CN106905435A

CN106905435A - 一种制备基于蛋白a突变体的结合蛋白的方法

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Publication number: CN106905435A
Application number: CN201710145207.1A
Authority: CN
Inventors: 宋波
Original assignee: Wuhan Sea Shabaide Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Sea Shabaide Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-03-13
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2037-03-13
Also published as: CN106905435B

Abstract

本发明涉及一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法。此外，本发明提供编码所述异源多聚体蛋白A突变体的核苷酸文库和对应的蛋白质文库，揭示了从所述突变体文库中筛选对预定靶分子具有结合能力的蛋白A突变体的方法，分离编码所述蛋白A突变体的核苷酸的方法，鉴定和分析所述蛋白A突变体的方法，以及生产所述蛋白A突变体的方法。本发明的方法具有产生更高结合能力的特异性结合蛋白的优点。

Description

一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法

技术领域

本发明涉及制备具有新的特异性结合能力的异源多聚体蛋白A突变体的方法。本发明提供编码所述异源多聚体蛋白A突变体的核苷酸文库和对应的蛋白质文库，揭示了从所述突变体文库中筛选对预定靶分子具有结合能力的蛋白A突变体的方法，分离编码所述蛋白A突变体的核苷酸的方法，鉴定和分析所述蛋白A突变体的方法，以及生产所述蛋白A突变体的方法。此外，本发明进一步提供能以高亲和力特异性结合到预定靶分子上的、以异源多聚体蛋白A为基础的新的结合蛋白质。

背景技术

抗体能够特异性识别和结合各类外源性物质，如小分子化合物、花粉、病毒、细菌等半抗原和抗原。在抗体分子Y型的两个分叉顶端，各有一个由六条环状多肽构成的互补区域(CDR)形成锁状结构，这些部位的氨基酸通过氢键、范德华力、电荷作用和疏水作用，与抗原表面的表位形成非共价键相互作用。在抗体基因中，编码抗原结合部位的DNA可以随机组合和突变，这一高变区的氨基酸可以发生非常丰富的变化，每一种特定的变化，可以赋予抗体具有和某一预定抗原相结合的能力。

随着基因重组技术、蛋白质工程和重组抗体库体外亲和筛选技术以及结构生物学的发展，越来越多的抗体三维晶体结构得到解析，抗体结合抗原的分子机理得到更好理解。抗体的局限性，比如分子量大、结构复杂等，促使研究者将来源于抗体CDR区域的“结合区域”这一概念，移植到一些非常稳定的非抗体类的蛋白(如本发明用到的异源多聚体蛋白A)表面。将这些蛋白表面的某些邻近的氨基酸高度突变，可以人为的塑造出适当的结合区域，从而赋予这些蛋白与各类预定靶分子结合的能力。

WO 95/19374描述了以蛋白A的一个结构域单体为基础的结合蛋白(Affibody)的产生。蛋白A是来源于金黄色葡萄球菌细胞表面的一种蛋白质，由5个高度同源的结构域组成，其结合许多哺乳动物物种(包括人)的免疫球蛋白。由于蛋白A单个结构域的分子量非常小(约6kDa)，其表面能提供的结合区域的面积相对较小，限制了其结合能力。根据已有技术信息，WO 95/19374中产生的结合蛋白的亲和力K_D范围通常在10^-6-10^-8M范围，多数情况下在10^-7M，例如初筛得到的结合EGFR的结合蛋白的亲和力在130nM-185nM，结合H-Ras的结合蛋白的亲和力在79nM-283nM，结合rVIII的结合蛋白的亲和力在100nM-200nM。在此外，蛋白A单个结构域的结合区域由两个并列的α螺旋一侧的氨基酸构成，形成了一个扁平的结合面，这也限制了其能结合的靶分子表位的类型。

发明内容

本发明的目标是提供具有更高结合能力的、能够普遍的识别更多不同类型的靶分子表位的多聚体蛋白A突变体的方法。本发明的进一步目标是提供以新颖的异源多聚体蛋白A为基础，通过初始筛选，即可普遍制备高亲和力结合蛋白的方法。

更具体地，本发明提供了一种制备具有新的特异性结合能力的异源多聚体蛋白A突变体的方法，包括下列主要步骤：

提供单体经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的库，所述库包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的蛋白A单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少两个所述单体是通过对位于SEQ ID No：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换而进行的修饰，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；

为所述经过修饰的蛋白A的库提供潜在的靶分子；

使所述修饰的蛋白质的库与所述靶分子接触；

通过筛选方法得到异源多聚体蛋白A突变体。

用于该申请中重要的术语的定义

术语“蛋白A单体”是指蛋白A的一个结构域蛋白，包括与SEQ ID NO:1完全一致的，或者氨基酸序列一致性超过80％的蛋白质。

本说明书中，术语“异源多聚体蛋白”是包含两个或更多不同修饰的蛋白A单体的蛋白质。因此，本发明的“异源多聚体”具有两个独立的结合区域的至少两个不同修饰的蛋白A单体的融合蛋白，优选为异源二聚体或异源三聚体。

根据本发明，由至少两个不同的蛋白A修饰蛋白所组成的异源多聚体结合蛋白能结合预定抗原。其中的蛋白A修饰蛋白可以通过多种方式组合在一起，形成“头尾相接”的融合蛋白，例如基因融合等。这种融合可以使多个不同的蛋白A修饰蛋白上的结合区域能够组合起来，形成一个大的、整体性的结合区域。这种融合，类似于抗体可变区的多个CDR区域组合起来，共同形成了抗体结合部位。对应的，多个不同的蛋白A修饰蛋白上的结合区域，能够分别结合到同一特定抗原的不同部位，这些部位组合起来，共同形成了抗原表位。

术语“头尾相接的融合”描述了把多个不同的蛋白A修饰蛋白连接起来形成融合蛋白的形式。把多个不同的蛋白A修饰蛋白按照(氨基端-羧基端)—(氨基端-羧基端)n的连接方向，连接起来形成异源多聚体融合蛋白，这里n取决于需要连接起来的蛋白A修饰蛋白的数量。在这种头尾相接的连接形式中，相邻的两个蛋白A修饰蛋白可以直接连接在一起，也可以通过柔性连接多肽，比如，氨基酸序列为SGGGG的连接多肽，或者其他连接多肽，比如KPEVIDASELTPAVT，GGGGS等。其他通常用于基因融合的连接多肽也可以在这里使用。总之，异源多聚体可以通过把两个或多个不同的蛋白A修饰蛋白，通过首尾相接的方式连接在一起，形成一个由两个及两个以上的蛋白A修饰蛋白组成的融合蛋白。通过柔性多肽将两个或多个蛋白A修饰单体上的结合区域连接起来，所述的两个或多个结合区域具有了更多的构象，提供了识别更多类型的靶分子表位的可能性。

术语“群”或者“库”、“文库”特指由经过不同修饰的蛋白A的异源多聚体突变体混合而得到的集合。编码所述经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的DNA的混合也被成为核苷酸群。术语“群”或者“库”、“文库”都是同义的且能互换使用。

本发明所述的“特异结合区”表示：形成聚合物的各蛋白A单体之间，突变位点由于电荷、空间结构和侧链的疏水性/亲水性等原因，突变的氨基酸与周围的环境相互作用，形成一个连续的表面暴露区域，该连续区域能够和预定靶分子特异性结合，该环境可以是溶剂，一般是水，或者其它分子。

在本发明中，“氨基酸修饰”是指氨基酸替换、***、缺失或者化学修饰；优选氨基酸替换。在具体的实施方式中，氨基酸修饰通过对蛋白A单体的第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换来实现。术语“修饰”或“突变”指使用20种氨基酸的其他任一氨基酸对所选定位置的氨基酸进行替换。这两者都是同义的且能互换使用。

上述通过突变产生的蛋白A修饰蛋白所组成的异源多聚体蛋白文库，可以通过噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示或细胞表面展示、酵母展示或细菌表面展示方法，进而通过体外定向筛选的方式，针对任一预定的靶分子进行筛选，使能特异性结合靶分子的异源多聚蛋白A突变体富集，从而得到此类结合蛋白。根据本发明，可以通过以下一种或多种方法，确定所述的蛋白A突变体与特定靶分子是否具有可定量的结合能力，比如酶联免疫吸附实验(ELISA)、等离子表面共振(SPR)、免疫荧光光谱(IF)、流式细胞术(FACS)、等温滴定量热法(ITC)和分析离心等。

在本发明所采用的噬菌体展示方法中，重组蛋白A突变体展示在M13丝状噬菌体上，同时该突变体的编码DNA以单链形式包装在噬菌体包膜中。因此，在亲和筛选中，可以从文库中选择出具有某些特性的突变体，其遗传信息可以分别通过感染细菌并在下一轮亲和筛选中得到扩增。突变体蛋白通过融合到噬菌体衣壳蛋白，优选的是PIII蛋白，从而可以在噬菌体表达得到展示。此外，编码的融合蛋白还可以含有其他功能性元件，比如便于通过亲和层析检测或纯化的亲和标签等。

作为根据本发明所产生的所述结合蛋白的靶分子，可以使用所有生物学和医学活性相关的分子，包括但不限于抗原和半抗原。抗原是指能被免疫***识别为外来物质(非自身的)的任何物质。在大多数免疫反应情形中，可以引起免疫反应。半抗原通常是简易、低分子量的化合物，其不能引起免疫反应，但是结合到载体蛋白质上后，可以变成完整的抗原。优选的，靶分子可以是生物受体，优选G蛋白偶联受体(GPCR，例如人EGFR、HER2、HER3、VEGF/R1-4、EpCAM)或其配体、或其结构域、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、白介素(例如IL-2、IL-6、IL-11、IL-12)、生长因子(例如神经生长因子NGF)和其前体(ProNGF)、BMP、EGF、激酶、整合素(例如糖蛋白受体IIb/IIIa)、人血清白蛋白HSA、T和B细胞抗原，优选CD4、CD11、CD14、CD16、CD20、CD22、CD25、CD34、CD47、CD56、CD137、CD154、CTLA-4等。

本发明中，以异源二聚体蛋白A为基础，获得了其在特定位点发生修饰的突变体，这些突变体获得了其原来没有的靶分子结合能力。本发明中，用作异源二聚体蛋白A的靶分子的实例是降钙素原(PCT)、人血清白蛋白(HSA)、钙粘附蛋白16(CDH16)。通过初始筛选所获得的的蛋白A异源二聚体结合蛋白的亲和力分布在3.6nM-57.6nM，明显高于现有技术资料中根据WO 95/19374所制备的结合蛋白的亲和力，有近10倍左右的提高。

本发明得到的异源多聚体蛋白A的突变体蛋白在细胞内、外环境中都具有结合活性，具有广泛的应用领域。本发明的蛋白质可用于检测、定量检测、分离和提取对应的靶分子，以及用于诊断和治疗涉及到对应的靶分子所参与的疾病等。例如，可以通过ELISA、Western印迹等生物分析测试直接检测靶分子，可以用于***或传染性疾病、可用于食品和营养工业、营养补充剂、化妆品、医学和非医学诊断和分析领域。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的方法具有以下优点:

1.基于蛋白A异源二聚体或多聚体的结合蛋白能提供更大面积的结合区域，进而可以提供更高的结合能力；

2.两个或多个蛋白A单体通过柔性的连接多肽相连，使分布在两个蛋白A单体上的结合区域在空间构象上是灵活多变的，从而提供了识别更多靶分子表位的能力。

附图说明

图1为在野生型蛋白A单体表面经修饰后新生的结合位点区域；

在表面通过氨基酸随机化替代进行修饰，从而获得新的结合位点的野生型蛋白A单体的晶体结构示意图。用PyMOL软件(DeLano Scientific)进行二级结构元件的三维显示。作为实例制备文库的发生随机替换的位点9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35用侧链表示。

图2为异源二聚体蛋白A的结构示意图；

两个蛋白A单体通过柔性的多肽链形式首尾相接的连接，成为本发明中形成具有新结合活性的异源二聚体蛋白A的基础。椭圆形线圈代表了蛋白质表面的靶分子结合区域，通过对特定氨基酸进行替换的修饰方式形成。

图3为用于筛选具有新结合特性的基于异源多聚体蛋白A的修饰蛋白的噬菌粒质粒pCan-dPA；

pCan-dPA用于制备噬菌体文库，在Lac操纵子的转录调控下，编码g3p蛋白信号肽、蛋白A二聚体、E-tag标签和噬菌体衣壳蛋白III的序列被表达为融合蛋白，进而使蛋白A二聚体展示在噬菌体表面。

图4表示检测经噬菌体展示筛选到的异源二聚体蛋白A的修饰蛋白PCT-P1G07与其靶分子PCT结合亲和力的ELISA实验结果。通过非线性回归确定平衡条件下的K_D值。

图5表示检测经噬菌体展示筛选到的异源二聚体蛋白A的修饰蛋白PCT-P2A08与其靶分子PCT结合亲和力的ELISA实验结果。通过非线性回归确定平衡条件下的K_D值。

图6表示检测经噬菌体展示筛选到的异源二聚体蛋白A的修饰蛋白PCT-P2A12与其靶分子PCT结合亲和力的ELISA实验结果。通过非线性回归确定平衡条件下的K_D值。

图7表示检测经噬菌体展示筛选到的异源二聚体蛋白A的修饰蛋白HSA-P1A02与其靶分子HSA结合亲和力的ELISA实验结果。通过非线性回归确定平衡条件下的K_D值。

图8表示检测经噬菌体展示筛选到的异源二聚体蛋白A的修饰蛋白HSA-P1F11与其靶分子HSA结合亲和力的ELISA实验结果。通过非线性回归确定平衡条件下的K_D值。

图9表示检测经噬菌体展示筛选到的异源二聚体蛋白A的修饰蛋白CDH16-2H03-2与其靶分子CDH16结合亲和力的ELISA实验结果。通过非线性回归确定平衡条件下的K_D值。

图10表示检测经噬菌体展示筛选到的异源二聚体蛋白A的修饰蛋白CDH16-2H07-1与其靶分子CDH16结合亲和力的ELISA实验结果。通过非线性回归确定平衡条件下的K_D值。

图11表示未修饰的dPA、dPA突变体文库以及各经修饰的异源二聚体蛋白A结合蛋白的序列信息及比对。灰色背景显示了未突变的保守区域的氨基酸序列，而白色背景显示了选定进行修饰的氨基酸位点。X表示对所在位置的氨基酸进行随机化替换，以制备修饰文库。

具体实施方式

实施例1：合成未经修饰的蛋白A二聚体(dPA-wt)基因

本实施例提供了通过基因合成的方式获得未经修饰的蛋白A二聚体核苷酸(DNA)片段的方式。

用本领域技术人员已知的标准方法进行以下基因工程操作。为制备编码dPA-wt蛋白(Seq ID No.2)的DNA序列(Seq ID No.3)，用作制备dPA突变体文库的起点和模板，使用以下操作步骤：为合成基因片段，在50μl体积中进行PCR反应，使用引物(每种浓度0.1μM)作为模板进行搭桥PCR反应，每种1μl。引物长度一般为30-59个碱基，每对前后相连的引物3’和5’端大约重叠15-20个碱基。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用SV Gel andPCR Clean-Up试剂盒(Promega)回收目标条带。以上PCR均按照下面的程序进行反应，94℃预变性5分钟，然后进入28个循环。每个循环94℃反应30秒，55℃反应30秒，68℃反应1分钟。最后68℃保温10分钟。

预期PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离目标条带，并用SV Gel and PCRClean-Up试剂盒(Promega)回收目标条带。回收后的DNA片段分别用sfiI/NotI(NewEngland Biolabs)双酶切，纯化回收后的DNA片段***到同样经sfiI/NotI双酶切的噬菌粒载体pCANTAB，得到质粒pCan-dPA，结构如图3所示，用作构建dPA突变体文库的模板。

实施例2：制备dPA修饰突变体文库

通过本领域已建立的和已知的方法进行修饰，可得到dPA修饰突变体文库。在本发明中，“修饰突变体文库”是指对选定位点的核苷酸或氨基酸序列进行任意的修饰，这种修饰导致核苷酸或氨基酸的替代完全随机的，其最终的表达产物是具有不同氨基酸的平均分配的完全随机的序列。本发明中，用作构建的dPA修饰突变体文库(Seq ID No.4)在前后两个蛋白A单体上分别包含了11个修饰位点，分别位于单体第9、10、13、14、17、18、24、27、28、32、35氨基酸位点。

依照本发明，优选地通过在基因水平进行修饰，优选的通过对氨基酸进行随机化替换，从而导致发生突变，从而得到氨基酸修饰。优选地，依靠基因工程的技术手段实现对蛋白A的修饰。优选地，为了将随机化的序列恰当地引入dPA基因片段中，可以通过合成并使用带有随机化突变的引物，通过多轮搭桥PCR产生突变体文库。例如可以在期望的限制性内切酶识别位点周围构建第一组正向和反向引物，并在待突变的密码子的上下游构建第二组包含随机化突变的引物，即正向和反向突变引物。适当的使用这些引物，可以构建第一中间片段和第二中间片段。两个PCR反应产生了线性的中间产物片段。每一个片段至少包含一个选定的密码子突变、与上下游中间片段融合的共有序列。融合后的完整片段的最上游和最下游还包含了限制性酶切位点和保护碱基，以便经过酶切后形成粘性末端，可以通过DNA连接酶与载体片段连接，产生环状的核苷酸产物，比如环状质粒。本领域可以利用其他方法且可以代替的使用其他方法。

具体来讲，得到包含突变位点的中间片段后，将全部中间片段等摩尔混合后，加入最上游和最下游包含酶切位点的引物对(Seq ID No.5和Seq ID No.6)，进行最后的PCR扩增反应，随后使用SV Gel and PCR Clean-Up试剂盒纯化回收该DNA片段后，用SfiI和NotI对片段进行双酶切，并用琼脂糖凝胶电泳分离回收约400bp的DNA片段。

为制备噬菌粒载体，分别使用SfiI和NotI根据制造商说明书对质粒pCANTAB进行酶切，并用琼脂糖凝胶电泳分离较大的载体片段。用SV Gel and PCR Clean-Up试剂盒纯化载体DNA，最后以50fmol/ul溶于水中。为进行连接反应，把100μl 10×T4DNA连接酶缓冲液、3pmol所述经SfiI和NotI双酶切的dPA文库DNA片段、9pmol pCANTAB载体片段和8000U T4DNA连接酶(New England Biolabs)在1ml反应体积中16℃保温24小时。65℃加热10分钟使T4DNA连接酶失活，然后用SV Gel and PCR Clean-Up试剂盒纯化连接产物，最后将DNA用50ul无菌水洗脱保存，用于电转化实验。

为了将连接产物转化到大肠杆菌XL1Blue(Stratagene)中，使用Gene Pulser II(Bio-rad)电转化仪和2mm间距的电转化杯(Bio-rad)。上述连接产物所得溶液与电转化感受态大肠杆菌XL1Blue混合后，根据制造商说明书进行转化实验。所得细胞混合液涂到10块含2×YT/氨苄青霉素固体培养基的平皿上，经37℃过夜培养平皿，并对经梯度稀释后的生长菌落进行计数，发现所构建的文库包含3.1×10¹⁰个独立克隆。用2×YT培养基从平皿上刮下菌落，加入甘油使终浓度为20％(v/v)，分成每管1ml，保存于-80℃。随机挑取50个单克隆，经测序分析，发现26个克隆具有功能性的目的DNA序列，在预定突变位点有性质完全不同的氨基酸替换，且DNA序列各不相同，证实该文库的正确率约为52％。

实施例3：制备dPA修饰蛋白噬菌体展示文库

为生产在表面展示了不同dPA突变体的噬菌体，在400ml 2×YT/氨苄青霉素培养基接种由实施例2中获得的甘油菌，使细胞密度达到OD₆₀₀＝0.05，在37℃和200rmp条件下振荡培养直至细胞密度达到OD₆₀₀＝0.6。用10¹²cfu的辅助噬菌体M13KO7感染，在30℃和50rpm条件下培养30分钟。加入50mg/l卡那霉素后在30℃和200rmp条件下振荡培养30分钟后，通过离心(15分钟，1,600×g，4℃)分离沉淀，重悬于400ml 2×YT/氨苄青霉素/卡那霉素培养基，在30℃和200rmp条件下振荡培养16小时。最后细胞通过离心(20分钟，8,000×g，4℃)分离沉淀并丢弃，上清用0.45μm规格滤膜过滤后，加入1/4体积20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液并冰浴1小时沉淀噬菌体。随后离心收集沉淀(20分钟，12,000×g，4℃)，将噬菌体重悬于25ml预冷PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄)中，在冰上保持30分钟后离心(5分钟，20,000×g，4℃)。向上清液加入1/4体积20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液，并冰浴30分钟再次沉淀噬菌体。离心沉淀(30分钟，20,000×g，4℃)，再次将噬菌体沉淀重悬于4ml预冷PBS中，在冰上保持30分钟并离心(30分钟，17,000×g，4℃)。上清液与封闭液以1:1混合，置于旋转混合器上，室温下保温10分钟，然后直接用于筛选。

实施例4：通过体外筛选富集能特异结合靶分子的噬菌粒

为从包含了各种dPA突变体的噬菌体展示文库中，筛选出能特异性结合预定靶分子的dPA突变体，使用上述实施例3中制备的噬菌体展示文库，分别针对预定的不同靶分子(抗原或半抗原)，实施了筛选和富集实验。

靶分子用PBS稀释后，在免疫管中4℃包被过夜。第二天弃上清后，加入5ml PBS-B(B代表封闭液)并在室温下保温90分钟，从而封闭免疫管内表面上的未被抗原占据的结合位点。然后吸取4ml所制备的噬菌体溶液，加到免疫管中，并在室温下保温2小时。分别用PBST(T代表0.1％Tween-20)和PBS洗涤五次，而除去未结合的噬菌体。最后用2ml甘氨酸-盐酸在室温下保温5分钟，将与固定在免疫管上的抗原结合的噬菌体洗脱下来，并加入300μl浓度为1M的Tris溶液。每种情况洗脱下来的噬菌体溶液与10ml细胞密度OD₆₀₀＝0.6的培养物中，以感染大肠杆菌XL1blue，并在37℃220rpm培养30分钟。将这些细胞悬浊液铺到含2×YT/氨苄青霉素固体培养基的平皿上，经37℃过夜培养平皿，并计数梯度稀释后的生长菌落。用2×YT培养基从平皿上刮下菌落，加入甘油使终浓度为20％(v/v)，分成每管1ml，保存于-20℃。

为增加筛选体系中dPA结合蛋白的富集程度，针对靶分子的定向筛选共进行3-5轮循环，通常为4轮循环。从第二轮筛选开始，每次在100ml培养基中进行培养和噬菌体援救，并使用更苛刻的洗涤条件，即第二轮筛选中分别用PBST和PBS洗涤15次和5次，第三轮分别洗涤25次和5次，第四轮分别洗涤35次和5次。

实施例5：鉴定和分离与不同靶分子特异性结合的噬菌粒

经过3-5轮针对不同的预定靶分子的体外亲和筛选后，从得到的克隆中随机挑取96个克隆，使用single phage ELISA方法鉴定与对应靶分子的结合情况。具体操作步骤如下：把每个单菌落接种到600μl 2×YT/氨苄青霉素培养基，在37℃220rpm培养16小时。次日各取30μl培养物，接种到新鲜的800μl 2×YT/氨苄青霉素培养基，在37℃220rpm培养2小时，随后每孔加入10⁹cfu M13KO7辅助噬菌体。在37℃200rpm培养30分钟后，加入50ml/l卡那霉素，然后继续在37℃220rpm培养16小时。最后离心30分钟(3,000×g，4℃)沉淀细菌，取上清转移到新的预先加入了等体积20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液的96孔培养板，在冰上保温1小时沉淀上清中的噬菌体颗粒，再次离心沉淀(5,000×g，4℃，30分钟)，将沉淀重悬于200μl PBS溶液，用于后续的ELISA实验。

每一个待分析克隆的噬菌体，需同时针对其对应的筛选靶分子和阴性对照蛋白(通常为牛血清白蛋白或者溶菌酶)进行ELISA检测。将对应抗原和溶菌酶包被在96孔板上，并使用封闭液进行封闭，使塑料表面的剩余结合位点饱和。用PBST洗涤三次后，取上述制备好的噬菌体样品加到ELISA板的各孔。室温下保温2小时后，用PBST洗涤三次。为了检测结合的噬菌体，每孔加入100μl以1:5000稀释的抗M13噬菌体的抗体-过氧化物酶偶联物(GEHealthcare)，室温下保温1小时后，用PBST和PBS分别洗涤三次。最后吸取50μl TMB底物加入到孔中，并在室温下显色10分钟，随后每孔加入50μl的2M H₂SO₄终止显色反应。用Microplate reader(Bio-Rad)在450nm测量吸收值。在ELISA实验中，对靶分子显示较强结合信号，与对照蛋白无结合信号的噬菌体，其对应的单克隆用引物Seq ID No.7进行测序。由此获得并进一步分析dPA修饰蛋白的氨基酸序列，在表1中示例性列出其中发生替换的氨基酸位置和序列，其中9-35标注出了dPA蛋白的第一个蛋白A单体中发生替换修饰的氨基酸位置；9’-35’标注了第二个蛋白A单体中发生替换修饰的氨基酸位置。

在以PCT为靶分子的实施例中，所得到的蛋白A异源二聚体结合蛋白PCT-P1G07(Seq ID No.8)、PCT-P2A08(Seq ID No.9)和PCT-P2A12(Seq ID No.10)的氨基酸替换在表1中示例性列出。在以HSA为靶分子的实施例中，所得到的蛋白A异源二聚体结合蛋白HSA-P1A02(Seq ID No.11)和HSA-P1F11(Seq ID No.12)的氨基酸替换在表1中示例性列出。在以CDH16为靶分子的实施例中，所得到的蛋白A异源二聚体结合蛋白CDH16-2H03-2(Seq IDNo.13)和CDH16-2H07-1(Seq ID No.14)的氨基酸替换在表1中示例性列出。

实施例6：制备并纯化基于dPA的修饰蛋白

将筛选得到的具有靶分子特异性结合活性的dPA修饰蛋白基因通过引物对(SeqID No.15和Seq ID No.16)进行PCR扩增后，分别克隆到表达载体pET22b(+)中，并将质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)。在实验室水平使用摇瓶和常规异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，能大量表达dPA修饰蛋白。诱导表达后的大肠杆菌经裂解后，可利用蛋白羧基端融合的六组氨酸多肽，通过固定化金属亲和层析法(IMAC)纯化所述蛋白。

为生产具有新结合活性的dPA修饰蛋白，挑取单菌落接种到5ml 2×YT/氨苄青霉素培养基，在37℃、220rpm震荡培养16小时。培养物以1:100转接到200ml 2×YT/氨苄青霉素培养基，并在37℃220rpm震荡培养，直至细胞密度达到约OD₆₀₀＝0.6。加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导外源基因表达，在30℃、220rpm震荡培养6小时。离心(4,000×g，4℃，15分钟)收集细胞沉淀，并重悬于15ml NPI-20溶液(50mM MaH₂PO₄,150mMNaCl,20mM咪唑，pH 8.0)。加入200μg/ml溶菌酶和80U Benzonase在室温下混匀30分钟，随后使用超声破碎细胞，在冰水浴中每工作15秒间隔30秒，共重复5次。离心(15,000×g，4℃，30分钟)去除细胞碎片沉淀，可溶性目标蛋白存在于上清液中，可直接用于接下来的固定化金属亲和层析。

使用5倍柱体积的所述NPI-20缓冲液，预先平衡5ml HisTrap HP纯化柱，然后使上述细胞裂解上清液流过纯化柱。用8倍柱体积的NPI-50缓冲液(50mM MaH₂PO₄,500mM NaCl,50mM咪唑，pH 8.0)洗去未结合的杂蛋白，随后用NPI-250缓冲液(50mM MaH₂PO₄,150mMNaCl,250mM咪唑，pH 8.0)洗脱结合的目的蛋白。将蛋白样品透析到PBS缓冲液，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化后的蛋白的组分和纯度，并用BCA法测定蛋白浓度。在摇瓶培养条件下，dPA修饰蛋白的产率一般为10-150mg/l细胞培养物。

实施例7:鉴定具有新结合特性的dPA修饰蛋白的结合活性

通过浓度梯度ELISA实验，测定dPA修饰蛋白对不同靶分子的结合活性。为此目的，用0.1M NaHCO₃(pH 9.6)包被液稀释靶分子，每孔包被200ng，50μl/孔，4℃包被过夜，并用含封闭液的PBST于室温下封闭2小时。然后用PBST漂洗平板三次并去除干净。随后，向每个孔板加入100μl含一系列浓度的各dPA修饰蛋白的PBST溶液，每个样品的测定使用平行三孔分析。37℃保温2小时后，用PBST漂洗三次，随后加入1:5000稀释的HRP标记鼠抗E-tag抗体(购自金斯瑞)100μl/孔，37℃反应1小时。为了检测，用PBST漂洗孔三次，然后用PBS漂洗三次，最后加入TMB显示15分钟，用每孔50μl的2M H₂SO₄终止显色反应，用酶联免疫检测仪(Bio-Rad)在450nm测量光吸收值。用Sigma Plot软件评估所得到的吸光强度值，计算抗体的结合强度。为此目的，每种情况下测量的消光值对相应的结合蛋白浓度作图，并用下面的非线性回归对所得曲线进行拟合。

其中鉴定固定的靶分子和dPA修饰蛋白之间的结合/解离平衡是：

x＝dPA修饰蛋白的浓度

y＝靶分子/dPA修饰蛋白复合体的浓度(通过显色反应后吸光值间接测量)

a＝固定化靶分子的总浓度

b＝解离常数(K_D值)

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海沙百得生物技术有限公司

<120> 一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法

<130> 2017-03-10

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala

65 70 75 80

Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn

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Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu

100 105 110

Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

115 120 125

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt acatttacct 60

aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt taaaagatga cccaagccaa 120

agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaatctggt 180

ggtggcggta gtggaggtgg tggagtggac aataaattta acaaggagca gcagaacgct 240

ttctacgaaa tcctgcacct gccgaacctg aacgaagaac agcgtaacgc gttcattcag 300

tctctgaagg acgacccgtc gcagtctgcc aacctgctgg ctgaagccaa gaaactgaac 360

gatgcgcagg ccccgaaa 378

<210> 4

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(28)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<222> (32)..(32)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222> (102)..(102)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (105)..(105)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 4

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn Ala Xaa Xaa Glu Ile

1 5 10 15

Xaa Xaa Leu Pro Asn Leu Asn Xaa Glu Gln Xaa Xaa Ala Phe Ile Xaa

20 25 30

Ser Leu Xaa Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa

65 70 75 80

Asn Ala Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Leu Pro Asn Leu Asn Xaa Glu Gln

85 90 95

Xaa Xaa Ala Phe Ile Xaa Ser Leu Xaa Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala

100 105 110

Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcatggccca gccggccatg gtagacaaca aattc 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agatgcggcc gctttcgggg cctgcg 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caacgtgaaa aaattattat tcgc 24

<210> 8

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Tyr Leu Asn Ala Phe Phe Glu Ile

1 5 10 15

Ser Ile Leu Pro Asn Leu Asn Arg Glu Gln Lys His Ala Phe Ile Arg

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Asp Leu Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr Gly

65 70 75 80

Asn Ala Leu Thr Glu Ile Val Leu Leu Pro Asn Leu Asn Ile Glu Gln

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Ile Leu Ala Phe Ile Val Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala

100 105 110

Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

115 120 125

<210> 9

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Tyr Asn Ala Gly Leu Glu Ile

1 5 10 15

Asn Arg Leu Pro Asn Leu Asn Arg Glu Gln Trp Val Ala Phe Ile Val

20 25 30

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Leu Val Glu Ile Thr Gln Leu Pro Asn Leu Asn Ile Glu Gln

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Arg Lys Ala Phe Ile Arg Ser Leu Ile Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala

100 105 110

Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

115 120 125

<210> 10

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Val Trp Asn Ala Tyr Lys Glu Ile

1 5 10 15

Ser Val Leu Pro Asn Leu Asn Met Glu Gln Thr Ile Ala Phe Ile Val

20 25 30

Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Val Leu

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Ile Lys Ala Phe Ile Leu Ser Leu Ile Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala

100 105 110

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<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Pro Trp Asn Ala Trp His Glu Ile

1 5 10 15

Ser Lys Leu Pro Asn Leu Asn Leu Glu Gln Glu Phe Ala Phe Ile Phe

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Ala

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Asn Ala Val Ser Glu Ile Lys Gln Leu Pro Asn Leu Asn Gly Glu Gln

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<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Thr Asn Ala Thr Tyr Glu Ile

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Gln Asp Leu Pro Asn Leu Asn Met Glu Gln Glu Asp Ala Phe Ile Trp

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Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Glu

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Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

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<210> 13

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Tyr Gln Asn Ala Asn Ile Glu Ile

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Ile Ala Leu Pro Asn Leu Asn Phe Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ile Tyr

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Ser Leu Thr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ala His

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Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

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<210> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Trp Asn Ala Phe Ile Glu Ile

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Lys Ile Leu Pro Asn Leu Asn Gln Glu Gln Pro Leu Ala Phe Ile Met

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Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ile Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ala Phe Met Glu Ile Val Thr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Glu Gln

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Asn Val Ala Phe Ile Arg Ser Leu Met Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala

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Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

taagaaggag atatacatat ggtagacaac aaattcaaca aag 43

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tggtggtggt gctcgagttt cggggcctgc g 31

Claims

1.一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法，包括下列步骤：

a)提供单体经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的库，所述库包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的蛋白A单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少两个所述单体是通过对位于SEQ ID No：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换而进行的修饰，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；

b)为所述经过修饰的蛋白A的库提供潜在的靶分子；

c)使所述修饰的蛋白质的库与所述靶分子接触；

d)通过筛选方法得到异源多聚体蛋白A突变体，所述突变体以K_D范围是10^-7-10^-12M的亲和力结合于所述靶分子。

2.权利要求1步骤所述的方法，其中所述至少五个氨基酸的替换优选为8-11个氨基酸替换。

3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括所述的异源多聚体蛋白A突变体库的核苷酸库。

4.权利要求1的蛋白质突变体库与权利要求3的核苷酸库的组合，所述蛋白质突变体库的每个成员与编码该成员的核苷酸通过用于基因型-表型偶联的手段以物理方式结合。

5.权利要求4的组合，其中所述用于基因型-表型偶联的手段包括噬菌体展示***、酵母菌展示、细菌展示、细胞表面展示或核糖体展示***。

6.权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述靶分子是抗原或半抗原。

7.一种通过权利要求3所述的核苷酸库的表达获得的蛋白质库。

8.一种包含根据权利要求3所述的核苷酸库的原核或真核的细胞或噬菌体库。