CN105086998B

CN105086998B - 一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN105086998B
Application number: CN201510565576.7A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 任明光; 邓贝贝; 周凯; 王建勇; 刘展榕
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: CN105086998A

Abstract

本发明公开了一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。该荧光探针分子式为：C₃₇H₃₅N₅O₅S，具有示（Ⅰ）所示结构：。该探针的合成包括四个步骤，且后处理过程相对简单；实现了次氯酸分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。此探针可以应用于检测生物体系中细胞内溶酶体中的次氯酸的检测，作为细胞内溶酶体内次氯酸检测探针。本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种快速检测细胞中溶酶体靶内次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

活性氧（ROS）是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧自由基（羟基自由基和超氧阴离子自由基等）和非自由基（次氯酸和次氯酸等）的总称。生物体内在氧化应激、炎症等生理和病理情况下通过酶促和非酶促反应产生各种ROS。近代的生物医学研究表明，体内产生的ROS与一些疾病的发生、发展和机体的老化有着密切的关系。次氯酸，化学式为HClO，是一种不稳定的弱酸，在纯净的水中通入氯气即可形成次氯酸。在水溶液中次氯酸可部分电离生成次氯酸根和氧离子，日常生活中次氯酸(一般是其钠盐)被广泛用作漂白剂、除臭剂和消毒剂。在生物细胞(如嗜中性白细胞)中，次氯酸由次氯酸和氯离子在髓过氧化物酶(MPO)的催化作用下产生。作为一种重要的活性氧物种，次氯酸在维持细胞内的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病，检测生物体系中次氯酸的浓度已成为一个重要的课题。

然而目前对次氯酸的检测缺少靶向性，不能对细胞内某一特定的细胞器内的次氯酸进行检测，特别缺少对细胞内溶酶体靶向的次氯酸探针，从而缺少研究细胞病变过程中对溶酶体中次氯酸浓度变化情况的检测工具。

发明内容

针对目前次氯酸分子荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有响应时间快以及溶酶体靶向性的次氯酸荧光探针。

本发明还提供了上述溶酶体靶向性的次氯酸荧光探针的制备方法和其在水环境和生物细胞体系中的应用。

本发明采用以下技术方案：

一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针，其特征在于，该探针分子式为：C₃₇H₃₅N₅O₅S，结构式如下：

。

上述荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）将1.0mg的 4-二乙氨基酮酸与776mg的4-苯并噻唑-1,3-间苯二酚溶于5ml甲基磺酸中，氮气保护，90℃加热回流，反应24 h；用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，将反应液缓慢倒入50ml冰水中，用甲醇/二氯甲烷=1:10萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品用硅胶柱进行洗脱分离，可得到化合物Lyso-1，Lyso-1结构式如下：

；

2）将300mg化合物Lyso-1溶于10ml无水乙醇中，加入2ml水合肼，氮气保护，100℃加热回流，反应30 min，用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，旋干，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-2，结构式如下：

；

3）将150mg化合物Lyso-2溶于5ml氯仿中，在0℃加入15 µL三乙胺和64mg氯乙酰氯，逐渐升至室温，在室温下搅拌24 h，用TCL板检测反应，反应完全后，加入1mL水淬灭反应，用50 mL乙酸乙酯稀释反应，用水20 mL*2洗涤后用20 mL*1的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-3，结构式如下：

；

4）将100mg化合物Lyso-3溶于5ml DMF后，加入34mg碳酸钾和41mg碘化钾，室温下搅拌30min，然后逐滴加入43mg吗啉，在室温下搅拌过夜，用TCL板检测反应，反应完全后，加入1mL水淬灭反应，用50 mL二氯甲烷稀释反应，用水20 mL*2洗涤后用20 mL*1的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到目标探针化合物，简记为Lyso-ClO。

上述次氯酸荧光探针的合成路线如下：

所述步骤1）中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。

所述步骤2）中硅胶柱洗脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚=1:1。

所述步骤3）中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。

所述步骤4）中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。

本发明还提供了上述荧光探针的应用，其特征在于，该探针用于水环境中和生物细胞体系中次氯酸的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。

该荧光探针用于检测生物体系中细胞内溶酶体中的次氯酸的检测，与商业化溶酶体绿进行共定位实验，其共定位系数为0.98，因而此探针可以作为细胞内溶酶体内次氯酸检测探针。

本发明的优点是：（1）探针的合成比较容易，且后处理过程相对简单；（2）本发明实现了次氯酸分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。(3) 此探针可以应用于检测生物体系中细胞内溶酶体中的次氯酸的检测，通过与商业化溶酶体染料进行比较，发现此荧光探针对溶酶体内次氯酸成像的重合率高，两种染料的共定位系数为0.98，说明此探针可以作为细胞内溶酶体内次氯酸检测探针。基于此探针的特异性且显著的颜色变化，其试剂也可作为显示水溶液中次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中探针Lyso-ClO的¹H NMR图谱；

图2是探针Lyso-ClO随次氯酸的加入荧光谱图的变化情况；

图3是探针Lyso-ClO对不同离子和分子的选择性荧光谱图；

图4是探针Lyso-ClO对不同离子和分子的选择性柱状图数据，其中1、空白; 2、Co² ⁺; 3、Cu²⁺; 4、Ni²⁺; 5. Br^-; 6. I-,; 7. NO₂ ^-; 8. NO₃ ^2-; 9. OH^-; 10、S^2-; 11、Cys; 12、GHS; 13、Hcy; 14、过氧叔丁醇; 15、过氧叔丁醚; 16、 H₂O₂; 17、 NO; 18、HClO；

图5是探针Lyso-ClO溶液在次氯酸加入前后溶液颜色的变化图；

图6是探针Lyso-ClO溶液在次氯酸加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化图；

图7是探针Lyso-ClO次氯酸荧光探针检测外源性次氯酸荧光成像图，其中a）只有探针离子Lyso-ClO （5μM）荧光成像明场图；b) 只有探针离子Lyso-ClO （5μM）蓝通道成像图；c) 只有探针离子Lyso-ClO 红通道成像图，d)明场与荧光成像图重叠图；e）探针浓度为5μM加入到SiHa细胞中培养30min后加入20μM次氯酸3 min 后明场图，f）对加入次氯酸后蓝通道荧光成像图；g）对加入次氯酸后红通道荧光成像图；h)明场e与荧光成像h，g图重叠图片；

图8是探针Lyso-ClO次氯酸荧光探针检测外源性次氯酸荧光成像图与商业化染料溶酶体红的共定位成像图，其中a) 探针浓度为5μM与溶酶绿红加入到A549细胞中培养30min后明场图， b)商业染料溶酶体绿荧光成像图 c)加入次氯酸后探针分子红荧光成像图， d) 绿通道与红通道叠加图，e) 绿通道与红通道叠加箭头部分荧光强度比较，f) 绿通道与红通道叠加强度散点图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

目标探针化合物Lyso-ClO的制备

（1）化合物Lyso-1的合成

4-二乙氨基酮酸（1.0 g，3.19 mmol, 1 eq）与4-苯并噻唑-1,3-间苯二酚（776mg，3.19 mmol, 2 eq）溶于5 mL甲基磺酸溶液中，氮气保护，90℃加热，反应24 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，将反应液缓慢倒入50 mL冰水中，用甲醇/二氯甲烷=1:10萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:30，产率为64%。合成路线如下：

（2）化合物Lyso-2的合成

化合物Lyso-1（300 mg，0.574 mmol, 1eq）溶于10mL无水乙醇中，加入2mL水合肼，氮气保护，100℃加热回流，反应30 min，用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，旋干，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:1，产率为85%。合成路线如下：

（3）化合物Lyso-3的合成

化合物Lyso-2（150 mg，0.41 mmol, 1 eq）溶于5 mL三氯甲烷中，在0℃ 下加入三乙胺15 µL和氯乙酰氯（64 mg，0.62 mmol，1.5 eq），逐渐升至室温，在室温下搅拌24 h，TLC检测反应完全，加入1mL水淬灭反应，用50 mL乙酸乙酯稀释反应，用水20 mL*2洗涤后用20mL*1的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:30，得化合物Lyso-3，产率为72%。合成路线如下：

（4）化合物Lyso-ClO的合成

化合物Lyso-3（100 mg，0.164 mmol, 1 eq）溶于5 mL DMF中, 在室温下加入K₂CO₃（34 mg，0.245mmol， 1.5eq）和KI （41 mg，0.245mmol， 1.5eq）在室温下搅拌30min 后加入吗啉（ 43 mg，0.49 mmol， 3eq）在室温下搅拌过夜。 TLC检测反应完全，加入1mL水淬灭反应，用50 mL二氯甲烷稀释反应，用水20 mL*2洗涤后用20 mL*1的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:30，得化合物Lyso-ClO，产率67%。合成路线如下：

实施例2

化合物Lyso-ClO次氯酸荧光探针随次氯酸加入当量的增加荧光谱图的变化

取实施例1制备的Lyso-ClO次氯酸荧光探针溶于二甲亚砜（DMSO）中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出30μL 加入到5mL 的离心管当中，加入不同当量（0-30 eq）的次氯酸标准溶液，用PBS缓冲溶液（0.1mol/L，pH=7.5）与DMSO体积比为1:1的溶液稀释至3 mL，以365nm为激发光，测量其荧光性质。荧光光谱如图2 所示。由图2可见，随着次氯酸加入当量的增加在450 nm处的荧光逐渐减弱而在585nm处的荧光逐渐增强。

实施例3

化合物Lyso-ClO次氯酸荧光探针对不同分子或离子的选择性

从实施例2 中荧光探针储备液中取出30μL 加入到5mL 的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的次氯酸标准溶液，30min 后以PBS:DMF (1:1)为溶剂， 365nm为激发光，检测溶液的荧光发射光谱变化，结果如图3所示。同时还研究了其他金属离子对本发明探针荧光强度的影响，在以PBS:DMF (1:1)为溶剂，410 nm 为激发光，结果如图4所示。由图3和图4综合看可以发现，其他金属离子对化合物Lyso-ClO在585nm处的荧光几乎没有影响，而次氯酸溶液的加入使化合物Lyso-ClO在585nm处的荧光显著增强。

实施例4

化合物Lyso-ClO荧光探针对次氯酸的可视化检测

从实施例2 中荧光探针储备液中取出30μL 加入到5mL 的样品管当中，加入80摩尔量的次氯酸标准溶液，次氯酸可以使合物Lyso-ClO荧光探针的PBS：DMSO体积比为1:1的缓冲溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成红色，如图5所示。伴随着紫外灯下肉眼可视化的次氯酸诱导的荧光探针由浅蓝光转变成明亮的红色荧光（图6），说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。

实施例5

化合物Lyso-ClO次氯酸荧光探针对细胞外源性次氯酸荧光成像

我们将本发明探针应用于SiHa细胞中对外源性的次氯酸进行荧光成像。具体操作步骤如下：将5μM Lyso-ClO次氯酸探针DMSO溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30 min后用共聚焦显微镜进行成像。成像结果如图7所示。首先进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓。然后用蓝光进行激发观察在未加入次氯酸前的荧光成像情况，此时观察不到荧光发射。向体系中加入20μM的次氯酸水溶液后，等待5min后在用蓝光进行激发可以观察到有绿光发出，说明此荧光探针可以对外源性的次氯酸进行荧光成像。

实施例6

化合物Lyso-ClO次氯酸荧光探针对细胞外源性次氯酸荧光成像与商业溶酶体染料共定位比较

我们将本发明探针应用于A549细胞中与商业化的溶酶体染料进行共定位实验，说明本探针可以定位到溶酶体中，并对溶酶体内的外源性的次氯酸进行荧光成像应用（图8）。具体操作步骤如下：将5μM Lyso-ClO次氯酸探针DMSO溶液和商业化溶酶体染料-溶酶体红5μM加入到育有A549细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30 min后，向体系中加入20μM的次氯酸水溶液后，再等待10 min后用共聚焦显微镜进行成像，此时用（Ex=405 nm）进行激发可以观察到有蓝光发出，此为Lyso-ClO次氯酸探针与次氯酸响应后发射的光，用光（Ex =561 nm）进行激发可以观察到有红光发出，此为商业化染料溶酶体红发出的红光，用软件进行处理可以得出两种染料的共定位系数为0.98。

Claims

1.一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针，其特征在于，该探针分子式为：C₃₇H₃₅N₅O₅S，结构式如下：

2.一种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1)将1.0mg的4-二乙氨基酮酸与776mg的4-苯并噻唑-1,3-间苯二酚溶于5ml甲基磺酸中，氮气保护，90℃加热回流，反应24h；用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，将反应液缓慢倒入50ml冰水中，用甲醇/二氯甲烷＝1:10萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品用硅胶柱进行洗脱分离，可得到化合物Lyso-1，Lyso-1结构式如下：

2)将300mg化合物Lyso-1溶于10ml无水乙醇中，加入2ml水合肼，氮气保护，100℃加热回流，反应30min，用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，旋干，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-2，结构式如下：

3)将150mg化合物Lyso-2溶于5ml氯仿中，在0℃加入15μL三乙胺和64mg氯乙酰氯，逐渐升至室温，在室温下搅拌24h，用TCL板检测反应，反应完全后，加入1mL水淬灭反应，用50mL乙酸乙酯稀释反应，用水20mL*2洗涤后用20mL*1的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-3，结构式如下：

4)将100mg化合物Lyso-3溶于5ml DMF后，加入34mg碳酸钾和41mg碘化钾，室温下搅拌30min，然后逐滴加入43mg吗啉，在室温下搅拌过夜，用TCL板检测反应，反应完全后，加入1mL水淬灭反应，用50mL二氯甲烷稀释反应，用水20mL*2洗涤后用20mL*1的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到目标探针化合物。

3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:30。

4.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中硅胶柱洗脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚＝1:1。

5.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:30。

6.根据权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:30。

7.一种权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于，该探针用于水环境中和生物细胞体系中次氯酸的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。