膏a中加入600g水，用与水等体积的氯仿萃取4次，合并萃取相，减压浓缩成247g浸膏b；用200目硅胶1600g装柱，在浸膏b中加入600g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶250g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到9个部分，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为67g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以60%的甲醇为流动相，流速8mL/min，21.2×250mm，5um 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50uL，收集15min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例2
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实3kg，粗粉碎至 20 目，用100%的乙醇超声提取 3 次，每次60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/3；静置，滤除沉淀物，浓缩成189g浸膏a；在浸膏 a 中加入360g的水，用与水等体积的氯仿萃取 4 次，合并萃取相，减压浓缩成158g浸膏b；用100目硅胶900g装柱，在浸膏 b 中加入260g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶260g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的正己烷-丙酮混合有机溶剂的洗脱液 c 为76g；用反相材料C-8装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以68%的甲醇为流动相，流速14mL/min，21.2×250mm，5um的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50uL，收集21min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例3
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实6kg，粗粉碎至 30目，用80%的甲醇超声提取 4 次，每次30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成392g浸膏a；在浸膏a中加入700g的水，用与水等体积的***萃取 4 次，合并萃取相，减压浓缩成 242g 浸膏 b ；用100目硅胶1600g装柱，在浸膏 b 中加入 320g 的丙酮溶解，然后加入 100 目硅胶 260g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为45g；用反相材料 ODS 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量 50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 55% 的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，5um 的Zorbax PrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254nm，每次进样 50uL，收集 19min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例4
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实5.3kg，粗粉碎至 40 目，用90%的乙醇超声提取 3 次，每次45min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成 321g 浸膏 a ；在浸膏 a 中加入680g的水，用与水等体积的石油醚萃取 4 次，合并萃取相，减压浓缩成235g浸膏b；用100目硅胶1450g装柱，在浸膏 b 中加入 290g 的丙酮溶解，然后加入100目硅胶265g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC监测，合并相同的部分；体积比 9:1 的石油醚-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为 52g ；用反相材料MCI装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含量 50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 70% 的甲醇为流动相，流速10mL/min，21.2×250mm，5um 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，收集 14min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例5
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实10 kg，粗粉碎至20目，用70%的甲醇超声提取4次，每次35 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成879g浸膏a；在浸膏a中加入1700g的水，用与水等体积的苯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成445g浸膏b；用200目硅胶3330 g装柱，在浸膏b中加入900 g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶580g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液c为105 g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以50%的甲醇为流动相，流速12 mL/min，21.2 ×250 mm，5um 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，收集31 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例6
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实8.1 kg，粗粉碎至20目，用100%的丙酮超声提取4次，每次30 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成638g浸膏a；在浸膏a中加入1200g的水，用与水等体积的苯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成362g浸膏b；用200目硅胶2400 g装柱，在浸膏b中加入500 g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶400g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液c为87 g；用反相材料ODS装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以62%的甲醇为流动相，流速12 mL/min，21.2 ×250 mm，5um 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，收集22 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例7
取实施例1制备的化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，为橙黄色胶状物；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构：
（1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max（log ε）：570 (1.79), 266 (3.69), 226(3.82), 204 (3.96) nm；
（2）红外光谱（溴化钾压片）V max 3 432, 2 924, 2 852, 1 630, 1 503, 1 450,1 374, 1 243, 1 173, 1 096, 1 054, 1 027, 905, 855, 824, 591 cm–1；
（3）HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 298.1202 [M]+（计算值为298.1205），结合13C 和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见图4）给出其分子式为C18H18O4。1H NMR（C5D5N，500 MHz）和13C NMR（C5D5N，125 MHz）数据，见图4；
HRESIMS 显示其准分子离子峰为298.1202 [M]+ (计算值 298.1205)，结合 13CNMR谱确定分子式为 C18H18O4，不饱和度为10。红外吸收光谱在 3432cm-1 表明羟基的存在，在1630、1503 cm-1表明苯环的存在，紫外光谱在204、226、266 nm有最大吸收也证实了苯环的存在。13C NMR和1H NMR 谱数据显示了联苯结构的特征信号。1H NMR 数据显示有一个芳香质子δ H 6.81 (1H, s)，表明该化合物是具有五取代的联苯结构。芳香质子δ H 6.81 (1H,s) 为H-5，是因为在HMBC中显示它和C-4 (δ C 128.8)、C-9 (δ C 118.7)、C-7 (δ C 132.1)、C-6 (δ C 150.0) 和C-1′′ (δ C 132.5)有相关。1H NMR 数据显示了一个对位取代的苯环 [δ H7.58 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′′, H-6′′) 和 7.33 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′′,5′′)]，一个异丙烯基香豆酮的部分信号 [δ H 3.44 (1H, dd, J = 15.2, 9.0 Hz, H-3),3.23 (H, dd, J = 15.2, 8.6 Hz, H-3), 5.30 (1H, t, J = 8.6 Hz, H-2), 4.88 (1H,s, H-2′), 5.22 (1H, s, H-2′) 和 1.72 (3H, s, H-3′)]，还有一个甲氧基 (δ H 3.84,3H, s, 6-OMe)。在HMBC中，H-3和 C-4、C-9、C-8 (δ C 149.1) 相关，H-2 和 C-8、C-9相关，可以知道异丙烯基香豆酮和C-8、C-9相连。甲氧基 (δ H 3.84) 的取代在C-6位，可由它与C-6的HMBC的相关确认。根据其分子式可知两个羟基分别位于C-7、C-4′′位。至此，该化合物的结构得到确定，命名为2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例8
取实施例2制备的化合物，为橙黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C18H18O4。确认实施例2制备的化合物为所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例9
取实施例3制备的化合物，为橙黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C18H18O4。确认实施例3制备的化合物为所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran；
图4 化合物的1H和13C NMR数据（溶剂为C5D5N）(125 and 500 MHz)。
实施例10
取实施例4制备的化合物，为橙黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C18H18O4。确认实施例4制备的化合物为所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例11
取实施例5制备的化合物，为橙黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C18H18O4。确认实施例5制备的化合物为所述的联苯类化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。
实施例12
取实施例 1~5 所制备的任一联苯类化合物进行细胞毒活性检测试验，试验情况如下：
细胞株: 罗猴肾细胞系(MA-104)由上海微蒙生物科技有限公司提供。
实验设计: MA-104细胞与不同浓度化合物温育 72 小时, 每株细胞的实验均重复一次, 用两次实验的结果进行数据处理, 采用改良MTT 法评价化合物对细胞增殖的抑制程度, 计算抑制率, 根据抑制率采用Logit方法计算IC50, 比较化合物的体外抗肿瘤活性。
EC50即指半数有效浓度，是指引起 50％ 试验动物产生某一特定反应，或是某反应指标被抑制一半时的浓度。
CC50即指半数细胞毒性浓度，是指对半数细胞产生毒性作用所需浓度。在本实验中，指致 50％ 细胞死亡所需的药物浓度。
化合物细胞毒性测定
化合物用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶解，于微波消毒 10 min，用MEM 配成 l mg/mL 的母液备用，MEM 溶液稀释成所需浓度。96 孔细胞培养板，加 l ×105 /mL 浓度的 MA-104 细胞悬液，100 ul/孔，37℃、5%CO2 孵箱培养 24 h，在生长良好的单层细胞上分别加入浓度分别为 l mg/mL、0.2 mg/mL、40 ug/mL、8 ug/mL、1.25 ug/mL 的化合物;100 ul/孔，每个浓度设 3 个复孔，同时设正常细胞对照。置于 37℃，5%CO2 孵箱继续培养 24h 后，MTT 法检测细胞存活率。
化合物对病毒感染预防作用
以浓度为 104/mL，每孔 l00ul 接种细胞于 96 孔板中，培养 24 小时，见细胞长成单层并生长状况良好，用浓度分别为 100 ug/mL、75 ug/mL、50 ug/mL、25 ug/mL、l ug/mL 的化合物在 37℃ 孵箱预先作用细胞 1.5 h，PBS 洗涤后以100 TCID 50/mL 的轮状病毒每孔 100 ul 吸附 1 h 后弃去，加 MEM 培养基 100 ul/孔 维持，置 37℃、5% CO2 孵箱，每日观察细胞病变情况。48h 后以 MTT 法检测病毒抑制率。
细胞存活率测定
采用 MTT 法，在培养 48h 的细胞中加入 5 mg/mL 甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT) 20 ul，继续培养 3-4 h，弃上清，加入 DMSO 每孔 100 ul，振荡使孔内结晶完全溶解后立即在 490 nm 波长下测定吸光度 A 值：
细胞存活率=药物组平均 A 值/细胞对照组 A 值× 100%
病毒抑制率=[实验组平均 A 值一病毒对照组平均A值]/[细胞对照组平均A 值一病毒对照组平均 A 值] × 100%
治疗指数(TI)=半数毒性浓度(CC50)/半数抑制浓度(IC50)。
实验结果
实验结果表明：经抗轮状病毒活性实验，选用病毒唑作为对照，2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran对轮状病毒的 CC50和 EC50值分别为 164.2 和 12.9 μmol/L，其具有较好的抗轮状病毒活性（如图5所示）。

Claims (3)

1.一种二氢呋喃联苯类化合物，其特征是：所述的联苯类化合物是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、反相柱层析、高效液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C18H18O4，具有下述结构式：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种权利要求1所述的联苯类化合物的制备方法，其特征在于是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、反相柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将藤黄科乔木枝条、叶或果实粗粉碎到20~40目，用80~100%的丙酮、乙醇或甲醇超声提取2~4次，每次30~60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、***、石油醚或苯；
C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重0.8~ 1.2倍的100~200目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为100~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯，所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1；
D、反相柱层析：将以配比为7:3或9:1的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-8、C-18、ODS或MCI 装柱；用体积含量为 40~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量55~80%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的联苯类化合物；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14 mL/min，21.2×250 mm，5 um的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~60 uL，收集16~34 min的色谱峰，多次累加后蒸干；即得所述的联苯类化合物 。
3.一种权利要求1所述的联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
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