CN106902901B - 微流控芯片装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微流控芯片装置及其应用，用于制造特发性膜性肾病检测设备。包括动力部，试剂储存部，采样部，检测反应部，危废处理部。检测时通过各个部分端口连通后形成通路，试剂储存部自尾端至前端依次气封有银增强试剂、PBST、金标二抗和PBST，检测反应部自尾端至前端的各段梳形结构的内壁上分别为无包被、PLA2R蛋白检测层、THSD7A蛋白检测层和羊抗鼠IgG抗体检测层，根据检测时的显色位置判断特发性膜性肾病。本发明的微流控芯片使得便携检测特发性膜性肾病变得可能。通过微流控芯片检测指尖血就能够准确检测特发性膜性肾病，检测效率高，自动便携。
Description
[技术领域]
本发明涉及微流控芯片装置及其应用。
[背景技术]
微流控芯片技术已被列入21世纪最为重要的前沿技术的行列，它是通过分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学等的交叉实现从样品处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。这样通常需要在一个实验室中，多种仪器辅助下才能完成的实验在一个芯片***上就可以完成，这样不仅大大提高了实验速度，减少实验成本，最为重要的是减少了所需实验的样品剂量和反应时间。充分体现了当今分析设备的微型化、集成化、便携化的发展趋势，在高通量、低消耗、和大规模平行处理方面具有极大的优势。
[发明内容]
本发明的目的在于使特发性膜性肾病的检测装置微型化、自动化、集成化与便携化。
为了实现上述目的，提供一种微流控芯片装置，包括以下部件：
a.动力部，包括负压腔和连通腔，负压腔上设置有密封接口，连通腔与大气连通，连通腔上设置有两个插口，
b.试剂储存部，包括尾端分支的两个支管和支管汇总后连通的总管，支管中分别气封有不同的银增强试剂，总管自尾端至前端依次气封有PBST、金标二抗和PBST，各段的PBST、金标二抗和PBST通过所述的气封隔开，两个支管的管口和总管的管口均通过密封接口密封，连通腔插口可***支管的密封接口使连通腔与试剂储存部连通，
c.采样部，包括采样管，采样管尾端设置有插口，该插口可***试剂储存部总管的密封接口使试剂储存部与采样管连通，采样管前端设置有采样口，
d.检测反应部，为具有四段梳形结构的检测管，检测管尾端设置有密封接口，前端与危废处理部连通，检测管自尾端至前端的各段梳形结构的内壁上分别为无包被、PLA2R蛋白检测层、THSD7A蛋白检测层和羊抗鼠IgG抗体检测层，采样部的采样口可***检测反应部尾端的密封接口中使采样管与检测管连通
e.危废处理部，包括危废腔，危废腔前端具有与检测管前端连通的进口，危废腔尾端具有插口，危废腔内进口与插口之间设置有吸水纸，危废腔尾端插口可***负压腔的密封接口使危废腔与负压腔连通。
该微流控芯片装置还具有如下优化结构：
所述的负压腔和连通腔为一个腔体中隔开的两个区域。
试剂储存部的总管具有梳形结构，各段的PBST、金标二抗和PBST分别气封在总管梳形结构的不同梳齿上。
两个支管中气封的银增强试剂分别为苯二酚溶液和硝酸银溶液。
所述的危废腔腔体呈扁平的片状结构，所述的吸水纸平铺在该片状的腔体内。
所述的吸水纸为消毒吸水纸。
本发明的微流控芯片装置可用于制造特发性膜性肾病检测设备。
本发明的微流控芯片使得便携检测特发性膜性肾病变得可能。通过微流控芯片检测指尖血就能够准确检测特发性膜性肾病，检测效率高，自动便携。
[附图说明]
图1为微流控检测芯片的结构示意图；
图2为微流控检测芯片的操作流程示意图；
图3为微流控检测芯片的其中一种结构的示意图；
图4为图3的俯视图；
图5为图3的仰视图；
图中1.苯二酚溶液，2.硝酸银溶液，3.PBST，4.金标二抗，5.气封，6.采样管，7.空白对照区，8.PLA2R蛋白检测层，9.THSD7A蛋白检测层，10.羊抗鼠IgG抗体检测层，11.危废腔，12.吸水纸，13.连通腔，14.负压腔，15.(连通腔的)插口，16.(支管的)密封接口，17.(采样管的)插口18.(试剂储存部总管的)密封接口，19.(采样管的)采样口，20.(检测管的)密封接口，21.(危废腔的)插口，22.(负压腔的)插口。
[具体实施方式]
以下，结合实施例和附图对于本发明做进一步说明，应当理解，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。
特发性膜性肾病(IMN)芯片制备
制备anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab联合检测筛查特发性膜性肾病的检测卡的工艺如下：
1主要材料
1.1PLA2R蛋白和THSD7A蛋白制备
1.1.1引物设计
根据NCBI和相关文献报道，分别对PLA2R(Accession:Q13018)和THSD7A(Accession NP_056019.1)基因进行引物设计，引物具体序列如下：
PLA2R Gene
F1如SEQ ID NO.1所示，
R1如SEQ ID NO.2所示。
THSD7A Gene
F1如SEQ ID NO.3所示，
R1如SEQ ID NO.4所示。
1.1.2表达载体构建
对PLA2R和THSD7A基因的全长进行扩增，回收纯化，通过快速克隆的方法将基因构建到原核表达载体PET-28a载体上。转化大肠杆菌DH5α,挑克隆、提取质粒并测序鉴定。
1.1.3蛋白表达和纯化
将构建好的Pet-28a-PLA2R和Pet-28a-THSD7A质粒转化到BL21感受态细胞中，经IPTG诱导获得所需蛋白。使用均质机对菌体进行裂解，并将上述蛋白通过ChelatingSepharose FF柱进行蛋白纯化，获得其粗蛋白。然后使用 pure***对粗蛋白进行最后阶段的纯化，得到所述的PLA2R蛋白和THSD7A蛋白。
1.2其它原料
鼠抗人lgG4抗体(名称：Mouse anti-Human IgG4Fc Secondary Antibody,货号A-10651,厂家thermofisher)；羊抗鼠IgG抗体：Sigma公司产品；吸水纸：上海杰一生物技术有限公司。
以一实施例举例说明，特发性膜性肾病(IMN)筛查芯片(通过检测血液中的抗磷脂酶A2受体(PLA2R)自身抗体和1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)自身抗体，两者联合检测筛查膜性肾病的灵敏度达80-92％，特异度高达100％)。结构示意图如图1所示，本实施例中IMN芯片包含动力部、试剂存储部、采样部、检测反应部和危废处理部五大***。
芯片大小：60mm*40mm*2.5mm；材质：PMMA，芯片一般由上下两片拼合，这对于微流控芯片领域的技术人员是清楚的，芯片中包括以下部件：
a.动力部，包括负压腔和连通腔，负压腔和连通腔为一个腔体中隔开的两个区域，负压腔上设置有密封接口，负压腔大小：20mm*5mm*1.5mm，负压0.04MPA。连通腔与大气连通，连通腔上设置有两个插口。连通腔大小：20mm*2mm*1.5mm，与大气相连。动力部在本实施例中是可滑动设置的，如图3所示，芯片上部类似于“拼图”的结构，参照图3中的左上角为一滑片，该滑片材质与芯片相同或类似，滑片内部设置有动力部，其中的密封口和两个插口露出所述的滑片外，滑片与芯片的下片通过滑轨的方式连接如图4所示。当然，只要能够实现动力部与试剂储存部与危废处理部连接的结构都能用于本发明。
b.试剂储存部，包括尾端分支的两个支管和支管汇总后连通的总管，支管中分别气封有5ul的苯二酚溶液和5ul的硝酸银溶液，总管自尾端至前端依次气封有5ul的PBST(0.01M PH7.4的pbs+0.05％吐温20)、10ul的金标二抗(10OD的胶体金标记鼠抗人lgG4)和5ul的PBST(0.01M PH7.4的pbs+0.05％吐温20)，各段的PBST、金标二抗和PBST通过1ul空气的气封隔开，
金标二抗制备：以40nm胶体金颗粒物标记鼠抗人lgG4抗体；以不同浓度的PEG8000、BSA及其他有封闭效果的蛋白或者高分子聚合物分别对标记物进行封闭；标记结束后以10000rpm离心，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS+5％BSA+5％蔗糖)稀释至原溶液体积的1/10制备成金标二抗。
两个支管的管口和总管的管口均通过密封接口密封，连通腔插口可***支管的密封接口使连通腔与试剂储存部连通，总管具有梳形结构，各段的PBST、金标二抗和PBST分别气封在总管梳形结构的不同梳齿上，
c.采样部，包括采样管，采样管尾端设置有插口，该插口可***试剂储存部总管的密封接口使试剂储存部与采样管连通，采样管前端设置有采样口，采样管为一段直径30mm的毛细玻璃采样管，吸5ul指尖血后***芯片中进行反应。与动力部类似的，采样部与芯片是可分离式的连接，采样部在本实施例中也具有滑片结构，滑片通过滑轨与芯片的下片连接，滑片随轨道滑动取下后可以用于采样，插上后延滑轨滑动可以与试剂储存部总管的密封接口以及检测反应部尾端的密封接口连接，当然，只要能够实现采样部可分离式连接的结构都可以被用于本发明中。
d.检测反应部，为具有四段梳形结构的检测管，梳形结构的大小约为5mm*5mm，检测管尾端设置有密封接口，前端与危废处理部连通，检测管自尾端至前端的各段梳形结构的内壁上分别为无包被、PLA2R蛋白检测层、THSD7A蛋白检测层和羊抗鼠IgG抗体检测层，各个检测层通过包被设在所述的内壁上，所述的包被方式如下：检测管梳形结构的内壁经表面羧基化处理，再分别包被空白、PLA2R蛋白、THSD7A蛋白和羊抗鼠IgG抗体，然后用2.5％的BSA封闭；采样部的采样口可***检测反应部尾端的密封接口中使采样管与检测管连通。
e.危废处理部，包括危废腔，危废腔前端具有与检测管前端连通的进口，危废腔尾端具有插口，危废腔腔体呈扁平的片状结构，消毒吸水纸平铺在该片状的腔体内的进口与插口之间，危废腔尾端插口可***负压腔的密封接口使危废腔与负压腔连通。危废腔大小：15mm*5mm*1.5mm；吸水纸大小：15mm*5mm*1.5mm，吸水纸用消毒液处理后烘干使用。
检测时，取下芯片上的采样管，用采样口吸取5ul液体样本，采样部经过毛细作用把微量液体样本吸入毛细管中，再把采用管***到芯片相应位置，采样管的插口与试剂存储部的接口相连，采样管的采样口和检测反应部的接口相连。按下动力部，负压腔的接口和危废处理部的插口连通，使芯片内部形成完整的通路；连通腔的插口和试剂存储部的接口连通。连通后负压腔为整个***提供驱动力，使样本和试剂按一定流速经过检测反应部，最后到达危废处理部。这样整个***相通，样本和试剂依次经过检测反应部反应。样本和试剂依次经过各个梳形结构时，梳形结构内包被的蛋白捕获样本中的相应抗体，再经试剂染色形成显色反应，各个梳形结构的颜色深浅和样本中目标物的浓度成正比，15min后，通过检测区颜色深浅可测出样本中目标物的浓度，或者通过肉眼观察梳形结构是否显色来判定样本中目标物的有无(定性)，或者把芯片***Reader定量读数。吸水纸通过层析作用为整个***体统稳定温和的动力，消毒粉处理反应后的样本及试剂，保障生物安全。
特发性膜性肾病(IMN)筛查检测
操作步骤(如图2)：
1.取出芯片，平放在实验台上，恢复至室温；
2.用采样管吸取5ul指尖血，***到芯片中；
3.确认采样管插好后，按下动力部，使整个***连通，可观察到血液样本和试剂往检测反应部流动；
4.反应15min；
5.判读结果：
当样本中含有anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab时，PLA2R蛋白检测层和THSD7A蛋白检测层均显色，则为特发性膜性肾病阳性；
当样本中含有anti-PLA2R Ab而不含anti-THSD7A Ab时，PLA2R蛋白检测层显色而THSD7A蛋白检测层不显色，则为特发性膜性肾病阳性；
当样本中含有anti-THSD7A Ab而不含anti-PLA2R Ab时，THSD7A蛋白检测层显色而PLA2R蛋白检测层不显色，则为特发性膜性肾病阳性；
当样本中均不含有anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab时，PLA2R蛋白检测层和THSD7A蛋白检测层均不显色，则为特发性膜性肾病阴性；
无论样本中有无anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab，空白对照区均不显色，羊抗鼠IgG抗体检测层均显色。
当空白对照区显色或者羊抗鼠IgG抗体检测层不显色时，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏，在任何情况下，应重新测试。
利用IMN芯片检测指尖血，与特发性膜性肾病的符合率如下表：
〈110〉上海埃文生物科技有限公司
〈120〉微流控芯片装置及其应用
〈160〉4
〈210〉1
〈211〉42
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉1
atgggtcgcg gatccgaatt catgctgctg tcgccgtcgc tg 42
〈210〉2
〈211〉44
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉2
gtggtggtgg tggtgctcga gttggtcact cttctcaaga tcag 44
〈210〉3
〈211〉41
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉3
atgggtcgcg gatccgaatt catggggctg caagccaggc g 41
〈210〉4
〈211〉43
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉4
gtggtggtgg tggtgctcga gcatgtcggc atctccatca tag 43
Claims (8)
1.一种微流控芯片装置，其特征在于包括以下部件：
a .动力部，包括负压腔和连通腔，负压腔上设置有密封接口，连通腔与大气连通，连通腔上设置有两个插口，
b .试剂储存部，包括尾端分支的两个支管和支管汇总后连通的总管，支管中分别气封有不同的银增强试剂，总管自尾端至前端依次气封有PBST、金标二抗和PBST，各段的PBST、金标二抗和PBST通过所述的气封隔开，两个支管的管口和总管的管口均通过密封接口密封，连通腔插口可***支管的密封接口使连通腔与试剂储存部连通，
c .采样部，包括采样管，采样管尾端设置有插口，该插口可***试剂储存部总管的密封接口使试剂储存部与采样管连通，采样管前端设置有采样口，采样管为毛细玻璃采样管，吸指尖血后***芯片中进行反应，采样部与芯片可分离式连接，
d .检测反应部，为具有四段梳形结构的检测管，检测管尾端设置有密封接口，前端与危废处理部连通，检测管自尾端至前端的各段梳形结构的内壁上分别为无包被、PLA2R蛋白检测层、THSD7A蛋白检测层和羊抗鼠IgG抗体检测层，采样部的采样口可***检测反应部尾端的密封接口中使采样管与检测管连通，
e .危废处理部，包括危废腔，危废腔前端具有与检测管前端连通的进口，危废腔尾端具有插口，危废腔内进口与插口之间设置有吸水纸，危废腔尾端插口可***负压腔的密封接口使危废腔与负压腔连通。
2.如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于所述的负压腔和连通腔为一个腔体中隔开的两个区域。
3.如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于试剂储存部的总管具有梳形结构，各段的PBST、金标二抗和PBST分别气封在总管梳形结构的不同梳齿上。
4. 如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于两个支管中气封的银增强试剂分别为苯二酚溶液和硝酸银溶液。
5.如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于所述的危废腔腔体呈扁平的片状
结构，所述的吸水纸平铺在该片状的腔体内。
6.如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于所述的吸水纸为消毒吸水纸。
7.如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于所述的金标二抗为金标鼠抗人lgG4抗体。
8.一种如权利要求1-7任一所述微流控芯片装置在制造特发性膜性肾病检测设备中的应用。
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