CN106811443A - 载脂蛋白c-ⅲ单克隆抗体的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠抗人载脂蛋白C-III单克隆抗体的制备及应用。具体而言，本发明提供载脂蛋白C-III抗原多肽的氨基酸序列，保藏号为CCTCC No.C2015191的小鼠杂交瘤细胞株WLC001，以及由此杂交瘤细胞株产生的载脂蛋白C-III单克隆抗体。本发明还涉及载脂蛋白C-III单克隆抗体在检测载脂蛋白C-III免疫印迹中的应用。

Description

载脂蛋白C-III单克隆抗体的制备及应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在检测载脂蛋白C-III免疫印迹中的应用。

背景技术

载脂蛋白C-III是由79个氨基酸组成的小分子糖蛋白，是载脂蛋白C族中含量最丰富的一类，主要在肝脏中合成，仅小部分在小肠合成，载脂蛋白C-III主要分布于乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。载脂蛋白C-III基因位于11号染色体长臂q23区，在载脂蛋白A-I和载脂蛋白A-IV之间，三者共同组成一个基因家族。载脂蛋白C-III的转录受胰岛素及过氧化物酶体增殖物激活受体等多种因素调控。

载脂蛋白C-III具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶活性的功能，可抑制肝脏摄取富含甘油三酯的脂蛋白及脂类分解，是血浆甘油三酯水平的主要调节因子。载脂蛋白C-III在血浆高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白之间相互转移，在血脂正常个体的血清中，载脂蛋白C-III大部分与高密度脂蛋白结合，而在高甘油三酯血症患者血清中，则大部分与极低密度脂蛋白结合。高甘油三酯血症是我国最常见的脂质代谢异常疾病，是引起冠心病的独立危险因素之一。随着我国肥胖人群的增加，高甘油三酯血症患者的数量也在逐年增加，其发病主要是由于富含甘油三酯的脂蛋白代谢障碍引起，患者血浆中载脂蛋白C-III含量显著高于正常人群，载脂蛋白C-III已成为高甘油三酯血症发生发展的有效标志物，制备载脂蛋白C-III单克隆抗体可用于开发高甘油三酯血症患病风险的诊断试剂，对探讨高甘油三酯血症的发病机制具有重要意义。

目前已有载脂蛋白C-III单克隆抗体，但仍需要稀释度更高，亲和性更好，表达量更多的单克隆抗体。获得活性高的载脂蛋白C-III单克隆抗体对高甘油三酯血症的临床诊断和科学研究具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株能稳定、高效分泌载脂蛋白C-III单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法；

本发明的另一个目的是提供载脂蛋白C-III单克隆抗体；

本发明的又一个目的是将所述的载脂蛋白C-III单克隆抗体应用于载脂蛋白C-III免疫印迹检测中。

本发明的上述目的通过以下技术方式实现：

一种载脂蛋白C-III抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。合成所述多肽，并与载体蛋白偶联，偶联产物免疫小鼠，吸取骨髓瘤细胞悬液和来源于偶联多肽免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞悬液进行细胞融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，获得所述杂交瘤细胞株。其微生物保藏编号为：CCTCC N0.2015191；保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

制备小鼠腹水，Protein G层析柱纯化载脂蛋白C-III单克隆抗体，ELISA法测定纯化抗体效价，Western blot验证所述单克隆抗体的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为载脂蛋白C-III免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析结果，方框中显示的是选用合成的多肽序列片段。

图2为以载脂蛋白C-III单克隆抗体为一抗，免疫印迹检测人血浆和肝细胞HepG2中载脂蛋白C-III蛋白表达情况。泳道1：正常人血浆；泳道2：HepG2细胞。

图3为本实验的发明流程。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明，并非用于限定本发明。在不脱离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：载脂蛋白C-III抗原多肽设计

1.1根据载脂蛋白C-III GenBank登录号GI：4557323，获得人载脂蛋白C-III蛋白序列(UniProt：P02656)，含有79个氨基酸。

1.2用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)在线分析载脂蛋白C-III蛋白特性，分析结果见表1，该蛋白的分子量为8.7646KD，等电点为4.72，为酸性蛋白。

表1载脂蛋白C-III基本理化性质分析结果

1.3用DNAstar软件分析载脂蛋白C-III蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明载脂蛋白C-III近C端有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强(见图1)。

1.4载脂蛋白C-III抗原多肽筛选

将筛选出的16个氨基酸序列经Blastp分析，最终筛选多肽序列为：KFSEFWDLDPEVRPTS(60aa-75aa，SEQ ID NO：1)。

实施例2：载脂蛋白C-III抗原多肽合成及偶联

2.1载脂蛋白C-III多肽合成

多肽由上海吉尔生化公司合成，纯度为93.85％。

2.2多肽与载体蛋白偶联

取5mg多肽溶解于50μl DMSO，加入偶联缓冲液稀释至终体积为1ml，取出200μl用于ELISA检测，在剩余800μl多肽溶液中加入400μl浓度为10mg/ml的OVA溶液混匀后，再加入200μl浓度为10mg/ml的EDC，立即混匀，室温反应2h。

2.3偶联产物的超滤与分装

将偶联产物用PBS稀释至4ml，用10KD Milipore超滤离心管对偶联产物进行超滤，每次超滤后将下管中滤液弃去，待上管中剩余液体约1ml时，继续用PBS稀释后进行超滤离心，循环超滤4次后，取上管中剩余液体1ml加入PBS稀释至3ml混匀，采用NanoDrop分光光度计测定偶联后蛋白浓度为1.272mg/ml，用0.22μm滤器过滤除菌后，每管分装偶联后蛋白500μl，-80℃保存。

实施例3：抗载脂蛋白C-III的杂交瘤细胞的制备

3.1免疫动物

选取6只6-8周龄清洁级BALB/c小鼠，取分装后的偶联蛋白与等体积相应的佐剂乳化混合后免疫小鼠，免疫程序如表2所示。

表2动物免疫程序

3.2ELISA法检测血清抗体效价

第三次免疫后7天对免疫小鼠尾部取血，ELISA检测血清抗体效价，具体步骤如下：

以合成的载脂蛋白C-III多肽(2μg/ml)为抗原包被酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜，弃包被液，每孔加入200μl 15％脱脂奶粉，37℃封闭1h，洗涤3次，加入以1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000比例稀释的血清样品，每孔100μl，以未免疫小鼠血清作为阴性对照，不加血清作为空白对照，37℃孵育1h，洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶5000)，37℃孵育1h，洗涤3次，每孔加入底物显色剂50μl，室温静置5min，每孔加入终止液50μl，酶标仪检测450nm波长处的OD值。待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍判断为阳性，满足此条件的待测样品的最大稀释倍数即为血清抗体效价，结果见表3。

表3血清抗体效价

3.3细胞融合

选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合，眼球摘除放血法处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，研磨法制备小鼠脾细胞悬液，骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠来源的SP2/0，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞以10∶1混合，并加入1ml50％聚乙二醇促进细胞融合。采用HAT选择培养基进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清，采用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，获得稳定分泌载脂蛋白C-III的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞扩大培养，保存于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，邮编430072)，保藏号为CCTCC No.2015191，分类命名为：人载脂蛋白C-III单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例4：单克隆抗体的大量制备与纯化

4.1腹水制备

取8周龄BALB/c小鼠，腹腔注入降植烷预处理，1周后腹腔注入杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌条件下采集腹水10ml。

4.2腹水纯化

将腹水在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除脂类物质，收集上清液即为腹水单克隆抗体。用PBS将腹水以1∶2比例稀释，10000rpm离心25min，离心后的腹水用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，过Protein G亲和层析柱，洗脱液(Gly-HCl，pH 2.7)进行洗脱，超滤浓缩后NanoDrop分光光度计测定亲和纯化后的抗体浓度为测定抗体浓度为3.7mg/ml。

实施例5：ELISA法检测单克隆抗体效价

以合成的载脂蛋白C-III多肽(2μg/ml)为抗原包被酶标板进行ELISA，具体方法同实施例3.2，检测结果如表4所示。

表4抗载脂蛋白C-III单克隆抗体效价ELISA检测结果

实施例6：载脂蛋白C-III单克隆抗体Western blot应用检测

Western blot检测人血清及HepG2细胞中载脂蛋白C-III的表达，具体步骤如下：

分别取人血浆及HepG2细胞，将其裂解后，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测出提取样本的蛋白浓度，取20μg上样进行SDS-PAGE电泳后，200mA恒流1h转至PVDF膜，用TTBS缓冲液配制5％(M/V)脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温封闭1h。将封闭好的PVDF膜放入杂交袋中，加入5％(M/V)脱脂奶粉稀释的实施例4中纯化得到的抗载脂蛋白C-III单克隆抗体(1∶500)，用压膜机封口，4℃孵育过夜。PVDF膜取出，放入TBST中，在摇床上洗涤4次，每次5min。加入5％的脱脂牛奶稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶5000)，37℃孵育45min，加入ECL显色以检测载脂蛋白C-III的表达情况。结果见图2。本发明中的抗载脂蛋白C-III单克隆抗体可在人血浆和HepG2细胞裂解液中检测到分子量11KD左右的单一条带，与人载脂蛋白C-III预期相对分子量相符。

Claims (4)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏号为：CCTCC NO.C2015191。

2.一种针对载脂蛋白C-III的单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌产生。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测载脂蛋白C-III免疫印迹中的应用。

4.一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含步骤：

①根据人载脂蛋白C-III(UniProt：P02656)蛋白特性，筛选出多肽序列：KFSEFWDLDPEVRPTS(60aa-75aa)；

②根据表达的载脂蛋白C-III抗原蛋白合成多肽SEQ ID NO：1，并与载体蛋白偶联；

③将偶联后的多肽免疫小鼠，ELISA检测血清抗体效价；

④选取抗体效价最高的小鼠脾脏B淋巴细胞悬液与BALB/c小鼠来源的SP2/0骨髓瘤细胞融合；

⑤选择性培养杂交瘤细胞，ELISA检测杂交瘤效价，筛选阳性细胞株，获得所述的杂交瘤细胞株。