CN105776179B - 一种水溶性季铵盐化碳纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水溶性季铵盐化碳纳米球，它是由带氨基高分子化合物和烷基甜菜碱反应制得，包括一个主要由碳元素组成的碳纳米球以及接枝在碳纳米球表面的烷基甜菜碱。本发明还公开了前述水溶性季铵盐化碳纳米球的制备方法和在抗菌方面的应用。与现有技术相比，本发明通过水热法一步完成了带氨基高分子化合物和烷基甜菜碱的化学接枝和碳纳米颗粒化，制得的碳纳米球具有良好的水溶性、较低的细胞毒性和优异的广谱抗菌性能。

Description

一种水溶性季铵盐化碳纳米球及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种水溶性季铵盐化碳纳米球及其制备方法与应用。
背景技术
碳元素是自然界中存在的最重要的、与人类关系最为密切的元素之一。最近十几年以来，各类具有优异性能的碳纳米材料(如碳纳米管、碳纳米纤维、碳纳米球、碳量子点、石墨烯和富勒烯等)引起了人们的广泛关注。碳材料生物相容性良好、原料价廉、可大量获得、并且结构及性质多样，已经被广泛用于材料改性、能源、催化、环保、电子器件、载药及生物成像等领域。
而纳米材料在抗菌方面的发展亦是逐渐兴起，主要包括两大类：第一类是通过纳米颗粒自身对细菌产生抑制作用的，具体包括：(1)碳纳米材料，如石墨烯；(2)单一金属及金属氧化物纳米颗粒，如金、银、二氧化钛、氧化锌、氧化钙、氧化铜、硫化铜、氧化镁等纳米颗粒等；(3)金属双合金纳米颗粒，如金银合金、金铂合金、银钴合金、钛铜合金纳米颗粒等。第二类是通过接枝抗生素等抗菌分子从而使纳米颗粒具有抗菌功能，并能改善抗生素的效能而增加抗菌效果或对抗细菌耐药性等，如金或银纳米颗粒接枝阿莫西林等抗生素、单壁碳纳米管接枝溶菌酶、以及万古霉素修饰二氧化硅等等。然而这样的接枝通常受限于纳米颗粒上的官能团与抗生素，制备困难，步骤繁琐，而且经过修饰后会大大降低纳米颗粒的稳定性和水溶液分散性。相比于利用贵金属(如金、银)等实现的抗菌应用，采用碳材料具有成本低廉的优势。然而，目前利用碳材料实现抗菌应用的主要是石墨烯，其制备过程复杂、成本高、水分散性差、且抗菌效果不佳。本发明采用一步法水热制备具有优异抗菌性质的碳纳米球，制备方法极其简单、成本低廉、可大规模生产，并且水分散性好、生物相容性良好，具有生物体内抗菌应用、日常生活抗菌应用等巨大潜力。
本发明以带氨基高分子和烷基甜菜碱为原料，利用水热法，首次一步制得了具有优异抗菌性能的季铵盐化碳纳米球。透射电子显微镜图表明该碳纳米球尺寸分布均匀、平均尺寸在100nm左右、且具有良好的分散性。细菌毒性实验表明，该碳纳米球对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌杀菌性能。对正常的肝细胞(L02细胞)的细胞存活率结果显示，该碳纳米球具有较低的细胞毒性，有望在生物医药领域、日化用品、水净化处理以及各种抗菌界面等领域得到广泛应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水溶性季铵盐化碳纳米球，以解决现有技术存在的制备过程复杂，成本较高和抗菌效果不佳等问题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述水溶性季铵盐化碳纳米球的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述水溶性季铵盐化碳纳米球的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种水溶性季铵盐化碳纳米球，它包括一个主要由碳元素构成的碳纳米球和接枝在碳纳米球表面的烷基甜菜碱。
其中，所述的烷基甜菜碱为十二烷基甜菜碱、十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱和十八烷基甜菜碱中的任意一种或几种的组合，优选十六烷基甜菜碱；烷基甜菜碱的结构式如下：
上述水溶性季铵盐化碳纳米球的制备方法，它包括如下步骤：
(1)将带氨基的高分子化合物溶于水后，加入烷基甜菜碱，混合均匀后备用；
(2)将步骤(1)中所得的混合体系在160～200℃下反应12～36小时，反应完成后得到碳纳米球溶液并进行透析，即得水溶性季铵盐化碳纳米球。
步骤(1)中，所述的带氨基的高分子化合物为壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚丙烯胺、牛血清白蛋白或溶菌酶。
步骤(1)中，对于水溶性不好的带氨基的高分子化合物，可通过向水中加入盐酸或醋酸的方式，使带氨基的高分子化合物完全溶解于水中。
步骤(1)中，烷基甜菜碱和高分子化合物的质量比为1：5～50。
其中，所述的烷基甜菜碱优选为十六烷基甜菜碱，所述的带氨基的高分子化合物优选为壳聚糖，十六烷基甜菜碱和壳聚糖的质量比为1：10；当十六烷基甜菜碱被替换成其它烷基甜菜碱时，其它烷基甜菜碱和十六烷基甜菜碱的物质的量相同。
步骤(2)中，所述透析操作中，透析液为去离子水，透析膜(或透析袋)的规格为分子量为1000。
步骤(2)中，所述透析操作可由离心操作代替；其中，离心转速为1000～30000转/分钟，离心时间为1～120分钟。
上述水溶性季铵盐化碳纳米球在作为抗菌试剂方面的应用也在本发明的保护范围之内。
上述水溶性季铵盐化碳纳米球在制备抗菌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，上述水溶性季铵盐化碳纳米球可以抑制和杀死革兰氏阳性菌。
有益效果：本发明利用水热法一步完成了高分子化合物和烷基甜菜碱的接枝，制得的碳纳米球具有良好的水溶性及优异的广谱抗菌性能，与现有技术相比，具有如下优势：
(1)利用水热法一步完成了具有抗菌性能的碳纳米球的制备，制备方法简单、原料价廉、可大量制备。
(2)优异的抗菌性能：对革兰氏阳性菌菌具有良好的抑菌和杀菌效果；在1×105～1×106CFU/mL细菌个数下，金黄色葡萄球菌的MIC为4μg/mL；枯草芽孢杆菌的MIC为5μg/mL；藤黄微球菌的MIC为2μg/mL。
(3)细胞毒性低：在30μg/mL下对正常的肝细胞MTT结果表明还有80％以上的存活率，在体内抗菌试剂方面可能有所应用。
(4)本发明制得的碳纳米球具有很好的水分散性和稳定性，适合在含水的生物体系中的各种抗菌应用。
附图说明
图1为实施例1中水溶性季铵盐化碳纳米球的制备示意图；
图2为实施例1中制备得到的水溶性季铵盐化碳纳米球的扫描电子显微镜(SEM)图；
图3为实施例8中水溶性季铵盐化碳纳米球对金黄色葡萄球菌的抑菌实验的结果示意图；
图4为实施例9中平板涂布实验结果示意图；
图5为实施例13中水溶性季铵盐化碳纳米球对正常肝细胞(L02)的毒性检测实验结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做出进一步说明
实施例1
水溶性季铵盐化碳纳米球的制备(见图1)，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于盐酸水溶液；
(2)在壳聚糖溶液中加入十六烷基甜菜碱，加热溶解搅拌混匀；
(3)将步骤(2)中所得的混合体系在180℃反应20小时，形成碳纳米球溶液；
(4)通过透析纯化上述碳纳米球溶液。
其中，
所述十六烷基甜菜碱与壳聚糖的质量比为1：10；
透析液为去离子水，透析膜的分子量为1000；
所制得的碳纳米球粒径为100nm左右(见图2)。
实施例2
制备方法与实施例1相同，所不同的是，步骤(3)中，反应时间为24小时，反应温度为160℃。
实施例3
制备方法与实施例1相同，所不同的是，步骤(3)中，反应时间为12小时，反应温度为200℃。
实施例4
制备方法与实施例1相同，所不同的是，将步骤(1)中的壳聚糖分别替换为聚乙烯亚胺、聚丙烯胺、牛血清白蛋白和溶菌酶，所用的量与壳聚糖的质量一样。制备得到4种不同的水溶性季铵盐化碳纳米球。
实施例5
制备方法与实施例1相同，所不同的是，将十六烷基甜菜碱与壳聚糖的质量比分别替换为1：5和1：50，制备得到2种不同的水溶性季铵盐化碳纳米球。
实施例6
制备方法与实施例1相同，所不同的是，将十六烷基甜菜碱分别替换为十二烷基甜菜碱、十四烷基甜菜碱和十八烷基甜菜碱，制备得到3种不同的水溶性季铵盐化碳纳米球。
实施例7
制备方法与实施例1相同，所不同的是，将盐酸水溶液分别替换为醋酸水溶液、硝酸水溶液和硫酸水溶液，制备得到3种不同的水溶性季铵盐化碳纳米球。
实施例8
测试实施例1的水溶性季铵盐化碳纳米球对金黄色葡萄球菌的抑菌能力，方法如下：
选取培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm处的吸光度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108CFU/mL。将金黄色葡萄球菌与含有不同浓度碳纳米球(0,5,10,20,30,40μg/mL)的培养基以1:10的比例稀释过后，置于37℃培养24小时后，测定600nm处的吸光度，实验结果见图3。实验结果表明，在细菌个数为1×106～1×107CFU/mL情况下，碳纳米球浓度为10μg/mL时，即可杀死大部分金黄色葡萄球菌并实现长期抑制。
实施例9
平板涂布法测试实施例1的碳纳米球对金黄色葡萄球菌的抑菌能力，方法如下：
选取培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm处的吸光度为0.5左右。将金黄色葡萄球菌与含有不同浓度碳纳米球(0,5μg/mL)的培养基以1:10的比例稀释，置于37℃培养2小时后，分别将菌液在生理盐水中分步稀释，最终稀释10000倍，并取稀释液100μL置于已凝固的培养基平板上，再用涂布棒快速地将其均匀涂布，置于37℃培养14～18个小时后，对其进行拍照计数，实验结果见图4，其中对照中菌落数为1137，而5μg/mL碳纳米球中菌落数为1。平板涂布实验结果表明，在细菌个数为1×106～1×107CFU/mL情况下，碳纳米球浓度为5μg/mL时，即可杀死绝大部分金黄色葡萄球菌。
实施例10
测试实施例1的碳纳米球对金黄色葡萄球菌的MIC的测定，方法如下：
选取培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:30的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm处的吸光度为0.5左右。将金黄色葡萄球菌与含有不同浓度的碳纳米球(0,1,2,3,4,5,6μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养14～18个小时后，没有出现明显浑浊的浓度，即为碳纳米球对金黄色葡萄球菌的MIC。实验结果表明，在金黄色葡萄球菌的个数为1×105～1×106CFU/mL时，该碳纳米球浓度为4μg/mL时，没有出现浑浊，4μg/mL即为对金黄色葡萄球菌的MIC。
实施例11
碳纳米球对枯草芽孢杆菌的MIC的测定，与实施例10类似，实验结果表明，在枯草芽孢杆菌的个数为1×105～1×106CFU/mL时，该碳纳米球浓度为5μg/mL时，没有出现浑浊，5μg/mL即为对枯草芽孢杆菌的MIC。
实施例12
碳纳米球对藤黄微球菌的MIC的测定，与实施例10类似，实验结果表明，在藤黄微球菌的个数为1×105～1×106CFU/mL时，该碳纳米球浓度为2μg/mL时，没有出现浑浊，2μg/mL即为对藤黄微球菌的MIC。
实施例13
测试实施例1的碳纳米球的细胞毒性，方法如下：
选择正常肝细胞L02，以5×104个/mL细胞分别与浓度为0,2,5,10,20,30μg/mL的碳纳米球孵育24小时后，利用酶标仪采用MTT检测法测定碳纳米球对L02细胞的毒性，结果见图5。实验结果表明碳纳米球浓度在远远大于细菌MIC的浓度下，细胞仍有80％以上的存活率，说明该碳纳米球具有良好的生物相容性。

Claims (9)

1.一种水溶性季铵盐化碳纳米球，其特征在于，它包括一个碳纳米球和接枝在碳纳米球表面的烷基甜菜碱。
2.根据权利要求1所述的水溶性季铵盐化碳纳米球，其特征在于，所述的烷基甜菜碱为十二烷基甜菜碱、十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱和十八烷基甜菜碱中的任意一种或几种的组合。
3.权利要求1所述的水溶性季铵盐化碳纳米球的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)将带氨基的高分子化合物溶于水后，加入烷基甜菜碱，混合均匀后备用；
(2)将步骤(1)中所得的混合体系在160～200℃下反应12～36小时，反应完成后得到碳纳米球溶液并进行透析，即得水溶性季铵盐化碳纳米球。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的带氨基的高分子化合物为壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚丙烯胺、牛血清白蛋白或溶菌酶。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，烷基甜菜碱和高分子化合物的质量比为1:5～1:50。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述透析操作中，透析液为去离子水，透析膜的分子量为1000。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的透析操作由离心操作代替；其中，离心转速为1000～30000转/分钟，离心时间为1～120分钟。
8.权利要求1所述的水溶性季铵盐化碳纳米球在作为抗菌试剂方面的应用。
9.权利要求1所述的水溶性季铵盐化碳纳米球在制备抗菌药物中的应用。
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