CN106834135B - 一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法 - Google Patents
一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明中公开了一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法,该方法取生长在装有PDA培养基的培养皿生长15天的葡萄黑痘病病原真菌菌落的外圈菌丝体接种于新的无菌装有PDA培养基的培养瓶中;25℃下黑暗培养25天后,将培养瓶在21℃下,黑暗放置24小时;用无菌手术刀刮取菌落表面组织,挤压成粉末状,然后放入无菌水中,震荡30秒,取上清液用血球计数板进行孢子计数。该方法操作简单,能够稳定获得较多的分生孢子,以便用于筛选抗黑痘病的葡萄种质,为抗病育种和葡萄病理研究提供保障。
Description
技术领域
本发明属于果树病理学技术领域,具体涉及一种用于诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法。
背景技术
葡萄病害种类多,危害严重,其中葡萄黑痘病分布广泛,在我国南北多雨地区大量发生,发病严重时最高可造成果实损失50%,严重影响了葡萄的产量和品质,已经成为制约葡萄产业健康发展的主要因素之一。葡萄黑痘病是由葡萄痂囊腔菌(Elsinoe ampelina)引起的一种真菌性病害,危害葡萄的新梢、蔓、叶柄、叶脉、果柄及果实等部位。
葡萄痂囊腔菌的无性阶段为半知菌亚门痂圆孢菌属,有性阶段为子囊菌亚门痂囊腔菌属,在人工培养基上生长缓慢。据报道,葡萄痂囊腔菌在谷类琼脂培养基上生长较好,但培养8周才能达到8cm2左右。该病原菌极难产孢,目前主要通过紫外辐射处理和加水培养获得孢子,但产孢不稳定,操作不便,尤其是产孢量小。
发明内容
针对葡萄痂囊腔菌是葡萄黑痘病的病原菌,该菌生长缓慢,且产孢困难的技术难题,本发明的目的在于,提供一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法。
为了实现上述任务,本发明采用如下的技术解决方案:
一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法,其特征在于,按以下步骤进行:
(1)取生长在装有PDA培养基的培养皿生长15天的葡萄黑痘病病原真菌菌落的外圈菌丝体接种于新的无菌装有PDA培养基的培养瓶中;
(2)25℃下黑暗培养25天后,将培养瓶在21℃下,黑暗放置24小时;
(3)用无菌手术刀刮取菌落表面组织,挤压成粉末状,然后放入无菌水中,震荡30秒,取上清液用血球计数板进行葡萄痂囊腔菌孢子计数,得到葡萄痂囊腔菌孢子。
根据本发明,所述的PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方为:1000毫升纯水、200克马铃薯、20克葡萄糖、15克琼脂。
进一步的,所述的培养瓶为玻璃材质,塑料瓶盖上有0.22微米的微孔,能过滤微生物的透气膜,其规格为250毫升,口径、胸径和瓶高的尺寸分别为5.6厘米、6.9厘米和9.1厘米。
根据本发明,所述的葡萄痂囊腔菌的DNA序列是:
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCCTTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGCCTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACAACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCCCCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTCGGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA。
本发明的诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法,操作简单,能够稳定获得较多的葡萄痂囊腔菌分生孢子,以便用于筛选抗黑痘病的葡萄种质,为抗病育种和葡萄病理研究提供保障。
附图说明
图1是葡萄黑痘病菌的分离和鉴定。A图是从‘红地球’叶片病健交界处长出的菌落接种于新的PDA培养基上生长10天的形态;B图是黑痘病菌分生孢子在培养基上生长6天,长出单菌落的形态;C图是分离纯化后的葡萄黑痘病菌ITS扩增产物,大小为580bp;D图是葡萄黑痘病菌ITS序列与痂囊腔菌属内真菌ITS序列的***进化分析。
图2是PDA培养皿和PDA培养瓶培养葡萄痂囊腔菌在不同天数的菌落形态图片。其中,A-C图为PDA培养皿上培养0天,10天,15天的形态,标尺为2cm;D图为PDA培养皿上生长25天的菌落形态,标尺为0.5cm;E-G图为PDA培养瓶中培养0,10,15天的菌落形态,标尺为1cm;H图为PDA培养瓶中培养25天的菌落形态,标尺为0.5cm。
图3是温度、光照、诱导时间和培养时间对葡萄痂囊腔菌产孢的影响图。其中,A图是PDA培养瓶中培养25天的葡萄痂囊腔菌分别放置在19℃,21℃,23℃,和25℃下24小时的产孢情况;B图是PDA培养皿和培养瓶中培养25天的葡萄痂囊腔菌分别在光照和黑暗下,21℃下诱导24小时的产孢情况;C图是PDA培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌黑暗放置在21℃下,不同的诱导时间对产孢的影响情况;D图是PDA培养瓶培养20天,25天,30天和35天后的葡萄痂囊腔菌,黑暗放置在21℃下24小时的葡萄痂囊腔菌产孢情况。
图4是PDA培养瓶培养25天和35天后的菌落形态和诱导产孢的情况图。其中,A图是PDA培养瓶培养25天葡萄痂囊腔菌的菌落形态,标尺为0.5cm;B图是PDA培养瓶培养25天葡萄痂囊腔菌的菌落表面形态,标尺为50μm;C图是PDA培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下24小时的产孢情况,标尺为10μm;D图是PDA培养瓶培养35天葡萄痂囊腔菌的菌落形态,标尺为0.5cm;E图是PDA培养瓶培养35天葡萄痂囊腔菌的菌落表面形态,标尺为50μm;F图是PDA培养瓶培养35天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下24小时的产孢情况,标尺为10μm。
以下结合附图和发明人给出的实施例,对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
由于葡萄黑痘病病原菌为葡萄痂囊腔菌,生长缓慢,极难产孢,申请人通过研究培养方式、培养天数、温度和光照对产孢的影响,进而发现:
1)培养瓶培养比培养皿培养更容易产孢;
2)培养瓶培养25天后诱导效果最佳;
3)培养瓶培养25天后,21℃下黑暗诱导24小时,产孢效果最好。
本发明给出的诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法,为痂囊腔菌属真菌诱导产孢提供快速稳定的参考,同时为开展葡萄黑痘病相关研究提供基础。
选择的具体实验包括:
(1)培养方式的确定:由于PDA培养皿培养葡萄痂囊腔菌具有菌落形态的多样性,影响诱导产孢的稳定性,而通过PDA培养瓶培养的葡萄痂囊腔菌在形态上具有一致性,而且培养瓶的产孢量较培养皿大。
(2)培养时间的确定:葡萄痂囊腔菌生长比较缓慢,前期的菌落颜色为暗红色,但在后期菌落颜色变为灰绿色,通过在培养瓶上培养不同天数后进行诱导产孢发现培养25天的产孢量最大。
(3)温度调节产孢:葡萄痂囊腔菌的培养条件为25℃,而在此温度下的不同培养阶段都没有获得孢子。通过设置温度梯度观察对葡萄痂囊腔菌产孢的影响,结果发现在21℃下的葡萄痂囊腔菌产孢效果最好;进一步发现,在21℃下诱导24小时,葡萄痂囊腔菌产孢量最大。
(4)光照对产孢的影响:光照条件下,21℃诱导24小时后发现其产孢量比黑暗条件少,说明光照下不利于诱导葡萄痂囊腔菌产孢,因此黑暗下诱导葡萄痂囊腔菌产孢的效果更好。
以下的实施例中,所使用培养瓶为玻璃材质,塑料瓶盖上有0.22微米的微孔,能过滤微生物的透气膜,其规格为250毫升,口径、胸径和瓶高的尺寸分别为5.6厘米、6.9厘米和9.1厘米。
实施例1:葡萄黑痘病菌的分离和鉴定
采集‘红地球’葡萄发生黑痘病(带有葡萄黑痘病病原真菌)的叶片带回实验室,用手术刀将病健交界处切下,用剪刀剪成3mm×3mm的小块,将剪好的小块放入浓度为2.5%的NaClO溶液中表面消毒2min,再用无菌水漂洗3次。自然晾干后,放置于含50ng/mL链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上,马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方为:1000毫升纯水、200克马铃薯、20克葡萄糖、15克琼脂。25℃下黑暗培养。生长5天后将长出葡萄痂囊腔菌的菌落转移至新的PDA培养基中继续培养(图1A)。将分生孢子均匀涂布在PDA培养基上,生长6天可长出单菌落,挑取单葡萄痂囊腔菌的菌落接种于新的PDA培养基上(图1B)。利用CTAB法提取葡萄黑痘病菌DNA,通过ITS扩增(正向引物:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’,反向引物:5’-TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’),产物片段大小为580bp(图1C),测序该产物片段的DNA序列是:
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCCTTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGCCTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACAACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCCCCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTCGGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA(如SEQ ID NO.1所示)。
所得序列在NCBI数据库中进行比对,结果与葡萄黑痘病菌的序列一致性最高,属于痂囊腔菌属中的葡萄痂囊腔菌(图1D),因此命名为葡萄痂囊腔菌。
实施例2:培养方式对葡萄痂囊腔菌产孢的影响
首先挑取在PDA培养皿上生长15天的葡萄痂囊腔菌菌落边缘,接种于含有PDA培养基的培养皿和含有PDA培养基的培养瓶中(图2A和2E),25℃下黑暗培养,菌落形态如图2所示,培养25天后,然后将培养皿和培养瓶放置在21℃下诱导24小时,用无菌手术刀刮取菌落表面组织,挤压成粉末状,然后放入无菌水中,震荡30秒,取上清液用血球计数板进行葡萄痂囊腔菌孢子计数,得到葡萄痂囊腔菌孢子。
采用培养瓶培养的葡萄痂囊腔菌的菌落,其产孢量可达5.3×106个/mL,而培养皿每个葡萄痂囊腔菌的菌落在相同条件下的产孢量仅为1.3×106个/mL(图3B)。说明用培养瓶的培养方式葡萄痂囊腔菌在产孢量上优于培养皿。
实施例3:培养时间对葡萄痂囊腔菌产孢的影响
由于葡萄痂囊腔菌生长比较缓慢,前期的葡萄痂囊腔菌的菌落颜色为暗红色,但在后期菌落颜色变为灰绿色,为了探讨培养时间对葡萄痂囊腔菌产孢的影响,对培养瓶培养20天,25天,30天和35天的葡萄痂囊腔菌进行诱导产孢,发现在培养瓶上培养25天,葡萄痂囊腔菌的产孢量最大,而35天的葡萄痂囊腔菌的产孢量仅为0.25×106个/mL(图3D),说明培养时间长并不利于葡萄痂囊腔菌的产孢。通过形态观察发现,培养35天葡萄痂囊腔菌的菌落表面有大量气生菌丝(图4E),而且菌丝中产生大量的油胞(图4F),诱导葡萄痂囊腔菌的产孢量低;而培养25天葡萄痂囊腔菌的菌落表面气生菌丝少(图4B),未观察到油胞,能够诱导出较多的分生孢子(图4C)。说明培养瓶培养25天是葡萄痂囊腔菌最佳的诱导产孢时期。
实施例4:温度对葡萄痂囊腔菌产孢的影响
为了明确温度对葡萄痂囊腔菌产孢的影响,将培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌,分别放置在19℃,21℃,23℃和25℃下诱导24小时,结果发现在21℃下诱导,葡萄痂囊腔菌的孢子量最大,达到5.0×106个/mL(图3A)。为进一步确定21℃下需要诱导多长时间,效果最佳,将培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下诱导,分别在6小时,12小时,18小时,24小时,30小时后观察产孢量,结果发现21℃下24小时,葡萄痂囊腔菌的产孢量达到稳定(图3C)。
实施例5:光照对葡萄痂囊腔菌产孢的影响
大量的文献报道葡萄痂囊腔菌需要在黑暗条件下进行培养,为了明确光照葡萄痂囊腔菌产孢的影响,将培养瓶或培养皿培养25天的葡萄痂囊腔菌在光照条件下,21℃诱导24小时,结果发现黑暗条件下葡萄痂囊腔菌的产孢效果好于光照条件下(图3B),说明光照下不利于诱导葡萄痂囊腔菌产孢。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 西北农林科技大学大学
<120>一种诱导葡萄黑痘病病原菌稳定产孢的方法
<160>
<210> 1
<211> 580
<212> SEQ ID NO. 1
<213> DNA
<220>
<400> 1
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCCTTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGCCTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACAACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCCCCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTCGGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA
<210> 2
<211>25
<212>正向引物
<213> DNA
<220>
<400> 2
5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’
<210> 3
<211>25
<212>反向引物
<213> DNA
<220>
<400> 3
5’- TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’
Claims (3)
1.一种诱导葡萄痂囊腔菌(Elsinoe ampelina)产孢的方法,其特征在于,按以下步骤进行:
(1)取在装有PDA培养基的培养皿上生长15天的葡萄黑痘病病原真菌菌落的外圈菌丝体接种于新的无菌装有PDA培养基的培养瓶中;
(2)25℃下黑暗培养25天后,将培养瓶在21℃下,黑暗放置24小时;
(3)用无菌手术刀刮取菌落表面组织,挤压成粉末状,然后放入无菌水中,震荡30秒,取上清液用血球计数板进行葡萄痂囊腔菌孢子计数,得到葡萄痂囊腔菌孢子。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,配方为:1000毫升纯水、200克马铃薯、20克葡萄糖、15克琼脂。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的培养瓶为玻璃材质,塑料瓶盖上有0.22微米的微孔和能过滤微生物的透气膜,其规格为250毫升,口径、胸径和瓶高的尺寸分别为5.6厘米、6.9厘米和9.1厘米。
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