CN106795201A - 用于制备amg416的方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于制备AMG416或其药学上可接受的盐的方法。AMG 416为合成的钙敏感受体的八氨基酸选择性肽拮抗剂。其开发作为患有慢性肾疾病‑矿物质和骨病症(CKD‑MBD)的血液透析患者中继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)的静脉内治疗。

Description

用于制备AMG416的方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年4月3日提交的美国临时申请号61/974,899的权益，所述申请的内容通过引用以其整体结合到本文中。
对序列表的引用
序列表经由EFS以文本文件形式电子提交，该文本创建于2015年4月3日，并且命名为“0419250488seqlist.txt”(2531字节)，所述序列表的内容通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本公开内容涉及多肽合成领域，更具体地涉及AMG416或其药学上可接受的盐的合成。
发明背景
AMG 416为合成的钙敏感受体的八氨基酸选择性肽拮抗剂。其开发作为患有慢性肾疾病-矿物质和骨病症(CKD-MBD)的血液透析患者中继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)的静脉内治疗。
AMG 416的盐酸盐具有化学结构：
主链具有7个氨基酸，均为D-构型。侧链半胱氨酸残基为l-构型。AMG 416 (游离碱)的分子式为C38H73N21O10S2，并且具有1048.3 Da的计算平均分子量。
国际专利出版号WO 2011/014707中描述了AMG 416和用于其制备的方法，所述专利出版通过引用结合到本文中用于任何目的。如国际专利出版号WO 2011/014707中所描述的，AMG 416可通过固相合成从相应的Fmoc-保护的D-氨基酸装配。从树脂切割后，物料可用Boc-l-Cys(NPyS)-OH处理以形成二硫键。Boc基团可然后用三氟乙酸(TFA)去除，所得产物通过反相高压液相色谱（HPLC）纯化并作为TFA盐形式通过冻干法分离。TFA盐可通过进行后续的盐交换程序转换为药学上可接受的盐。这样的程序为本领域所熟知并且包括，例如，离子交换技术，任选随后纯化所得产物(例如通过反相液相色谱或反渗透)。
存在对生产AMG 416或其药学上可接受的盐(例如，AMG 416 HCl)的有效方法，特别地适于商业规模制造的方法的需求。
发明概述
鉴于上述问题，除了别的之外，本公开内容的一个目标为提供用于制备AMG 416，或其药学上可接受的盐的方法。
在第一个方面，提供用于制备AMG 416的方法，所述方法包括：提供具有选自Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[树脂](SEQ ID NO:2)和Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[树脂] (SEQ ID NO:3)的结构的树脂-结合的肽；从固体载体切割肽；和活化切割的肽的D-Cys残基的侧链。
在第一个方面有关的一个或多个实施方案中，切割和活化步骤在同一容器中发生。
在一个或多个进一步的实施方案中，树脂-结合的肽与包含水、三氟乙酸、三异丙基硅烷和二吡啶二硫化物的溶液接触。
在第二个方面，提供用于制备AMG 416的方法，所述方法包括：提供具有Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 (SEQ ID NO:4)结构的肽；和使肽与l-Cys接触以产生缀合产物。
在第二个方面有关的一些实施方案中，肽与包含l-Cys和三氟乙酸的水溶液接触。
在第二个方面有关的一些进一步的实施方案中，所述方法进一步包括冻干缀合产物。
在又一些进一步的实施方案中，第二个方面的方法进一步包括使缀合产物与包含异丙醇(IPA)和盐酸(HCl)的水溶液接触，从而产生包含AMG416 HCl的沉淀。
在第二个方面有关的又一个或多个进一步的实施方案中，所述方法进一步包括通过高效液相色谱(HPLC)纯化沉淀。
在又第三个方面提供用于制备AMG 416的方法，所述方法包括：提供具有选自Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[树脂] (SEQ ID NO:2)和Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[树脂] (SEQ ID NO:3)的结构的树脂-结合的肽；从固体载体切割肽，即，以提供无支持的肽，和活化无支持的肽的D-Cys残基的侧链以产生AMG 416 SPy中间体(其中SPy为2-吡啶亚磺酰基或S-Pyr)，在水性0.1% TFA (三氟乙酸溶液)中溶解AMG 416 SPy中间体，和通过HPLC纯化AMG 416 SPy衍生物。
在第三个方面有关的一些实施方案中，所述方法进一步包括AMG 416 SPy 中间体的共沸蒸馏，从而引起溶剂交换以产生AMG 416 SPy在新溶剂，例如，水和异丙醇中的溶液。
在第三个方面有关的又一些额外的实施方案中，所述方法进一步包括使AMG 416SPy的异丙醇-水溶液，在一些实施方案中以其三氟乙酸盐的形式，与包含l-Cys的水溶液接触。
在第四个方面，提供用于制备H-D-Arg(Pbf)-OH，即用于本文所提供的某些合成方法的合适的起始材料的方法。
在第四个方面有关的一些实施方案中，所述方法包括在NaI (碘化钠)存在下将Boc-D-Arg-OH转化为Boc-D-Arg(Pbf)-OH。在又一些进一步的实施方案中，碘化钠以约5%mol的浓度存在。
在第四个方面有关的一些额外的实施方案中，所述方法进一步包括将Boc-D-Arg(Pbf)-OH转化为D-Arg(Pbf)-OH，并在IPA/水溶剂***中结晶D-Arg(Pbf)-OH。
本文所述方法的额外的实施方案将从下列说明书、实施例和权利要求显而易见。如可从前面和后面的描述理解的，本文所描述的每一个特征，和两个或更多个这种特征的每一个组合，包括在本公开内容的范围内，只要这种组合中包含的特征不互相矛盾。另外，可从本发明的任何实施方案特定排除任何特征或特征的组合。
附图简述
图1显示AMG 416 (Ac-D-Cys(l-Cys-OH)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2) (SEQ ID NO:1)的化学结构。
图2显示Rink Amide AM树脂和Ac-D-Cys(Trt)- D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-树脂(SEQ ID NO:3)的化学结构。
图3显示其中SPy中间体产物(Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2)(SEQ ID NO:4)从肽基-树脂(Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH-树脂) (SEQ ID NO:3)形成的反应图示。
图4显示其中AMG 416的TFA盐从SPy中间体(AA1-7(SPy))形成的反应图示。
图5显示其中AMG 416的HCl盐从AMG 416的TFA盐形成的反应图示。
图6显示其中Boc-D-Arg(Pbf)-OH从Boc-D-Arg-OH形成的反应图示。
图7显示其中D-Arg(Pbf)-OH从Boc-D-Arg(Pbf)-OH形成的反应图示。
发明详述
本公开内容现在将在后文中更全面地描述。然而，该公开内容可以以许多不同的形式体现并且不应解释为限制于本文所阐述的实施方案；而是，提供这些实施方案以使本公开内容会彻底和全面，并且会将其范围完全传达给本领域技术人员。
本文所引用的全部出版物、专利和专利申请，无论上文或下文，通过引用以其整体结合到本文中，除非另有说明。在其中相同术语在通过引用结合在本文中的出版物、专利或专利申请和本公开内容中均限定的情况下，本公开内容中的定义代表控制定义。对于因其对具体类型的化合物、肽、化学品等的描述而引用的出版物、专利和专利申请，关于这样的化合物、化学品等的部分为通过引用结合到本文中的文件的那些部分。
本文所使用的部分标题仅为了组织目的，并且不应解释为限制所描述的主题。
除非本文中另有定义，关于本申请使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。此外，除非上下文另有需要，单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。
一般而言，关于本文所描述的分子生物学和蛋白质化学使用的命名法，及技术，为本领域所熟知和通常使用的那些。本申请的方法和技术一般按照本领域所熟知的常规方法并且如本说明书各处所引用和讨论的各个一般或更具体的参考中所描述的进行，除非另有说明。参见，例如，Laszlo, Peptide-Based Drug Design: Methods and Protocols (基于 肽的药物设计：方法和方案), Humana Press (2008); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis (肽合成化学), CRC Press (2005); Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学当前方案), Greene Publishing Associates (1992)，其通过引用结合到本文中用于所有目的。纯化技术按照制造商的说明进行，如本领域所通常完成的或如本文所描述的。关于分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学使用的术语，及实验室程序和技术为本领域所熟知和通常使用的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送和患者治疗可使用标准技术。
应理解本公开内容不限于本文所描述的具体方法学、方案和试剂等，并且这些可以变化。本文所使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，并且不意在限制所公开的范围，其通过权利要求单独定义。
术语“约”，特别是参照给定的量时，意指包含加或减5%的偏差。
I一般定义
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个或一个以上(即，至少一个)冠词的语法对象，除非另有特别说明。例如，“一种元素”意指一种元素或一种以上元素。
术语“AMG 416”，也称为etelcalcetide，以前称为velcalcetide或KAI-4169，指具有化学名称：N-乙酰-D-半胱氨酰-D-丙氨酰-D-精氨酰-D-精氨酰-D-精氨酰-D-丙氨酰-D-精氨酰胺与L-半胱氨酸的二硫化物的化合物，其具有下列结构式：
对AMG 416，或如本文所描述的任何化合物或AMG 416片段、中间体或前体的提及意在包括其中性不带电的形式，以及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物。
术语“AMG 416盐酸化物”和“AMG 416 HCl”可互换，并且指具有下列结构式的AMG416的盐酸盐形式：
一般地，x具有值3-5 (例如，3、4或5)。
“药学上可接受的盐”指具有至少一个适合盐形成的基团的化合物的盐形式，其不引显著的对患者的不利毒理效应。在一个方面，术语“药学上可接受的盐”可指如本文所提供的具有一个或多个可电离胺基的化合物，例如，AMG416，以及AMG416片段、中间体、前体等的相对无毒的有机或无机酸加成盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见，例如，Berge等人(1977) "Pharmaceutical Salts (药用盐)", J. Pharm. Sci. 66:1-19)。额外的合适的药学上可接受的盐形式可存在于，例如，Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties, Selection and Use (药用盐手册：性质、选择和使用), Weinheim/Zürich:Wiley-VCH/VHCA, 2002; P. H. Stahl和C. G. Wermuth, Eds中。
如本文所使用的，术语“氨基酸”和“残基”可互换，并且当在肽或多肽的语境中使用时，指天然存在和合成的氨基酸二者，以及氨基酸类似物、氨基酸模拟物和非天然存在的与天然存在的氨基酸化学上相似的氨基酸。“游离氨基酸”或“游离氨基”指具有–NH2形式，即，未保护的氨基的氨基酸、肽片段或肽。
如本文所使用的短语“保护基团”或“PG”指保护潜在反应性功能基团免于不期需的化学转化的一个或多个临时取代基。这样的保护基团的实例包括羧酸酯类、醇的甲硅烷基醚类以及醛和酮各自的缩醛类和缩酮类等。参见，例如，Greene, T.W.; Wuts, P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis (有机合成中的保护基团), 第四版; Wiley:New York, 2007; Isidro-Llobet, A., 等人, Amino Acid-Protecting Groups (氨基酸保护基团), Chem. Rev 2009, 109, 2455-2504。如本文所描述的反应性氨基酸或肽片段常常适当地在非主题化学转化靶的官能度上包含一个或多个保护基团。示例性的保护基团包括，例如，羧基苄基，也称为苄氧羰基(“Cbz”或“Z”)，9-芴甲氧羰基(Fmoc)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、叔丁氧羰基(Boc)、三苯甲基(Trt)、甲酯(OMe)、2-吡啶亚磺酰基(SPy或S-Pyr)、酰胺等。在本文所提供的缩写结构中，C端的NH2表示酰胺保护基团(~C(O)NH2)，N端的“H”指游离氨基，保护基团在括号中的标示表示保护基团在鸟氨酸的δ氮上。
如本文所使用的，术语“保护消除剂”或“脱保护剂”可互换使用，为用于去除氨基酸上连接的氨基保护剂的化学试剂，氨基保护剂可为本领域所熟知的，例如，但不限于Fmoc和Boc。
如本文所使用的，术语“偶联剂”、“缩合剂”、“活化剂”、“缩合活化剂”在本文中可互换使用，指促进来自一个氨基酸的氨基与来自另一个氨基酸的羧基反应以形成肽键的化学试剂。示例性的偶联剂为本领域所熟知，包括但不限于碳化二亚胺类例如N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-***[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)、[苯丙***-1-基氧(二甲氨基)亚甲基]-二甲基氨、四氟硼酸酯(TBTU)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并***-1-基)脲六氟磷酸酯、O-(苯并***-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。参见，例如，El-Faham, A.和Albericio, F., “Peptide Coupling Reagents, More than aLetter Soup”, Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602。这样的化合物可容易地从商业供应商获得。
如本文所使用的，术语“切割剂”指可从树脂分离结合到树脂的肽的化学剂。切割剂为本领域普通技术人员所熟知，包括包含TFA的酸溶液和HCl溶液。
术语“治疗”指成功治疗或改善损伤、病理或病况的任何迹象，包括任何客观或主观参数例如减轻、缓和、减少体征或症状或使损伤、病理或病况对患者而言更能忍受，减慢退化或衰退速率，使退化终点不那么虚弱，改善患者的身体或心理健康。体征或症状的治疗或改善可基于客观或主观参数，包括体格检查的结果。例如，本文所呈现的某些方法通过降低血清完整甲状旁腺激素(iPTH)成功治疗患有CKD-MBD的血液透析患者中的SHPT。
“有效量”一般而言为足以减少症状严重性和/或频率，消除症状和/或潜在原因，阻止症状和/或其潜在原因发生，和/或改善或补救疾病状态(例如，提高的PTH水平)引起的或与之相关的损伤的量。“治疗有效量”为足以医治疾病状态或症状，特别地与该疾病状态相关的状态或症状，或另外阻止、妨碍、延迟或逆转该疾病状态或以无论任何方式与该疾病相关的任何其它不期需症状的进展的量。完全的疗效不一定通过给予一剂发生，其可能仅在给予一系列剂量后发生。因此，治疗有效量可以在一次或多次给予中给予。
如本文所使用的，术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”意指在研究者、医师或其它临床医生所探查的组织***、动物或人中引发生物学或医疗响应的量，包括减轻或改善所治疗的疾病或病症的体征或症状，即，支持可见水平的一个或多个期需生物学或医疗响应，例如降低iPTH的velcalcetide的量。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换，指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，与适用于天然存在的氨基酸聚合物同样。该术语可还包括已经修饰或磷酸化的氨基酸聚合物，所述修饰例如，通过添加碳水化合物残基以形成糖蛋白。肽、多肽和蛋白质可通过液相合成或固相合成或通过经基因工程改造的或重组细胞产生，并且包括具有氨基酸序列的分子。
肽或多肽的“变体”包括其中与另一个多肽序列相关的氨基酸序列中***、缺失和/或置换一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。
肽或多肽的“衍生物”为以与***、缺失或置换变体不同的一些方式，例如，经由缀合到另一个化学部分化学修饰的肽或多肽。这样的修饰可包括一个基团共价加成到肽或多肽的氨基和/或羧基端，例如，肽或多肽的氨基端的乙酰化和/或羧基端的酰胺化。
术语“氨基酸”包括其在本领域中的正常含义。二十种天然存在的氨基酸及其缩写遵循常规使用。参见，Immunology-A Synthesis (免疫学-A合成), 第二版, (E. S. Golub和D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991)，其通过引用结合到本文中用于任何目的。19种常规氨基酸(除了甘氨酸)的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如[α]-, [α]-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸和其它非常规氨基酸也可为多肽的适当组分，并且包含在短语“氨基酸”中。非常规氨基酸的实例包括：高半胱氨酸、鸟氨酸、4-羟脯氨酸、[γ]-羧基谷氨酸、[ε]-N,N,N-三甲基赖氨酸、[ε]-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、[Σ]-N-甲基精氨酸和其它相似的氨基酸和亚氨酸类(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所使用的多肽标记法中，左手方向为氨基端方向，右手方向为羧基端方向，与标准使用和惯例一致。
如本文所使用的“受试者”或“患者”可为任何哺乳动物。在典型的实施方案中，受试者或患者为人。
术语“q.s.”意指加入足以达到期需功能，例如，使溶液达到期需体积(即，100%)的量。
II.实施方案
在一个或多个实施方案中，AMG 416盐酸盐经由如下的一系列过程阶段而制备：示例性阶段包括AMG 416的七成员线性片段的固相肽合成(阶段I)，接着从树脂切割肽链并伴随侧链脱保护和半胱氨酸活化(阶段II)，接着进行肽链与l-Cys的原位缀合(二硫键形成)以提供粗制AMG 416 (阶段III)，接着，在一些实施方案中，立即通过制备型HPLC和冻干法提供纯化的AMG 416 TFA盐(阶段IV)。在阶段IV后通过沉淀进行盐交换(TFA至HCl)，并且在一些实施方案中，接着进行微过滤和冻干以提供纯化的AMG 416盐酸盐(阶段V)。
固相肽合成
AMG 416的七成员线性片段可通过本领域已知的任何方法合成，包括固相肽合成(SPPS)。如本文所使用的，术语“固相合成”或“固相肽合成”指本领域普通技术人员所熟知的其中生长的肽链连接到固体载体的方法。固相合成通常包括步骤：(i) 将第一个氨基酸(其氨基被封闭或“保护”)共价结合到固相载体；(ii) 使用脱保护剂从氨基去除保护基团；(iii) 活化第二个氨基酸(其氨基被封闭)的羧基并使第二个氨基酸与结合到固相载体的第一个氨基酸接触以致获得二肽(其氨基被封闭)；(iv) 重复肽键形成步骤，因此肽链从C端向N端延伸；和(v) 去除氨基的保护基团并用切割剂从固相载体分离肽链以产生肽。
适合的固相合成技术为本领域所熟知，并且包括Merrifield, in Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis和Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963); Davis等人, Biochem. Intl. 10:394-414 (1985);Stewart和Young, Solid Phase Peptide Synthesis(1969); 美国专利号3,941,763;Finn等人, The Proteins, 第三版,第二卷, pp. 105-253 (1976);和Erickson等人, The Proteins, 第三版,第二卷, pp. 257-527 (1976)中所描述的那些。还参见Houben-Weyl,Methods of Organic Chemistry (有机化学方法).第四版的附加补充卷, Vol E22A, “Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (肽和肽模拟物的合成)”,总编辑M.Goodman. Georg Thieme Verlag: Stuttgard and New York. 2002, pp. 685-877;Chan, W.C., White, P.D., “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach (Fmoc固相肽合成，一种实用方法)”. Oxford University Press, (200), p.9-109。固相合成通常为制造个体肽例如AMG 416的优选技术，因为其通常为制造小肽的最划算的方法之一。
在一些实施方案中，AMG 416的主链线性片段使用采用Fmoc-保护策略和例如，Rink amide (RAM)树脂(例如从Sigma Aldrich可得的)的标准固相肽合成方案装配，以提供C端树脂结合的酰胺，连同肽N端乙酰化。在一些其它的实施方案中，可使用其它树脂和接头(例如，Ramage amide AM树脂，也称为三环酰胺接头树脂)。在一个实施方案中，主链线性片段的装配包括步骤：(i) 混合Fmoc-Rink amide AM树脂与脱保护剂以获得Rink amideAM树脂；(ii) 缩合Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH与Rink amide AM树脂以获得Fmoc-D-Arg(Pbf)-Rink amide AM树脂；(iii) 对于AMG 416的主链线性片段的每一剩余氨基酸残基，重复步骤(i)中的Fmoc脱保护和步骤(ii)中的氨基酸与树脂上的多肽之间的缩合，从C端向N端进行(例如，使用Fmoc- D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH)以形成SEQID NO:2所表示的多肽树脂；和(iv) 重复步骤(i)中的Fmoc脱保护和乙酰化N端以形成SEQID NO:3所表示的多肽树脂。参见图2。
通常，Fmoc保护基团的切割使用脱保护剂例如DMF中的哌啶达成。在一个实施方案中，Fmoc-保护的氨基酸的偶联在溶剂例如二甲基甲酰胺(DMF)中使用合适的偶联剂例如碳化二亚胺偶联剂、N,N-二异丙基碳化二亚胺(DIC)，任选在除半胱氨酸外的所有氨基酸的添加剂例如乙基2-氰基-2-(肟基)乙酸酯(Oxyma)的存在下进行。在肽链用半胱氨酸延伸的情况下，偶联通常使用N,N-二异丙基碳化二亚胺(DIC)在苯并***添加剂例如羟基苯并***(HOBT)存在下在溶剂***例如二甲基甲酰胺-二氯甲烷(即，DMF、DCM、HOBt、DIC)中进行。
N端的乙酰化可通过本领域已知的任何方法实现。在一个实施方案中，N端的乙酰化使用，例如，(Ac2O)在吡啶和DMF中的乙酸酐进行。
从树脂切割
可通过本领域已知的任何手段从载体分离肽和从侧链去除保护基团。参见，例如，Synthetic Peptides: A User’s Guide (合成肽：用户指南) (G.A. Grant, ed.), W.H.Freeman and Company, New York, 1992; 和Chan, W.C., White, P.D. “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach (Fmoc固相肽合成，一种实用方法)”,Oxford University Press (2000), p. 64-66和105-109。
在一个实施方案中，将肽基-树脂加入包含水(例如，去离子水(DIW))、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIPS)和二吡啶二硫化物(DPDS)的混合溶液（cocktial solution）中。这使肽从树脂分离，并伴随侧链脱保护和半胱氨酸活化，因此为与l-Cys原位缀合做准备。产生七-氨基酸SPy中间体产物(AA1-7(SPy))。参见图3。SPy中间体产物的序列在SEQ IDNO:4中提供。
原位缀合和制备型HPLC
SPy中间体产物可通过本领域已知的任何方法与l-Cys缀合。在一个实施方案中，l-Cys的缀合在水性TFA中进行。
产生的AMG 416 (TFA盐)可通过本领域已知的任何方法纯化。在一个实施方案中，AMG 416 (TFA盐)通过高压液相色谱(HPLC)纯化。例如，在一个实施方案中，AMG 416 (TFA盐)的纯化和浓缩包括反相HPLC纯化步骤和反相HPLC浓缩步骤。参见图4。
可将纯化和浓缩的包含AMG 416 (TFA盐)的样品冻干。
盐转换
TFA盐可通过本领域已知的任何方法转换为药学上可接受的盐，例如盐酸盐。
在一个实施方案中，将冻干的AMG 416的TFA盐溶解在异丙醇(IPA)的水溶液中。然后将TFA盐溶液加入HCl溶液中用于盐交换和沉淀HCl盐。沉淀然后可用水复溶，过滤通过微滤器(例如，0.2 µm滤器)和冻干以分离AMG 416的HCl盐。参见图5。
SPy中间体的纯化
在一个备选的实施方案中，在与L-Cys缀合前纯化SPy中间体产物。一般而言，认为SPy中间体产物，特别是肽-SPy中间体，高度不稳定，即，认为其不足够稳定以承受有效纯化，所述纯化例如通过HPLC。然而，在达成本文所提供的方法中，申请人意外发现根据本文所述方法制备的肽-SPy中间体确实足够稳定以承受单独的（separate）纯化步骤。此外，进一步发现在与L-Cys缀合前纯化该中间体事实上可增加最终的肽药物产物的制造效率和减少最终的肽药物产物的制造费用。
在一个示例性实施方案中，备选方法如下进行。下文和在实施例5中描述的方法可用于如本文所提供的SPy中间体的纯化，其中中间体保持稳定并适于，例如，经由二硫键形成缀合到包含巯基的部分。例如，将肽-SPy中间体溶解在包含不超过约0.2%TFA，例如约0.05% - 0.15% TFA或约0.1% TFA的水溶液中，然后直接施加到HPLC柱用于色谱纯化。包含肽-SPy中间体的HPLC级分的溶剂交换可然后，例如，通过共沸蒸馏进行。肽-SPy中间体溶剂交换为适当溶剂例如水-异丙醇混合物后，向肽-SPy中间体溶液直接加入包含巯基的部分，例如l-Cys以引起缀合。所得缀合产物，例如，在溶液中，然后可用于盐交换。
前述纯化方法的一个具体实施方案如下。最初从树脂载体切割肽和分离AA1-7(SPy)中间体产物后，将中间体溶解在0.1%TFA和乙腈中，装载到固定相HPLC柱上并如上述纯化。当与使用，例如，0.2%TFA溶液相比时，使用0.1%TFA溶液对于HPLC纯化具有多个优点。例如，纯化过程期间0.1%TFA比更高浓度TFA溶液更少损伤固定相。也就是说，通过使用这一最佳化的TFA浓度，存在较少的固定相分解，从而导致更长的固定相寿命。此外，肽-SPy中间体(例如，AA1-7(SPy))产物极性较小，导致中间体更好地保留在反相固定相上。因此，在每一纯化运行中可达到固定相上更高的负载。在一些实施方案中，增加的负载能力使制造过程的通量增加1.5-2倍，或约1.5倍。
包含作为TFA盐的SPy中间体产物的HPLC级分然后在足够的IPA加料的情况下进行共沸蒸馏以将溶剂从乙腈和水改变至适合L-Cys缀合和盐交换的15%水/IPA溶液。该方法特别有利，因为缀合和盐交换可在单个容器中进行，进一步提高制造过程的效率和可行性。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH起始材料的制造
AMG 416包含7氨基酸线性序列，其中4个为D-精氨酸。本文公开了用于合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH，AMG 416合成中使用的D-精氨酸的Fmoc衍生物的方法。高品质Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH起始材料的使用可为阶段I至阶段III的粗制AMG 416提供额外的纯度，从而增加阶段IV中的纯化得率。更重要地，高品质、高纯度起始材料的使用可提供期需和有利的控制元件以确保期需的AMG 416纯度。开发了用于制备高品质D-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的新方法，其产生更高得率，需要更少的单元操作，提供更稳健的质量控制并且顺应大规模制造。总的来说，本文所述制备Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的方法代表AMG 416制造的可行性的显著增加伴随潜在质量增益。
文献中存在的最简明的Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH合成之一并且可用于商业规模合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的合成途径如下。参见，例如，中国专利号CN101250172B，2012年3月2日。合成从用二碳酸二叔丁酯(Boc2O)保护D-Arg的氨基开始，分离后以近乎定量的得率产生Boc-D-Arg-OH。在步骤2中，在碱例如水性氢氧化钠存在下用Pbf基团保护侧链胍基。产物在下一步中不经分离作为IPA (异丙醇)溶液直接使用。步骤3包括在酸性条件下去除Boc保护基团，和作为晶状中间体分离相应的产物，D-Arg(Pbf)-OH。方法的步骤4包括在氨基官能度上安置Fmoc保护基团以作为终产物提供Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH。由于步骤2和步骤4的产物二者均为非晶态物质，即，提供有限的排斥杂质的能力，晶状中间体D-Arg(Pbf)-OH (步骤3产物)用作影响和确保终产物纯度的控制点。
当依靠文献中所报道的方法时，获得高纯度产物是一个重大挑战。通常需要多重重结晶以满足纯度需求。例如，为了将纯度提升至期需水平，D-Arg(Pbf)-OH在EtOH/EtOAc/水三元溶剂***中重结晶7次。另外，在步骤2中，即使存在大大过量的氢氧化钠和PbfCl时仍有20-30%的起始材料仍然未反应，并且总收率(步骤1-3)通常仅不到40%。
本文开发和描述并且在图6和7中说明的改善方法提供超过已知方法的数个优点。NaI作为催化剂引入用于将Boc-D-Arg-OH转化为Boc-D-Arg(Pbf)-OH (参见图6中步骤2)。碘化钠的引入有效地显著改善反应动力学，并且因此，步骤2的转化率可增加至95%以上，测定得率可提高至~90%。另外，杂质的总质量也减少。
D-Orn(Pbf)-OH和D-Arg(Pbf)-OH的乙酯分别为步骤2和步骤3中形成的主要杂质(图7)，并且难以通过结晶去除，因此促成对多重重结晶的需求。本文所述改善的方法进一步包括对于其中将Boc-D-Arg(Pbf)-OH转化为D-Arg(Pbf)-OH的步骤3，使用乙酸异丙酯(IPAc)，一种与更通常使用的EtOAc比较时空间上更受阻的酯，作为溶剂。IPAc的使用显著减慢强酸HCl催化的副反应、酯交换。因此，相应的杂质，D-Arg(Pbf)-OH的酯的含量减少至小于约0.5% (相对于在使用EtOAc的方法中大于1.0%)。另外，发现异丙醇(IPA)/水为更有力的溶剂***，其允许去除所有过程杂质，还将结晶步骤中的产物损失降到最低。在以实验室规模(20 g)进行的试验运行中，仅用2次结晶，D-Arg(Pbf)-OH (步骤3中间体)的纯度提高至大于99.7%，总体收率(步骤1-3)约为70%。该改善的方法的一个实施方案在下文实施例6中描述。
技术人员将容易地理解，本公开内容还延伸至AMG 416的变体和衍生物。例如，在一个实施方案中，本文提供的方法也可与N-乙酰-D-半胱氨酰-D-丙氨酰-D-精氨酰-D-精氨酰-D-精氨酰-D-丙氨酰-D-精氨酰胺与D-半胱氨酸的二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的构想（formulation）也可与N-乙酰-l-半胱氨酰-l-丙氨酰-l-精氨酰-l-精氨酰-l-精氨酰-l-丙氨酰-l-精氨酰胺与D-半胱氨酸的二硫化物和/或N-乙酰-l-半胱氨酰-l-丙氨酰-l-精氨酰-l-精氨酰-l-精氨酰-l-丙氨酰-l-精氨酰胺与l-半胱氨酸的二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，公开的构想也可与N-乙酰-D-半胱氨酰-D-精氨酰-D-丙氨酰- D-精氨酰-D-精氨酰-D-丙氨酰-D-精氨酰胺与l-半胱氨酸的二硫化物，和/或N-乙酰-D-半胱氨酰-D-精氨酰-D-丙氨酰-D-精氨酰-D-精氨酰-D-丙氨酰-D-精氨酰胺与D-半胱氨酸的二硫化物一起使用。另外，本方法可用于制备国际专利出版号WO 2011/014707的表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9和/或表10中提供的一种或多种化合物。在进一步的实施方案中，本文所述方法也可用于制备国际专利出版号WO 2011/014707中描述的化合物。
实施例
下列实施例，包括进行的实验和取得的结果，仅为了说明性目的而提供，不应解释为限制所附权利要求的范围。
实施例1A
主链线性片段的合成
主链线性片段的合成在图2中示出。将Rink Amide AM树脂(连接至氨甲基树脂的Fmoc2,4-二甲氧基-4'(羧甲氧基)-二苯甲胺) (1 kg)加入DMF (5.8 L/kg)中并在22℃搅拌溶液。过滤树脂并浆洗（slurry washed）。检验样品的残余Fmoc (UV检验)和残余哌啶(pH)。进行Kaiser和/或TNBS显色试验以确保已经进行Fmoc脱保护。
开始的六个氨基酸衍生物偶联遵照相同的预活化、偶联和洗涤程序。在22℃将1.6eq保护的Fmoc氨基酸加入DMF中，8.9 L/kg。然后加入Oxyma (2.45 eq)。将溶液冷却至21℃并加入DIC (2.13 eq)，让反应进行。将预活化的溶液与树脂组合并让反应进行。加入DIC(1.07 eq)并让反应在22℃进行。使用Kaiser和/或TNBS显色试验检验样品的不完全偶联。洗涤物料，接着Fmoc脱保护和进一步洗涤。检验样品的残余Fmoc (UV检验)和残余哌啶(pH)。进行Kaiser和/或TNBS显色试验以确保Fmoc脱保护已经发生。
向1:1.7 DMF:DCM溶液，12 L/kg，中加入Fmoc-D-Cys(Trt)-OH 1.6eq，接着加入HOBt.H2O (2.45 eq)。将溶液冷却至20℃，加入DIC (2.13 eq)并让反应进行。将预活化的溶液与树脂组合并让反应在22℃进行。向SPPS反应中加入DIC 1.07 eq，其中DMF/DCM比率为约1:1。让反应在22℃进行。使用Kaiser和/或TNBS显色试验检验样品的不完全偶联。
洗涤物料，接着进行Fmoc脱保护和进一步洗涤。检验样品的残余Fmoc (UV检验)和残余哌啶(pH)。进行Kaiser和/或TNBS显色试验以确保Fmoc脱保护已经发生。
向溶液中加入DMF (0 L/kg)、乙酸酐(1.06 L/kg)和吡啶(1.06 L/kg)，搅拌溶液用于预活化。将预活化的溶液与树脂组合并在22℃搅拌。过滤并洗涤物料。使用Kaiser和/或TNBS显色试验检验样品的不完全帽化。浆洗物料。在氮气下不搅拌干燥树脂。取干树脂样品并检验LOD和残余溶剂。参见图2。
实施例1B
主链线性片段的合成
AMG 416的主链线性片段的合成在图2中示出。肽链在Rink AM酰胺树脂上从C端向N端建立，每循环1个氨基酸。每一循环由2个反应步骤组成：1)从N端切割Fmoc；2) 偶联下一个Fmoc保护的氨基酸或最终的乙酰化。
SPPS的开始：将Rink AM酰胺树脂 (1.0 mole)转移至SPPS反应器中并用N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤。
Fmoc切割：将来自前面步骤的树脂在20%哌啶/DMF溶液中悬浮至少10 min。Fmoc切割的完成通过紫外(UV)吸收测量监测。Fmoc切割完成后，用DMF和异丙醇(IPA)交替洗涤树脂，直至达到中性pH。
Fmoc-氨基酸偶联：Fmoc切割步骤之后，通过混合树脂与Fmoc保护的氨基酸衍生物(> 1.2 mole)和活化剂(> 1.8 moles) (N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)和乙基(肟基)-氰基乙酸酯(Oxyma))在DMF中的溶液进行偶联反应。对于Fmoc-D-Cys(Trt)-OH的偶联，使用DIC和1-羟基苯并***水合物(HOBt)作为活化剂，并使用DMF和二氯甲烷(DCM)的混合物作为反应溶剂。室温搅拌反应混合物过夜。进行Kaiser和TNBS试验以监测偶联的完成。过程前进至下一个循环前需要Kaiser和TNBS试验二者的阴性结果。每一偶联或帽化步骤后，用DMF和IPA交替洗涤树脂。
最终的乙酰化：最后的Fmoc脱保护后，使用DMF中的乙酸酐和吡啶将肽的N端氨基乙酰化。进行Kaiser和TNBS试验以检验乙酰化的完成。如果乙酰化不完全，那么重复相同的乙酰化程序，直至从Kaiser和TNBS试验二者均获得阴性结果。
最后，通过过滤分离树脂上药物物质的受保护的肽骨架(AMG 416-树脂)，用DMF、IPA和乙腈(ACN)洗涤并减压干燥。
实施例2A
从树脂切割主链线性片段
通过在室温组合DIW (0.16 L/kg)、TFA (5.64 L/kg)、TIPS (0.46 eq)和DPDS (6.41eq) 制备混合溶液然后将溶液冷却至0±2℃。将树脂上的肽在0±2℃加入混合溶液中，将溶液加热至25℃并让反应进行。通过过滤去除树脂并洗涤。将溶液维持在-10℃并经时在-10℃加入IPE:MeCN的6.8:1溶液(24.5 L/kg)以控制温度和沉淀。让反应进行，在-5℃过滤AMG 416 SPy中间体产物并洗涤。在20℃在完全真空下干燥SPy中间体产物。参见图3。
实施例2B
从树脂切割主链线性片段
切割溶液在反应器中通过以约96.9:2.6:0.5 (v/v/v)的比率混合TFA、H2O和三异丙基硅烷(TIPS)制备。向切割溶液中加入DPDS (> 1.2 moles)作为D-半胱氨酸的巯基的活化试剂。向反应器中加入AMG 416-树脂(1.0 mole)并在室温搅拌反应混合物> 1 h。过滤除树脂。将滤液和洗涤溶液转移至另一个容器并冷却。然后向溶液中加入冷的二异丙醚(IPE)和ACN的反溶剂混合物以沉淀AMG 416-SPy。悬浮液通过过滤干燥器而过滤，随后用ACN和IPE洗涤AMG 416-SPy滤饼，并在大约20℃在过滤干燥器上减压干燥。
实施例3
L-Cys的原位缀合/制备型HPLC
将AMG 416 SPy中间体(1.0 mole)加入到0.2%TFA溶液中。向溶液中加入L-半胱氨酸(>1.1 moles)并让反应在室温进行至少15 min。
粗制AMG 416的纯化通过制备型色谱使用C18硅胶固定相使用ACN / H2O作为流动相和TFA作为改性剂进行。将来自阶段III的粗制AMG 416溶液装载到柱上，并将线性梯度方法用于纯化步骤。通过230 nm处的UV吸收监测洗脱。每次装载后，用80% ACN/水(v/v)冲洗柱直至达到稳定的UV基线。将级分储存在5℃，对其取样，然后汇集具有期需纯度(通过HPLC测定)的级分。来自纯化运行的合并汇集物通过使用相同的HPLC柱进行浓缩运行而浓缩。将级分储存在5℃。冻干具有期需纯度(通过HPLC测定)的级分以分离AMG 416 TFA盐。参见图4。
实施例4
盐转换
在10℃将AMG 416 TFA盐加入到10 L/kg的15%水/IPA (v/v)溶液中直至观察到完全溶解。在3小时内将该溶液通过表面下添加加入12M水性HCl 0.27 L/kg和IPA 49.4 L/kg溶液中，导致AMG 416 4.5 HCl盐直接沉淀。将批料老化3小时并取样分析。
过滤物料并用10 L/kg的96 wt% IPA浆洗。滤饼然后在10 L/kg 96% wt% IPA中再浆液化（slurried）4小时。过滤物料并用96 wt% IPA 10 L/kg然后IPA 10 L/kg进一步浆洗。在25℃在完全真空下干燥物料。将干燥滤饼溶解在8 L/kg的水中并通过蒸馏浓缩批料以去除残余IPA和达到期需浓度。溶液温度在整个蒸馏期间保持在25℃以下。参见图5。
实施例5
纯化SPy中间体和产生AMG 416 HCl
此处描述用于制备AMG 416 HCl盐的备选方法。如上文实施例2中所描述的，从树脂切割、沉淀和过滤后，SPy中间体产物在20℃在完全真空下干燥。然后将沉淀溶解在0.1% TFA水溶液中并装载到C-18柱上用于HPLC纯化。柱在<60 bar时运行，并且溶液温度从头至尾为15-25℃。洗脱液为0.1% TFA/乙腈和0.1% TFA/水。将级分储存在5℃，对其取样，然后汇集级分。稀释来自两个运行的合并汇集物并使用相同的HPLC柱进行浓缩/纯化运行以减少总体积和去除额外的杂质。将级分储存在5℃。
包含AMG 416 SPy中间体的级分经受共沸蒸馏以将溶剂从0.1%TFA变成15%水/IPA溶液，根据需要用IPA加料。然后向所得的IPA溶液中的AMG 416 SPy中间体加入L-半胱氨酸1.15 eq并让反应在室温进行，用于发生缀合和形成AMG 416 TFA盐，如上文在实施例4中所描述的。在3小时内将AMG 416 TFA溶液通过表面下添加加入0.27 L/kg的12M水性HCl和49.4 L/kg的 IPA溶液中，导致AMG 416 4.5 HCl盐直接沉淀。将批料老化3小时并取样分析。
过滤物料并用96 wt% IPA10 L/kg浆洗。滤饼然后在10 L/kg 96% wt% IPA中再浆液化4小时。过滤物料并用10 L/kg的96 wt% IPA然后IPA 10 L/kg进一步浆洗。在25℃在完全真空下干燥物料。将干燥滤饼溶解在8 L/kg的水中并通过蒸馏浓缩批料以去除残余IPA和达到期需浓度。溶液温度在整个蒸馏期间保持在25℃以下。
实施例6
合成H-D-Arg(Pbf)-OH
如实施例1中所述合成主链线性片段需要使用Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH用于添加D-精氨酸亚单元，所述D-精氨酸亚单元占线性片段中7个残基的4个。下文描述改善和更有效的用于合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的方法。
合成始于通过二碳酸二叔丁酯(Boc2O)保护D-Arg的氨基，在文献中报道的标准程序下通过结晶分离后以近乎定量的得率产生Boc-D-Arg-OH。精氨酸侧链胍基通过在水性NaOH (4.3 eq)/NaI (5% mol)作为碱存的情况下添加Pbf-Cl (1.3 eq)的10/1丙酮/THF溶液1h (0-5℃)用Pbf基团保护，产生Boc-D-Arg(Pbf)-OH (85-90%测定得率)。参见图6。用4.8 eq浓缩HCl在20℃处理Boc-D-Arg(Pbf)-OH/IPAc溶液大约6 h。反应后，丢弃有机层并通过使用NaOH调节pH至5从水层分离粗制产物，其后观察到白色的悬浮液。参见图7。当上清液在20℃具有大约3 mg/ml的浓度时，室温过滤上清液，用水洗涤所得滤饼并在真空下干燥。该步骤后的总体测定得率为约80-85%。通过从3/1水/IPA (v/v)第一次重结晶，H-D-Arg(Pbf)-OH的纯度增加至>98.5%。当上清液具有约7mg/mL的浓度时，将其过滤并在真空下干燥。该步骤后，总体测定得率为约75%。(在该步骤中通常观察到约10%的产物损失)。进行从4/1水/IPA (v/v)的第二次重结晶。当上清液浓度为约3.7 mg/mL时进行过滤。第二次重结晶使H-D-Arg(Pbf)-OH的纯度增加至通过HPLC的约99.84面积百分比纯度(LCAP)，并且杂质不超过0.2 LCAP。该步骤通常的得率为约93%，产物损失约5%。H-D-Arg(Pbf)-OH然后按照标准方案与FmocOSu反应并使用文献中的标准程序分离产物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH。

Claims (13)

1.一种用于制备AMG416的方法，其包括：
提供具有选自Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf) -D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[树脂] (SEQ ID NO:2)和Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[树脂] (SEQ ID NO:3)的结构的树脂-结合的肽；
从所述固体载体切割所述肽；和
活化所述D-Cys残基的侧链。
2.权利要求1的方法，其中所述切割和所述活化在同一容器中发生。
3.权利要求1的方法，其中所述树脂-结合的肽与包含水、三氟乙酸、三异丙基硅烷和二吡啶二硫化物的溶液接触。
4.用于制备AMG416的方法，包括：
提供具有Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 (SEQ ID NO:4)结构的肽；和
使所述肽接触l-Cys以产生缀合产物。
5.权利要求4的方法，其中所述肽与包含l-Cys和三氟乙酸的水溶液接触。
6.权利要求4的方法，进一步包括冻干所述缀合产物。
7.权利要求4的方法，进一步包括使所述缀合产物与包含IPA和HCl的水溶液接触，从而产生包含AMG 416 HCl (SEQ ID NO:1)的沉淀物。
8.权利要求7的方法，进一步包括通过HPLC纯化所述沉淀物。
9.用于制备AMG416的方法，包括：
提供在TFA溶液中的具有Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 (SEQ ID NO:4)结构的肽；
通过HPLC纯化所述肽；
通过共沸蒸馏进行溶剂交换；和
使所述肽与l-Cys接触以产生缀合产物。
10.权利要求9的方法，其中所述肽与l-Cys和水在IPA中的水溶液接触。
11.权利要求10的方法，进一步包括使所述缀合产物与包含IPA和HCl的水溶液接触，从而产生包含AMG 416 HCl (SEQ ID NO:1)的沉淀物。
12.用于合成D-Arg(Pbf)-OH的方法，包括：
通过混合Boc-D-Arg-OH与PbfCl、NaOH和NaI将所述Boc-D-Arg-OH转化为Boc-D-Arg(Pbf)-OH。
13.权利要求12的方法，进一步包括：
通过混合所述Boc-D-Arg(Pbf)-OH与HCl和IPAc将所述Boc-D-Arg(Pbf)-OH转化为D-Arg(Pbf)-OH。
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