CN106880593A - 一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂及其制备方法与应用。以两亲性嵌段共聚物PCL‑b‑PAsp自组装形成的聚合物胶束作为纳米载体，利用其亲水性壳层中PAsp链段的负电性吸附带正电的Ag+离子并通过还原剂将其原位还原成纳米银，再利用疏水性的内核PCL包裹天然无毒的抗菌成分姜黄素，从而形成同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束，用于增强抗菌活性。本发明的纳米抗菌剂对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均有很好的协同抗菌效率。其制备简单，原料具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且价廉易得，容易向临床方向转化。与单独负载纳米银或姜黄素相比，对致病细菌展现出很好的协同杀灭效果，具有良好的应用前景。

Description

一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂的制备方法及其在增强抗菌活性中的应用。
背景技术
近年来，多药耐药细菌的快速出现已成为一个日益严重的全球性问题，世界卫生组织将其认定为人类健康的三大威胁之一。因此，探索具有良好安全性和强抗菌活性且不会产生细菌耐药性的新抗菌剂是当务之急。为此，人们广泛研究了各种抗菌材料，如抗菌肽、阳离子聚合物、碳基纳米材料、聚合物和无机纳米粒子，以提高抗菌性能。然而，单一疗法已不足以完全应对复杂的细菌感染。例如，医生常会使用两种或更多种抗菌药物来增加对结核分支杆菌患者的治疗效果。因此，对新型高效的联合治疗的开发正成为治疗细菌感染的关键。
被普遍用于消费产品的银纳米粒子，由于其广谱抗菌活性、有限的细菌耐药性和对哺乳动物细胞相对较低的毒性，被认为是最好的抗菌剂之一。银纳米粒子可以增加细菌膜的通透性，从而渗透到细菌的细胞质中，使其蛋白变性并干扰DNA复制，最终导致细菌死亡。因此，研究者们做出了巨大努力，通过将银纳米粒子与常规抗生素（如氨苄青霉素、青霉素G、红霉素、卡那霉素和万古霉素等）结合，以实现针对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的协同抗菌效果。然而，这些方法也可能存在一些问题，如银纳米粒子的聚集、较高的成本以及抗生素的副作用等。
大量研究表明，使用适当的载体材料，包括季铵化合物、二氧化硅纳米粒子、氧化石墨烯、碳纳米管和聚合物结构，可以有效负载银纳米粒子并阻止其急剧降低抗菌效率的聚集。在各种各样可选择的模板中，由两亲性嵌段共聚物自组装形成的聚合物胶束是一个值得推荐的银纳米粒子载体，因为它具有多功能性可调的组成和在生物医药应用中独特的优势。此外，聚合物胶束也为同时递送不同治疗药物提供了机会。
姜黄素是一种天然多酚化合物，可以从草本植物姜黄的根茎中提取。它是一种高效、无毒、廉价的药物，具有广泛的生物活性，如抗癌、抗HIV、抗氧化、抗炎和抗菌。近期研究表明，当姜黄素结合其它试剂（包括乳铁蛋白，N-乙酰半胱氨酸和抗生素）使用时，它可以发挥协同抗菌的效果。但因姜黄素水溶性差、生物利用度低，其临床发展极其有限。幸运的是，聚合物胶束可以作为合适的纳米载体克服这些问题。因此，利用聚合物胶束制备一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂是一种非常具有前途联合抗菌方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束及其制备方法。并对本发明用于发挥纳米银和姜黄素的协同抗菌能力进行评估。
本发明的聚合物胶束体系将具备以下一些优势：1）能够克服纳米银自身容易聚集的缺点，提高其在水体系中的分散性和稳定性；2）提高疏水性姜黄素在水中的溶解性和生物利用度；3）组成聚合物胶束的嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物可降解性；4）同时负载纳米银和姜黄素，能够根据两者的不同机制发挥协同抗菌的作用，增强抗菌效果；5）价廉易得的原料可以为以后的实际应用提供方便。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂，其特征在于： 它是以两亲性嵌段共聚物PCL-b-PAsp在水溶液中自组装形成PCL-b-PAsp聚合物胶束PM，利用亲水性壳层中PAsp的负电性吸附带正电的Ag+离子并通过还原剂将其原位还原成纳米银，再利用疏水性内核PCL包裹天然无毒的抗菌成分姜黄素，从而形成既携带纳米银又同时负载姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur；其中PCL-b-PAsp聚合物胶束PM： 纳米银：姜黄素的重量份数比为10：1：2。
该纳米抗菌剂具有良好的生物相容性和生物可将降解性，并且能够克服纳米银自身容易聚集和姜黄素水溶性差的缺点，提高两者的稳定性和生物利用度，并根据各自不同的抗菌机制发挥协同抗菌的作用，增强抗菌效果。同时，价廉易得的原料和简单易行的制备方法使得这种纳米抗菌剂易于推广应用。
本发明进一步公开了同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）将5.0 mg PCL-b-PAsp溶解于1 mL DMF中，再将此聚合物溶液在电磁搅拌下，逐滴缓慢加入到9 mL磷酸盐缓冲液，1 mM，pH=7.4中，然后将溶液在室温下搅拌4 h使胶束稳定，之后将溶液透析三天以完全除去体系中的DMF溶剂，得到PCL-b-PAsp聚合物胶束PM；
2）将100 μL 5 mg/mL AgNO3溶液在冰水浴搅拌下逐滴缓慢加入到PCL-b-PAsp聚合物胶束PM，在黑暗环境下轻轻搅拌30 min后，快速加入100 μL 15 mg/mL 新鲜NaBH4溶液，溶液迅速变色，继续搅拌4 h，然后透析两天得到PM-Ag溶液；
3）将1.0 mg姜黄素溶解于5 mL无水DMF中，并在磁力搅拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室温下搅拌2 h后，将溶液透析两天以除去体系中的DMF，最终得到同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur。
其中聚环己内酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制备步骤如下：
1）将0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺（1 mmol）和10.0 g ε-CL（87.8 mmol）加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合，然后用20 mL重蒸的甲苯溶解均匀，加入一滴Sn(Oct)2（0.1% wt/wt）；
2）液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复此过程三次，之后在氮气保护下，于110°C的油浴中反应12 h；
3）反应结束后冷至室温，加入冰***沉淀，静置使其沉淀完全，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体 PCL-NHBoc；
4）将上述3）中所得的PCL-NHBoc溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中，然后在室温下搅拌12 h，反应结束后，用冰***沉淀，在冰箱中静置过夜，抽滤洗涤，干燥得白色固体；
5）将4）中白色固体在三乙胺和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中室温搅拌12 h，再用冰***沉淀，抽滤，放入真空干燥箱中干燥得到大分子引发剂PCL-NH2；
6）将2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH2（0.2 mmol）和2.5 g BLA-NCA（10 mmol）加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷将其溶解均匀，然后液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复三次，之后在氮气保护下，于30°C的油浴中反应24 h；
7）反应完成后，加入适量的二氯甲烷稀释并用十倍体积的冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体PCL-b-PBLA；
8）将1.0 g上述7）中得到的白色固体置于25 mL圆底烧瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，在0℃冰浴下搅拌2 h，之后用冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。
本发明更进一步公开了同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂在增强抗菌活性药物方面的应用；所述的增强抗菌活性指的对致病细菌有很好的协同杀灭效果。
本发明同时也公开了同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂在提高对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌协同抗菌效率方面的应用。实验结果显示：与单独负载纳米银或姜黄素的聚合物胶束相比，同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂具有更好的协同抗菌效果。
本发明更加详细的描述如下：
（1）聚合物胶束：一种同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束，以两亲性嵌段共聚物聚环己内酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）在水溶液中自组装形成的胶束PM为基础，亲水性PAsp壳层中含有的大量羧基（-COOH）使胶束表面带有负电荷，可以吸引带正电的Ag+离子，随后加入还原剂（如NaBH4）将其原位还原为纳米银，而疏水性的PCL内核可以包裹疏水性的姜黄素，从而形成既携带纳米银又同时负载姜黄素的聚合物胶束。
（2）同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束的制备方法：
1）将5.0 mg PCL-b-PAsp用 1 mL DMF溶解均匀，再将此聚合物溶液在快速的电磁搅拌下，逐滴缓慢加入到9 mL磷酸盐缓冲液（1 mM，pH=7.4）中，然后将溶液在室温下匀速搅拌4h使胶束稳定，之后将溶液透析三天以完全除去体系中的DMF溶剂，得到PCL-b-PAsp胶束溶液；
2）在冰水浴搅拌下，将100 μL 5 mg/mL AgNO3溶液逐滴缓慢加入到PCL-b-PAsp胶束溶液中，在黑暗环境下匀速搅拌30 min后，快速加入100 μL 15 mg/mL 新鲜NaBH4溶液，溶液迅速变色，继续搅拌4 h，然后透析两天得到PM-Ag溶液；
3）将1.0 mg姜黄素用5 mL无水DMF溶解均匀，并在磁力搅拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室温下搅拌2 h后，将溶液透析两天以除去体系中的DMF，最终得到同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur。
进一步所述的聚环己内酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制备步骤如下：
1）将0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺和10.0 g ε-CL加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合，然后加入20 mL重蒸的甲苯溶解均匀，再加入一滴Sn(Oct)2；
2）通过液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复此过程三次，之后在氮气保护下，于110°C的油浴中反应12 h；
3）反应结束后将反应瓶冷至室温，然后加入冰***沉淀，静置使其沉淀完全，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体 PCL-NHBoc；
4）将上述3）中所得的PCL-NHBoc均匀溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中，然后在室温下匀速搅拌12 h，反应结束后，用冰***沉淀，在冰箱中静置过夜，抽滤洗涤，干燥得白色固体；
5）将4）中白色固体在三乙胺和二氯甲烷的混合溶剂中室温搅拌12 h，再用冰***沉淀，抽滤，放入真空干燥箱中干燥得到大分子引发剂PCL-NH2；
6）将2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH2和2.5 g BLA-NCA加入到干燥的茄形瓶中，加入15mL二氯甲烷将其溶解均匀，然后液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复三次，之后在氮气保护下，于30°C的油浴中反应24 h；
7）反应完成后，加入适量的二氯甲烷稀释并用十倍体积的冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体PCL-b-PBLA；
8）将1.0 g上述7）中得到的白色固体置于25 mL圆底烧瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，在0°C冰浴下搅拌2 h，之后用冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。
本发明更进一步公开了所述的聚合物胶束对能够分泌脂肪酶的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌能力的评估，步骤如下：
1）分别从含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌菌落的固体LB琼脂平板上挑取单菌落于5 mL的液体LB培养基中，在37℃的摇床中孵育过夜；
2）将细菌悬液用LB培养基稀释至105 CFU/ml，然后与等体积的预先设定好浓度的不同聚合物胶束溶液混合，于37 ℃下孵育12 h；
3）使用多功能酶标仪检测不同浓度溶液于600 nm检测波长下的光密度值OD600，其中对照组样品用超纯水处理，实验重复三次，然后通过数据处理比较得到PM-Ag-Cur的抗菌能力。
本发明公开的同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂及其制备方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
本发明利用两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束作为纳米载体，同时负载广泛应用的抗菌剂纳米银和天然无毒的植物化学成分姜黄素，用以增强抗菌活性，有如下的优势：1）制备简单；2）原料具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且价廉易得，容易向临床方向转化；3）纳米银的使用可以降低细菌的耐药性；4）聚合物胶束的脂溶性内核PCL能够被细菌分泌的脂肪酶降解，从而快速释放出核内的姜黄素，表现出细菌脂肪酶响应性；5）与单独负载纳米银或姜黄素相比，具有良好的协同抗菌能力。综上，本发明的胶束体系具有很好的应用前景。
附图说明
图1为同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束的制备及作用机制示意图；
图2为制备的四种聚合物胶束（PM、PM-Cur、PM-Ag和PM-Ag-Cur）的物理化学性质表征(A.四种聚合物胶束溶液的数码照片；B.四种聚合物胶束的表面电位；C. 四种聚合物胶束的紫外吸收光谱；D.四种聚合物胶束的荧光光谱)；
图3为制备的四种聚合物胶束的粒径分布和透射电镜（TEM）照片（A.没有任何负载的聚合物胶束；B.单独负载姜黄素的聚合物胶束；C. 单独负载纳米银的聚合物胶束；D.同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束）；
图4为负载姜黄素的聚合物胶束在脂肪酶刺激下的响应性释放；
图5为四种聚合物胶束在不同浓度下抗菌能力的比较（A. 铜绿假单胞菌；B.金黄色葡萄球菌）。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料N-(叔丁氧羰基)乙醇胺、辛酸亚锡（Sn(Oct)2）、三氟乙酸、ε-己内酯（ε-CL）、L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐（BLA-NCA）、三氟甲磺酸、甲苯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、硝酸银（AgNO3）、硼氢化钠（NaBH4）、姜黄素均有市售。
实施例1
一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂，它是以两亲性嵌段共聚物PCL-b-PAsp在水溶液中自组装形成PCL-b-PAsp聚合物胶束PM，利用亲水性壳层中PAsp的负电性吸附带正电的Ag+离子并通过还原剂将其原位还原成纳米银，再利用疏水性内核PCL包裹天然无毒的抗菌成分姜黄素，从而形成既携带纳米银又同时负载姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur；其中PCL-b-PAsp聚合物胶束PM： 纳米银：姜黄素的重量份数比为10：1：2。
纳米抗菌剂的制备方法：
1）将5.0 mg PCL-b-PAsp溶解于1 mL DMF中，再将此聚合物溶液在电磁搅拌下，逐滴缓慢加入到9 mL磷酸盐缓冲液，1 mM，pH=7.4中，然后将溶液在室温下搅拌4 h使胶束稳定，之后将溶液透析三天以完全除去体系中的DMF溶剂，得到PCL-b-PAsp聚合物胶束PM；
2）将100 μL 5 mg/mL AgNO3溶液在冰水浴搅拌下逐滴缓慢加入到PCL-b-PAsp聚合物胶束PM，在黑暗环境下轻轻搅拌30 min后，快速加入100 μL 15 mg/mL 新鲜NaBH4溶液，溶液迅速变色，继续搅拌4 h，然后透析两天得到PM-Ag溶液；
3）将1.0 mg姜黄素溶解于5 mL无水DMF中，并在磁力搅拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室温下搅拌2 h后，将溶液透析两天以除去体系中的DMF，最终得到同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur。
其中聚环己内酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制备步骤如下：
1）将0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺（1 mmol）和10.0 g ε-CL（87.8 mmol）加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合，然后用20 mL重蒸的甲苯溶解均匀，加入一滴Sn(Oct)2（0.1% wt/wt）；
2）液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复此过程三次，之后在氮气保护下，于110°C的油浴中反应12 h；
3）反应结束后冷至室温，加入冰***沉淀，静置使其沉淀完全，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体 PCL-NHBoc；
4）将上述3）中所得的PCL-NHBoc溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中，然后在室温下搅拌12 h，反应结束后，用冰***沉淀，在冰箱中静置过夜，抽滤洗涤，干燥得白色固体；
5）将4）中白色固体在三乙胺和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中室温搅拌12 h，再用冰***沉淀，抽滤，放入真空干燥箱中干燥得到大分子引发剂PCL-NH2；
6）将2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH2（0.2 mmol）和2.5 g BLA-NCA（10 mmol）加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷将其溶解均匀，然后液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复三次，之后在氮气保护下，于30°C的油浴中反应24 h；
7）反应完成后，加入适量的二氯甲烷稀释并用十倍体积的冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体PCL-b-PBLA；
8）将1.0 g上述7）中得到的白色固体置于25 mL圆底烧瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，在0°C冰浴下搅拌2 h，之后用冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。
实施例2：
（一）聚环己内酯-b -聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制备，步骤如下：
1）将0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺（1 mmol）和10.0 g ε-CL(ε-己内酯) （87.8mmol）加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合均匀，然后加入20 mL重蒸的甲苯，再加入一滴Sn(Oct)2（0.1% wt/wt）；
2）通过液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复此过程三次，然后在氮气保护下，将反应瓶置于110°C的油浴中反应12 h；
3）待反应结束后将反应瓶冷至室温，再加入冰***沉淀，静置使其沉淀完全，通过抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体 PCL-NHBoc；
4）将上述3）中所得的PCL-NHBoc溶解于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中，然后在室温下匀速搅拌12 h，反应结束后，利用冰***沉淀，在冰箱中静置过夜，抽滤洗涤，干燥得白色固体；
5）将4）中白色固体在三乙胺和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中室温搅拌12 h，再利用冰***沉淀，抽滤，放入真空干燥箱中干燥，从而得到大分子引发剂PCL-NH2；
6）将2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH2（0.2 mmol）和2.5 g BLA-NCA（L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐）（10 mmol）加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷将其溶解均匀，然后液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复此过程三次，之后在氮气保护下，置于30℃的油浴中反应24 h；
7）待反应完成后，向反应瓶中加入适量的二氯甲烷稀释，并用十倍体积的冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体PCL-b-PBLA；
8）将1.0 g上述7）中得到的白色固体置于25 mL圆底烧瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，将其置于0℃冰浴下搅拌2 h，之后用冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。
（二）四种不同聚合物胶束的制备，步骤如下：
1）将5.0 mg PCL-b-PAsp溶解于1 mL DMF中，再将此聚合物溶液在磁力磁搅拌下，缓慢加入到9 mL磷酸盐缓冲液（1 mM，pH=7.4）中，然后将溶液在室温下搅拌4 h，之后将溶液透析三天以除去体系中的DMF溶剂，得到PCL-b-PAsp聚合物胶束，简称PM；
2）将1.0 mg姜黄素与PCL-b-PAsp聚合物的DMF溶液混合均匀，然后将溶有姜黄素的聚合物溶液在电磁搅拌下，逐滴缓慢加入到9 mL磷酸盐缓冲液（1 mM，pH=7.4）中，后续步骤同上述1）中相同，得到负载姜黄素的聚合物胶束，简称PM-Cur；
3）在冰水浴搅拌下，将100 μL 5 mg/mL AgNO3溶液逐滴缓慢加入到PCL-b-PAsp胶束溶液中，然后在黑暗环境下匀速搅拌30 min，再快速加入100 μL 15 mg/mL 新鲜NaBH4溶液，溶液颜色迅速由黄色变为棕色，继续搅拌4 h，然后透析两天得到负载纳米银的聚合物胶束，简称PM-Ag；
4）将1.0 mg姜黄素溶解于5 mL DMF中，并在磁力搅拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室温下搅拌2 h后，将溶液在超纯水中透析两天，最终得到同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束，简称PM-Ag-Cur。
参见附图2和附图3，给出了制备的四种聚合物胶束（PM、PM-Cur、PM-Ag和PM-Ag-Cur）的物理化学性质表征结果，步骤如下：
1）将（二）中制备得到的四种聚合物胶束用超纯水定容到0.5 mg/mL，图2A即显示的不同聚合物胶束溶液的外观，其中纯胶束PM为无色透明，PM-Cur为黄色，说明负载了姜黄素，而携带银的PM-Ag和PM-Ag-Cur为棕色；
2）用ZetaPALS来测定不同聚合物胶束的zeta电位，图2B显示四种聚合物胶束表面均带负电荷，且PM表面负电最强，PM-Cur和PM-Ag稍低，PM-Ag-Cur最弱，由此可以间接表明胶束对Ag和Cur的同时负载；
3）用UV-2550型紫外可见分光光度计来测量四种胶束波长在300-600 nm范围内的紫外吸收，如图2C所示，PM无明显吸收，PM-Cur和PM-Ag分别在425 nm和400 nm处存在Cur和Ag的最大吸收峰，而PM-Ag-Cur在400 nm处出现高于PM-Ag的吸收峰，这正是Ag受Cur影响产生的，由此证明胶束的成功制备；
4）采用F-4600型荧光分光光度计在420 nm的激发波长下扫描得到四种聚合物胶束的荧光光谱，如图2D所示， PM-Cur得到一个较宽的发射光谱，其中520 nm为最大发射波长，而PM-Ag-Cur的荧光强度大大降低，这是Ag纳米粒作用的效果，由此进一步证明胶束的成功制备；
5）将约1 mL的不同样品溶液经0.45 μm的亲水性Millipore滤膜（针式过滤器）过滤至准备好的无尘光散射样品瓶中，然后利用光散射测定不同溶液的粒径及粒径分布，图3显示了通过动态光散射在散射角为90°时测定的四种聚合物胶束的流体力学直径分布图，其流体力学直径Dh均在90-95 nm左右，且粒径分布都比较窄；
6）在室温条件下，将10 μL的不同样品溶液滴于300目的碳支持膜铜网上，静置10 min，用滤纸吸去多余的样品，待铜网自然晾干后，真空干燥12 h后用Philips T20ST电子显微镜（加速电压为100 kV）检测，从图3中TEM照片可以清楚地看出，这些胶束均为规整的球形结构，粒径与光散射的结果比较接近。
附图4给出了负载姜黄素的聚合物胶束PM-Cur和PM-Ag-Cur在有无脂肪酶（Lipase）刺激下对姜黄素的释放效果，步骤如下：
1）分别将2 mL含有或不含铜绿假单胞菌脂肪酶的负载姜黄素的胶束溶液封装在截留分子量为3500 Da的透析袋中，其中脂肪酶终浓度为1.0 mg/mL，然后将透析袋浸入20 mL磷酸盐缓冲溶液（10 mM，pH=7.4）中，于37℃恒温振荡器中进行体外释放实验；
2）于相同时间间隔点，取出1 mL透析液用于测定其姜黄素浓度，同时补加1 mL新鲜的缓冲液；
3）取样后用UV-2550型紫外可见分光光度计来检测各个样品于425 nm检测波长下的紫外吸收值，换算成相应姜黄素浓度，然后计算各个时间点姜黄素的累计释放率；
4）图4即为实验重复三次后得到的负载姜黄素的聚合物胶束在有或无脂肪酶刺激下姜黄素累积释放曲线，相比于无Lipase下的缓慢释放，在含有Lipase的条件下，姜黄素的释放速度明显加快，且48 h后超过95%的姜黄素得到释放，由此证明Lipase可以使胶束疏水性内核PCL降解，从而释放出包裹在其内部的姜黄素。
附图5通过四种聚合物胶束对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的杀灭比较，来评估同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur的抗菌能力，步骤如下：
1）分别从含有铜绿假单胞菌P. aeruginosa菌落和金黄色葡萄球菌S. aureus菌落的固体LB琼脂平板上挑取单菌落于5 mL的液体LB培养基中，在37 ℃的摇床中孵育过夜；
2）将细菌悬液用LB培养基稀释至105 CFU/ml，然后与等体积的预先设定好浓度的四种聚合物胶束的不同溶液混合，于37℃下孵育12 h；
3）使用多功能酶标仪检测不同浓度溶液于600 nm检测波长下的光密度值OD600，其中对照组样品用超纯水处理，实验重复三次，然后通过数据处理比较得到PM-Ag-Cur的抗菌能力；
4）铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌分别作为革兰氏阴性和革兰氏阳性的模型代表，结果如图5所示，可能由于载药量低的缘故，PM-Cur在浓度低于250 μg/mL的情况下，对细菌的生长没有表现出较强的抑制能力，图中表明携带银的PM-Ag和PM-Ag-Cur对两种菌均有较强的抗菌活性，呈现明显的浓度依赖性，而且PM-Ag-Cur具有更强的抑菌能力，同时PM-Ag-Cur较PM-Ag携带Ag的量更少，可见同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束能够更好地发挥协同抗菌效应。

Claims (5)

1.一种同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂，其特征在于： 它是以两亲性嵌段共聚物PCL-b-PAsp在水溶液中自组装形成PCL-b-PAsp聚合物胶束PM，利用亲水性壳层中PAsp的负电性吸附带正电的Ag+离子并通过还原剂将其原位还原成纳米银，再利用疏水性内核PCL包裹天然无毒的抗菌成分姜黄素，从而形成既携带纳米银又同时负载姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur；其中PCL-b-PAsp聚合物胶束PM： 纳米银：姜黄素的重量份数比为10：1：2。
2.权利要求1所述同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）将5.0 mg PCL-b-PAsp溶解于1 mL DMF中，再将此聚合物溶液在电磁搅拌下，逐滴缓慢加入到9 mL磷酸盐缓冲液，1 mM，pH=7.4中，然后将溶液在室温下搅拌4 h使胶束稳定，之后将溶液透析三天以完全除去体系中的DMF溶剂，得到PCL-b-PAsp聚合物胶束PM；
2）将100 μL 5 mg/mL AgNO3溶液在冰水浴搅拌下逐滴缓慢加入到PCL-b-PAsp聚合物胶束PM，在黑暗环境下轻轻搅拌30 min后，快速加入100 μL 15 mg/mL 新鲜NaBH4溶液，溶液迅速变色，继续搅拌4 h，然后透析两天得到PM-Ag溶液；
3）将1.0 mg姜黄素溶解于5 mL无水DMF中，并在磁力搅拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室温下搅拌2 h后，将溶液透析两天以除去体系中的DMF，最终得到同时负载纳米银和姜黄素的聚合物胶束PM-Ag-Cur。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于聚环己内酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制备步骤如下：
1）将0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺（1 mmol）和10.0 g ε-CL（87.8 mmol）加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合，然后用20 mL重蒸的甲苯溶解均匀，加入一滴Sn(Oct)2（0.1% wt/wt）；
2）液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复此过程三次，之后在氮气保护下，于110°C的油浴中反应12 h；
3）反应结束后冷至室温，加入冰***沉淀，静置使其沉淀完全，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体 PCL-NHBoc；
4）将上述3）中所得的PCL-NHBoc溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中，然后在室温下搅拌12 h，反应结束后，用冰***沉淀，在冰箱中静置过夜，抽滤洗涤，干燥得白色固体；
5）将4）中白色固体在三乙胺和二氯甲烷的混合溶剂（1/1，V/V）中室温搅拌12 h，再用冰***沉淀，抽滤，放入真空干燥箱中干燥得到大分子引发剂PCL-NH2；
6）将2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH2（0.2 mmol）和2.5 g BLA-NCA（10 mmol）加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷将其溶解均匀，然后液氮冷冻，抽真空，通氮气，解冻，重复三次，之后在氮气保护下，于30°C的油浴中反应24 h；
7）反应完成后，加入适量的二氯甲烷稀释并用十倍体积的冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥后得到白色固体PCL-b-PBLA；
8）将1.0 g上述7）中得到的白色固体置于25 mL圆底烧瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，在0°C冰浴下搅拌2 h，之后用冰***沉淀，抽滤洗涤，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。
4.权利要求1所述同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂在制备增强抗菌活性药物方面的应用；所述的增强抗菌活性指的对致病细菌有很好的协同杀灭效果。
5.权利要求1所述同时负载纳米银和姜黄素的纳米抗菌剂在制备在提高对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌协同抗菌效率方面的应用。
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