CN106890479A

CN106890479A - 一种双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法

Info

Publication number: CN106890479A
Application number: CN201710130464.8A
Authority: CN
Inventors: 林子俺; 郑琼; 俞瑞芳
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2017-06-27
Anticipated expiration: 2037-03-07
Also published as: CN106890479B

Abstract

本发明公开了一种双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法。该方法将含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体、交联剂、致孔剂、引发剂于室温下超声至完全溶解，再注入经乙烯基改性的石英毛细管内，经过处理制得毛细管整体柱。该方法制得的聚合物基质毛细管整体柱可通过变换不同条件的流动相，实现在同根柱上既可以富集糖蛋白，又可以富集磷酸化蛋白，适用于分离或富集含1,2‑顺式二醇结构的小分子、糖蛋白和磷酸化蛋白。

Description

一种双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法

技术领域

本发明属于毛细管整体柱的制备领域，更具体地涉及一种双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法。

背景技术

蛋白质是生理功能的执行者，当今生命科学研究的热点之一是蛋白质组学，其中翻译后修饰蛋白组学在蛋白质组学的研究中占重要地位。糖基化和磷酸化蛋白质翻译后修饰是最常见的翻译后修饰。虽然糖基化和磷酸化蛋白质种类繁多，但生物样品中多数目标糖蛋白和磷酸化蛋白的相对丰度较低。因此，研究糖基化和磷酸化蛋白质的首要工作就是如何将其从复杂体系中分离富集出来，这也是翻译后修饰蛋白质组学发展的关键技术。

毛细管整体柱是微分离领域的热点研究对象，是具有多孔结构的整体棒状固定相，其优点是制备简单、条件温和、通透性好、易于改性等，在复杂生物样品分离领域逐渐发挥重要作用。整体柱按基质的不同可分为三个部分：无机基质整体柱、有机基质整体柱和有机-无机杂化整体柱。有机基质整体柱主要是将单体、交联剂、致孔剂、引发剂等混合均匀后注入改性后的毛细管内，在一定温度条件下反应一段时间，形成聚合物连续床。有机基质整体柱具有合成方法简单、色谱性能稳定、生物兼容性好等优点。

硼酸亲和色谱是一种经典的糖蛋白富集技术（Zian Lin, Jilei Pang, HuanghaoYang, Zongwei Cai, Lan Zhang, Guonan Chen, Chem. Commun., 2011, 47 (34),9675-9677.）。硼酸基团在碱性条件下可与含1,2-顺式二羟基的物质发生可逆共价键结合，在酸性条件下共价键解离重新释放出含顺式二羟基的物质。由于硼酸盐亲和色谱具有亲和力强，过程可逆，操作简便等优点，在糖蛋白分离与富集领域受到了越来越广泛的关注。

磷酸化肽的选择性富集通常是用固定金属离子亲和色谱（IMAC）。传统的IMAC是Fe³⁺或Ga³⁺等与亚氨基二乙酸（IDA）或次氨基三乙酸（NTA）形成螯合作用，然而，这种方法不仅能富集磷酸化肽，而且对非磷酸化的酸性肽段以及含组氨酸残基的多肽也具有一定的亲和效果，将会抑制磷酸化肽的富集。邹汉法课题组（Shun Feng, Mingliang Ye, HoujiangZhou, Xiaogang Jiang, Xingning Jiang, Hanfa Zou, Bolin Gong,Mol.Cell.Proteomics, 2007, 6:1656-1665）发展了一种新型的以磷酸化基团为配位基团的IMAC技术，将磷酸基团通过共价键结合到载体上，然后将Ti⁴⁺或Zr⁴⁺固载到载体表面，用于选择性富集磷酸化蛋白。

双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱具有同时富集糖蛋白和磷酸化蛋白的优点，并且机械强度高，渗透性好，为糖蛋白和磷酸化蛋白的富集提供了新方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种基于双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法。该方法制备的整体柱可分别用于两种翻译后修饰蛋白质的分离富集，具有均匀连续层固定相、良好的机械稳定性和渗透性；在分离具有1,2-顺式二羟基的小分子、糖蛋白和磷酸化蛋白方面具有较好的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法，包括以下步骤：

1）将含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合均匀，将所得混合物在室温下超声振荡，然后通氮气（氮吹）以除去混合物中溶解的氧气；

2）将步骤1）制得的混合物注入经乙烯基改性的石英毛细管内，密封后置于水浴锅内，并于60~85℃（优选75℃）发生原位自由基聚合反应12~24h（优选24h），将毛细管从水浴锅内取出用甲醇或乙腈冲洗制得所述的原位自由基聚合的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱。

该方法的步骤1）中所述含硼酸基团的单体为任意同时含硼酸基团和末端烯烃的化合物，优选4-乙烯基苯硼酸；含磷酸基团的单体为任意同时含磷酸基团和末端烯烃的化合物，优选乙烯基膦酸；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种，优选所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；致孔剂为二甘醇和乙二醇的混合物，引发剂为偶氮二异丁腈。

所述含硼酸基团的单体与含磷酸基团的单体的摩尔质量比为1~2:1，优选1:1；含硼酸基团的单体与含磷酸基团的单体的总质量与交联剂的质量比为11~12:8~9，优选11.3:8.7；所述含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体和交联剂三者之和与致孔剂的质量比为20~40:60~80，优选20:80；致孔剂二甘醇和乙二醇的混合物中，二甘醇与乙二醇的质量比为60~80:1~20，优选72:8；所述引发剂的质量为含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体和交联剂三者总质量的1~2%，优选1%。

本发明还保护了利用上述制备方法制得的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的应用，制得的毛细管整体柱用于分离或富集含1,2-顺式二羟基结构的小分子、生物大分子糖蛋白和磷酸化蛋白。

本发明的优点如下：

1.本发明提供的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱制备方法，反应温度温和，制备过程简单，易于操作。制得的毛细管整体柱具有良好的固定床，通透性好，可满足快速、高效分离的要求；

2.本发明提供的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱可满足含1,2-顺式二醇结构的小分子、糖蛋白质以及磷酸化蛋白等物质的分离或富集，具有高效的选择性，在同一根整体柱上分别分离富集不同的蛋白质。

附图说明

图1 为本发明的双功能亲和毛细管整体柱截面的扫描电镜图；

图2 为图1所示整体柱柱体与管内壁连接处的扫描电镜图；

图3 为实施例2中邻苯二酚和对苯二酚混合样的色谱分离图；

图4 为实施例3中牛血清白蛋白（BSA）、辣根过氧化酶（HRP，一种糖蛋白）两种蛋白的色谱分离图；

图5 为实施例4中牛血清白蛋白（BSA）、血红蛋白（Hb）和β-酪蛋白（一种磷酸化蛋白）三种蛋白的色谱分离图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但是本发明不仅限于此。本发明采用的原材料可在市场购得，或可用本领域已知的方法合成。

实施例1

1. 柱子预处理

将毛细管内壁依次用丙酮冲洗30min，二次水冲洗1h，1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗12h，二次水冲洗1h，0.2mol/L盐酸溶液冲洗3h，二次水冲洗1h，甲醇冲洗30min，在60℃氮气吹干。

2. 硅烷化

在预处理过的毛细管内注入无水甲醇与甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）体积比为1：1的混合液，在45℃下反应24h，然后用甲醇冲洗30min，在60℃氮气吹干。

3. 柱内合成

准确称取32.5 mg 4-乙烯基苯硼酸（VPBA），24 mg乙烯基膦酸（VPA），1 mg 偶氮二异丁腈（AIBN）于离心管中，加入322 μL二甘醇、36 μL乙二醇和42 μL乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），于室温下超声20 min，直至混合物完全溶解。将混合物注入硅烷化后的100 μm内径毛细管中，至25 cm处，两端封口放入75 ℃水浴中反应24 h。反应结束后取出冷却至室温，用高压恒流泵在低流速下100%甲醇冲洗40 min以除去未反应的功能单体以及反应产生的一些副产物，制得双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱。该整体柱在使用前用100 mmol/L醋酸冲洗平衡30 min。

用扫描电子显微镜观察上述制备得到的整体柱的柱体微观形貌，可以得知材料具有微米级的通孔和连续的三维骨架，如图1所示。

用扫描电子显微镜观察上述制备得到的整体柱的柱体微观形貌，可以得知整体柱基质与石英毛细管内壁键合完好，能耐受16兆帕的泵压，具有较好的机械稳定性，如图2所示。

实施例2

在微柱液相色谱（μHPLC）模式下，以pH 8.0，离子浓度20 mmol/L磷酸盐溶液：乙腈（50/50，v/v）的缓冲液为流动相A，运行时间7min；以100 mmol/L醋酸溶液：乙腈（50/50，v/v）的缓冲液为流动相B，运行时间从7min开始；泵流速为0.05 mL/min；检测波长为214 nm。以1000 μg/mL邻苯二酚和1000 μg/mL对苯二酚为例，在流动相A条件下，对苯二酚在整体柱上不保留而直接被洗脱出来，而含1,2-顺式结构的邻苯二酚因与硼酸基团形成可逆共价键而被吸附在柱上，当流动相切换到B条件下，邻苯二酚得到洗脱。二者混合物在实施例1中制得的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱上实现高效选择性的分离，其色谱分离图如图3所示。

实施例3

在微柱液相色谱（μHPLC）模式下，以pH9.0，离子浓度20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液：0.4mol/L 氯化钠（NaCl）（50/50，v/v）的混合溶液为流动相A，运行时间7 min；以100 mmol/L醋酸溶液为流动相B，运行时间从7 min开始；泵流速为0.05 mL/min；检测波长为214 nm。以非糖蛋白（1000 μg/mL牛血清白蛋白，BSA）与含1,2-顺式结构的糖蛋白（1000 μg/mL辣根过氧化酶，HRP）为例，在流动相A条件下，BSA在整体柱上不保留而直接被洗脱出来，而HRP上的糖链因与硼酸基团形成可逆共价键而被吸附在柱上，当流动相切换到B条件下，HRP得到洗脱。二者蛋白混合物在实施例1中制得的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱上实现高效选择性的分离，其色谱分离图如图4所示。

实施例4

实施例1中制得的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱使用前先用10 mmol/LZrCl₄以0.005 mL/min流速过夜处理，使整体柱骨架表面的磷酸基团与Zr⁴⁺形成螯和作用，剩余的Zr⁴⁺的结合位点在酸性条件下与磷酸化蛋白形成螯和，用于吸附磷酸化蛋白，然后在碱性条件下脱附。

在微柱液相色谱（μHPLC）模式下，以10 mmol/L，pH6.0的 3-吗啉丙磺酸（MOPS）为流动相A，运行时间7min；以10%氨水为流动相B，运行时间从7 min开始；泵流速为0.05 mL/min；检测波长为280 nm。以非磷酸化蛋白BSA和Hb以及磷酸化蛋白β-酪蛋白为例，蛋白浓度均为1000 μg/mL，在流动相A条件下，非磷酸化蛋白BSA和Hb在整体柱上不保留而直接被洗脱出来，而磷酸化蛋白β-酪蛋白在酸性条件下整体柱中的Zr⁴⁺形成螯合作用；当流动相切换到B条件下，β-酪蛋白得到洗脱。二者蛋白混合物在实施例1中制得的双功能亲和毛细管整体柱上实现高效选择性的分离，其色谱分离图如图5所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1）将含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合均匀，将所得混合物于室温下超声振荡，然后通氮气以除掉混合物中溶解的氧气；

2）将步骤1）制得的混合物注入经乙烯基改性的石英毛细管内，密封置于水浴锅内发生原位自由基聚合反应；将毛细管从水浴锅内取出，用甲醇或乙腈冲洗制得所述的原位自由基聚合的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述含硼酸基团的单体为同时含硼酸基团和末端烯烃的化合物中的一种，含磷酸基团的单体为同时含磷酸基团和末端烯烃的化合物中的一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种；致孔剂为二甘醇和乙二醇的混合物；引发剂为偶氮二异丁腈。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述致孔剂中，二甘醇与乙二醇的质量比为60~80:1~20。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述二甘醇与乙二醇的质量比为72:8。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，含硼酸基团的单体与含磷酸基团的单体的摩尔质量比为1~2:1；含硼酸基团的单体与含磷酸基团的单体的总质量与交联剂的质量比为11~12:8~9；含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体和交联剂三者之和与致孔剂的质量比为20~40:60~80；所述引发剂的质量为含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体和交联剂三者总质量的1~2%。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述含硼酸基团的单体与含磷酸基团的单体的摩尔质量比为1:1；所述含硼酸基团的单体与含磷酸基团的单体的总质量与交联剂的质量比为11.3:8.7；所述含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体和交联剂三者之和与致孔剂的质量比为20:80；所述引发剂的质量为含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体和交联剂三者总质量的1%。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，反应温度为60~85℃；反应时间为12~24h。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，反应温度为75℃；反应时间为24h。

10.根据权利要求1~9中任一项所述的制备方法制得的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的应用，其特征在于：制得的双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱用于分离或富集含1,2-顺式二羟基结构的小分子、生物大分子糖蛋白和磷酸化蛋白。