CN106840828B - 一种微量全血中快速分离血浆的方法及分离装置 - Google Patents

一种微量全血中快速分离血浆的方法及分离装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种微量全血中快速分离血浆的方法及分离装置，所述微量全血中快速分离血浆的方法，通过样本由下往上方向的重叠吸附减少了分离过程中红细胞的物理堆积，选用孔径3μm经过磺化亲水性处理非对称结构的聚醚砜树脂(PES)膜，即有效隔离红细胞又提高血浆透过率，低密度玻璃纤维的血浆吸附区便于吸取分离后的血浆，提高了血浆的吸取量；所用分离装置包括A区血浆吸收材料、B区聚醚砜树脂(PES)膜、C区混合纤维和D区玻璃纤维，不需外部设备、应用更为便携，无机械力破坏红细胞、样本由下往上方向的重叠吸附减少了分离过程中红细胞的物理堆积，低密度玻璃纤维的血浆吸附区便于吸取分离后的血浆，在短时间内高效分离高纯度血浆。

Description

一种微量全血中快速分离血浆的方法及分离装置
技术领域
本发明涉及生物样品分离技术领域，尤其是一种微量全血中快速分离血浆的方法及分离装置。
背景技术
现阶段对于血浆的分离，是将含有抗凝剂的全血静置，依靠红细胞的重力作用进行沉降分离得到上清液为血浆；或者将含有抗凝剂的全血样本进行离心，分离得到上清液为血浆；CN201380041858.6发明专利使用膜与毛细管对血浆进行分离；CN201310254336.6发明专利使用PDMS芯片通过化学处理的微通道对血浆进行分离。
对于上述现有技术手段，往往存在以下不足：
静置分离需要长时间处理才能分离得到血浆。
离心分离虽然降低了分离时间，但是样本采集后需要借助离心机才能实现血浆分离，离心机需要安装在水平的固定场地不能便携使用，离心力可能对红细胞造成损害导致溶血现象。
CN201380041858.6发明专利提供一种便携的血浆分离装置，该装置将膜直接与全血样本接触，垂直方向过滤。在过滤过程中由于重力作用红细胞会沉降到膜底部，导致小孔径膜堵塞，直接影响分离效率。
CN201310254336.6发明使用的微通道需要复杂的化学预处理后才可以使用，由于红细胞***分为原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞与红细胞，细胞直径大约在6-10微米，但是该装置的微通道允许的直径为0.5-50微米，在分离过程中会造成分离的血浆中混有部分红细胞。
因此，寻找到不需离心机或外部仪器可独立使用，在短时间内可高效分离高纯度血浆的方法及装置，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种微量全血中快速分离血浆的方法。
本发明所要解决的技术问题在于提供一种实现微量全血中快速分离血浆的分离装置。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种微量全血中快速分离血浆的方法，具体步骤如下：
(1)取血浆吸收材料、经过磺化亲水性处理的孔径0.03-10μm的非对称结构的聚醚砜树脂(PES)膜、含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和0-2.2mg/mL EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾)或EDTA-NA(乙二胺四乙酸二钠)的玻璃纤维、含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和0-2.2mg/mL EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾)或EDTA-NA(乙二胺四乙酸二钠)的玻璃纤维依次边缘叠加放置，所述血浆吸收材料置于最上层，所述血浆吸收材料为玻璃纤维、聚酯、混合纤维或纯棉滤纸，其中，
血浆吸收材料，称为A区；
经过磺化亲水性处理的孔径0.03-10μm的非对称结构的聚醚砜树脂
(PES)膜，称为B区；
含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和0-2.2mg/mL EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾)或EDTA-NA(乙二胺四乙酸二钠)的混合纤维，称为C区；
含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和0-2.2mg/mL EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾)或EDTA-NA(乙二胺四乙酸二钠)的玻璃纤维，称为D区；
(2)全血样本首先和D区预包被0.1mg/mL-10mg/mL浓度的红细胞单克隆抗体和0-2.2mg/mL EDTA抗凝剂的玻璃纤维反应，EDTA保证了全血在分离过程中不会发生凝集，全血中的红细胞会与红细胞单克隆抗体发生特异性的免疫学反应，由于玻璃纤维的不规则结构，大部分红细胞会吸附在D区；
(3)少部分红细胞与血浆再与C区预包被0.1mg/mL-10mg/mL浓度的红细胞单克隆抗体和EDTA抗凝剂的混合纤维反应，通过D区与C区的反应使绝大部分红细胞被吸附，由于选用流动性和吸水性强于D区玻璃纤维的混合纤维材料，促进红细胞与血浆快速分离；
(4)少量游离的红细胞被B区的聚醚砜树脂膜通过分子筛的物理作用截留在C区，只有血浆可以通过，并最终吸附在A区血浆吸收材料中。
优选的，上述微量全血中快速分离血浆的方法，所述聚醚砜树脂膜的孔径为3μm。
优选的，上述微量全血中快速分离血浆的方法，所述C区的玻璃纤维中含有2.2mg/mL EDTA-K2。
优选的，上述微量全血中快速分离血浆的方法，所述D区的玻璃纤维中含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体。
一种用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置，包括A区血浆吸收材料、B区聚醚砜树脂(PES)膜、C区混合纤维和D区玻璃纤维，以及PVC板和外壳，所述PVC板和外壳配合固定形成盒状中空结构，所述A区血浆吸收材料、B区聚醚砜树脂(PES)膜、C区混合纤维和D区玻璃纤维置于该盒状中空结构内并依次边缘叠加放置于所述PVC板上，所述A区血浆吸收材料置于最上层，所述A区血浆吸收材料上非与B区聚醚砜树脂膜重叠一侧称为血浆暂存池，A区血浆吸收材料上靠近与B区聚醚砜树脂膜重叠一侧称为血浆吸收区，所述外壳上设有三个通孔，分别对应设置于血浆暂存池、血浆吸收区和D区玻璃纤维的正上方，其中，
A区血浆吸收材料为玻璃纤维、聚酯、混合纤维或纯棉滤纸，
B区聚醚砜树脂(PES)膜为经过磺化亲水性处理的孔径0.03-10μm的非对称结构的聚醚砜树脂膜，
C区玻璃纤维为含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和0-2.2mg/mL EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾)或EDTA-NA(乙二胺四乙酸二钠)的混合纤维，
D区玻璃纤维为含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和0-2.2mg/mL EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾)或EDTA-NA(乙二胺四乙酸二钠)的玻璃纤维。
优选的，上述用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置，所述聚醚砜树脂膜的孔径为3μm。
优选的，上述用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置，所述C区玻璃纤维中含有2.2mg/mL EDTA-K2。
优选的，上述用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置，所述D区玻璃纤维中含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体。
本发明的有益效果是：
所述微量全血中快速分离血浆的方法，通过样本由下往上方向的重叠吸附减少了分离过程中红细胞的物理堆积，选用孔径3μm经过磺化亲水性处理非对称结构的聚醚砜树脂(PES)膜，即有效隔离红细胞又提高血浆透过率，低密度玻璃纤维的血浆吸附区便于吸取分离后的血浆，提高了血浆的吸取量；所用分离装置体积小、生产成本低、不需外部设备、应用更为便携，无机械力破坏红细胞、样本由下往上方向的重叠吸附减少了分离过程中红细胞的物理堆积，低密度玻璃纤维的血浆吸附区便于吸取分离后的血浆，在短时间内高效分离高纯度血浆。
附图说明
图1为本发明所述用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置的内部结构示意图；图中，1-S1垫 2-S2垫 3-PES膜 4-AB垫
图2为本发明所述用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置的外部结构示意图，塑卡上设有A、B、C三个通孔。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
下述实施例中提到的“红细胞单克隆抗体”指鼠抗人红细胞单克隆抗体，为商品化生物原料，购自深圳市菲鹏生物股份有限公司。
实施例1
1.材料：
红细胞单克隆抗体，EDTA-K2，混合纤维，玻璃纤维，0.03μm、3.00μm和10.00μm PES膜，PVC板，已知红细胞压积的EDTA-K2抗凝全血样本P4(该全血样本P4为阴性全血样本，来自天津华泰医院的阴性全血样本)。
2.方法
将混合纤维与玻璃纤维浸泡在含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2的0.01M PH7.4PBS缓冲液中，充分浸泡后在45℃烘干12小时。处理后的玻璃纤维记为S1垫，处理后的混合纤维记为S2垫，未处理的玻璃纤维记为AB垫。
如图1、图2所示，按照S1垫1、S2垫2、PES膜3、AB垫4的顺序，将4个材料依次重叠粘贴在PVC板上，根据PES膜的不同组成3种半成品。将半成品切割为4mm条形装到塑卡中形成分离装置。所述塑卡上设有三个通孔A孔、B孔和C孔，其中，C孔设置于S1垫正上方，A孔和B孔设置于AB垫正上方，同时A孔和C孔分别设置于B孔的两侧。
选取P4样本来检测分离装置的分离效率。将100μL全血样本加入到分离装置的C孔，静置3分钟后使用移液器从分离装置B孔处吸取血浆并测量血浆的体积，按照公式分离效率＝(1-红细胞压积)×样本量÷分离体积，计算血浆的分离率。
3.结果
实验结果见表1，结果显示，0.03μm的PES膜孔径太小影响分离效率，10μm的PES膜孔径较大血浆分离效率最高，但是由于孔径太大会有部分红细胞也渗出到分离后的血浆中，3μm的PES膜可以充分隔离游离红细胞的渗入，而且同样具有较高的分离效率。
表1
Figure BDA0001257589400000051
实施例2
1.材料：
红细胞单克隆抗体，EDTA-K2，混合纤维，玻璃纤维，3μm PES膜，PVC板，已知红细胞压积的EDTA-K2抗凝全血样本P4。
2.方法
将混合纤维和玻璃纤维浸泡在含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2的0.01M PH7.4PBS缓冲液中，充分浸泡后在45℃烘干12小时。处理后的玻璃纤维记为S1垫，处理后的混合纤维记为S2垫，未处理的玻璃纤维记为AB垫。
按照S1垫、S2垫、PES膜、AB垫的顺序，将4个材料依次重叠粘贴在PVC板上组成半成品。将半成品分别切割为2mm、4mm和8mm的条形装到不同大小的塑卡中形成分离装置(结构参见实施例1)。选取P4样本检测分离装置的分离效率。分别将50、100和200μL全血样本加入到分离装置的C孔，静置3分钟后使用移液器从分离装置B孔处吸取血浆并测量血浆的体积，按照公式分离效率＝(1-红细胞压积)×样本量÷分离体积，计算血浆的分离率。
3.结果
实验结果见表2-4，结果显示，2mm的分离装置分离50μL样本时分离效率最高为60.57％，过量的样本的只会停留在加样孔。4mm的分离装置分离100μL样本时分离效率最高为61.15％，由于分离装置本身的吸附性材料样本量太少会导致分离装置不能进行样本分离，而过量的样本的只会停留在加样孔。8mm的分离装置分离200μL样本时分离效率最高为63.48％，由于分离装置本身的吸附性材料样本量太少会导致分离装置不能进行样本分离，而样本量不足的会影响样本的分离效率。
表2 2mm分离装置的检测结果
Figure BDA0001257589400000061
表3 4mm分离装置的检测结果
Figure BDA0001257589400000071
表4 8mm分离装置的检测结果
Figure BDA0001257589400000072
实施例3
1.材料：
红细胞单克隆抗体，EDTA-K2，低密度玻璃纤维，高密度玻璃纤维，3μm PES膜，PVC板，已知红细胞压积的阴性EDTA-K2抗凝全血样本P1、P2、P3、P4、P5(均为阴性全血样本，来自天津华泰医院的阴性全血样本)。
2.方法
将混合纤维与玻璃纤维浸泡在含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2的0.01M PH7.4PBS缓冲液中，充分浸泡后在45℃烘干12小时。处理后的玻璃纤维记为S1垫，处理后的混合纤维记为S2垫，未处理的玻璃纤维记为AB垫。
按照S1垫、S2垫、PES膜、AB垫的顺序，将4个材料依次重叠粘贴在PVC板上组成半成品。将半成品切割为4mm条形装到塑卡中形成分离装置(结构参见实施例1)。选取已知红细胞压积的EDTA-K2抗凝全血样本检测分离装置的分离效率。将100μL全血样本加入到分离装置的C孔，静置3分钟后使用移液器从分离装置B孔处吸取血浆并测量血浆的体积，按照公式分离效率＝(1-红细胞压积)×样本量÷分离体积，计算血浆的分离率。
3.结果
实验结果见表5，结果显示，红细胞压积在0.38-0.51范围的血液样本通过血浆分离装置分离后，血浆的分离效率约为62.46％，由3μm PES膜、含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体的S1垫、含有2.2mg/mL EDTA-K2的S2垫、AB垫组成的血浆分离装置适用于不同红细胞压积的血液样本。
表5
Figure BDA0001257589400000081
上述参照实施例对该一种微量全血中快速分离血浆的方法及分离装置进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种微量全血中快速分离血浆的方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)取血浆吸收材料、经过磺化亲水性处理的孔径0.03-10μm的非对称结构的聚醚砜树脂膜、含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2或EDTA-Na2的混合纤维、含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2或EDTA-Na2的玻璃纤维依次边缘叠加放置，所述血浆吸收材料置于最上层，所述血浆吸收材料为玻璃纤维、聚酯、混合纤维或纯棉滤纸,
其中，血浆吸收材料，称为A区；
经过磺化亲水性处理的孔径0.03-10μm的非对称结构的聚醚砜树脂膜，称为B区；
含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2或EDTA-Na2的混合纤维，称为C区；
含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2或EDTA-Na2的玻璃纤维，称为D区；
(2)全血样本首先和D区预包被0.1mg/mL-10mg/mL浓度的红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2或EDTA-Na2的玻璃纤维反应，EDTA-K2或EDTA-Na2保证了全血在分离过程中不会发生凝集，全血中的红细胞会与红细胞单克隆抗体发生特异性的免疫学反应，由于玻璃纤维的不规则结构，大部分红细胞会吸附在D区；
(3)少部分红细胞与血浆再与C区预包被0.1mg/mL-10mg/mL浓度的红细胞单克隆抗体和EDTA-K2或EDTA-Na2的混合纤维反应，通过D区与C区的反应使绝大部分红细胞被吸附，由于选用流动性和吸水性强于D区玻璃纤维的混合纤维材料，促进红细胞与血浆快速分离；
(4)少量游离的红细胞被B区的聚醚砜树脂膜通过分子筛的物理作用截留在C区，只有血浆可以通过，并最终吸附在A区血浆吸收材料中。
2.根据权利要求1所述的微量全血中快速分离血浆的方法，其特征在于：所述聚醚砜树脂膜的孔径为3μm。
3.根据权利要求1所述的微量全血中快速分离血浆的方法，其特征在于：所述D区的玻璃纤维中含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体。
4.一种用于实现权利要求1-3任一项所述微量全血中快速分离血浆的分离装置，其特征在于：包括A区血浆吸收材料、B区聚醚砜树脂膜、C区混合纤维和D区玻璃纤维，以及PVC板和外壳，所述PVC板和外壳配合固定形成盒状中空结构，所述A区血浆吸收材料、B区聚醚砜树脂膜、C区混合纤维和D区玻璃纤维置于该盒状中空结构内并依次边缘叠加放置于所述PVC板上，所述A区血浆吸收材料置于最上层，所述A区血浆吸收材料上非与B区聚醚砜树脂膜重叠一侧称为血浆暂存池，A区血浆吸收材料上靠近与B区聚醚砜树脂膜重叠一侧称为血浆吸收区，所述外壳上设有三个通孔，分别对应设置于血浆暂存池、血浆吸收区和D区玻璃纤维的正上方
其中，A区血浆吸收材料为玻璃纤维、聚酯、混合纤维或纯棉滤纸，
B区聚醚砜树脂膜为经过磺化亲水性处理的孔径0.03-10μm的非对称结构的聚醚砜树脂膜，
C区混合纤维为含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2或EDTA-Na2的混合纤维，
D区玻璃纤维为含有0.1mg/mL-10mg/mL红细胞单克隆抗体和2.2mg/mLEDTA-K2或EDTA-Na2的玻璃纤维。
5.根据权利要求4所述的用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置，其特征在于：所述聚醚砜树脂膜的孔径为3μm。
6.根据权利要求4所述的用于实现微量全血中快速分离血浆的分离装置，其特征在于：所述D区玻璃纤维中含有0.1mg/mL红细胞单克隆抗体。
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