CN106896095A - 复合表面等离子体共振及表面增强拉曼的显微成像技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)及表面增强拉曼(Surface‑enhanced Raman Scattering,SERS)的复合显微成像技术,涉及表面等离子体基元及表面增强拉曼领域。本发明技术要点:组装SPR‑SERS综合显微成像***,利用纳米狭缝阵列光栅双模结构激发与检测SPR和SERS。SPR***通过测量SPR峰位的移动判定激发角度的变化,以确定芯片表面生物分子反应所引起的表面有效折射率的改变;SERS***通过测量拉曼光谱以直接分辨生物分子本身。而SPR与拉曼的高效、高灵敏度检测借助于纳米狭缝阵列光栅双模结构:激发光波经光栅结构高效激发SPR;SPR在金属表面传播过程中与纳米间隙产生偶极振荡,SPR产生的表面电场与纳米狭缝偶极共同作用增强表面局域电场获得增强的拉曼信号。
Description
技术领域
本发明涉及表面等离子体基元及表面增强拉曼领域,大面积周期性纳米缝隙阵列结构激发等离子体共振和表面增强拉曼,以及一种复合表面等离子体共振及表面增强拉曼的显微成像技术。
背景技术
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)是光子入射到贵金属表面从而导致金属中的电子随着电场发生振荡的一种量子光电现象。SPR技术通过测量金属界面上发生生物物质相互作用后,表面有效折射率的变化所导致的激发耦合条件的变化来检测生物分子,是一种间接测量;而拉曼信号检测则是一种完全的直接测量。拉曼散射是待测样品对入射光的非弹性散射,其实质是当光子与分子发生非弹性碰撞时,光子将能量传递给待测分子后,分子能态发生跃迁及辐射,揭示分子的振动或转动能级的光谱技术。拉曼光谱提供了待测材料中分子固有的振动和旋转模式,直接反应待测样品的分子结构。然而拉曼散射是一种弱散射过程,其探测受限于背景噪声和荧光背景。拉曼散射截面约为10-30cm2,而荧光过程的散射截面约为10-15cm2;相对于拉曼散射,荧光信号远远高于拉曼散射,这也是目前荧光技术更为普遍应用的原因。拉曼信号电磁场增强是一种通过局域电场(如粗糙的金属表面能够产生增强的局域电场)所引发的拉曼增强效应;这种所谓的表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering, SERS)所产生的信号与分子所处光电场强度的四次方成正比。显然,拉曼信号的增强依赖于局域电场的增强,而局域电场集中在纳米共振结构附近,因此SERS适用于表面附着分子或者细胞表面的蛋白分子的直接分辨及检测。
鉴于SPR技术对生物分子的间接检测与拉曼光谱对分子的直接分辨,近年来不断有科研工作者探讨SPR拉曼增强,或将结合两种模式的双模式结构。现已有研究将银纳米粒嵌入光栅结构用以激发表面等离子体,增强纳米颗粒间的局域场从而进行表面增强拉曼检测。然而,该方法所使用的银颗粒层是随机形成的,无法精确控制纳米粒子位置及间隙形成方式,因此检测结果的可重复性低,以致无法进行实用化应用。另外,有研究制作了周期性金纳米蝴蝶结结构来形成SPR与SERS基底;周期性结构激发表面等离子体,而蝴蝶结结构激发偶极共振,形成强局域电场增强拉曼信号。然而纳米结构蝴蝶结制作工艺繁琐,需要用电子束光刻或离子束刻蚀的方法制作,昂贵的制作成本根本无法实用化推广。虽然采用纳米压印方法可以降低其制作成本,但其纳米结构在转移过程中,精度无法保证。有研究采用111晶向在硅基底上进行湿法刻蚀得到周期性的三角结构,利用金属周期性结构激发表面等离子体局域电场增强拉曼。此方法能达到80%拉曼信号检测重复率,基本达到实用化要求。但其增强方式仅通过表面等离子共振增强拉曼信号,缺少纳米结构增强局域场强,导致增强率不高,无法进行高精度的生物检测。
以上这些方法都能一定程度上实现表面等离子体增强拉曼检测或表面等离子体与表面拉曼增强的同时检测,但目前存在制作成本高、精度低、可实用性差等缺点;另外,SPR-SERS***协同进行显微成像还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:针对上述存在的问题,提供一种高精度、可实用化的复合表面等离子体共振及表面增强拉曼的显微成像技术,于同一芯片实现表面等离子体共振的高效激发和表面局域场的超增强。
本发明采用的技术方案如下:组装SPR-SERS 综合显微成像***,利用纳米狭缝阵列光栅双模结构同时激发与检测SPR和SERS。
SPR-SERS综合显微成像***如图1所示。在普通显微镜白光照明光路之外引入激光,以在SPR-SERS复合功能芯片上激发表面等离体共振,用于感应其上的生物样品;此激光能同时激发局域电场增强,激励生物样品产生表面增强拉曼散射;这两类信号经过显微物镜信号收集***,光路分离进而各自进行成像显示及数据分析。
采用大面积纳米狭缝阵列光栅结构作为SPR-SERS复合芯片,如图2所示,其一个周期内存在两个10纳米量级的纳米间隙以产生强局域场。激发光波经光栅结构高效激发SPR:对于显微照明***,如图3,平行激光经显微物镜聚焦,汇聚于芯片上,到达芯片的入射光包括由零度到物镜所确定的孔径角,方位角为零度到360度的锥形内的所有光束;激光入射方向在孔径角与方位角的变化,提供了SPR检测所需要的变量扫描,即孔径角与方位角角度分布中出现代表SPR激发的暗带(见图3(b))。SPR在金属表面传播过程中与纳米间隙产生偶极振荡,SPR产生的表面电场与纳米狭缝偶极共同作用增强表面局域电场获得增强的拉曼信号。
具体检测包括:照明白光(未画出)经分光棱镜3分光后由透镜4聚焦成像在接收屏5上,进行一般成像检查,包括样品对焦、区域选择及样品轮廓观察等。人眼1可通过透镜2聚焦在焦面上的像直接观察成像。在普通显微镜白光照明光路之外引入两种波长的激光15(例如从两个端口应用同样的光路***,分别引入633纳米及785纳米激光),经一组透镜14与12成平行光,其中采用位相扩散器13去除光的空间相干性以消除激光成像像斑(SPR成像用),位相片11、偏振片10用以调制偏振状态。平行激光光束经分光棱镜7导入显微物镜8,聚焦在样品台9上的纳米狭缝阵列光栅SPR-SERS芯片区域。聚焦在SPR-SERS芯片区域上的光线经显微物镜8收集反射光束后再经过分光棱镜7导入下一分光棱镜6。平行光束经过滤波片16分别进入SPR成像***和SERS检测***:激发SPR的一路平行光束全部通过滤波片16由透镜17聚焦导入CCD相机(Charge Coupled Device, 电荷耦合器件)相机18,由CCD相机接收SPR信号(傅里叶变换平面)电脑显示SPR像,通过测量代表SPR激发的两条暗带(如图3(b))表征激发角度的移动;拉曼散射光线由滤波片16全部反射而经过反射镜19改变光路的方向,再经过滤波片20后由透镜21聚焦在拉曼检测区域(包括光栅23、24和CCD相机25)26上的狭缝22,由拉曼检测区域26接收拉曼光谱的信号,分析分子的本征峰以直接分辨分子。
综上所述,本发明的关键为:将表面等离子共振激发以及表面增强拉曼激发在同一芯片上实现,利用显微镜成像,实现表面等离子体与表面增强拉曼的同时检测。通过测量SPR峰位的移动判定激发角度的变化,以确定芯片表面生物分子反应所引起的表面有效折射率的改变。同时,金属表面SPR与纳米缝隙的耦合所导致的强局域场,可以用来测量拉曼光谱以直接分辨生物分子本身。SPR间接测量与拉曼信号的直接判定,为精确判定感应表面上的生物反应增加了确定性。综上,本发明提出的复合显微成像技术具有成本低、精度高、可实用性强的优点,可广泛应用于生物检测等领域。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明,其中:
图1为SPR-SERS双模芯片复合显微成像示意图。1为人眼,2、4、12、14、17、21为透镜,3、6、7为分光棱镜,5为接收屏,8为显微物镜,9为样品台,10为偏振片,11为位相片,13为位相扩散器,15为激光,16、20为滤波片,18、25为CCD相机,19为反射镜,22为狭缝,23、24为光栅,26为拉曼检测区域。
图2(a)为原子力显微镜测量的复合芯片面型示意图。显示纳米缝隙阵列结构及纳米缝隙,图中斜线区域的高度信息如图2(b)。
图2(b)为复合芯片的狭缝扫描图。狭缝扫描图对应于图2(a)中面型示意图中的斜线区域代表的高度信息。
图3(a)为显微镜示意图。为物镜光轴与实际光线之间的夹角,为锥形光束内某一光线投影到圆平面上与x轴方向所成方位角,方位角从0度到360度变化;坐标描述在图3(b)中。
图3(b)为入射角为时的SPR像。图中白色圆圈线表示SPR的傅里叶变换平面,两条黑色暗带代表SPR激发。图中x轴方向沿逆时针绕一圈,对应方位角从0度到360度变化;在x轴方向从圆心沿径向往外分别对应孔径角从0度到正负最大孔径角处。
图4为SPR激发检测平台示意图。15为激光,27为40倍、数值孔径0.65的显微物镜,28为透镜,7为分光棱镜,8为40倍、数值孔径为0.65或100倍、数值孔径为0.85的显微物镜,9为样品台,17为透镜,18为CCD相机,29为计算机。
图5为不同电介质下的SPR像。金属光栅上的周围媒介,由空气(air)、纯水(H2O)、1%、10%、25%、50%、75%容积比乙二醇到纯乙二醇(Ey_Gl)变化,对应代表SPR激发的暗带由外侧向中心处移动。
图6为不同电介质下SPR激发角度随复合折射变化的关系曲线。SPR表面电介质从纯水、1%乙二醇到100%乙二醇变化时,激发角度随复合折射率的变化关系;给出7个数据点及线性拟合曲线。
图7为不同浓度苯硫酚溶液下SPR激发角度变化曲线。电介质溶液中苯硫酚溶液浓度(单位为摩尔M)从0M、10-2M、10-1M、1M、10M变化时,SPR激发角度随苯硫酚溶液浓度的变化关系;给出5个数据点及线性拟合曲线。
图8为不同浓度苯硫酚溶液下的表面增强拉曼散射光谱图。从下到上依次对应苯硫酚浓度为10-6M、10-5M、10-4M、10-3M的四条拉曼光谱。
图9为特征峰位1023cm-1的绝对强度平均值随苯硫酚溶液浓度的变化关系。电介质溶液中苯硫酚溶液浓度10-6M、10-5M、10-4M、10-3M变化,1023cm-1峰位绝对强度平均值随苯硫酚浓度的变化;给出4个数据点及线性拟合曲线。
图中标记为:1人眼;2透镜;3分光棱镜;4透镜;5接收屏;6分光棱镜;7分光棱镜;8显微物镜;9样品台;10偏振片;11位相片;12透镜;13位相扩散器激光;14透镜;15激光;16滤波片;17透镜;18 CCD相机;19反射镜;20滤波片;21透镜;22狭缝;23光栅;24光栅;25 CCD相机;26拉曼检测区域;27 40x/0.65显微物镜;28透镜;29计算机;air指煤质为空气;H2O指煤质为纯水;1%指煤质为乙二醇比纯水容积比为百分之一;10%指煤质为乙二醇比纯水容积比为百分之十;25%指煤质为乙二醇比纯水容积比为百分之二十五;50%指煤质为乙二醇比纯水容积比为百分之五十;75%指煤质为乙二醇比纯水容积比为百分之七十五;100%指煤质为乙二醇比纯水容积比为百分之一百。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征,或公开的所有方法或过程中的步骤,除了互相排斥的特征和/或步骤以外,均可以以任何方式组合。
本说明书中公开的任一特征,除非特别叙述,均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即除非特别叙述,每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
采用图2所示复合生物芯片:普通光栅结构经参数耦合后形成新的光栅,新旧光栅之间形成纳米间隙,一个周期内存在两个10纳米量级的纳米间隙;复合芯片为光栅周期大约400或600纳米的缝隙阵列结构,对应SPR激发波长分别为633或785纳米。对于显微照明***,平行光经显微物镜聚焦,汇聚于芯片上,到达芯片的入射光包括由零度到物镜所确定的孔径角,方位角为0度到360度的锥形内的所有光束。显微镜将入射平面波聚焦成锥形分布,入射角范围为,为入射光波的最大孔径角(由物镜的数值孔径NA决定), ,其中n为入射媒介折射率。如图3(a)所示,入射平行光转换为入射角为,入射面(对应方位角)为0-360︒的无数组光波。入射方向在孔径角与方位角的变化,提供了SPR检测所需要的变量扫描,即孔径角与方位角角度分布中出现代表SPR激发的如图3(b)所示的暗带。由显微镜示意图可知,入射角分布是对称的,若以一侧入射角激发SPR波,必存在一相反入射角激发另一反向传播的SPR波。
复合双模芯片的SPR激发检测平台如图4所示。633nm或785nm波长激光15经显微物镜27(40x/0.65)及透镜28滤波、准直后成为平行光,经分光棱镜7导入显微物镜8(40x/0.65或100x/0.85)聚焦于样片上(其置于样品台9)。芯片上的光线反射回来经过物镜8,分光棱镜7后改变方向,由透镜17聚焦,在其傅里叶变换平面上用CCD相机18接收SPR信号,计算机29记录CCD相机18的成像信息。在此检测平台上进行SPR体折射率标定和面折射率灵敏度测试。
进行SPR体折射率灵敏度标定:不同浓度百分比乙二醇溶液分别按照乙二醇与去离子水的容积比例为0%、1%、10%、25%、50%、75%、100%配置样品;在进行每个浓度点测试时,将溶液用移液管取出,滴在芯片上,周围放置垫片,盖上一片盖玻片以保证液样厚度为100微米。选用785纳米激光作为激发光源,通过40x/0.65显微物镜收集反射光,改变金属光栅上的媒介,由空气、纯水、1%乙二醇到100%乙二醇变化,得到不同浓度下的显微SPR像(傅里叶面,成像透镜的焦面),如图5;通过容积比的关系,根据n复合折射率=水容积百分比n水+乙二醇容积百分比n乙二醇可计算出785纳米波长下混合溶液的折射率;线性拟合SPR表面电介质从纯水、1%乙二醇到100%乙二醇变化时,激发角度随复合折射率的变化关系如图6,计算可得每变化单位折射率(Refractive Index Unit, RIU)时激发角度改变69.8°,复合芯片的SPR体折射率灵敏度S=69.8°/RIU。
选用具有文献中普遍采用的拉曼标识材料苯硫酚来进行复合芯片的测试证明。SPR生物检测是测量金属表面反应所引起的表面有效折射率的变化,因此,反映SPR检测性能的物理量是其表面折射率灵敏度,即表面分子层吸附灵敏度。苯硫酚中的硫原子与金属结合形成单分子层;金属上结合单分子层的面密度与苯硫酚溶液的浓度成正比关系。用移液器取苯硫酚溶液于分析纯乙醇中得到溶度分别为10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、10-1M、1M的苯硫酚稀释液,置于超声清洗机中用60%功率常温超声2分钟,让苯硫酚分子均匀分布在溶液中。
在进行每个SPR浓度点测试前,将芯片分别依次放入上述所配10-2M、10-1M、1M、10M苯硫酚溶液中,浸泡2小时让其表面吸附苯硫酚分子。浸泡后从苯硫酚溶液中取出样片,放入乙醇溶液中漂洗2-3秒后取出。将漂洗后的样片放入氮气干燥柜中,在氮气流中干燥后测试备用。取复合测试样片于样品台9上,用100x/0.85显微物镜进行聚焦激发SPR。 按照上述测试过程测定复合芯片在未沉积苯硫酚溶液时的SPR信号,作为浓度为0 M的参考点。
在进行每个拉曼浓度点测试前,将芯片放入10-6M、10-5M、10-4M、10-3M苯硫酚溶液中浸泡4小时后取出,在乙醇溶液中漂洗2-3秒后取出。将漂洗后的样片放入氮气干燥柜中,在氮气流中干燥后测试备用。用镊子将测试样片放到拉曼-原子力联用***拉曼检测平台的样品台上,以633纳米或785纳米波长激光作为激发光源,到达样品的激光功率为0.1毫瓦、2.5毫瓦。用50x/0.5物镜进行聚焦,激发光斑大小为2,扫描3次,积分3秒。
取测试样片于图4所示样品台9上,用100x/0.85显微物镜进行聚焦激发SPR,选用633纳米激光作为激发光源。据前述样品准备方法,将待测样片进行0M苯硫酚浓度的SPR复合芯片测试;再依次进行10-2M、10-1M、1M、10M苯硫酚浓度溶液浸泡处理的SPR复合芯片进行测试。
当电介质溶液中苯硫酚溶液浓度从0M、10-2M、10-1M、1M、10M变化时,SPR激发角度随苯硫酚溶液浓度的变化关系如图7所示,每个数据点代表测试样品区域上4个不同位置的平均值,测量中的标准偏差值以误差棒给出;斜线为以各浓度下的SPR激发角度的平均值拟合的线性曲线。当苯硫酚浓度较低时,如10-2M、10-1M;当苯硫酚浓度为10M时,SPR激发角度偏差较大。根据线性拟合方程,每改变单位浓度激发角度改变1.5°,复合芯片的表面感应灵敏度S surface=1.5°/M。
应用复合芯片,可同时获得SPR及拉曼散射检测,只需将反射信号通入拉曼光谱仪,而SPR信号导入SPR成像仪中。采用的拉曼-原子力联用***拉曼检测平台同图1拉曼检测部分原理相同。考虑到复合芯片对高浓度苯硫酚分子非常敏感,激发强度达到饱和,采用低浓度苯硫酚溶液进行拉曼检测。用50x/0.5 物镜进行聚焦,聚焦光斑大小为2微米,扫描3次,积分3秒. 如图8所示为10-6M、10-5M、10-4M、10-3M浓度苯硫酚溶液下的拉曼光谱图。从下到上依次对应10-6M、10-5M、10-4M、10-3M四条拉曼光谱,苯硫酚各特征峰明显;随着苯硫酚浓度的降低,拉曼光强随之降低。当浓度降低到10-15M时,仍可以检测到较强的拉曼信号。拉曼谱中特征峰及高的信噪比,显示高出的拉曼增强效应,SERS的增强因子为106。
取特征峰位的绝对强度平均值随苯硫酚溶液浓度的变化关系做图9。每个数据点代表测试样品区域拉曼光谱1023cm-1峰位的绝对强度平均值,其中对每个浓度点扫描三次并取平均值;斜线为各浓度下1023cm-1峰位绝对强度值的线性拟合曲线,;标准偏差以图中的误差线标出。当苯硫酚浓度较高时,如10-4M、10-3M;绝对强度由于浓度饱和而偏差较大。
结合图4所示的SPR显微成像装置及商用拉曼显微***,应用纳米狭缝阵列光栅结构,在同一芯片实现了表面等离子SPR检测与表面增强拉曼散射SERS检测。应用本发明图1的显微***,结合大面积纳米狭缝阵列光栅结构作为SPR-SERS复合芯片,即可在同一SPR-SERS芯片上,同时实现SPR与拉曼的高效、高灵敏度检测。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合,以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
Claims (5)
1.一种复合表面等离子体(Surface Plasmon Resonance, SPR)无标记检测及表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering, SERS)的显微成像技术;
其特征在于,在普通显微镜轮廓成像的基础上,于同一芯片实现表面等离子体共振的高效激发和表面局域场的增强;其中SPR 与 SERS 的同时高效激发是通过一种大面积周期性纳米缝隙阵列结构实现的。
2.根据权利要求1所述的显微成像技术,其特征在于显微照明***将平行光经显微物镜聚焦,汇聚于芯片上,达到芯片的入射光包括由零度到物镜所确定的孔径角,而方位角为零度到360°的锥形内的所有光束。
3.根据权利要求1所述实现表面等离子体共振的高效激发,其特征在于大面积周期性纳米缝隙阵列结构可激发SPR,SPR和纳米间隙相互耦合增强表面局域场,增强的强局域场再增强SPR,得到SPR的高效激发;显微SPR像通过CCD(Charge Coupled Device,电荷耦合器件)相机在透镜傅里叶变换平面上接收。
4.根据权利要求1所述实现表面增强拉曼散射的方法,其特征在于大面积周期性纳米缝隙阵列结构可激发高效的SPR,SPR在金属表面传播过程中与纳米间隙产生偶极振荡;SPR产生的表面电场增强与纳米狭缝局域偶极场共同作用增强表面局域场获得强拉曼信号。
5.根据权利要求1所述同时实现表面等离子体共振的高效激发和表面局域场的增强,其特征在于在应用两种波长,使用同一芯片,同时测得表征角度频谱信息的SPR信号和表征强度信息的拉曼信号。
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