CN106916772A - 一株耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌及其应用 - Google Patents

一株耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP，其保藏编号为：CGMCC NO.13928。所述甘蔗兰希氏菌可在30‑75℃范围内生长，最适生长温度为60℃，可产生蛋白酶、脂肪酶等多种降解酶；在酒精度(V/V)为1‑13％和pH值为3‑12的固体和液体培养基良好生长，非常适合目前白酒酒糟的“pH值由低到高、酒精度由高到低再到高”的动态高温腐熟工艺特点，无需进行酒糟的降酒精度、降酸度等方式处理，减少了处理工序，节约了人力、物力、财力和时间，1d达到55℃，3d达到85℃，83‑85℃维持3d，发酵周期仅仅15‑16d，有效提高了有机肥料的产量和质量，防止了酒糟的二次污染腐败和土壤碱化，保护了环境和土壤，为白酒酒糟直接高温堆肥腐熟制作高质量有机肥料开辟了一条新的捷径。

Description

一株耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及酒糟腐熟菌，具体涉及一株耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌及其应用。
背景技术
酒糟是酿酒过程中的直接下脚料，目前我国需要处理的酒糟达5000万吨以上，因此，对于发酵后的酒糟处理问题一直为人们所关注。白酒酒糟，极易发酵腐败，散发恶臭易对环境造成污染。因其含有大量粗脂肪、粗淀粉、粗蛋白以及丰富的氮磷钾和多糖等成分，是极好的有机肥源。因此利用酒糟制作有机肥料，既能解决环保问题，变废为宝，又可以为绿色农业生产提供优质有机肥料，减少化肥的使用量，具有较高的经济效益、环保效益和社会效益。
酒糟高温堆肥腐熟是目前酒糟制作有机肥料的最主要的方式，酒糟腐熟菌是酒糟有机肥料制作过程的关键原料，是成品质量和效益的重要保障，但是，白酒酒糟不同于其它有机肥料发酵基质的重要特征是：新鲜酒糟含水量大(60-65％)、酸度高(pH值3.4-4.0)、酒精度高(6-10％)，不利于酒糟腐熟菌的的生长和繁殖，很难直接发酵腐熟。因此，为了创造一个良好的发酵基质环境，大多酒糟腐熟工艺都会向酒糟中加入秸秆粉、木屑粉等调整水分和碳氮比；加入生石灰、草木灰等降低酸度；将酒糟摊凉、敞口通风以降低酒精度。
中国专利CN 105296378A公开了一种酒糟快速腐熟的菌种及其应用，菌种保藏号为CGMCC No.8268，分类命名：莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)，用于制备腐熟酒糟有机肥，达到有机肥料的技术指标，一般情况4～5天，条垛温度升到60～65℃，并在条垛上长满菌丝体，进行第一次翻堆；2～3天后，温度再次上升到60～65℃，长满菌丝体，进行翻堆；进入发酵高温期，视条垛温度而定，原则保持条垛温度不超过65℃，翻堆频率为隔天或每天；发酵周期为20～25天，其中，用生石灰将酒糟pH调节到6～6.5之间。
中国专利CN 104151042B公开了一种酒糟有机肥及其生产方法，该酒糟有机肥的发酵物料包含如下质量份组分：酒糟100份、秸秆3～5份、锯木面1～2份、生石灰2～2.5份和菌种0.2～0.3份；将发酵物料接菌种混合均匀后建成条垛进行发酵，条垛温度升到60～65℃时进行翻堆，以保持条垛温度不超过65℃的原则调整翻堆的频率，发酵结束后再自然通风1～2月，进一步粉碎、过筛后得到酒糟有机肥最终产品；所述的菌种通过包含如下步骤的方法制备：将腐熟菌剂及其干重2.5～3倍的砻糠充分搅拌均匀进行活化和扩散，再加入腐熟菌剂干重4.5～5倍的锯木面搅拌均匀；所述的腐熟菌剂的主要构成为保藏编号为CGMCCNo.8143的解淀粉芽孢杆菌和保藏编号为CGMCCNo.8268的莫海威芽孢杆菌；发酵周期为20～25天。
中国专利CN 106146105A公开了一种含氨基酸的木薯酒糟有机肥，该有机肥包括如下质量份数的原料：木薯酒糟800-900份，草木灰175-250份，植物蛋白50-100份，复合菌种0.2-0.4份；所述复合菌种由耐热芽孢杆菌和梅久兰链霉菌按1:1-1.2的质量比组成。
王和玉、江有峰、胡旭等发表了“复合菌剂对白酒丟糟高温好氧堆肥的影响”(酿酒科技2015,1:19-22)，将具有高效纤维素降解能力和氨化作用的复合菌剂接种到以白酒丢糟为主要原料的堆肥中，通过测定堆积发酵过程各种发酵参数和成分变化，以研究复合菌剂对白酒丢糟高温好氧堆肥的影响。结果表明，在堆肥过程中，接菌堆体比对照(CK)提前2d进入高温期，且高温期持续时间较对照长。堆肥结束，接菌堆体NH4 +-N含量和总氮损失率分别比CK低28.3％、4.1％，而NO3 --N含量、有机氮和总氮含量分别比CK高出22.2％、6.6％和7.9％。接菌处理的纤维素降解率、腐殖化指数(HI)和发芽指数(GI)分别比CK高18.7％、113.5％和8.6％。复合菌剂的添加促进了白酒丢糟堆肥化的进行，有效地提高了有机肥的品质。
上述专利文献和技术文献中公开的酒糟腐熟菌耐酸碱度低、耐酒精度差，需要对酒糟进行降酸和降低酒精度预处理才可正常腐熟发酵，耐温性也不很理想，进入高温腐熟的时间长而维持高温腐熟的时间短，发酵周期长，实际应用受到很大限制。
甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)分离自甘蔗和自己发热的蔗渣中，属于莱斯氏属(Laceyella)。莱斯氏属(Laceyella)是2005年由Yoon等将高温放线菌属分成4个属之一，其它3个属是高温放线菌属(Thermoactinomyces)、黄色高温微杆菌属(Thermoflavimicrobium)、清野氏菌属(Seinonella)。同年Hatayama等报道了直丝菌属(Plani filum)，也放入“高温放线菌科”。这5个属在形态上有发育良好的菌丝体，属于放线菌。该菌最适生长温度为55-60℃，生长温度在35-65℃之间，低于33℃和超过67℃不生长。可产生多种纤维素酶、半纤维素酶等降解酶，非常适合酒糟高温堆肥腐熟。
施庆珊、梁文涛等发表了“一株高温放线菌及其在造纸污泥堆肥过程中的应用”(农业环境科学学报2008,27(1):0368-0371)，公开了高温放线菌是堆肥过程中微生态环境的重要组成成分,在好氧堆肥的升温期对有机物的分解发挥重要的作用。在造纸污泥堆肥过程的高温期分离到一株高温放线菌AO-Ⅲ,其形态和主要生理生化特征与高温放线菌属的典型种相似,但该菌株能耐受80℃以上的高温。菌株AO-Ⅲ16S r DNA序列经校对、拼接后与Gen Bank数据库中相关种的序列进行比对,并通过MEGA3构建进化树进行分析,该菌株与甘蔗兰希氏菌(曾用名:普通高温放线菌,登录号:AY114169.1)高度同源,同源率为99.9％,因此,菌株AO-Ⅲ鉴定为甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)。以该菌株为外源微生物添加到造纸污泥与味精废液的混合物中进行堆肥试验。结果表明,在高温好气性堆肥发酵过程中达到高温阶段(80℃以上)的时间由原来的3d缩短为1d,高温好气性发酵周期由20d缩短至10d,水份由55％降至40％以下。该菌株能够维持较长的高温期时间及缩短堆肥发酵周期。上述技术文献中公开的甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)虽然耐高温性能较好，发酵周期短，但并未公开耐酸碱性、耐酒精度和是否适合白酒酒糟的堆肥腐熟。
中国专利CN 104909854A公开了一种酱香白酒糟有机肥及其制备方法，该有机肥的发酵原料包括以下成分：酱香白酒糟80-90份，菜籽饼5-10份，骨粉4-8份，秸秆3-4份，锯木粉3-4份，玉米棒芯5-10，鸡蛋壳2-4份，生石灰1-2份，腐熟菌剂0.1-0.2份，餐厨垃圾2-4份，该有机肥重金属含量少、养分足，所述腐熟菌剂由芽孢杆菌、酵母菌、放线菌和醋酸杆菌复合而成。
中国专利CN 106278526A公开了一种微生物有机肥的制备方法，其步骤为：将原料草炭、酒糟、油枯按比例混合调节水分和pH值后，加入高温腐熟剂，混合均匀后进行堆肥发酵；然后在堆肥发酵的肥料中加入功能菌剂搅拌均匀即得微生物有机肥；所述的高温腐熟剂为液态菌剂，所述液态菌剂的活菌含量为1.8-2.5亿/ml；所述液态菌剂的菌种包括枯草芽孢杆菌、放线菌及酵母菌，所述枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌的菌种数量比为3:4:3，所述高温腐熟剂的添加的重量为肥料基质调整水分含量和pH值后的总重量的0.4-0.6％。
上述专利文献中公开的放线菌耐酸碱度低、耐酒精度差，耐温性也不很理想，仍然不适合白酒酒糟直接高温堆肥腐熟。
综上，虽然公开的白酒酒糟高温腐熟菌较多，且无论单菌发酵还是混菌发酵，都需要进行酒糟的降酒精度、降酸度等方式处理，工序复杂，浪费人力、物力、财力和时间，同时还会造成酒糟的二次污染腐败和土壤碱化，污染环境，并且，随着高温腐熟过程的进行，酒糟的pH值升高，继续发酵，酒精度会继续升高(3-6％)。
因此，提供一株耐酸碱(pH值宽泛)、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)，以直接高温腐熟白酒酒糟，无需进行酒糟预处理和成分调整，将是本领域技术人员的迫切需要。
发明内容
本发明首要目的是克服现有白酒酒糟腐熟菌的缺陷，提供一株耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP；
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
从河北省唐山市牛粪高温腐熟物中分离、初筛、纯化得到18株耐高温腐熟菌，经耐酸、耐碱、耐酒精复筛得到1株耐酸碱、耐高温腐熟菌，综合形态特性，培养特性、生理生化特性、遗传特性鉴定为甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP；
所述甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP是从河北省唐山市牛粪高温腐熟物中分离、纯化、筛选得到的。该菌株已于2017年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.13928，分类命名为甘蔗兰希氏菌Laceyella sacchari；
所述甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP可在30-75℃范围内生长，最适生长温度为60℃；可产生蛋白酶、脂肪酶等多种降解酶。
所述甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP在酒精度(V/V)为1-13％的不同浓度的NA液体培养基中50℃培养3d后涂布NA平板和NA液体培养基试管中50℃培养3d，均能生长良好，两项试验均证明该菌株可耐受酒精度范围在1-13％，具有较强的酒精度耐受度。
所述甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP在pH值为3-12的不同酸碱度的NA液体培养基中50℃培养3d后涂布NA平板和NA液体培养基试管中50℃培养3d，均能生长良好，两项试验均证明该菌株可耐受pH值的范围为3-12，较为宽泛，具有较强的酸碱耐受度。
本发明的另一目的是提供甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP在快速腐熟白酒酒糟方面的应用。
有益效果：
本发明分离得到的甘蔗兰希氏菌CP除具有普通高温放线菌耐高温特性外，具有非常强的耐酒精、耐酸碱特性，非常适应目前白酒酒糟“pH值由低到高、酒精度由高到低再到高、高温发酵”的动态高温发酵腐熟工艺特点，无需进行酒糟的降酒精度、降酸度等方式处理，减少了处理工序，节约了人力、物力、财力和时间，进入高温期短(1d达到55℃，3d达到85℃)，维持高温发酵时间长(83-85℃维持3d)，缩短了发酵周期(仅仅15-16d)，比现有白酒酒糟腐熟剂缩短26-27天，有效提高了有机肥料的产量和质量(腐熟度)，防止了酒糟的二次污染腐败和土壤碱化，保护了环境和土壤，为白酒酒糟直接高温堆肥腐熟制作高质量有机肥料开辟了一条新的捷径，具体技术效果见实施例4，具体技术原理如下：
1.本发明甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP在酒精度(V/V)为1-13％的不同浓度的NA平板及液体培养基中，50℃培养3d，均能生长良好，且试管浑浊度明显，证明该菌株可耐受酒精度范围在1-13％，具有较强的酒精度耐受度。
2.本发明甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP在pH值为3-12的不同酸碱度的NA平板及液体培养基中，50℃培养3d，均能生长良好，且试管浑浊度明显，证明该菌株可耐受pH值的范围为3-12，较为宽泛，具有较强的酸碱耐受度。
3.本发明甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP可在30-75℃范围内生长，最适生长温度为60℃；可产生蛋白酶、脂肪酶等多种降解酶。
附图说明
图1为甘蔗兰希氏菌CP在NA平板上生长的革兰氏染色电镜图；
图2为白酒酒糟堆肥过程中不同腐熟处理下温度的变化；
图3为白酒酒糟堆肥过程中不同腐熟处理下pH值的变化；
图4为白酒酒糟堆肥过程中不同腐熟处理下有机质含量的变化；
图5为白酒酒糟堆肥过程中不同腐熟处理下全氮含量的变化；
图6为白酒酒糟堆肥过程中不同腐熟处理下水分含量的变化。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP的分离、纯化、筛选与鉴定
1)分离、初筛：从河北省唐山市牛粪高温腐熟物中采集样品带回实验室，取10g样品加到含有100mL冷却无菌水的带玻璃珠灭菌三角瓶中，200r/min摇床震荡混匀30min，然后放在80℃水浴锅中，水浴10min，不断摇动三角瓶混匀土样，静置5min吸取上清液1mL，依次梯度稀释得到10-3～10-9浓度，选取10-3，10-4，10-5，10-6的稀释浓度，用移液器分别吸取各个梯度悬浮液100μL，用涂布器均匀涂布到营养琼脂平板(NA平板)上，以无菌水对照，将平板倒置于培养箱，50℃培养5d，每个处理设置水平重复3组，根据微生物菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶色素等方面的特征，初步筛选获得18株耐高温、长势良好、直径较大的单个菌落；
2)纯化：将步骤1)获得的18株耐高温菌落分别在NA平板上划线接种，50℃培养3d，根据各菌落特点进行筛选纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征表现为一致时视为单一菌种的菌落，如此获得18株耐高温纯化菌株；
3)复筛：将步骤2)获得的18株耐高温纯化菌株分别接种至pH值为5的NA液体培养基中，200r/min、50℃条件下摇床培养3d，用移液枪吸取100uL培养液涂布于NA平板中，50℃倒置培养2d，选取长势较好，菌落直径较大的10株耐高温、耐酸性菌株；
将10株耐高温、耐酸性菌株分别接种至pH值为10的NA液体培养基中200r/min、50℃条件下摇床培养3d。用移液枪吸取100uL培养液涂布于NA平板中，50℃倒置培养2d，选取长势较好、菌落直径较大6株耐高温、耐酸碱性菌株；
将6株耐高温、耐酸碱性菌株分别接种于含酒精度为10％(V/V)的NA液体培养基中，200r/min、50℃条件下摇床培养3d，用移液枪吸取100uL培养液涂布于NA平板中，50℃倒置培养2d，选取长势较好，菌落直径最大的1株耐高温、耐酸碱、耐酒精菌株CP；
所述NA平板培养基质量组成为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂20g，水1L，pH值7.2；
所述NA液体培养基质量组成为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，水1L，pH值7.2；
4)鉴定：
A：培养特性：
将获得的耐高温、耐酸碱、耐酒精度菌株CP接种到NA平板，50℃倒置培养1d。用革兰氏染色法进行染色并电镜检验。菌体染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，基内菌丝不发达、无隔膜，气生菌丝发达、多分化为孢子，孢子呈球形(见附图1)；
将菌株CP划线接种到NA平板中，于25℃、30℃、35℃，40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，倒置培养2d，每组实验设置三组水平实验，观察并比较不同培养条件下的单菌落直径。实验结果表明：该菌株CP可在30-75℃范围内生长，在60℃生长菌落直径最大，故最适生长温度为60℃；
将所述菌株CP分别接种到高氏一号琼脂培养基、燕麦琼脂培养基、麦芽汁酵母膏琼脂培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、天门冬素琼脂培养基50℃恒温培养2～3d，观察并记录菌落特征：一般指基内菌丝的颜色和是否产生可溶色素等。颜色记录参考《链霉菌鉴定手册》，菌落特征如表1。
所述高氏一号琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉20g,NaCl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1L,pH 7.4；
所述燕麦琼脂培养基质量组成：燕麦粉20g，琼脂20g，微量盐溶液1mL，蒸馏水补充至1L，pH 7.2；
所述麦芽汁酵母膏琼脂培养基质量组成：酵母粉4g，麦芽粉10g，葡萄糖4g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2；
所述无机盐淀粉琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉10g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O1g，NaCl 1g，(NH4)2SO4 2g，CaCO3 2g，微量盐溶液1g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2；
所述天门冬素琼脂培养基质量组成：甘油10g，L-天冬酰胺1g，微量盐溶液1mL，K2HPO41g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH自然；
所述微量盐溶液质量组成：FeSO4.7H2O0.1g，MnSO4·H2O 0.1g，ZnSO4 0.1g，蒸馏水100mL；
表1：菌落特征
B.生理生化特性：
所述菌株CP淀粉水解实验、牛奶胨化实验、牛奶凝固实验均为阳性；纤维素分解实验为弱阳性；黑色素产生实验、明胶液化实验为阴性；能够利用葡萄糖、甘露糖、果糖、乳糖、半乳糖、山梨糖；不能利用鼠李糖、棉籽糖、蔗糖、木糖、核糖、肌醇；对***糖利用成弱阳性；
参照《放线菌的分类与鉴定》和《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》的相关内容进行生理生化鉴定。主要生理生化特性如表2。
表2：主要生理生化试验结果
W*为弱阳性
C.遗传特性：利用TRAN基因组DNA提取试剂盒提取所述菌株CP的DNA。依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物。引物27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTCA-3'；引物1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'由北京六合华大基因科技有限公司合成。PCR反应条件：94℃4min，后94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物在25℃与质粒连接15min，后水浴热激45s转入大肠杆菌感受态，进行克隆培养，通过蓝白斑筛选获得含有目的基因的菌株，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序(具体见序列表)。测序结果进行双向拼接后，将得到的16S rDNA序列在EzBioCloud网站上比对，结果为甘蔗兰希氏菌Laceyella sacchari，同源性为99.65％。
综合菌株CP的培养特性、生理生化特性及遗传特性将菌株CP确定为甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)，属于莱斯氏属(Laceyella)。
莱斯氏属(Laceyella)是2005年由Yoon等将高温放线菌属分成4个属之一，其它3个属是高温放线菌属(Thermoactinomyces)、黄色高温微杆菌属(Thermoflavimicrobium)、清野氏菌属(Seinonella)。同年Hatayama等报道了直丝菌属(Plani filum)，也放入“高温放线菌科”。这5个属在形态上有发育良好的菌丝体，属于放线菌，但有细菌样的内生孢子；细胞壁含meso-DAP，无特征性糖(细胞壁Ⅲ型)，属于放线菌；用Tm法测定，DNA的(G+C)mol％含量在52～58，属于放线菌，用HPLC法测定，为40～49，属于低(G+C)mol％***，因此，有学者认为该科的位置应该是低(G+C)***和高(G+C)***(放线菌)之间的界限微生物。
所述甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP是从河北省唐山市牛粪高温腐熟物中分离、纯化、筛选得到的。该菌株已于2017年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.13928，分类命名为甘蔗兰希氏菌Laceyella sacchari；
实施例2甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP pH值耐受性试验
将甘蔗兰希氏菌CP斜面菌种挑取适量菌体接入100mL NA液体培养基，50℃、200r/min摇床培养24h得种子液，首先以1‰接种量接入分别调成pH值为1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5，12的NA液体培养基中，50℃、200r/min摇床培养培养3d后涂布NA平板,观察生长情况；然后再将种子液以1‰接种量接入相同pH值梯度的NA液体培养基试管，50℃、200r/min摇床培养3d，观察浑浊度。
试验结果：甘蔗兰希氏菌CP在pH值3-12的NA液体培养基中50℃培养3d，涂布NA平板均能生长良好；在NA液体培养基试管50℃、200r/min摇床培养3d后生长良好，浑浊度明显，两项试验均证明甘蔗兰希氏菌CP可耐受pH范围在3-12，具有较高的酸碱度耐受性。
实施例3甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP酒精耐受性试验：
将甘蔗兰希氏菌CP斜面菌种挑取适量菌接入100mL NA液体培养基，50℃、200r/min摇床培养24h得种子液，首先以1‰接种量接入分别调成酒精度为1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％、20％的NA液体培养基中，50℃、200r/min培养3d后涂布NA平板,观察生长情况；然后再将种子液以1‰接种量接入相同酒精浓度梯度的NA液体培养基试管，50℃、200r/min摇床培养3d，观察浑浊度。
试验结果：甘蔗兰希氏菌CP在酒精度为1-13％的NA液体培养基中50℃培养3d，涂布NA平板均能生长良好；在NA液体培养基试管50℃、200r/min摇床培养3d后生长良好，浑浊度明显，两项试验均证明甘蔗兰希氏菌CP可耐受酒精度范围为1-13％，具有较高的酒精度耐受性。
实施例4甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP在快速腐熟白酒酒糟方面的应用
(一)白酒酒糟酒糟快速腐熟剂的制备：包括如下步骤：
1.甘蔗兰希氏菌CP菌剂的制备：将甘蔗兰希氏菌CP斜面菌种用接种针接种于NA种子瓶固体培养基，60℃培养1d，并将菌体用无菌水洗脱刮下，调整菌体浓度为5×1011cfu/mL，吸取100mL菌液接种到1kg固体培养基A中，60℃培养2d，在60℃条件下干燥1d，用粉碎机进行粉碎，过40目筛即得甘蔗兰希氏菌CP菌剂，其中甘蔗兰希氏菌活菌含量为7×1011cfu/g；
所述NA种子瓶固体培养基的制备方法为：取蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1L，均匀混合，充分溶解，调整pH值为7.0，煮沸后分装到种子瓶中，每瓶80-100mL，121℃灭菌30min，摆成斜面即得；
所述固体培养基A的制备方法为：取稻壳100g，麸皮300g，玉米粉200g，豆饼粉100g，淀粉100g，红土100g，硫酸钙5g，氧化钙7.5g，磷酸氢二钾3g，硫酸镁2g，水400mL，均匀混合，121℃灭菌45min即得；
2.地衣芽孢杆菌菌剂的制备：将地衣芽孢杆菌斜面菌种用接种针接种到NA种子瓶培养基，在50℃下培养1d，并将菌体用无菌水洗脱刮下，调整菌体浓度为5×1011cfu/mL，吸取100mL菌液接种到1kg固体培养基B中，50℃培养2d，在50℃条件下干燥2d后用粉碎机进行粉碎，过40目筛即得地衣芽孢杆菌菌剂，其中地衣芽孢杆菌活菌含量为5×1011cfu/g；
所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 27811；
所述固体培养基B的制备方法为：取麸皮800g，稻壳粉100g，豆饼粉5g，硫酸铵5g，硫酸镁1g，硫酸锰0.5g，水1200mL，均匀混合，121℃灭菌45min即得；
3.枯草芽孢杆菌菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种用接种针接种到NA种子瓶培养基，在37℃下培养1d，并将菌体用无菌水洗脱刮下，调整菌体浓度为5×1011cfu/mL，吸取100mL菌液接种到1kg固体培养基C中，37℃培养2d，在37℃条件下干燥3d后用粉碎机进行粉碎，过40目筛即得枯草芽孢杆菌菌剂，其中枯草芽孢杆菌活菌含量为6×1010cfu/g；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051；
所述固体培养基C的制备方法为：取麸皮800g，稻壳100g，玉米粉50g，豆粕50g，硫酸镁0.5g，硫酸铵5g，水1100mL，均匀混合，121℃灭菌45min即得；
4.解淀粉芽孢杆菌菌剂制备：将解淀粉芽孢杆菌斜面菌种用接种针接种到NA种子瓶培养基，在37℃下培养1d，并将菌体用无菌水洗脱刮下，调整菌体浓度为5×1011cfu/mL，吸取100mL菌液接种到1kg固体培养基D中，37℃培养2d，37℃干燥3d后用粉碎机进行粉碎，过40目筛即得解淀粉芽孢杆菌菌剂，其中解淀粉芽孢杆菌活菌含量5×1011cfu/g；
所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CICC10035；
所述固体培养基D的制备方法为：取花生饼粉500g，麸皮350g，棉粕120g，蛋白胨3g，葡萄糖2g，硫酸镁0.2g，水450mL，均匀混合，121℃灭菌45min即得；
5.复配：
按重量份数计，取上述甘蔗兰希氏菌CP菌剂5份、地衣芽孢杆菌菌剂3份、枯草芽孢杆菌菌剂3份、解淀粉芽孢杆菌菌剂3份，均匀混合即得白酒酒糟酒糟快速腐熟剂。
(二)白酒酒糟堆肥腐熟：
1.酒糟堆肥腐熟过程
将步骤(一)制备的白酒酒糟快速腐熟剂以质量比1.2‰的接种量量接入酒精度为10％，pH为3.58的新鲜白酒酒糟堆体中，拌匀，堆体长宽高分别为：200m×2m×1.5m，初始堆肥水分为65％，当垛温大于等于55℃时，开始用翻倒车进行第一次翻倒，此后每1d翻倒一次，(以上腐熟处理定义为处理L)；
同时设置另外两个相同原料、规模的酒糟堆体腐熟处理作为对照，定义为处理CK1和CK2，其中处理CK1为不接种腐熟剂，处理CK2为接入市售白酒酒糟腐熟剂，试验方法同处理L。
2.处理L和处理CK1、处理CK2对比的试验结果：
2.1温度
由附图2可以看出，处理L的堆肥第1d能达到55℃，第3d达到最高温度85℃并于83-85℃持续3d，能达到堆肥无害化标准；处理CK2第4d达到55℃，第8d达到最高温度74℃仅维持1d，处理L达到的最高温度比处理CK2高11℃；处理L在发酵第16天即可结束腐熟，处理CK2在42d后结束腐熟，处理L腐熟期时间较处理CK2提前26d达到腐熟，处理CK1在57d腐熟才能结束；上述结果表明，接种腐熟剂可加速白酒酒糟堆体中有机物的降解，相对于市售白酒酒糟腐熟剂，添加本发明制备的白酒酒糟快速腐熟剂堆肥腐熟时发酵速率高、升温速度快、进入高温期的时间短、维持高温期的时间长、堆肥腐熟发酵周期短，具有显著的快速、直接腐熟新鲜白酒酒糟的特点，无需降酒精度、降酸等预处理。
2.2pH值
由附图3可以看出，在整个堆肥过程中，处理CK1、处理CK2和处理L堆肥后期pH分别为7.74、7.62、7.42，总体来说，接种腐熟剂对堆体pH影响不明显，但处理L相对低的pH值能减少堆肥过程中氨的挥发，从而减少氮的损失。
2.3有机质含量
由附图4可以看出，在堆肥结束时处理CK1、处理CK2和处理L的有机质含量分别为61.28％、51.75％和45.85％，比初始有机质含量(88.43％)分别降低了27.15％、36.68％、42.58％；由堆肥有机质含量变化可知，接种腐熟剂对堆肥有机质的降解作用较大，而且接种本发明制备的白酒酒糟快速腐熟剂的降解效率显著高于市售白酒酒糟腐熟剂。
2.4全氮含量
由附图5可以看出，三个处理比较，接种腐熟剂的堆体全氮含量明显高于对照组CK1，且接种本发明制备的白酒酒糟快速腐熟剂比市售白酒酒糟腐熟剂的全氮含量略高。此时处理L的全氮含量为2.23％，处理CK2的全氮含量为2.12％，处理CK1的全氮含量为2.06％。
2.5水分含量
由附图6可以看出，堆肥腐熟结束时，处理L、CK2、CK1的水分含量分别为21.16％、23.62％、25.32％，处理L水分的含量显著低于处理CK1和处理CK2，添加本发明制备的白酒酒糟快速腐熟剂堆肥腐熟时发酵速率高、升温速度快、进入高温期的时间短、维持高温期的时间长、有效加速了堆体水分的挥发，加快腐熟程度，与市售腐熟剂相比能有效缩短水分挥发时间，同时获得质量较高的酒糟有机肥。
SEQUENCE LISTING
<110> 陕西枫丹百丽生物科技有限公司
<120> 一种耐酒精耐高温快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌及其应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 甘蔗兰希氏菌（Laceyella sacchari）CGMCC No.13928
<400> 1
gcccttggtt accttgttac gacttcaccc caatcatctg ccccaccttc ggcggctggt 60
tccaaaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttgcaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg 120
tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc 180
ggcttcacgc aggcgagttg cagcctgcga tccgaactga gaccggtttt gtgggattag 240
ctccccctcg cgggttggcg acccattgta ccggccattg tagcacgtgt gtagcccagg 300
acataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggctttc accggctgtc 360
tcgctagagt gcccaactga atgctggcaa ctagcgataa gggttgcgct cgtcgcggga 420
ctgaacccaa catctcacga cacgagctaa cgacaaccat gcaccacctg tcaccgctgc 480
cccgaaggga ggctccatct ctggagcggt cagcgggatg tcaagccctg gtaaggttct 540
tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct 600
ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggagtg cttaatgggt taccttcggc 660
accgagggta ggaccccccg acacctagca ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt 720
atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg cgcctcagcg tcagaaacag gccagagagc 780
cgccttcgcc actggtgttc ctcccgatct ctacgcattc caccgctaca ccgggaattc 840
cgctctcctc tcctgcactc aagtcatcca gtttcaggtg ccgctctgcg gttgagccgc 900
agcctttcac acctgactta aatgaccgcc tgcgcgcgct ttacgcccaa taattccgga 960
taacgctcgc cccctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg gggctttctc 1020
ctgaagtacc gtcagaactt cttccttcag aacagagttt tacaacccga aggccgtcat 1080
cactcacgcg gcattgctcc gtcaggcttt cgcccattgc ggaaaattcc ctactgctgc 1140
ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg 1200
gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac cagctaatgc gccgcgggcc 1260
catccgtaag tggccgaagc cttttactct ttctccatgc ggagaaagag attatctggt 1320
attagcaccg gtttcccgaa gttatcccag tcttacgggc aggttgccca cgtgttactc 1380
acccgttcgc cgctagggtc cggagacccc cgcacgactt gcatgtatta ggcatgccgc 1440
cagcgttcat cctgagccag gatcaaactc taagggcgat ccaatcga 1488

Claims (2)

1.一株耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌(Laceyella sacchari)CP，其保藏编号为：CGMCC NO.13928。
2.如权利要求1所述的一种耐酸碱、耐酒精快速腐熟酒糟的甘蔗兰希氏菌CP在快速腐熟白酒酒糟方面的应用。
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