CN106834435A - 一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法 - Google Patents

一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蔬菜加工与食品生物技术领域，具体涉及一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，包括：于榨菜盐渍池中取样；提取样品DNA并做琼脂糖凝胶电泳检测后做PCR，扩增16S rDNA；获得的PCR产物进行高通量测序并做比对分析，确定优势菌群种类与组成比例；优势菌株的定向筛选；定向筛选菌株的高密度增殖培养；经高密度增值培养的菌液经离心并冷冻干燥得到各定向筛选和高密度增值培养的菌株冷冻干燥粉，按照16S rDNA测序确定的优势菌群种类与组成比例混合，制得榨菜专用直投式发酵剂。本发明可有效解决传统直投发酵剂存在发酵制品风味单一、发酵风味不醇厚等问题，具有产物稳定、亚硝酸盐含量低的特点。

Description

一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备 方法
技术领域
本发明涉及蔬菜加工与食品生物技术领域，具体涉及一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法。
背景技术
榨菜是中国特产，属于世界三大酱菜之一。榨菜在中国的种植面积广，产量高，是主要的腌制加工蔬菜之一。传统的榨菜盐渍多采用高盐浓度、自然发酵为主。传统的自然发酵存在耗工耗时、发酵周期长、杂菌易污染、产品风味不纯、食用安全性差等一系列应用上的弊端。榨菜盐渍的现代化，是以制作过程的可控性以及标准化、规范化及周年稳定均衡生产为代表的一种生产技术模式，其中采用纯菌接种就是其中一个重要环节，即通过人工分离盐渍蔬菜卤水中的肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌等主要菌种，经冻干、复配后制作成直投式发酵剂用于榨菜盐渍。由于直投式发酵剂具有活菌含量高(109～1012cfu/g)、安全性好、保质期长、使用方便、避免菌种退化等特点，且利于标准化生产以及能有效抑制杂菌、缩短发酵周期、降低亚硝酸盐含量等优点，弥补了榨菜盐渍自然发酵的诸多不足，可以解决上述弊端，在传统发酵蔬菜产业中具有广阔的应用前景。
榨菜的盐渍过程是微生物的发酵过程。正是利用微生物的发酵原理，榨菜在自然发酵过程中，丰富的微生物菌群对榨菜制品的保藏和形成各自独特的风味起到很大的作用，榨菜盐渍过程中乳酸菌代谢产生的高浓度矿物质、乳酸和生物活性物质是构成泡菜独特风味的重要原因。乳酸发酵是榨菜盐渍过程中各种发酵作用种的最主要的发酵作用。主要的乳酸菌包括乳杆菌属、片球菌属、明串株菌属、链球菌属、乳球菌属。在一定程度上，盐渍榨菜的品质和风味很多程度上是由发酵过程中的乳酸菌菌群决定的。
但由于一些菌群的不可培养性或较差重复性，导致传统的分离培养方式难以全面、客观地反映榨菜盐渍过程中的菌群结构和变化，因此目前根据传统分离培养所制得的发酵剂生产的榨菜难以真正反映其风味与品质，出现了风味单一、发酵味不醇厚等问题。另外，传统微生物种类鉴定的方法一般采用表型特征鉴定，但此法存在操作步骤繁琐、工作量大、周期长、某些检测结果不稳定等问题。因此，根据不同蔬菜的发酵特性，寻找更为优良、有效的发酵剂制备方法对于传统蔬菜加工方式意义重大。
随着生物技术的飞速发展，传统的微生物鉴定方法常常难以鉴定众多的生长习性复杂的微生物，因而基于基因组序列的分子鉴定受到广泛关注。在细菌基因组中，编码16SrRNA的rDNA基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度(约为1540bp)，以及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。16S rDNA序列分析的一个显著特点是能及时鉴定出生长缓慢或生化反应惰性的细菌。
发明内容
本发明针对传统直投发酵剂存在发酵制品风味单一、发酵风味不醇厚等问题，提出了一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，该方法可定向筛选出主导榨菜盐渍及榨菜风味、品质的不同乳酸菌属，特异性和目标导向性强，准确度高，不必反复纯化。
为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：
一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，至少包括以下步骤：
(1)于榨菜盐渍池中取样，样品置于无菌冷冻管中，立即放入液氮中保存，然后置于超低温冰箱中，
(2)提取样品DNA并做琼脂糖凝胶电泳检测后做PCR，扩增16S rDNA，所述的PCR扩增的特异性引物的上游引物515F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)，特异性引物的下游引物907R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)，PCR扩增区域为微生物16S rDNA的V4-V5可变区域，测序前需对所述PCR产物进行回收纯化，
(3)将步骤(2)获得的PCR产物进行高通量测序并做比对分析，确定优势菌群种类与组成比例，
(4)优势菌株的定向筛选，
(5)定向筛选菌株的高密度增殖培养，
(6)离心并冷冻干燥，
将步骤(5)经高密度增值培养的菌液加入脱脂奶粉，摇匀后离心，去除上清培养液，收集试管底部菌体；收集的菌体加入冻干保护剂后做冷冻干燥，其中：菌体与冻干保护剂质量分数配比为1:3-1:2.5，
(7)将步骤(6)得到的各定向筛选和高密度增值培养的菌株冷冻干燥粉按照16SrDNA测序确定的优势菌群种类与组成比例混合，制得榨菜专用直投式发酵剂。
作为优选方案，根据本发明所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其中，所述的步骤(1)中取样采用3点取样法，采集点分别位于盐渍池中心、盐渍池对角线两点，每处采集3次样品，采集后混匀。
作为优选方案，根据本发明所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其中，所述的步骤(4)优势菌株的定向筛选按如下操作：在所述步骤(1)的所取样品中，取1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在定向培养基上，然后在35～37℃恒温箱中定向培养36～72h，观察菌落；然后将定向培养的菌株进行生理生化特征鉴定实验；根据鉴定结果，将定向筛选后的菌株进行斜面培养。
作为优选方案，根据本发明所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其中，所述的步骤(5)定向筛选菌株的高密度增殖培养按如下步骤操作：将上述步骤(4)定向筛选与纯化培养的菌株进行高密度增值培养，高密度增值培养基为MRS琼脂培养基，培养条件为35～37℃恒温箱中培养48～72h；所述的MRS琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐温801.0毫升、磷酸氢二钾2.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸三胺2.0克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05克、琼脂粉15.0克和蒸馏水1升，加热溶解后，校正pH＝6.2～7.2，121℃高压灭菌15～20分钟。
作为优选方案，根据本发明所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其中，所述的步骤(6)中将步骤(5)经高密度增值培养的菌液，加入2.7～3.5％经高温灭菌的脱脂奶粉，摇匀后以4000-5000rpm转速于-5～10℃条件下离心25-30分钟。
作为优选方案，根据本发明所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其中，所述的步骤(6)中冻干保护剂配方为：脱脂乳25-30克、乳糖10-15克、葡糖糖5-12克、维生素C5-6.5克、D-山梨醇5-7.2克、L-谷氨酸5-6克和蒸馏水250mL；冻干保护剂加热溶解后，121℃高压灭菌15-20分钟后备用。
作为优选方案，根据本发明所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其中，所述的步骤(6)中冷冻干燥的主要工艺参数为：-50～-70℃预冻12-24h后，-60～80℃冻干24-72h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)与采用传统分离培养制备的传统发酵剂相比，本发明通过高通量测序鉴定微生物菌群的16SrDNA，能准确的获得榨菜自然发酵后详细微生物群落结构与组成比例，并确定主要的乳酸菌菌群，从而准确的判断不同微生物菌群对榨菜自然发酵进程与制品品质的影响。所使用的目标菌种具有多样性、特异性，避免了传统发酵剂菌种单一、菌群良莠不齐、非特异性等缺点。
(2)本发明定向制备获得的榨菜专用发酵剂具有特异性与目标导向性特征。根据不同地方榨菜加工的不同工艺及品质、风味需求，通过配比菌种构成提高发酵效率，产物稳定、亚硝酸盐含量显著降低(图3和图4)，避免了传统发酵剂发酵过程中所导致的发酵风味不纯的缺点。
(3)与传统筛选方法制备的发酵剂相比，一种基于16S rDNA测序定向制备榨菜专用直投式发酵剂的方法在发酵剂制备过程中，菌种专一性强、活性高，所制得的发酵剂干粉易于储藏与运输。
附图说明
图1榨菜样品16S rRNA基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
图2榨菜中细菌在不同分类水平的分布。
图3自然发酵榨菜中亚硝酸盐含量柱形图。
图4本发明榨菜专用发酵剂的榨菜中亚硝酸盐含量柱形图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
实施例1
一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，按以下步骤进行：
(1)于榨菜盐渍池中取样，采用3点取样法，采集点分别位于盐渍池中心、盐渍池对角线两点，每处采集3次样品。采集后混匀，置于15ml的无菌冷冻管中，立即放入液氮中保存，然后置于-70℃超低温冰箱中。
(2)将步骤(1)采集的样品用DNA提取试剂盒提取微生物的脱氧核糖核酸(英文缩写DNA)，所有样品的DNA提取步骤均参照DNA提取试剂盒说明书。对提取到的样品基因组DNA进行3％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)(3)将步骤(2)提取的DNA用特异性引物进行PCR，扩增微生物的16SrDNA，特异性引物的上游引物515F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)、下游引物907R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)，聚合酶链式反应(即PCR)扩增区域为微生物16S rDNA的V4-V5可变区域，测序前对所述PCR产物进行回收纯化。
(4)将步骤(3)获得的PCR产物进行高通量测序。筛选测序所得数据并与已有数据库信息进行序列比对，获得菌群的可操作分类单元(OTUs)；且与现有16S V4-V5数据库比对。根据标签序列和reads，榨菜腌渍后乳杆菌属(Lactobacillus)占有比例为72.7％，分别为：食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、Lactobacillus versmoldensis(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，比例分别为：22.7％、37％、8％、2.6％、2.4％(图2)。
(5)食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、Lactobacillusversmoldensis、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的定向筛选：
(5.1)食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)的定向筛选：在上述步骤(1)的所取样品中，取1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在MRS培养基，然后在35～37℃恒温箱中培养48～72h，观察菌落。挑选出呈乳白色、不透明、圆形光滑的单菌落，进行斜面培养48～72h；接入液体MRS培养基培养48～60h。MRS琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐温801.0毫升、磷酸氢二钾2.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸三胺2.0克、硫酸镁0.2克；硫酸锰0.05克、琼脂粉15.0克和蒸馏水1升；加热溶解后，校正pH为6.2，121℃高压灭菌15～20分钟。
将筛选的菌株进行生理生化鉴定实验，符合以下结果：
(5.2)Lactobacillus versmoldensis的定向筛选：在上述步骤(1)的所取样品中，取1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在MRS培养基，然后在36～37℃恒温箱中培养48～72h，观察菌落。挑选出呈乳白色、不透明、圆形光滑的单菌落，进行斜面培养48～72h；接入液体MRS培养基培养48～72h。MRS琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐温801.0毫升、磷酸氢二钾2.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸三胺2.0克、硫酸镁0.2克；硫酸锰0.05克、琼脂粉15.0克和蒸馏水1升；加热溶解后，校正pH为6.2，121℃高压灭菌15～20分钟。
将活化后的菌株，按3％接种量接种于胆盐质量浓度分别为0、0.3、0.6g/l的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养16h。然后筛选进行生理生化鉴定实验，符合以下结果：
(5.3)肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的定向筛选：取步骤(1)中1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在YGPB培养基上，然后挑取典型菌落于YGPB培养基上平板上划线，并置于25℃培养箱中厌氧培养2～3天，观察菌落生长状况。YGPB培养基配方为：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉浸膏8g、酵母浸膏3g、NaCl 5g、磷酸二氢钾2.5g、磷酸氢二钾2.5g、硫酸镁0.2克；硫酸锰0.05克、pH6.8，琼脂粉15.0克和蒸馏水1升；加热溶解后，校正pH为6.2，121℃高压灭菌15～20分钟。
将筛选的菌株进行生理生化实验，符合以下结果：
(5.4)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的定向筛选：在上述步骤(1)的所取样品中，取1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在定向MRS培养基上，于35～37℃恒温箱中培养48～72h，观察菌落，挑选出有溶钙圈、呈乳白色、不透明、圆形光滑的单菌落，在MRS平板上划线培养48～72h；斜面培养后，接入液体培养MRS培养48～72h。MRS琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐温801.0毫升、磷酸氢二钾2.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸三胺2.0克、硫酸镁0.2克；硫酸锰0.05克、1％碳酸钙、0.05‰的纳他霉素、琼脂粉15.0克和蒸馏水1升；加热溶解后，校正pH为6.2，121℃高压灭菌15～20分钟。
将筛选的菌株进行生理生化实验，符合以下结果：
(5.5)短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的定向筛选：在上述步骤(1)的所取样品中，取1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在MRS改良培养基，然后在37℃恒温箱中培养48h，观察菌落，挑选出呈乳白色、不透明、圆形光滑的单菌落，在MRS改良培养基平板上划线培养48h。斜面培养后，接入液体MRS改良培养基中培养72h。MRS改良培养基配方为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g和蒸馏水1000ml。溶解后，校正pH为6.5，121℃高压灭菌15～20分钟。
将筛选的菌株进行生理生化实验，符合以下结果：
(6)定向筛选菌株的高密度增殖培养。将步骤(5)定向筛选与纯化培养的食品乳杆菌、Lactobacillus versmoldensis、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和短乳杆菌进行高密度增值培养，高密度增值培养基为MRS琼脂培养基，培养条件为35～37℃恒温箱中培养64～72h。MRS琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐温801.0毫升、磷酸氢二钾2.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸三胺2.0克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05克、琼脂粉15.0克和蒸馏水1升；加热溶解后，校正pH为6.2，121℃高压灭菌15～20分钟。
(7)定向筛选菌株的收集：将步骤(6)得到的经高密度增值培养的菌液，加入3.5％经高温灭菌的脱脂奶粉，摇匀后以5000rpm转速于-5℃条件下离心30分钟，去除上清培养液，收集试管底部菌体。
(8)直投式发酵剂的冷冻干燥。将步骤(7)收集的菌体加入冻干保护剂，冻干保护剂配方为：脱脂乳30克、乳糖15克、葡糖糖12克、维生素C6.5克、D-山梨醇7.2克、L-谷氨酸6克和蒸馏水250mL。冻干保护剂加热溶解后，121℃高压灭菌20分钟。菌体与冻干保护剂质量分数配比为1:3。冷冻干燥条件为：-70℃预冻24h后，-80℃冻干24h。
(9)榨菜专用直投式发酵剂的制备。按照16S rDNA测序结果所确认的乳酸菌的组成，将上述的冻干的食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、Lactobacillusversmoldensis、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)按照22.7％、37％、8％、2.6％、2.4％比例混合，制得榨菜专用直投式发酵剂。经检测，活菌含量为109～1012cfu/g。
将本发明制得的榨菜专用直投式发酵剂用于榨菜盐渍，与自然发酵的榨菜比较，风味一致，而亚硝酸盐含量明显降低；同时采用本发明的榨菜专用直投式发酵剂用于榨菜盐渍，具有产物稳定的特点，避免了传统发酵剂发酵过程中所导致的发酵风味不纯的缺点。本发明榨菜专用直投式发酵剂制得的榨菜与自然发酵榨菜中亚硝酸盐含量比较，结果如图3和图4所示。可以看出，本发明的榨菜专用直投式发酵剂能显著降低榨菜中亚硝酸盐的含量，亚硝酸盐含量几乎只有自然发酵的一半。这是由于自然发酵菌群较为复杂，短时期内难以形成优势菌群且产酸速度慢而直接影响对有害微生物的抑制；本发明的榨菜专用直投式发酵剂则能在短时期内迅速形成优势菌群并快速产酸而使有害微生物得到有效抑制，因此使有害微生物对硝酸盐的还原作用能力大为削弱，抑制和减少了亚硝酸盐的生成。
实施例2
其他同实施例1，不同之处在于：
步骤(7)：将步骤(6)得到的经高密度增值培养的菌液，加入2.7％经高温灭菌的脱脂奶粉，摇匀后以4000rpm转速于10℃条件下离心25分钟，去除上清培养液，收集试管底部菌体。
步骤(8)直投式发酵剂的冷冻干燥。将步骤(7)收集的菌体加入冻干保护剂，冻干保护剂配方为：脱脂乳25克、乳糖10克、葡糖糖5克、维生素C5克、D-山梨醇5克、L-谷氨酸5克和蒸馏水250mL；冻干保护剂加热溶解后，121℃高压灭菌15分钟后备用。菌体与冻干保护剂质量分数配比为1:2.5。冷冻干燥条件为：-50℃预冻12h后，-60℃冻干72h。
经检测，本实施例与实施例1达到同样技术效果，不再赘述。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法
<130> Z164859
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 6
<211> 450
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 6
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tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa 360
caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt 420
agcaaacagg attagaaacc ctagtagtcc 450
<210> 7
<211> 450
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 7
gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca atgccgcgtg agtgaagaag 60
ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacact cttgagagta actgttcagg 120
agttgacggt atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180
gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttaa 240
gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg agaagtgcat cggaaactgg gagacttgag 300
tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa 360
caccagtggc gaaggcggct gtctagtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt 420
agcaaacagg attagatacc cttgtagtcc 450

Claims (7)

1.一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于至少包括以下步骤：
(1)于榨菜盐渍池中取样，样品置于无菌冷冻管中，立即放入液氮中保存，然后置于超低温冰箱中，
(2)提取样品DNA并做琼脂糖凝胶电泳检测后做PCR，扩增16S rDNA，所述的PCR扩增的特异性引物的上游引物515F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，特异性引物的下游引物907R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，PCR扩增区域为微生物16S rDNA的V4-V5可变区域，测序前需对所述PCR产物进行回收纯化，
(3)将步骤(2)获得的PCR产物进行高通量测序并做比对分析，确定优势菌群种类与组成比例，
(4)优势菌株的定向筛选，
(5)定向筛选菌株的高密度增殖培养，
(6)离心并冷冻干燥，
将步骤(5)经高密度增值培养的菌液加入脱脂奶粉，摇匀后离心，去除上清培养液，收集试管底部菌体；收集的菌体加入冻干保护剂后做冷冻干燥，其中：菌体与冻干保护剂质量分数配比为1:3-1:2.5，
(7)将步骤(6)得到的各定向筛选和高密度增值培养的菌株冷冻干燥粉按照16S rDNA测序确定的优势菌群种类与组成比例混合，制得榨菜专用直投式发酵剂。
2.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中取样采用3点取样法，采集点分别位于盐渍池中心、盐渍池对角线两点，每处采集3次样品，采集后混匀。
3.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)优势菌株的定向筛选按如下操作：在所述步骤(1)的所取样品中，取1ml液体于生理盐水中进行10倍的梯度稀释，均匀涂布在定向培养基上，然后在35～37℃恒温箱中定向培养36～72h，观察菌落；然后将定向培养的菌株进行生理生化特征鉴定实验；根据鉴定结果，将定向筛选后的菌株进行斜面培养。
4.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)定向筛选菌株的高密度增殖培养按如下步骤操作：将上述步骤(4)定向筛选与纯化培养的菌株进行高密度增值培养，高密度增值培养基为MRS琼脂培养基，培养条件为35～37℃恒温箱中培养48～72h；所述的MRS琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐温80 1.0毫升、磷酸氢二钾2.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸三胺2.0克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05克、琼脂粉15.0克和蒸馏水1升，加热溶解后，校正pH＝6.2～7.2，121℃高压灭菌15～20分钟。
5.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中将步骤(5)经高密度增值培养的菌液，加入2.7～3.5％经高温灭菌的脱脂奶粉，摇匀后以4000-5000rpm转速于-5～10℃条件下离心25-30分钟。
6.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中冻干保护剂配方为：脱脂乳25-30克、乳糖10-15克、葡糖糖5-12克、维生素C5-6.5克、D-山梨醇5-7.2克、L-谷氨酸5-6克和蒸馏水250mL；冻干保护剂加热溶解后，121℃高压灭菌15-20分钟后备用。
7.如权利要求1所述的一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中冷冻干燥的主要工艺参数为：-50～-70℃预冻12-24h后，-60～80℃冻干24-72h。
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