CN106880512B - Ha修饰的人脐带msc无血清培养液cs纳米粒冻干粉及其制备和应用 - Google Patents

Ha修饰的人脐带msc无血清培养液cs纳米粒冻干粉及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，按质量百分比包括以下组分：人脐带MSC无血清培养液活性蛋白成分5～12％，壳聚糖20～65％，三聚磷酸钠1～15％，透明质酸20～65％，水≤5％。其制备方法为，先采用CS纳米粒制备工艺将具有多种活性细胞因子的干细胞无血清培养上清液包覆，进而冻干，再使CS纳米粒表面的活性氨基与HA表面的羧基发生共价偶联反应，制得本发明产品。

Description

HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉及其制备 和应用
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，还涉及了该冻干粉的制备方法。
背景技术
干细胞美容最早是在整形外科中的应用，而整形外科中应用的较多的干细胞种类是间充质干细胞、表皮干细胞、血管内皮祖细胞及前脂肪细胞等。
传统上所谓的干细胞美容术，一般都是直接注射干细胞针剂。而这种注射用干细胞的来源主要是从流产的胚胎中提取的，所以难免会引起免疫排斥反应，而且存在一定的伦理问题。即使是采用自体干细胞，但是在干细胞的培养扩增过程中会引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反应。
人间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在培养中分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、***-1(IGF-1)和肝细胞生长因子(HGF)在内的多种促进皮肤细胞再生的生长因子。这些具有生物活性的生长因子能够有效的促进皮肤细胞的新陈代谢；促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性；促进表皮细胞的生长、分化和修复，使衰老死亡的细胞得以及时补充；同时能够加速角质层修复，加速基底新老细胞更替，使肌肤回到年轻姿态。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，解决液态干细胞培养上清保存期有限这一瓶颈，同时解决干细胞培养上清中细胞生长因子活性保存问题。
本发明的第二个目的是提供上述人脐带MSC无血清细胞培养液CS纳米粒冻干粉的制备方法。
本发明所采用的第一个技术方案是，一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，按质量百分比包括以下组分：人脐带MSC无血清培养液活性蛋白成分5～12％，CS(壳聚糖)20～65％，TPP(三聚磷酸钠)1～15％，HA(透明质酸)20～65％，水≤5％，以上各组分的质量总和是100％。
本发明所采用的第二个技术方案是，上述HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，制备负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒；
将人脐带MSC无血清培养液加入CS酸溶液中，并加入TPP，室温反应。将反应后的纳米粒混悬液离心，所得沉淀洗涤、冷冻干燥，得到负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒。
步骤2，制备HA修饰的负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉；
对HA中的羧基进行活化，然后将负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒加入到活化后的HA中反应，取反应后的纳米混悬液，离心，所得沉淀洗涤并冷冻干燥，即得HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉。
其中，步骤1中人脐带MSC无血清培养液的制备方法为：取新生儿脐带，将静脉内血迹洗涤干净；去除表皮、两条动脉血管及一条静脉血管，将组织剪碎，加入含FBS的DMEM/F12培养基培养，得到原代人脐带间充质干细胞；当细胞融合度为80％-90％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，取传代细胞，继续培养，当细胞融合度80％-90％时，弃含FBS的培养上清，PBS洗涤细胞，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养72小时，收集无血清培养液。
壳聚糖(CS)又叫脱乙酰甲壳素，可溶性甲壳素和聚氨基葡萄糖等，其化学名为β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，系甲壳素用浓碱处理后脱去乙酰基而得到的产物。壳聚糖是天然高分子中少有的碱性多糖，不溶于水和有机溶剂，可溶于pH＜6.5的稀酸，在稀酸中，其葡萄糖氨基转化为R-NH3 +,形成聚阳离子凝胶溶液。壳聚糖具有优良的生物可降解性、低毒、良好的生物相容性，因此非常适合用于生物医药及化妆品行业。
本发明采用离子交联法制备CS纳米粒，利用无不良反应的三聚磷酸钠(TPP)对CS进行离子诱导凝胶化形成纳米粒。在搅拌下，将TPP溶液加入到CS的酸溶液中，通过带负电的磷酸根离子与CS分子链上带正电的质子化氨基发生分子内和分子间交联凝胶化，便可迅速生成纳米粒。
透明质酸(HA)是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高分子多糖，是最佳的保湿成分之一。在一定的pH值条件下，透明质酸带负电荷，而CS纳米粒带正电荷，两者之间能够通过静电力相互吸引，使CS纳米粒具有良好的保湿作用。
本发明的特点还在于：
优选地，步骤1中CS和人脐带MSC无血清培养液中活性蛋白的质量比为2:1～10:1，CS与TPP的质量比为2:1～5:1，CS的分子量为2-30万。
优选地，步骤1所述CS酸溶液中用于溶解CS的酸是甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、丁二酸、丙二酸、脂肪酸、丙酮酸、戊二酸、酒石酸、天冬氨酸、水杨酸或乙醇酸中的一种或几种。
优选地，步骤1中离心参数为：离心温度2～8℃，离心时间10～60min，离心力1.0×103～1.0×105g。
优选地，步骤2中HA的分子量为8-30Kda，HA和负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒的质量比为1:1～5:1。
优选地，步骤2中HA的羧基活化方法为，采用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对HA中的羧基进行活化，然后调节pH至7.5，37℃孵育。
优选地，步骤1和步骤2中冷冻干燥参数均为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间24-36h。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所用的干细胞培养上清液为无血清培养上清，减小了干细胞用于美容中存在的免疫排斥反应。
(2)采用CS纳米粒制备工艺将具有多种活性细胞因子的干细胞无血清培养上清液包覆，进而冻干，保质期可长达三年，远高于现有人间充质干细胞的保质期，解决了上清液保存期短的问题。
(3)CS纳米粒表面的活性氨基与HA表面的羧基发生共价偶联反应，制得HA修饰CS纳米粒，这样不仅解决了CS纳米粒稳定性差的问题，同时在CS纳米粒中引入了化妆品高效保湿剂HA。
(4)本发明所用的CS作为一种天然碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，安全性较高、成本低廉，采用CS制备纳米粒，反应条件温和，工艺简单、成本低。
附图说明
图1为本发明HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉的制备方法流程图；
图2MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs 48h流式细胞测定结果；
图3MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs 72h流式细胞测定结果；
图4MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs 48h和72h正常活细胞数占细胞总数百分比；
图5MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs 48h和72h早期凋亡细胞数占细胞总数百分比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于这些实施方式。
实施例1
制备一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，参照图1，其方法如下：
步骤(1)，制备人脐带间充质干细胞无血清培养液
人脐带间充质干细胞提取：无菌条件下，取新生儿脐带5～10cm，置脐带保存液，4℃储存(时间不超过8小时)。用D-Hanks液冲洗直至静脉内无血迹。去除表皮、两条动脉血管及一条静脉血管，将组织剪碎至大约1mm3/块，加入含10％FBS的DMEM培养基(含双抗)培养大约一个星期，培养条件为37℃、饱和湿度、5％CO2，即可得到原代人脐带间充质干细胞。
收集无血清培养液：细胞融合度80％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，取6代的细胞继续培养。当细胞融合度80％时，弃含10％FBS的培养上清，PBS(pH＝7.0)洗涤细胞三次，加入无血清的DMEM培养基继续培养72小时，收集无血清培养液。
步骤(2)，离子交联法制备负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒
称取分子量为2万的CS粉末25mg，溶于质量分数为1％的25mL醋酸溶液中，配成质量分数为0.1％的CS溶液，超声脱除气泡，然后过0.45μm水系滤膜，得到澄清透亮的CS溶液。将活性蛋白浓度为998μg/mL的2.5mL人脐带MSC无血清培养液缓慢滴加到CS溶液中，搅拌10min，得混合液。将0.2％的TPP溶液5mL滴加至上述混合液中，室温反应30min。其中CS与TPP的质量比为2.5:1，CS与人脐带MSC无血清培养液中活性蛋白的质量比为10:1。
将反应后的纳米粒混悬液高速离心，离心温度4℃，离心时间10min，离心力1.0×105g。离心所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间24h。冷冻干燥后得负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒。
步骤(3)，HA活化；
配制分子量为8KDa的HA浓度为0.05％的HA水溶液50mL，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)137.5mg,待其完全溶解后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)165mg，用0.1M氢氧化钠调节至pH为7.5，37℃孵育1h。
步骤(4)，制备HA修饰的负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉
将步骤(2)得到的负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒加入到步骤(3)活化后的HA中，HA和CS纳米粒的投料质量比为1:1。室温搅拌反应2h，取反应后的纳米混悬液，高速离心，离心参数为：离心温度4℃，离心时间30min，离心力1.0×104g。所得沉淀用蒸馏水洗涤10次，然后进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间24h。冷冻干燥后即得HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉。
本实施例得到的HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，通过测定清洗CS纳米粒液体中及离心上清液中TPP的含量确定已交联的TPP的含量，检测方法采用分光光度法(GB/T13171-1997)，TPP的投料量为10mg，已交联的为6.4mg。通过检测HA的结合率得知，HA和CS纳米粒的结合率为36.0％，其中，人脐带间充质干细胞无血清培养液活性蛋白成分5.5％CS55.2％，TPP14.1％，HA21.9％，水3.3％。
实施例2
制备一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，其方法如下：
步骤(1)，制备人脐带间充质干细胞无血清培养液，具体方法同实施例1。其中不同之处在于收集无血清培养液时细胞融合度为85％。
步骤(2)，离子交联法制备负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒
称取分子量为20万的CS粉末20mg，溶于质量分数为4.0％的10mL柠檬酸溶液中，配成质量分数为0.2％的CS溶液，超声脱除气泡，然后过0.45μm水系滤膜，得到澄清透亮的CS溶液。将活性蛋白浓度为1015μg/mL的9.9mL人脐带MSC无血清培养液缓慢滴加到CS溶液中，搅拌20min，得混合液。将0.2％的TPP溶液2.5mL滴加至上述混合液中，室温反应30min。其中CS与TPP的质量比为4:1，CS与人脐带MSC无血清培养液中活性蛋白的质量比为2:1。
将反应后的纳米粒混悬液高速离心，离心温度4℃，离心时间30min，离心力1.0×104g。离心所得沉淀用蒸馏水洗涤5次，然后进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间30h。冷冻干燥后得负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒。
步骤(3)，HA活化；
配制分子量为15KDaHA浓度为0.14％的HA水溶液100mL，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)700mg,待其完全溶解后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)840mg，用0.1M氢氧化钠调节至pH为7.5，37℃孵育5h。
步骤(4)，制备HA修饰的负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉
将步骤(2)得到的负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒加入到步骤(3)活化后的HA中，HA和CS纳米粒的投料比为4.7:1。室温搅拌反应10h，取反应后的纳米混悬液，高速离心，离心参数为：离心温度4℃，离心时间60min，离心力1.0×103g。所得沉淀用蒸馏水洗涤3次，然后进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间30h。冷冻干燥后即得HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉。
本实施例得到的HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，通过测定清洗CS纳米粒液体中及离心上清液中TPP的含量确定已交联的TPP的含量，检测方法采用分光光度法(GB/T13171-1997)，TPP的投料量为5mg，已交联的为3.3mg。检测HA的结合率得知，HA和CS纳米粒的结合率为42.3％，其中，人脐带间充质干细胞无血清培养液活性蛋白成分10.8％，CS 21.3％，TPP3.5％，HA63.2％，水1.3％。
实施例3
制备一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，其方法如下：
步骤(1)，制备人脐带间充质干细胞无血清培养液，具体方法同实施例1。其中不同之处在于收集无血清培养液时细胞融合度为90％。
步骤(2)，离子交联法制备负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒
称取分子量为30万的CS粉末50mg，溶于质量分数为0.3％的10mL酒石酸溶液中，配成质量分数为0.5％的CS溶液，超声脱除气泡，然后过0.45μm水系滤膜，得到澄清透亮的CS溶液。将活性蛋白浓度为950μg/mL的10.5mL人脐带MSC无血清培养液缓慢滴加到CS溶液中，搅拌30min，得混合液。将0.18％的TPP溶液5.5mL滴加至上述混合液中，室温反应30min。其中CS与TPP的质量比为5:1，CS与人脐带MSC无血清培养液中活性蛋白的质量比为5:1。
将反应后的纳米粒混悬液高速离心，离心温度4℃，离心时间60min，离心力1.0×103g。离心所得沉淀用蒸馏水洗涤10次，然后进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间36h。冷冻干燥后得负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒。
步骤(3)，HA活化；
配制分子量为30KDaHA浓度为0.1％的HA水溶液150mL，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)750mg,待其完全溶解后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)900mg，用0.1M氢氧化钠调节至pH为7.5，37℃孵育10h。
步骤(4)，制备HA修饰的负载人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉
将步骤(2)得到的负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒加入到步骤(3)活化后的HA中，HA和CS纳米粒的投料比为2.5:1。室温搅拌反应24h，取反应后的纳米混悬液，高速离心，离心参数为：离心温度4℃，离心时间10min，离心力1.0×105g。所得沉淀用蒸馏水洗涤6次，然后进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间36h。冷冻干燥后即得HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉。
本实施例得到的HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，通过测定清洗CS纳米粒液体中及离心上清液中TPP的含量确定已交联的TPP的含量，检测方法采用分光光度法(GB/T13171-1997)，TPP的投料量为10mg，已交联的为6.8mg。检测HA的结合率得知，HA和CS纳米粒的结合率为28.6％，其中，人脐带间充质干细胞无血清培养液活性蛋白成分8.8％，CS44.1％，TPP6.0％，HA37.8％，水3.3％。
对本发明的HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉的各项性能进行检测，样品组为实施例1制备出的HA-MSC-CS-NPs，对照组采用不用HA进行修饰的MSC-CS-NPs，其他工艺参数和实施例1完全相同。
(一)粒径及粒径分布
表1 MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs粒径分布及PDI
从表1可以看出，经HA修饰后的MSC-CS-NPs粒径稍有增大趋势，但是PDI指数明显减小(PDI是多分散指数，其大小表示粒径分布的宽窄)，说明HA-MSC-CS-NPs的粒径分布比对照组更均一，体系也更趋向于稳定。
(二)流式细胞仪考察HA修饰的人脐带MSC无血清培养CS纳米粒冻干粉对细胞的增殖力。
采用小鼠成纤维细胞L929为靶细胞，对比对照组——人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉(MSC-CS-NPs)，样品组——HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉(HA-MSC-CS-NPs)在培养48h和72h，对L929细胞增殖活力的影响。
如图2、3所示，在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限代表对于X轴及Y轴所代表的参数呈双阴性反应的细胞即正常活细胞,右下象限代表对于X轴所代表的参数呈阳性反应，对于Y轴所代表的参数呈阴性反应的细胞即早期凋亡细胞,右上象限代表对于X轴及Y轴所代表的参数呈双阳反应的细胞即晚期凋亡及死亡细胞,左上象限代表对于Y轴所代表的参数呈阳性反应，对于X轴所代表的参数呈阴性反应的细胞即碎片及损伤细胞。
如图4、5所示，与对照组MSC-CS-NPs比较，HA-MSC-CS-NPs在加入后48h，正常活细胞数为总数的92.51％，对照组仅为88.95％，比对照组高出3.56个百分点；而早期凋亡细胞数为总数的4.00％，对照组为8.30％，比对照组低出4.30个百分点。
与对照组MSC-CS-NPs比较，HA-MSC-CS-NPs在加入后72h，正常活细胞数为总数的96.13％，对照组仅为93.05％，比对照组高出3.08个百分点；而早期凋亡细胞数为总数的2.38％，对照组为3.87％，比对照组低出1.49个百分点。
从这个结果可以看出，MSC-CS-NPs中引入HA后，和未修饰的纳米粒相比，不仅提高了促进细胞增殖作用，同时还具有延缓细胞凋亡的作用。

Claims (8)

1.透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，所述透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉，按质量百分比包括以下组分：人脐带MSC无血清培养液活性蛋白成分5～12％，壳聚糖20～65％，三聚磷酸钠1～15％，透明质酸20～65％，水≤5％，以上各组分的质量总和是100％；
包括以下步骤：
步骤1，制备负载人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒；
将人脐带MSC无血清培养液加入壳聚糖酸溶液中，并加入三聚磷酸钠，室温反应；将反应后的纳米粒混悬液离心，所得沉淀洗涤、冷冻干燥，得到负载人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒；
步骤2，制备透明质酸修饰的负载人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉；
对透明质酸中的羧基进行活化，然后将负载人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒加入到活化后的透明质酸中反应，取反应后的纳米混悬液，离心，所得沉淀洗涤并冷冻干燥，即得透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉。
2.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤1中所述人脐带MSC无血清培养液的制备方法为：取新生儿脐带，将静脉内血迹洗涤干净；去除表皮、两条动脉血管及一条静脉血管，将组织剪碎，加入含FBS的DMEM/F12培养基培养，得到原代人脐带间充质干细胞；当细胞融合度为80％-90％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，取传代细胞，继续培养，当细胞融合度80％-90％时，弃含FBS的培养上清，PBS洗涤细胞，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养72小时，收集无血清培养液。
3.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤1中所述壳聚糖和人脐带MSC无血清培养液中活性蛋白的质量比为2:1～10:1，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为2:1～5:1，壳聚糖的分子量为2-30万。
4.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤1中所述离心参数为：离心温度2～8℃，离心时间10～60min，离心力1.0×103～1.0×105g。
5.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤2所述透明质酸的分子量为8-30Kda，透明质酸和负载人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒的质量比为1:1～5:1。
6.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤2中所述透明质酸的羧基活化方法为，采用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对透明质酸中的羧基进行活化，然后调节pH至7.5，37℃孵育。
7.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤1和步骤2中所述冷冻干燥参数均为：预冻温度-60℃±2℃，预冻时间6h以上，冷冻温度-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间24-36h。
8.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的人脐带MSC无血清培养液壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤1所述壳聚糖酸溶液中用于溶解壳聚糖的酸是甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、丁二酸、丙二酸、丙酮酸、戊二酸、酒石酸、天冬氨酸、水杨酸或乙醇酸中的一种或几种。
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