CN106834485A - 一种水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记及其应用，应用分子标记I9辅助选育抗稻瘟病水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，I9为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有565bp的单条带，则表示该检测样品为Pi9基因纯合；如果有688bp的单条带，则表示该检测样品不含Pi9基因；如果有565bp和688bp两条带，则表示该检测样品为Pi9基因杂合。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及一种水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记及其应用。
背景技术
水稻作为最重要的粮食作物，全世界超过一半以上的人口以水稻为主食，由子囊菌[Magnaporthe grisea ( Hebert) Barr]引起的稻瘟病是世界范围内水稻生产上最严重的病害之一，病害可以发生在水稻的各个生长时期，一般减产10%-20%，严重时甚至颗粒无收，是全球粮食安全的限制因子之一。化学防控在一定程度上能减轻病害、减少产量损失，但由于化学农药的大量施用会对环境造成污染。因此，选育和种植抗稻瘟病水稻品种是最经济、最有效、对环境最友好的措施。由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，单一抗性品种往往在推广应用几年后抗病能力就会渐渐丧失，所以挖掘、利用广谱抗性基因是获得持久抗病品种的重要途径。
稻瘟病抗性是典型的数量性状，受多基因控制，且易受环境影响。常规抗病育种中，抗病性鉴定结果不准确导致育种效率偏低。分子标记辅助选择是一种利用与抗性基因紧密连锁标记或者基因内功能标记，在后代中结合基因型和表型鉴定对目标性状进行选择的现代育种技术。该方法不仅可大大缩短育种年限，提高育种效率，而且还节约了大量的人力、物力成本。Pi9是一个来源于小粒野生稻的广谱抗病基因，位于第6染色体短臂靠近着丝粒位置的Pi2/9位点，与Pi2、Piz-t、Pigm、Pi40、Pi50、Pi2-2等多个抗病基因等位，研究表明Pi9基因至少对21个稻瘟病菌生理小种具有抗性，在抗稻瘟病育种方面有很大的应用价值，开发Pi9基因的功能性标记对充分利用该基因，进一步改良水稻稻瘟病抗性有着重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种水稻抗稻瘟病基因Pi9的分子标记、其的正反引物及其应用。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记，所述分子标记编号为I9，所述分子标记I9的正反引物序列为：
I9 F：5’- ATTGTAATTCTAGCCTTCCGTCC -3’
I9 R：5’- TCCATTTCAGAAACAGAGCACA -3’。
本发明提供了分子标记I9的用途：所述分子标记I9用于水稻抗瘟病基因Pi9的鉴定和/或抗瘟病水稻的辅助选择育种。
进一步的，所述用于水稻抗瘟病基因Pi9的鉴定包括以下实验步骤：
i、提取供试水稻样品基因组；
ii、利用所述分子标记I9的正反引物组合对步骤i中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；
iii、通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，如果有565bp的单条带，则表示所述样品为Pi9基因纯合；如果有688bp的单条带，则表示所述样品不含Pi9基因；如果有565bp和688bp两条带，则表示所述样品为Pi9基因杂合。
本发明的有益效果是：
本发明通过利用核苷酸序列差异设计Pi9基因的功能分子标记，不存在遗传交换，准确性高；由于扩增片段差异较大可直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。
附图说明
下面结合附图对本发明的一种水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记及其应用作进一步说明。
图1是本发明中分子I9标记对8个水稻品种的电泳检测图。
注：其中1-8分别表示水稻品种沪旱1B、秀水123、沪旱7B、黄华占、中组14、沪旱11B、日本晴和75-1-127；M表示D2000 Marker。
具体实施方式
实施例1：Pi9基因分子标记的开发
（1）、供试材料：抗病水稻亲本：75-1-127；感病水稻品种：沪旱1B，秀水123，沪旱7B，黄华占，中组14，沪旱11B，日本晴。
（2）、水稻基因组DNA提取方法参考楼巧君（2006）中所述方法。（楼巧君, 陈亮, 罗利军. 三种水稻基因组 DNA 快速提取方法的比较[J]. 分子植物育种, 2006, 3(5):749-752）
（3）、基因分子标记I9的开发：Pi9是一个已克隆的广谱抗稻瘟病基因，位于第6染色体短臂的Pi2/9位点，Pi9的全基因组序列来自GenBank数据库，收录号为DQ285630，在日本晴参考基因组上的等位感病基因序列收录号为DQ454158，在第13239到13476个碱基之间，75-1-127和日本晴相比缺失了124个碱基，见表1。
表1：日本晴与75-1-127的碱基比较
| 日本晴 | CTCAATCTCCTTGGCGATGGAAGTTTTCTTAATATTGTAGGCACCACATTTCTAGCTGAT |
| 75-1-127 | CTCAATCTC-------------------------TTGCAGGC--TGAGTTGGTAGC---- |
| ********* *** **** ** **** | |
| 日本晴 | AATGCAACTATCGTGGAGATCATAAAGAGGAGGAATTTTGTGGAAGAAGGACCTGGAGGT |
| 75-1-127 | AATGCAATT-----GGCGAT----------GGGAGTTTT-------------CTTAATAT |
| ******* * ** *** *** **** ** * * | |
| 日本晴 | TGGGAGTCTTCGGCCTCTACTCAGTCAAATACAAGAAAATATTCCTCAAAACTTAATGCA |
| 75-1-127 | TG-------TAGGCATC---------------------ACATTTCT-AACACACAATGCA |
| ** * *** ** * *** ** ** ** ****** | |
| 日本晴 | TGTGATGTAGATTCAAAAAGAGGTGAATCAACTAGCTGATAAGTTAGCAAAGGATGTGAG |
| 75-1-127 | -------------------ACGGTGTATCGACTAGGTGATAAGGTAGCAAAGGATGTGAG |
| **** *** ***** ******* **************** | |
| 日本晴 | ATCGCGACAGCTAAATCCTTCAGGTTTATGATTGTCAAAATATCTTGAGTCTTGCTCATC |
| 75-1-127 | ATCGCAACAGCTCAATCCTTCAG-TTTATGATTGTCAAAATATCTTGAGTCTTGCTCACC |
| ***** ****** ********** ********************************** * | |
| 日本晴 | CTAGAAACCTTTGTTATGTTAGAGATTTGAAGAACCATTTCAGAGCAACGAATTGTATTA |
| 75-1-127 | CTAGAAACCTTCGTTATGCTTGAGATTTGAAAAA--------GAGCAACGAATTGTATTA |
| *********** ****** * ********** ** ****************** | |
| 日本晴 | CAACTTTACAAGTCATGTGCTCTGTTTCTGAAATGGAAATAAAACTGATGAGTTCTAAAA |
| 75-1-127 | C--------AAGTCATGTGCTCTGTTTCTGAAATGGAAATAATACTGACGAGTTCTAAAG |
| * ********************************* ***** ********** |
（4）、根据核苷酸序列差异，利用Primer Premier 5.0软件设计引物I9，其正反引物序列为：
I9 F：5’- ATTGTAATTCTAGCCTTCCGTCC -3’
I9 R：5’- TCCATTTCAGAAACAGAGCACA -3’。
实施例2：Pi9基因分子标记的亲本多态性检测
（1）、提取供试水稻品种基因组，提取方法为常规CTAB法。供试水稻品种分别为：沪旱1B、秀水123、沪旱7B、黄华占、中组14、沪旱11B、日本晴和75-1-127。
（2）、利用功能标记I9对供试水稻品种进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10 uL Taq PCR Mastermix（天根生化科技(北京)有限公司），10 uM的前后引物各1 uL，补充dd H2O至20 uL。PCR反应程序为： 95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s，55℃下 30 s，72℃下 1 min 进行30个循环，最后72℃下延伸 5 min。
（3）、取PCR产物8 uL上样于2%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，抗病水稻亲本75-1-127扩增出565bp的单条带，在其他感病水稻品种中均扩增出688bp的单条带，电泳条带清晰，差异明显。
实施例3：Pi9基因分子标记的验证与应用
利用Pi9基因分子标记I9对水稻保持系沪旱1B与抗病亲本75-1-127的BC3F1代群体的基因组DNA进行PCR扩增，产物在2%的琼脂糖凝胶进行电泳分型，检测到33个样品含有565bp和688bp两条带，表示这些检测样品为Pi9基因杂合。人工接种稻瘟病菌鉴定结果显示，这33个单株表现为中抗至抗病水平。
利用Pi9基因分子标记I9对350个黄华占和75-1-127 F2单株的基因组DNA进行PCR扩增，产物在2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分别有90个Pi9基因纯合单株、169个Pi9基因杂合单株和91个不含Pi9基因单株，在井冈山稻瘟病自然鉴定结果表明，含Pi9基因的单株均表现出抗病水平，不含Pi9基因的单株表现出感病表型。
因此表明可以利用该标记进行水稻抗瘟病基因Pi9的鉴定和/或抗瘟病水稻的辅助选择育种。
本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。
Claims (3)
1.一种水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记，其特征在于，所述分子标记编号为I9，所述分子标记I9的正反引物序列为：
I9 F：5’- ATTGTAATTCTAGCCTTCCGTCC -3’
I9 R：5’- TCCATTTCAGAAACAGAGCACA -3’。
2.根据权利要求1所述水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记，其特征在于：所述分子标记I9用于水稻抗瘟病基因Pi9的鉴定和/或抗瘟病水稻的辅助选择育种。
3.根据权利要求2所述水稻抗瘟病基因Pi9的分子标记，其特征在于，所述用于水稻抗瘟病基因Pi9的鉴定包括以下实验步骤：
i、提取供试水稻样品基因组；
ii、利用所述分子标记I9的正反引物组合对步骤i中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；
iii、通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，如果有565bp的单条带，则表示所述样品为Pi9基因纯合；如果有688bp的单条带，则表示所述样品不含Pi9基因；如果有565bp和688bp两条带，则表示所述样品为Pi9基因杂合。
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| GR01 | Patent grant | ||
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