CN106794129B - 对il-21具有特异性的结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了IL‑21结合分子，如抗‑IL‑21抗体及其抗原结合片段。在某些方面，抗‑IL‑21抗体及其片段可为杂交瘤‑来源的鼠单克隆抗体及其人源化形式。在某些方面，结合分子，如本文提供的抗‑IL‑21抗体及其抗原结合片段抑制、遏制或拮抗IL‑21活性。此外，本公开提供了用于诊断和治疗疾病或病症的组合物和方法，如与IL‑21‑介导的信号转导相关的炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症。在一个特定实施方案中，本公开提供了使用IL‑21结合分子，如抗‑IL‑21抗体及其抗原结合片段治疗或预防移植物抗宿主病(GVHD)的方法。

Description

对IL-21具有特异性的结合分子及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年4月8日提交的美国临时专利申请No.61/976,684的优先权权益，其内容在此通过引用并入。
以电子形式提交的序列表的并入
与本申请一起提交的呈ASCII文本文件形式的以电子形式呈递的序列表的内容(名称：IL21_100Pl_seqlist.txt；大小：55,898字节；及创建日期：2014年4月7日)通过引用整体并入本文。
背景技术
本公开提供了特异性结合至IL-21的组合物及使用此类组合物例如治疗或预防炎性或自身免疫性疾病或病症的方法。
IL-21属于包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的细胞因子家族，其全部结合至与常见的细胞因子受体γ链(γc)复合的私有(或共享)受体。该家族的大部分细胞因子对T细胞、B细胞和NK细胞的维持和功能至关重要。IL-21的受体广泛分布于淋巴造血细胞和非-造血细胞上，并且IL-21起到多种作用。
例如，IL-21对IL-21R的接合导致包括Jak/STAT途径的若干信号传导途径激活(Davis,ID等(2007)Clin Cancer Res 13,3630-3636；Fuqua,CF等(2008)Cytokine 44,101-107；Habib,T等(2002)Biochemistry 41,8725-8731)。更具体地，IL-21激活STAT1、STAT3和STAT5，这通过细胞内这些分子的磷酸化增加来指示(Asao,H等(2001)JImmunol167,1-5；Diehl,SA等(2008)JImmunol 180,4805-4815；Scheeren,FA等(2008)Blood 111,4706-4715；Zeng,R等(2007)Blood 109,4135-4142)。特别地，激活STAT3显示出在调节人B细胞对IL-21的应答起到重要作用(Avery,DT等(2008)J Immunol 181,1767-1779；Avery,DT等，J Exp Med 207,155-171)。
此外，IL-21有助于CD8+记忆T细胞和NK细胞的维持和功能，促进在小鼠(并且可能是人)中产生Thl7和T滤泡辅助(Tfh)细胞，以及抑制调节性T细胞(Treg)细胞产生。IL-21已显示调节了NK细胞的活性，包括对其成熟生长和溶细胞活性的影响(Spolski,R和Leonard,WJ(2008)Curr Opin Immunol 20,295-301)。此外，IL-21已显示促进原代NK细胞以及人NK细胞系NK-92产生IFNγ(Kasaian,MT等(2002)Immunity 16,559-569；Strengell,M等(2003)J Immunol170,5464-5469)。IL-21还对非-造血细胞产生多种作用，诸如基质细胞，其中其通过基质金属蛋白酶(MMP)释放诱导炎症(Monteleone等(2006)Gut 55,1774-1780)。
IL-21的一个主要的非冗余作用是在体液免疫应答期间促进B细胞激活、分化或死亡。已广泛研究了IL-21对人B细胞的作用。IL-21对B细胞存活、激活和增殖以及B细胞分化为分泌Ig的血浆细胞(PC)有着深远的影响(Avery,DT等(2008)J Immunol 181,1767-1779；Avery,DT等，J Exp Med 207,155-171)；Bryant,VL等(2007)J Immunol 179,8180-8190；Ettinger,R等(2005)J Immunol175,7867-7879；Parrish-Novak,J等(2000)Nature 408,57-63；Pene,J等(2004)J Immunol 172,5154-5157)。此外，IL-21产生增加的特征在于某些自身免疫性疾病，并且可能有助于自身抗体产生以及自身免疫性疾病的病理学特征。B细胞的体内激活可通过与经激活的T细胞相互作用驱动，所述经激活的T细胞表达共刺激分子(诸如CD40L)且产生B细胞趋向性细胞因子(诸如IL-21)。
IL-21的过表达是许多炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的特征，并且可能是一种重要的自身抗体产生的驱动因子以及自身免疫性疾病的病理学特征(Nakou等(2013)Clin.Exp.Rheumatol.31,172-179)。IL-21在促进体液免疫应答中的重要作用使其成为特征在于IL-21和病理学自身抗体两者过度产生的疾患的潜在治疗性干预的重要着力点(Dolff等(2011)Arthritis Res.Ther.13,R157；Kang等(2011)Arthritis Res.Ther.13,R179；McGuire等(2011)Immunity34,602-615；Liu等(2012)Arthritis Res.Ther.14,R255；Terrier等(2012)Arthritis Rheum.64,2001-2011；Li Q等(2013)PLoS One 8,e68145；LiY等(2014)Neurol.Sci.35,29-34)。因此，期望在自身免疫的背景下中和IL-21可影响据信参与免疫介导性疾病的发病的若干细胞群体。此类疾病或病症包括但不限于血管炎，如抗-中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)或巨细胞动脉炎(GCA)血管炎、舍格伦氏综合征(
Figure BDA0001172282280000031
syndrome)、炎性肠病、寻常天疱疮、狼疮性肾炎、银屑病、甲状腺炎、I型糖尿病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、关节强硬性脊椎炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)、重症肌无力和移植物抗宿主病(GVHD)。
抗-中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)-相关的血管炎(AAV)发病的特征是蛋白酶3(PR3)和髓过氧化物酶(MPO)的主要自身抗体。产生IL-21的CD4+T细胞在血液中扩增(Abdulahad等(2013)Arth Res&Ther 15:R70)。相对于健康对照，升高的IL-21存在于AAV血清中，且外源性IL-21诱导ANCA自身-抗体从自AAV患者体外分离的PBMC体外分泌。AAV由肉芽肿性血管炎(GPA)，即韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、嗜酸性粒细胞性肉芽肿性血管炎(也称为Churg-Strauss综合征(CSS))及显微镜下多血管炎(MPA)组成。它们通常归并在一起但在流行病学上患病率和分布不同。当前治疗包括皮质类固醇、生物制品(如利妥昔单抗、免疫抑制药物、抗生物素)或血浆取出法，但患者预后保持不良。仍然存在未满足的对AAV治疗的需求。
舍格伦氏综合征(SS)是一种特征在于自身抗体(诸如类风湿因子(RF))以及若干核抗原的自身抗体(诸如Ro/La)的自身免疫性疾病。SS是RA之后的第二常见的自身免疫性疾患。在美国存在至少1百万名原代舍格伦氏患者，其中90％是女性。SS影响了唾液腺，导致如口干和眼干。此外，SS可影响其它身体器官，包括肾、血管、肺、肝、胰腺、外周神经***和脑，并且与其它自身免疫性疾病(诸如狼疮和类风湿性关节炎)相关。非常高的血清IL-21水平与增加的IgG1和自身抗体的存在相关(Kang，2011)。升高的IL-21和IL-21R水平可存在于腺的异位滤泡中(Kang，2011)。此外，IL-21已知在NK细胞激活和细胞毒性中起直接作用。过表达激活受体NKp30的增加数目的组织-驻留NK细胞存在于原发性舍格伦氏综合征患者的唾液腺中，并且与病灶评分相关(Rusakiewicz等(2013)Sci.Transl.Med.5,195ra96)。这些NK细胞通过直接NK细胞-基质细胞串扰牵涉于疾病发病中，从而导致组织损伤。IL-21及其受体还在唾液腺浸润物上表达(Kang，2011)，并且IL-21产生-记忆CCR9+CD4+Tfh细胞已报道在大部分SS患者的循环中扩增(McGuire，2011)。此外，在具有升高的IL-21的患者中升高水平的Tfh细胞与腺外表现相关(Szabo等(2013)Clinical Immunol 147,95-104)。临床前动物模型已证实从IL-21抑制受益(Liu等(2012)J Oral Pathol Med)。不存在对SS治愈；当前治疗具有有效的功效，并且没有一个可被认为改善病情。轻度至中度疾病通过非处方药根据症状治疗。若干种疾病当前用羟氯喹、类固醇、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或标签外利妥昔单抗治疗。仍然存在对寻找SS的有效治疗的未满足的需求。
IL-21的中和在包括原发性SS和血管炎的若干种适应症中具有潜在用途(Kang，2011；Bae等(2012)Allergy Asthma Immunol Res.4,351-356；Terrier，2012；Abdulahad，2013；Szabo，2013)。
已广泛研究了IL-21对移植物抗宿主病(GVHD)的作用。当通过水动力学基因***递送时，IL-21已显示极大加速人至小鼠异种GVHD，并且发现可增加B细胞、血浆细胞和免疫球蛋白(Wu等(2013)Protein Cell 4,863-871)。相反，在该***中封闭IL-21据报道减少了胃肠道损伤、脾Thl细胞因子且免受致死性(Hippen等(2012)Blood 119,619-628)。此外，免受GVHD据报道取决于Treg的产生(Hippen等，2012)。
本公开提供了特异性结合至IL-21的组合物及使用此类组合物如治疗或预防炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的方法。
在一个特定方面，本公开提供了使用包含特异性结合至IL-21的抗体或其片段的组合物治疗或预防GVHD。例如，已在GVHD异种小鼠模型中显示出抗-IL-21组合物阻断从头产生的人IL-21。该组合物当预防性以及治疗性给予时有效抑制GVHD-诱导的消耗病和致死性。
发明内容
下文概述了本发明的一些主要方面。另外的方面描述于本公开的详细描述、实施例、附图和权利要求书部分中。本公开的每个部分的描述意在结合其它部分理解。此外，本公开的每个部分所述的各种实施方案可以各种不同的方式组合，并且所有此类组合意在落入本发明的范围内。
本公开提供了IL-21结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，如能够抑制IL-21与其受体的相互作用和抑制IL-21活性的单克隆抗体。
在一些情况下，特异性结合至IL-21的表位的经分离的结合分子或其抗原结合片段，其中结合分子特异性结合至与抗体或其抗原结合片段结合的表位相同的IL-21表位，包含19E3、9F11、8B6或9H10的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一些情况下，特异性结合至IL-21且竞争性抑制由抗体或其抗原结合片段结合IL-21的经分离的结合分子或其抗原结合片段包含19E3、9F11、8B6或9H10的VH和VL。在一些情况下，19E3的VH和VL分别包含SEQ ID NO：6和11，9F11的VH和VL分别包含SEQ ID NO：28和33，8B6的VH和VL分别包含SEQ ID NO：42和47，且9H10的VH和VL分别包含SEQ ID NO：52和57。
在一些情况下，特异性结合至IL-21的经分离的结合分子或其抗原结合片段包含抗体VL，其中VL包含分别与以下序列相同或者除了在一个或多个VL-CDR中具有四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13和14，SEQ ID NO：34、35和36，SEQ ID NO：48、49和50，或SEQ ID NO：58、59和60。
在一些情况下，特异性结合至IL-21的经分离的结合分子或其抗原结合片段包含抗体VH，其中VH包含分别与以下序列相同或者除了在一个或多个VH-CDR中具有四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：7、8和9，SEQ ID NO：29、30和31，SEQ ID NO：43、44和45，或SEQ ID NO：53、54和55。
在一些情况下，特异性结合至IL-21的经分离的结合分子或其抗原结合片段包含抗体VL，其中VL包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：57。
在一些情况下，特异性结合至IL-21的经分离的结合分子或其抗原结合片段包含抗体VH，其中VH包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：52。
在一些情况下，结合分子或其片段包含抗体或其抗原结合片段。
在一些情况下，特异性结合至IL-21的经分离的抗体或其抗原结合片段包含VL和VH，其包含分别与以下序列相同或者除了在一个或多个CDR中具有四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13、14、7、8和9，SEQ ID NO：34、35、36、29、30和31，SEQ IDNO：48、49、50、43、44和45，或SEQ ID NO：58、59、60、53、54和55。
在一些情况下，特异性结合至IL-21的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其中VH和VL分别包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：38和SEQID NO：39、SEQ ID NO：37和40、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：52和SEQ IDNO：57。
在一些情况下，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其中VH包含氨基酸序列SEQ IDNO：19且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：21。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区或其片段。在一些情况下，重链恒定区或其片段是IgG恒定区。在一些情况下，IgG恒定结构域包含相对于野生型IgG恒定结构域的一个或多个氨基酸取代，其中与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比经修饰的IgG具有增加的半衰期。在一些情况下，IgG恒定结构域包含在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸位置编号根据如Kabat中示出的EU指数。在一些情况下，至少一个IgG恒定结构域的氨基酸取代选自由以下组成的组：
(a)用酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或苏氨酸(T)取代在Kabat位置252处的氨基酸，
(b)用苏氨酸(T)取代在Kabat位置254处的氨基酸，
(c)用丝氨酸(S)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)或苏氨酸(T)取代在Kabat位置256处的氨基酸，
(d)用亮氨酸(L)取代在Kabat位置257处的氨基酸，
(e)用脯氨酸(P)取代在Kabat位置309处的氨基酸，
(f)用丝氨酸(S)取代在Kabat位置311处的氨基酸，
(g)用苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或丝氨酸(S)取代在Kabat位置428处的氨基酸，
(h)用精氨酸(R)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或谷氨酰胺(Q)取代在Kabat位置433处的氨基酸，
(i)用色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸取代在Kabat位置434处的氨基酸，和
(j)两种或更多种取代的组合。
在一些情况下，人IgG恒定结构域包含相对于野生型人IgG恒定结构域的在Kabat位置252、254和256处的氨基酸取代，其中
(a)Kabat位置252处的氨基酸被酪氨酸(Y)取代，
(b)Kabat位置254处的氨基酸被苏氨酸(T)取代，和
(c)Kabat位置256处的氨基酸被谷氨酸(E)取代。
在一些情况下，人IgG恒定结构域是人IgG1恒定结构域。
在一些情况下，重链包含氨基酸序列SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：24。在一些情况下，轻链恒定区选自由以下组成的组：人κ恒定区和人λ恒定区。在一些情况下，轻链恒定区是人κ恒定区。在一些情况下，重链和轻链分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22、或SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。
在一些情况下，抗体或其抗原结合片段是鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段是Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv和sc(Fv)2。
在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可结合至人IL-21和食蟹猴(cyno)IL-21。
在一些情况下，抗体或其片段不特异性结合至人IL-2、IL-4、IL-7、IL-9或IL-15。
在一些情况下，抗体或其片段抑制IL-21结合至IL-21受体。
在一些情况下，抗体或其片段是具有IL-21活性的拮抗剂。
在一些情况下，抗体或其片段可抑制人外周血单核细胞(PBMC)中IL-21-介导的STAT3磷酸化。
在一些情况下，抗体或其片段可抑制人外周血单核细胞(PBMC)中人和食蟹猴IL-21-介导的STAT3磷酸化。
在一些情况下，抗体或其片段可抑制IL-21-介导的由NK细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)。
在一些情况下，抗体或其片段可抑制人和食蟹猴IL-21-介导的由NK细胞产生干扰素-γ(IFN-y)。在一些情况下，NK细胞是培养的NK-92细胞。
在一些情况下，抗体或其片段可抑制IL-21-介导的B-细胞分化为血浆细胞。
在一些情况下，抗体或其片段可抑制人和食蟹猴IL-21-介导的经刺激的B细胞分化为血浆细胞。
在一些情况下，抗体或其片段可抑制CD4+T细胞-激活的B细胞分化为血浆细胞。
在一些情况下，抗体或其抗原结合片段以特征在于如在动力学排除测定(KineticExclusion Assay，KinExA)3000平台上所测量的约100pM至约0.1pM的解离常数(Kd)的亲和力特异性结合人IL-21。
在一些情况下，抗体或其抗原结合片段以特征在于如在动力学排除测定(KinExA)3000平台上所测量的约100pM至约0.1pM的解离常数(Kd)的亲和力特异性结合食蟹猴IL-21。
在一些情况下，抗体或其抗原结合片段，其中对人IL-21的Kd为约0.515pM且对食蟹猴IL-21的KD是约0.352pM。
在一些情况下，抗体或其片段缀合至选自由以下组成的组的试剂：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物反应调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标签、聚乙二醇(PEG)和任何两种或更多种所述试剂的组合。
在一些情况下，组合物包含如本文所述的抗体或其片段及载体。优选地，载体为药学上可接受的载体。
在一些情况下，经分离的多核苷酸包含编码抗体VL的核酸，其中VL包含分别与以下序列相同或者除了在一个或多个VL-CDR中有四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13和14，SEQ IDNO：34、35和36，SEQ ID NO：48、49和50或SEQ ID NO：58、59和60。
在一些情况下，经分离的多核苷酸包含编码抗体VH的核酸，其中VH包含分别与以下序列相同或者除了在一个或多个VH-CDR中具有四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：7、8和9，SEQ IDNO：29、30和31，SEQ ID NO：43、44和45或SEQ ID NO：53、54和55。
在一些情况下，经分离的多核苷酸包含编码抗体VL的核酸，其中VL包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：57。在一些情况下，经分离的多核苷酸包含编码抗体VH的核酸，其中VH包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：52。
在一些情况下，本文所述的多核苷酸包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸，所述抗体或其抗原结合片段包含本文所述的可特异性结合至IL-21的VH或VL。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段特异性结合至与包含19E3、9F11、8B6或9H10的VH和VL的抗体或其抗原结合片段结合的表位相同的表位。
在一些情况下，本文所述的多核苷酸包含编码包含VH或VL的抗体或其抗原结合片段的核酸，所述抗体或其抗原结合片段可结合至人IL-21和食蟹猴IL-21。
在一些情况下，提供包含本文所述的多核苷酸的载体。
在一些情况下，提供了包含本文所述的多核苷酸或本文所述的载体的组合物。
在一些情况下，提供编码如本文所述的结合分子或其抗原结合片段的多核苷酸或多核苷酸组合。
在一些情况下，提供编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或多核苷酸组合。
在一些情况下，组合物包含含编码VH的核酸的多核苷酸和含编码VL的核酸的多核苷酸，其中VL和VH包含分别与以下序列相同或者除了在一个或多个CDR中具有四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13、14、7、8和9，SEQ ID NO：34、35、36、29、30和31，SEQ ID NO：48、49、50、43、44和45，或SEQ ID NO：58、59、60、53、54和55。
在一些情况下，组合物包含含编码VH的核酸的多核苷酸和含编码VL的核酸的多核苷酸，其中VL和VH分别包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和SEQID NO：33、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：37和40、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：57。
在一些情况下，VH和VL分别由与选自由以下组成的组的参考核酸序列至少85％、90％、95％或100％相同的核酸序列编码：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：56。
在一些情况下，包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸在相同的载体中。在一些情况下，提供如本文所述的载体。
在一些情况下，包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸在不同的载体中。在一些情况下，提供如本文所述的载体。
在一些情况下，如本文所述的组合物包含含所述VH和所述VL的抗体或其抗原结合片段，所述VH和所述VL可特异性结合至IL-21。在一些情况下，包含VH或VL的抗体或其抗原结合片段可结合至人IL-21和食蟹猴IL-21。在一些情况下，该抗体或其抗原结合片段可特异性结合至与包含19E3、9F11、8B6或9H10的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的表位相同的表位。
在一些情况下，提供包含如本文所述的多核苷酸、如本文所述的组合物或如本文所述的一种或多种载体的宿主细胞。
在一些情况下，制备如本文所述的抗体或抗原结合片段的方法包括(a)培养如本文所述的细胞；和(b)分离抗体或其抗原结合片段。
在一些情况下，提供包含本文所述的抗体或抗原结合片段的诊断试剂或试剂盒。
在一些情况下，用于降低IL-21R-表达细胞中IL-21-诱导的STAT3磷酸化的方法包括使细胞与如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物接触。
在一些情况下，用于降低IL-21-介导的由NK细胞产生IFNγ的方法包括使NK细胞与如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物接触。
在一些情况下，用于降低IL-21-介导的初始或记忆B细胞分化为血浆细胞的方法包括使初始或记忆B细胞与如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物接触。
在一些情况下，血浆细胞分化由CD4+T细胞激活。
在一些情况下，治疗受试者的炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物。
在一些情况下，预防受试者中的炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的方法包括向对此类疾病或病症易感的受试者施用有效量的如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物。
在一些情况下，自身免疫性疾病是舍格伦氏综合征(SS)、血管炎(ANCA/GCA)、全身性红斑狼疮或狼疮性肾炎、类风湿性关节炎(RA)、克罗恩氏病、重症肌无力或其任何组合。
在一些情况下，免疫介导性疾病或病症是GVHD。
在一些情况下，预防GVHD的方法包括减少或消除GVHD的症状。
在一些情况下，减少或消除的GVHD症状是皮疹、水疱、恶心、食欲不振、呕吐、食用后很快饱胀、腹泻、腹部不适、腹胀、便血、黄疸、小便黄赤、上腹部不适、水体重增加(或膨胀)、关节炎样症状、疼痛和僵硬、干眼症、眼部刺激、口疮、持续咳嗽、呼吸短促、呼吸困难。
在一些情况下，用于抑制由于GVHD导致的重量减轻的方法包括向患有GVHD或对GVHD易感的受试者施用如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物。
在一些情况下，用于减少由于GVHD导致的贫血的方法包括向患有GVHD或对GVHD易感的受试者施用如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物。
在一些情况下，用于抑制T细胞扩增的方法包括向患有GVHD或对GVHD易感的受试者施用如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物。
在一些情况下，用于减少患有GVHD或对GVHD易感的受试者中的细胞因子的方法包括向受试者施用如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物。
在一些情况下，用于检测样品中IL-21表达水平的方法包括(a)使所述样品与如本文所述的结合分子或其抗原结合片段、如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的组合物接触，和(b)检测所述样品中的结合至IL-21。
附图说明
图1A显示鼠单克隆抗体9F11的可变区(VH：SEQ ID NO：28，VL：SEQ ID NO：33)和三种人源化变体的可变区(VH-4和VH-11：SEQ ID NO：41，VH-6：SEQ ID NO：42，VL-4和VL-6：SEQ ID NO：43，VL-11：SEQ ID NO：44)的比对。人与鼠框架区中不同的残基加
Figure BDA0001172282280000131
框架区中的鼠回复突变加粗，且CDR区加下划线。图1B显示鼠单克隆抗体19E3的可变区(VH：SEQ ID NO：6，VL：SEQ ID NO：11)和三种人源化VH变体的可变区(SEQ ID NO：61、62和63)和两种人源化VL变体的可变区(SEQ ID NO：64和65)的比对。人与鼠框架区中不同的残基加
Figure BDA0001172282280000132
框架区中的鼠回复突变加粗，且CDR区加下划线。
图2A和图2B显示与人(图2A)和食蟹猴(图2B)IL-21溶液相竞争的500fM和50pM浓度的K44VHa-N56Q(MEDI7169)IgG的KinExA双重曲线拟合(Dual Curve Fit)。
图3A显示人或食蟹猴IL-21对人PBMC的STAT3磷酸化的作用。图3B显示抑制抗-IL-21抗体K2Ha-N56Q(倒三角)、K44VHa-N56Q(MEDI7169)(菱形)和K44VHa6-N56Q(圆形)对人和食蟹猴IL-21-诱导的人PBMC的STAT3磷酸化上调的抑制。
图4显示NK-92细胞对人(图4A)和食蟹猴(图4B)IL-21诱导的IFNγ的抑制。
图5显示人(图5A)或食蟹猴(图5B)IL-21对IL-21-诱导的人B细胞分化为血浆细胞的抑制。图表显示与对照相比IgD-CD38hi PC水平的降低。图5C显示在对照条件下，用IL-21、抗-CD40和抗-IgM刺激导致到第6天在30-40μg/ml范围内的Ig产生，且19E3.1和9F11.1抑制Ig产生。
图6A显示B细胞与激活的CD4+T细胞的共培养导致IgD-CD38hi PC群体出现，其中68.5％的CD19+细胞到第7天表达该PC表型。图6B和6C显示通过添加19E3.1或9F11.1抑制PC分化。
图7显示抗-IL21抗体(19E3.1)阻断IL-21诱导的T细胞扩增。人T细胞用与抗-CD3组合的重组人IL-21刺激。添加指定浓度的抗体19E3.1，并且在第四天对T-细胞扩增定量。一式两份运行所有条件。用两种独特供体进行实验。显示一种代表性供体。
图8显示K44VHa-N5 6Q(MEDI7169)通过限制CD4+T-细胞扩增而阻断GVHD-诱导的消耗病。将供体1PBMC(12.71x 106)或供体2PBMC(13.46x 106)在研究第0天转移至NOD/SCID/γc小鼠内。小鼠接受了从第-1天开始一周给予三次的200μg对照mAb(图8A)或K44VHa-N56Q(图8B)。每隔一周对小鼠放血并通过流式细胞术评估以测定人CD45+细胞的数目和表型。图8C和图8D分别显示从接受了对照mAB或K44VHa-N56Q的小鼠收集的人CD45+细胞的百分比(从第21天开始，供体1；n＝3对照mAb，n＝5K44VHa-N56Q)。图8E和图8F分别显示接受了对照mAB或K44VHa-N56Q的小鼠中的人CD45+级分内的CD4+或CD8+细胞的百分比(从第35天开始，供体2；n＝10对照mAb+PBS媒介物/n＝5K44VHa-N56Q)。在流式细胞仪上收集所有条件染色的100μL血液持续相同长的时间，因此展现的事件的数目反映了相对细胞数。从第21天血液收集的人CD45+细胞的绝对数目的平均值±标准偏差对于供体1是对照mAb，n＝3(729,111±113,899)对比K44VHa-N56Q，n＝5(39,104±5,159)，P<0.0357。对于供体2，组合的对照mAb和PBS，n＝10(237,294±35,628)对比K44VHa-N56Q，n＝5(14,980±2,275)，P＝0.0007。
图9显示K44VHa-N56Q可逆地抑制6只接受者小鼠中的人细胞扩增。将供体2PBMC(13.46x 106)在研究第0天转移至NOD/SCID/γc小鼠内。小鼠接受了从第-1天开始直至第44天一周给予三次的200μL PBS媒介物(正方形)或者200μg K44VHa-N56Q(三角形)或对照mAb(圆形)。每隔一周对小鼠放血并通过流式细胞术评估以测定人CD45+细胞的数目。数据指示收集的人细胞的数目。在流式细胞仪上收集所有条件染色的100μL血液和相同的体积，因此展现的事件的数目反映了相对细胞数。
图10显示K44VHa-N56Q保护免受GVHD-诱导的重量减轻和死亡。将供体1PBMC(12.71x 106)在研究第0天转移至NOD/SCID/γc小鼠内且之后小鼠体重减轻(图10A)和死亡(图10B)。从第-1天开始直至第31天，一周三次给予200μg/小鼠的K44VHa-N56Q(三角形)或对照mAb(实心圆)。首次接触实验的(开口圆)动物不接受人细胞和mAh。存活百分比代表小鼠死亡或达到20％体重减轻并处死。显示两种不同的供体PBMC的两个独立实验的一个。
图11显示通过K44VHa-N56Q抑制细胞增殖和细胞因子产生。将供体2PBMC(13.46x106)在研究第0天转移至NOD/SCID/γc小鼠内并从第-1天开始一周三次注射200μg的K44VHa-N56Q或对照mAb。使用Millipore的MILLIPLEX MAP***人Thl7试剂盒，对小鼠放血且血清中细胞因子的量被用于评估存在细胞因子。显示IL-21(图11A)、干扰素γ(图11B)、肿瘤坏死因子α(图11C)、IL-9(图11D)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(图11E)、IL-10(图11F)和IL-5(图11G)的血清水平(pg/mL)。
图12显示抗-IL-21抑制细胞增殖和细胞因子产生是可逆的。将供体1PBMC(12.71x106)在研究第0天转移至NOD/SCID/γc小鼠内，并从第-1天开始直至第31天一周三次注射200μg的K44VHa-N56Q(封闭符号)或对照mAb(开放符号)(当终止K44Vha-N56Q时)。在第15、28、43和57天对小鼠放血，并使用Millipore’s MILLIPLEX MAP***人Thl7试剂盒在这些时间点测定血清中干扰素γ(图12A)、肿瘤坏死因子α(图12B)和IL-10(图12C)的量。在第7、21、35、51和57天对小鼠放血，并测定人CD45+细胞的数目(图12D)。所有接受了对照mAb的小鼠到研究第28天死亡；因此，对于这些动物，仅存在一个细胞因子时间点。
图13显示治疗性K44Vha-N56Q使受试者免受GVHD。将供体1PBMC(12.0x 106)在研究第0天转移至NOD/SCID/γc小鼠内，并监测存活率。一周三次以200μg/小鼠给予在研究第7天开始的对照mAb(圆形)、在研究第7天开始的K44Vha-N56Q(三角形)或在研究第14天开始的K44Vha-N56Q(倒三角形)。当确定小鼠体重减轻20％时或如果小鼠消瘦/垂死或另外处于疼痛或痛苦中，使小鼠安乐死。出于追踪存活的目的，死亡和人道的安乐死同义使用。
图14显示K44Vha-N56Q可保护免受GVHD-诱导的贫血。如对图13所述注射并处理小鼠。小鼠首次接触实验(即未给予细胞(星号))或给予人PBMC细胞，然后一周三次以200μg/小鼠给予在研究第7天开始的对照mAb(圆形)、在研究第7天开始的K44Vha-N56Q(三角形)或在研究第14天开始的K44Vha-N56Q(倒三角形)。将从眶后窦收集的肝素化全血样品以1:10稀释，之后用自动血液分析仪(Sysmex XT-2000iv)分析。将所得的总白细胞(图14A)和红细胞(图14C)计数、血细胞比容(图14B)和血红蛋白(图14D)的值乘以稀释因子10。
具体实施方式
本发明提供了结合至IL-21的分子及其抗原结合片段。在一些实施方案中，此类分子是特异性结合至IL-21的抗体及其抗原-结合片段。还提供了相关的多核苷酸、包含抗-IL-21抗体或其抗原结合片段的组合物及制备抗-IL-21抗体和抗原结合片段的方法。还提供了使用新型抗-IL-21抗体的方法，诸如治疗受试者中的炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的方法及诊断用途。
为了使本发明更容易理解，首先定义了某些术语。另外的定义在详述全文示出。
I.定义
如该说明书和随附权利要求所用，除非上下文明确地另外规定，否则单数形式“一个(an)””、“一种””和“所述(the)””包括复数指代物。术语“一个””(或”一种””)以及术语“一个或多个””和“至少一个””可在本文互换使用。
此外，“和/或”被认为特定公开具有或没有另一个的两个指定特征或组分的每一者。因此，如在短语诸如”A和/或B”中所用的术语”和/或””意在包括”A和B”、”A或B”、”A”(单独)和”B”(单独)。类似地，如在诸如”A、B和/或C”的短语中所用的术语”和/或”意在涵盖以下实施方案的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。例如，生物医学和分子生物学简明字典(Concise Dictionary of Biomedicin e and Molecular Biology，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC Press)；细胞和分子生物学字典(The Dictionary of Cell and MolecularBiology，第3版，1999，Academic Press)；和生物化学和分子生物学牛津字典(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology，修订版，2000，OxfordUniversity Press)为技术人员提供了本发明所用的许多术语的通用字典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(Systeme International de Unites(SI))可接受的形式表示。数字范围包含定义范围的数字。除非另外说明，否则氨基酸序列从左向右以氨基至羧基取向书写。本文提供的标题并非限制本发明的各个方面或实施方案，其可通过参考说明书整体而得到。对应地，下文立即定义的术语通过参考说明书全文来更完整地定义。
每当实施方案用措辞“包含/包括”描述时，还以其它方式提供了“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语中所述的类似实施方案。
氨基酸在本文中通过其普遍已知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一字母符号来指代。类似地，核苷酸通过其普遍认可的单字符编码指代。
术语“IL-21”是指细胞因子白细胞介素-21和/或其活性片段。IL-21结合至免疫***的各种不同细胞上的IL-21受体，从而如本文其它部分描述的那些细胞中的信号转导。IL-21已在最常见的动物模型***中表征。人IL-21的cDNA和氨基酸序列可见于如GenBank登录号BC066260.1(SEQ ID NO：l)和AAH69124.1(SEQ ID NO：2)。食蟹猴(食蟹猕猴(Macacafascicularis))IL-21的cDNA和氨基酸序列可见于如美国专利申请公布No.2008-0267910A1(通过引用以其整体并入本文)的SEQ ID NO：3(SEQ ID NO：3)和SEQ ID NO：4(SEQ ID NO：4)。
术语“抑制”、”“阻断”和“遏制”在本文中可互换使用且是指任何统计学上显著的生物活性减少，包括活性完全阻断。例如，“抑制”可指代生物活性减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。对应地，当应用术语“抑制””或“遏制””描述如对IL-21信号转导途径的作用、如对在IL-21的存在下表达IL-21受体(IL-21R)的细胞中的信号转导的作用(如STAT3磷酸化、在NK细胞中产生干扰素-γ(IFN-γ)、B细胞分化为血浆细胞或者抑制IL-21-驱动的人初始CD4+T-细胞增殖)时，该术语是指IL-21结合分子、如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段通过IL-21R相对于未处理(对照)的细胞中的信号转导在统计学上显著减少IL-21-诱导的信号转导的能力。表达IL-21R的细胞可为天然存在的细胞或细胞系(如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞或另一种类型的淋巴样细胞)或可通过将编码IL-21R的核酸引入至宿主细胞中重组产生。在一个实施方案中，如例如通过流式细胞术、蛋白质印迹、ELISA或如下文实施例中所述的其它测定，IL-21结合分子(如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段)可在IL-21R-表达细胞中将IL-21-介导的信号转导抑制至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或约100％。
如可在本文中互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括全抗体及其任何抗原结合片段或单链。
典型的抗体包含通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C1组成。VH区和VL区可进一步细分为穿插有更保守的区域(称作框架区(FW))的高变区(称作互补决定区(CDR))。每个VH和VL由按以下顺序从氨基端至羧基端排列的三个CDR和四个FW组成：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(如效应细胞)和典型补体***的第一组分(C1q))的结合。本公开的示例性抗体包括杂交瘤-产生的鼠单克隆抗体19E3、9F11、8H10和8B6，这些抗体的人源化、亲和力优化的、种系化形式和/或其它形式，及血清半衰期-优化的抗-IL-21YTE抗体(如K44Vha-N56QK44Vha6-N56Q或K2Ha-N56Q)。
术语“种系化”意指抗体内特定位置处的氨基酸经突变回至种系中的那些氨基酸。
术语“抗体”可指代通过免疫球蛋白分子可变区内至少一个抗原识别位点识别且特异性结合至靶标(诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述各物的组合)的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体，诸如从至少两种完整抗体产生的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白质及任何其它包含抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体展现所需的生物活性。基于分别被称为α、δ、ε、γ和μ的其重链恒定结构域的身份，抗体可具有任五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可为裸的或缀合至其它分子，诸如毒素、放射性同位素等。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是一种抑制或减少其结合的抗原的生物活性的抗体，诸如IL-21。在某些方面，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。所需地，生物活性被减少10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
术语“IL-21抗体”或“结合至IL-21的抗体”或“抗-IL-21”是指能够以足够的亲和力结合IL-21，使得该抗体可用作靶向IL-21的治疗剂或诊断试剂的抗体。如通过放射免疫测定(RIA)、
Figure BDA0001172282280000201
(使用重组IL-21作为分析物且使用抗体作为配体，或反之亦然)、
Figure BDA0001172282280000202
或本领域已知的其它结合测定所测量，抗-IL-21抗体与不相关的非-IL-21蛋白质的结合程度小于抗体与IL-21的结合的约10％。在某些实施方案中，结合至IL-21的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤10pM、≤1pM或≤0.1pM的解离常数(KD)。
术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分，且是指完整抗体的互补决定可变区。全长抗体的片段可为抗体的抗原结合片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、直链抗体、单链抗体(如ScFv)和从抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”(mAb)是指参与高度特异性识别和结合单一抗原决定簇或表位的同质抗体群体。这与通常包含针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白质及任何其它包含抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以许多方法制备的此类抗体，所述方法包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达及转基因动物。
术语“人源化抗体”是指经工程化以含有最少的非人(如鼠)序列的源自非人(如鼠)免疫球蛋白的抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的具有所需的特异性、亲和力和能力的CDR的残基替代(Jones等，1986，Nature，321:522-525；Riechmann等，1988，Nature，332:323-327；Verhoeyen等，1988，Science，239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FW)残基被来自非人物种的具有所需的特异性、亲和力和能力的抗体内对应的残基替代。
人源化抗体可通过取代Fv框架区内和/或经替代的非人残基内的另外的残基来进一步修饰，以精炼和优化抗体特异性、亲和力、和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常两个或三个可变结构域(所述可变结构域含有所有或基本上所有的对应于非人免疫球蛋白的CDR区)，而所有或基本上所有的FR区是具有人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可包含至少一部分的免疫球蛋白的恒定区或结构域(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利No.5,225,539或No.5,639,641中。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。重链和轻链的可变区各由通过三个还称为高变区的互补决定区(CDR)连接的四个框架区(FW)组成。各链中的CDR通过FW区紧密邻近保持在一起，并且与来自另一链的CDR一起帮助形成抗体的抗原结合位点。至少有两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991，NationalInstitutes of Health，Bethesda Md.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。此外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
Kabat编号***通常当指代可变结构域中的残基(约为轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(如，Kabat等，Sequences of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。
如在Kabat中的氨基酸位置编号是指在Kabat等的Sequences of Proteins ofImmunological Interest(第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991))中用于抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际直链氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或者***的更少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包含在H2的残基52之后的单个氨基酸***物(根据Kabat的残基52a)和在重链FW残基82之后***的残基(如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。
表1
Figure BDA0001172282280000221
可通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区处的比对来测定给定抗体的残基Kabat编号。Chothia反而是指结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。Chothia CDR-H1环的末端当使用Kabat编号惯例编号时在H32与H34之间变化，这取决于环长度(这是因为Kabat编号图解将***置于H35A和H35B处；如果35A和35B两者均不存在，则环在32处终结；如果仅35A存在，则环在33处终结；如果35A和35B两者均存在，则环在34处终结)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷物，并且由OxfordMolecular’s AbM抗体建模软件采用。参见表1。
IMGT(ImMunoGeneTics)还提供了包括CDR的免疫球蛋白可变区的编号***。参见如Lefranc,M.P.等的Dev.Comp.Immunol.27：55-77(2003)，其通过引用并入本文。IMGT编号***基于超过5000条序列、结构数据和高变环表征的比对，并且使得能够容易比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号图解，VH-CDR1在位置26至35处、VH-CDR2在位置51至57处、VH-CDR3在位置93至102处、VL-CDR1在位置27至32处、VL-CDR2在位置50至52处且VL-CDR3在位置89至97处。
如说明书全文所用，所述的VH CDR序列对应于经典的Kabat编号位置，即KabatVH-CDR1在位置31-35处、VH-CDR2在位置50-65处且VH-CDR3在位置95-102处。VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3还分别对应于经典的Kabat编号位置，即位置24-34、50-56和89-97。
术语“人抗体”意指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一条人重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链两者的可变区对应于源自一个哺乳动物物种(如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和/或能力的抗体的可变区，而恒定区与源自另一物种(通常是人)的抗体中的序列同源，从而避免在该物种中引发免疫应答。
术语“YTE”或“YTE突变体”是指IgG1Fc中导致结合至人FcRn增加且提高具有突变的抗体的血清半衰期的突变。YTE突变体包含引入至IgG1的重链中的三种突变的组合M252Y/S254T/T256E(EU编号Kabat等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，美国公共健康服务中心(U.S.Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，华盛顿)。参见美国专利No.7,658,921，其通过引用并入本文。YTE突变体已显示与相同抗体的野生型类型相比，将抗体的血清半衰期增加约四倍(Dall’Acqua等，J.Biol.Chem.281:23514-24(2006)；Robbie等(2013)Antimicrob.AgentsChemother.57,6147-6153)。还参见美国专利No.7,083,784，其在此通过引用整体并入。
“结合亲和力”通常是指分子(如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映了结合对成员(如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的方法测量，包括本文所述的那些方法。低-亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于稳定解离，而高-亲和力抗体通常更快结合抗原并倾向于保持更久的结合。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任一种可用于本发明的目的。
除非另外说明，否则“效价”通常表示为以nM或pM计的IC50值。IC50是抗体分子的中值抑制浓度。在功能性测定中，IC50是将生物应答减少50％的其最大值的浓度。在配体-结合研究中，IC50是将受体结合减少50％的最大特异性结合水平的浓度。IC50可通过本领域已知的许多方法计算。
本发明的抗体或多肽与参考抗体相比效价改进的倍数可为至少约2倍、至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍或至少约180倍或更大。
“抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种形式的细胞毒性，其中结合至某些细胞毒性细胞(如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的经分泌的Ig，使得这些细胞毒性效应细胞可特异性结合至携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞。针对靶细胞表面的特异性高-亲和力IgG抗体“武装”细胞毒性细胞且绝对为此类杀死所需。靶细胞的裂解是细胞内的，需要直接的细胞-与-细胞接触，并且不涉及补体。考虑的是除了抗体之外，具有特异性结合至携带抗原的靶细胞的能力的其它包含Fc区的蛋白质(特别是Fc融合蛋白质)将能够实现细胞-介导的细胞毒性。为了说明简便，由Fc融合蛋白质活性导致的细胞-介导的细胞毒性在本文中还被称为ADCC活性。
“经分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是非天然存在的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至一定程度使得它们不再为天然存在形式的那些。在一些实施方案中，经分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞、或组合物基本上是纯的。
所谓“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指任何需要诊断、预后或治疗的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家养动物、农场动物、竞技动物和动物园动物，包括如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
术语“药物组合物”是指呈允许活性成分的生物活性有效的形式且不含对将施用所述组合物的受试者有不可接受毒性的另外组分的制剂。此类组合物可为无菌的。
如本文公开的抗体的“有效量”是足以进行特别指定目标的足够量。“有效量”可根据经验和常规方式确定，这与指定的目标有关。
词语“标签”当在本文中使用时是指直接或间接缀合至抗体以便产生“标记的”抗体的可检测的化合物或组合物。标签自身可检测(如放射性同位素标签或荧光标签)，或在酶促标签的情况下，可催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。
术语诸如“治疗(treating，treatment，to treat)”或“缓解(alleviating，toalleviate)”是指治愈、减缓、减轻症状和/或诊断的病理性疾患或病症的症状、和/或使诊断的病理性疾患或病症的进展停止的治疗性措施。因此，需要治疗的那些人包括已经患有病症的那些人。在某些实施方案中，如果患者显示出如与疾病或病症相关的症状总体、部分或暂时缓解或消除，则根据本文提供的方法成功地“治疗”了受试者的炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症。
“预防(Prevent，Prevention)”是指预防或减缓所靶向的病理疾患或病症的发展的预防性或预防措施。因此，需要预防的那些人包括更易于患有病症或对病症易感的那些人。在某些实施方案中，如果与尚未经受本发明的方法的患者相比，患者如暂时或永久出现更少或更轻的与疾病或病症相关的症状，或者与疾病或病症相关的症状发作更晚，则根据本文提供的方法成功预防炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症。
如本文所用的“多核苷酸”可包括一种或多种“核酸”、“核酸分子”或“核酸序列”，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物且包括DNA和RNA。多核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物或可被DNA或RNA聚合酶掺入至聚合物中的任何基质。多核苷酸可包括经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。前文描述适用于本文指代的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”意指能够在宿主细胞中递送和在一些实施方案中表达一种或多种目标基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、脂质体中包裹的DNA或RNA表达载体及某些真核细胞，诸如生产细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸聚合物。多肽可为直链或支链，它可包含经修饰的氨基酸，且非-氨基酸可中断它。该术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义中还包括，例如，含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应理解的是，由于本发明的多肽是基于抗体的，因此在某些实施方案中，该多肽可作为单链或缔合链存在。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“同一的”或“同一性”百分比是指为了最大对应性比较和比对(如果需要则引入空位)时，不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的部分，相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两条或更多条序列或子序列。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。可用来获得氨基酸或核苷酸序列的比对的多种算法和软件是本领域已知的。
序列比对算法的一个此类非限制性实例是Karlin等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中所述的算法，如在Karlin等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中修改，并并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等，1991，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402)。在某些实施方案中，空位BLAST可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等，1996，Methods in Enzymology，266:460-480)，ALIGN、ALIGN-2(Genentech，South SanFrancisco，加利福尼亚)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的另外可公开获得的软件程序。在某些实施方案中，两条核苷酸序列之间的同一性百分比使用GCG软件包中的GAP程序测定(如使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或90的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重)。在某些可替代的实施方案中，GCG软件包中的包括Needleman和Wunsch算法的GAP程序(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))可用于测定两条氨基酸序列之间的同一性百分比(如使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的的空位权重及1、2、3、4、5的长度权重)。可替代地，在某些实施方案中，核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比使用Myers和Miller算法测定(CABIOS，4:11-17(1989))。例如，同一性百分比可使用ALIGN程序(2.0版)且使用PAM120(其具有残基表、空位长度罚分为12和空位罚分为4)测定。本领域的技术人员可通过特定比对软件测定适当的参数用于最大比对。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。
在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的同一性百分比“X”被计算为100x(Y/Z)，其中Y是第一序列与第二序列的比对中评分为同一性匹配的氨基酸残基的数目(如通过目视检查或特定序列比对程序比对)且Z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基替代的一种取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域定义，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，取代苯丙氨酸为酪氨酸是保守取代。在某些实施方案中，本发明的多肽和抗体的序列中的保守取代不消除含该氨基酸序列的多肽或抗体对抗原的结合，抗原即该多肽或抗体结合的IL-21。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见如Brummell等，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；及Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:412-417(1997))。
II.抗-IL-21-结合分子
本发明提供了IL-21结合分子，如特异性结合IL-21的抗-IL-21抗体及其抗原结合片段。IL-21的全长氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列是本领域已知的。分别对于人IL-21参见如GenBank登录号BC066260.1(SEQ ID NO：1)和AAH69124.1(SEQ ID NO：2)或者对于食蟹猴(食蟹猕猴)IL-21参见美国专利申请公布No.2008-0267910A1(分别为SEQ ID NO：3和4)。在一些实施方案中，IL-21结合分子，如本文提供的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段是鼠抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施方案中，IL-21结合分子是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，IL-21结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab’)3、四抗体、三抗体、二抗体、单-结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。在一些实施方案中，抗体属于IgG1亚型且包含三重突变体YTE，同上在定义部分所公开。实施例部分的表2中提供了某些抗-IL-21抗体或其片段。
在某些方面，本公开提供了IL-21结合分子或其抗原-结合片段，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，其可特异性结合至与包含19E3、9F11、8B6或9H10的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段相同的IL-21表位。还提供了IL-21结合分子或其抗原结合片段，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，其可竞争性抑制或可比包含19E3、9F11、8B6或9H10的VH和VL的抗体或其抗原结合片段以更高亲和力结合至IL-21。如本文所提供，19E3的VH和VL分别包含SEQ ID NO：6和11，9F11的VH和VL分别包含SEQ ID NO：28和33，8B6的VH和VL分别包含SEQ ID NO：42和47，且9H10的VH和VL分别包含SEQ ID NO：52和57。
本公开还提供了IL-21结合分子或抗原结合片段，如包含抗体VL区的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段。在某些方面，VL区包含一个、两个或三个VL-CDR，诸如与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：58相同的或者除了八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与其相同的VLCDR1，与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：59相同的或者除了八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与其相同的VLCDR2，或与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：60相同的或者除了八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与其相同的VLCDR3。在某些方面，VL区含有分别与以下序列相同或者除了在一个或多个VL-CDR中有八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13和14，SEQ ID NO：34、35和36，SEQ ID NO：48、49和50，或SEQ ID NO：58、59和60。在某些方面，VL区包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：57至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
还提供了特异性结合至IL-21的结合分子或其抗原结合片段，如包含抗体VH区的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段。在某些方面，VH区包含一个、两个或三个VH-CDR，诸如与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：53相同的或者除了八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与其相同的VHCDR1，与SEQ ID NO：8、SEQID NO：30、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：54相同的或者除了八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与其相同的VHCDR2，或与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：31、SEQID NO：45或SEQ ID NO：55相同的或者除了八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与其相同的VHCDR3。在某些方面，VH区含有分别与以下序列相同或者除了在一个或多个VH-CDR中具有八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：7、8和9，SEQ IDNO：29、30和31，SEQ ID NO：43、44和45或SEQ ID NO：53、54和55。在某些方面，VH区包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：52至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在特定方面，本文提供的IL-21结合分子包括抗-IL-21抗体或其抗原结合片段。例如，本公开提供了特异性结合至IL-21的包含VL区和VH区的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中VL和VH共同含有分别与以下序列相同或除了在一个或多个CDR中具有八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13、14、7、8和9，SEQ IDNO：34、35、36、29、30和31，SEQ ID NO：48、49、50、43、44和45，或SEQ ID NO：58、59、60、53、54和55。
例如，本公开提供了特异性结合至IL-21的包含VL区和VH区的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中VH和VL分别含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11、SEQID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：38和SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：37和40、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：47、或SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：57至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在一方面，本公开提供了抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，其包含K44Vha-N56Q的VH和VL，VH氨基酸序列SEQ ID NO：19和VL氨基酸序列SEQ ID NO：21。
例如，如上文所述的本文提供的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可为如鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体或其任何组合。抗-IL-21抗体抗原结合片段可为Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、dsFv片段、scFv片段或sc(Fv)2片段。
在一方面，本公开提供了可跨物种结合至IL-21分子的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，如抗体或片段可结合至小鼠IL-21、大鼠IL-21、兔IL-21、人IL-21和/或食蟹猴IL-21。例如，抗体或片段可结合至人IL-21和食蟹猴IL-21。在一个另外的实例中，抗体或片段还可结合至小鼠IL-21。
IL-21受体与多种其它细胞因子受体、如IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-9R和IL-15R共享共有的γ链。在本文提供的某些实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可特异性结合至IL-21、如人IL-21和食蟹猴IL-21和小鼠IL-21，但不特异性结合至人IL-2、IL-4、IL-7、IL-9或IL-15。
例如，如上所述的本文提供的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可包括除了VH和VL之外的重链恒定区或其片段。在某些方面，重链恒定区是人重链恒定区，如人IgG恒定区，如人IgG1恒定区。如本文的其它地方所述，在某些方面，重链恒定区或其片段、如人IgG恒定区或其片段可包含相对于野生型IgG恒定结构域的一个或多个氨基酸取代，其中与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，经修饰的IgG具有增加的半衰期。例如，IgG恒定结构域可含有在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸位置编号根据如在Kabat示出的EU指数。在某些方面，IgG恒定结构域可含有以下一个或多个取代：用酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或苏氨酸(T)取代Kabat位置252处的氨基酸，用苏氨酸(T)取代在Kabat位置254处的氨基酸，用丝氨酸(S)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)或苏氨酸(T)取代在Kabat位置256处的氨基酸，用亮氨酸(L)取代在Kabat位置257处的氨基酸，用脯氨酸(P)取代在Kabat位置309处的氨基酸，用丝氨酸(S)取代在Kabat位置311处的氨基酸，用苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或丝氨酸(S)取代在Kabat位置428处的氨基酸，用精氨酸(R)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或谷氨酰胺(Q)取代在Kabat位置433处的氨基酸，或者用色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸取代在Kabat位置434处的氨基酸。更特定地，IgG恒定结构域可含有相对于野生型人IgG恒定结构域的氨基酸取代，包括用酪氨酸(Y)取代在Kabat位置252处的氨基酸、用苏氨酸(T)取代在Kabat位置254处的氨基酸和用谷氨酸(E)取代在Kabat位置256处的氨基酸。
本公开提供了抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，其中重链是人IgG1YTE突变体，如重链可包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：24至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的重链氨基酸序列。
例如，如本文所述的本文提供的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可包含除了VH和VL以及任选的重链恒定区或其片段之外的轻链恒定区或其片段。在某些方面，轻链恒定区是κλ轻链恒定区，如人κ恒定区或人λ恒定区。在一个特定方面，轻链恒定区是人κ恒定区。
本公开提供了抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，其中轻链含有人κ恒定区，如轻链可包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：26至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％相同的轻链氨基酸序列。在某些方面，本公开提供了包含人IgG1YTE重链和人κ轻链、或其任何抗原结合片段的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段，其中抗体分别由SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26组成。
本文提供的抗-IL-21抗体或其片段可具有有益性质。例如，该抗体或其片段可抑制、遏制或阻断IL-21结合至如在T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或树突细胞上表达的或者在非-淋巴样细胞中重组表达的IL-21受体。作为另一个实例，该抗体或片段可抑制人IL-21或食蟹猴IL-21结合至人IL-21或食蟹猴IL-21受体，但不抑制小鼠IL-21结合至小鼠IL-21受体。此类抗-IL-21抗体或其片段还可抑制、遏制或阻断各种IL-21-介导的活性，即该抗体或片段可为IL-21活性的拮抗剂。在某些方面，本文提供的抗-IL-21抗体或其片段可抑制、遏制或阻断Jak/STAT途径中的IL-21-介导的磷酸化，如抑制、遏制或阻断IL-21R-表达细胞中(如人外周血单核细胞(PBMC)中)的STAT3磷酸化。
在某些方面，如本文提供的抗-IL-21抗体或其片段可抑制、遏制或阻断IL-21-介导的由NK细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)。此类抑制可来自天然存在的NK细胞(如人NK细胞)或经培养的NK细胞(如NK-92细胞)。
在特定方面，本文提供的抗-IL-21抗体或其片段可抑制、遏制或阻断体液免疫应答期间的IL-21-介导的B细胞激活、分化或死亡。例如，本文提供的抗-IL-21抗体或其片段可抑制、遏制或阻断IL-21-介导的B细胞(经刺激的B细胞)分化为血浆细胞。本文提供的某些抗体可抑制、遏制或阻断人和食蟹猴IL-21-介导的经刺激的B细胞分化为血浆细胞。在某些方面，B细胞可为其上外源添加了IL-21的经分离的B细胞。在其它方面，B细胞可与表达IL-21的经激活的CD4+T细胞天然或通过共培养接触。在其它方面，人B细胞可与表达IL-21的经激活的CD4+T细胞天然或通过共培养接触。
在某些方面，如本文提供的抗体或其抗原结合片段可以特征在于如在动力学排除测定(KinExA)3000平台上所测量的约100pM至约0.1pM的解离常数(KD)的结合亲和力结合至IL-21。
在某些方面，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可以如通过
Figure BDA0001172282280000341
或
Figure BDA0001172282280000342
测量的小于10-6M、或小于10-7M、或小于10-8M、或小于10-9M、或小于10-10M、或小于10-11M、或小于10-12M、或小于10-13M、或小于10-14M、或小于10-15M的解离常数或KD特异性结合至IL-21(如人IL-21或食蟹猴IL-21)及其抗原片段。在一方面，人源化抗-IL-21抗体K44Vha-N56Q可如通过
Figure BDA0001172282280000343
测量以约515fM(515x 10-15M)的KD结合至人IL-21和以约352fM(352x 10-15M)的KD结合至食蟹猴IL-21。
在另一个实施方案中，本发明的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段以小于1x10-3s-1或小于2x10-3s-1的Koff(解离速率常数)结合至IL-21和/或其抗原片段。在其它实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段以如通过
Figure BDA0001172282280000344
或
Figure BDA0001172282280000345
所测量的小于10- 3s-1、小于5x10-3s-1、小于10-4s-1、小于5x 10-4s-1、小于10-5s-1、小于5x 10-5s-1、小于10-6s-1、小于5x 10-6s-1、小于小于5x 10-7s-1、、小于10-8s-1、小于5x 10-8s-1、、小于10-9s-1、小于5x10-9s-1或小于10-10s-1的Koff结合至IL-21及其抗原片段。
在另一个实施方案中，本发明的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段以如通过
Figure BDA0001172282280000346
或
Figure BDA0001172282280000347
测量的至少105M-1s-1、至少5x105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5x106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5x107M-1s-1或至少108M-1s-1或至少109M-1s-1的缔合速率常数或Kon率结合至IL-21和/或其抗原片段。
如上所指出，VH和/或VL氨基酸序列可为如与本文示出的序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似，和/或包含相对于本文示出的序列的1个、2个、3个、4个、5个或多个取代(如保守取代)。具有VH区和VL区(其与VH区或VL区具有一定百分比相似性或具有一个或多个取代(如保守取代))的IL-21抗体可通过以下步骤获得：编码本文所述的VH区和/或VL区的核酸分子的诱变(如定点或PCR-介导的诱变)，然后是测试经编码的改变抗体结合至IL-21且使用本文所述的功能测定任选地测试保留的功能。
抗体对抗原的亲和力或亲合力可使用本领域熟知的任何适合的方法通过实验测定，如流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)或动力学(如
Figure BDA0001172282280000351
或BIACORETM分析)。可容易采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式(参见例如Berzofsky等“Antibody-Antigen Interactions”In Fundamental Immunology，Paul,W.E.编辑，Raven Press：New York，N.Y.(1984)；Kuby，Immunology，W.H.Freeman andCompany：New York，N.Y.(1992)；及本文所述的方法)。如果在不同的条件(如盐浓度、pH、温度)下测量，则经测量的特定抗体-抗原相互作用亲和力可变化。因此，亲和力和其它抗原结合参数(如KD或Kd、Kon、Koff)的测量用如本领域已知的抗体和抗原的标准化溶液及标准化缓冲液和诸如本文所述的缓冲液进行。
本公开还提供了如上所述的抗-IL-21抗体或其片段，其中抗体缀合至异源剂。在某些方面，该试剂可为抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物反应调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标签、聚乙二醇(PEG)或任何两种或更多种所述试剂的组合。异源缀合物抗-IL-21抗体在本文的其它地方更详细地讨论。
在某些实施方案中，IL-21-结合分子是非抗体的多肽。用于鉴定和产生以高亲和力结合至蛋白质靶标的非-抗体多肽的多种方法是本领域已知的。参见如Skerra，Curr.Opin.Biotechnol.，18:295-304(2007)；Hosse等，Protein Science，15:14-27(2006)；Gill等，Curr.Opin.Biotechnol.；17:653-658(2006)；Nygren，FEBS J.，275:2668-76(2008)；及Skerra，FEBS J.，275:2677-83(2008)，其各自通过引用以其整体并入。在某些实施方案中，噬菌体展示技术可用于鉴定/产生IL-21-结合多肽。在某些实施方案中，该多肽包括选自以下组成的组的类型的蛋白质支架：蛋白质A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白。
III.结合至与本发明的抗-IL-21抗体及其抗原结合片段相同的表位的结合分子
在某些实施方案中，本公开提供了IL-21-结合分子，如结合至与本文所述的各种抗-IL-21抗体结合的表位相同的表位的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段。如本文所用的术语“表位”是指能够结合至本发明的抗体的靶蛋白质决定簇。表位通常由化学活性表面分组的分子(诸如氨基酸或糖侧链)组成，且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下丢失与前者而非后者的结合。此类抗体可根据其在标准IL-21结合或活性测定中与诸如19E3、9F11、9H10或8B6的抗体交叉竞争(如以统计学显著的方式竞争性抑制结合)的能力鉴定。因此，在一个实施方案中，本发明提供了抗-IL-21抗体及其抗原结合片段，如与本发明的另一种抗-IL-21抗体或其抗原结合片段(诸如如本文所公开的鼠单克隆抗体19E3、9F11、9H10或8B6或者人源化变体)竞争结合至IL-21的单克隆抗体。测试抗体抑制如19E3、9F11、9H10或8B6的结合的能力表明测试抗体可与该抗体竞争结合至IL-21；此类抗体可根据非限制性理论结合至IL-21上与同其竞争的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段相同或相关(如结构类似或空间邻近)的表位。在一个实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段结合至IL-21上与如鼠单克隆抗体19E3、9F11、9H10或8B6相同的表位。
IV.IL-21结合分子的活性
在一些实施方案中，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可遏制IL-21R-表达细胞中IL-21-介导的信号转导。例如，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可遏制IL-21-介导的STAT3磷酸化。此外，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原-结合片段可遏制由NK细胞产生IFNγ。此外，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可抑制经刺激的B细胞分化为血浆细胞。
在一些实施方案中，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过流式细胞术测量以低于约500pM、低于约350pM、低于约250pM、低于约150pM、低于约100pM、低于约75pM、低于约60pM、低于约50pM、低于约40pM、低于约30pM、低于约20pM、低于约15pM、低于约10pM或低于约5pM的IC50遏制IL-21R-表达细胞(如PBMC)中IL-21-介导的STAT3磷酸化。在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过流式细胞术测量以约22pM、约19pM、约17pM、约14pM、约13pM、约12pM、约6pM、约5pM或约3pM的IC50遏制IL-21R-表达细胞(如PBMC)中的人IL-21-介导的STAT3磷酸化。在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过流式细胞术测量以约52pM、约51pM、约46pM、约19pM、约16pM、约10pM或约6pM的IC50遏制IL-21R-表达细胞(如PBMC)中的食蟹猴IL-21-介导的STAT3磷酸化。
在一些实施方案中，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过MSD人IFNγ单重测定测量以低于约100pM、低于约400pM、低于约100pM、低于约75pM、低于约60pM、低于约50pM、低于约40pM、低于约30pM、低于约20pM、低于约15pM、低于约10pM或低于约5pM的IC50遏制IL-21-介导的由NK细胞产生IFNγ。在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过MSD人IFNγ单重测定测量以约99pM、约93pM、约55pM、约41pM或约20pM的IC50遏制人IL-21-介导的由NK-92细胞系产生IFNγ。在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过MSD人IFNγ单重测定测量以约83pM、约81pM、约60pM、约37pM或约3pM的IC50遏制食蟹猴IL-21-介导的由NK-92细胞系产生IFNγ。
在一些实施方案中，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过流式细胞术或ELISA测量以低于约150nM、低于约75nM、低于约50nM、低于约30nM、低于约10nM、低于约1600pM、低于约1400pM、低于约1000pM、低于约800pM、低于约700pM或低于约600pM的IC50遏制IL-21-介导的经刺激的B细胞(如用抗-CD40和抗-IgM F(ab’)2刺激的初始B细胞和/或B记忆细胞)分化为血浆细胞(如产生IgG的血浆细胞)。在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过流式细胞术或ELISA测量以约115nM、约47nM、约1.5nM、约777pM、约618pM或约573pM的IC50遏制人IL-21-介导的经刺激的B细胞(如用抗-CD40和抗-IgM F(ab’)2刺激的初始B细胞和/或B记忆细胞)分化为血浆细胞(如产生IgG的血浆细胞)。在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可如通过流式细胞术或ELISA测量以约74nM、约30nM、约9nM、约1.3nM、约1.0nM、约775pM或约659pM的IC50遏制食蟹猴IL-21-介导的经刺激的人B细胞(如用抗-CD40和抗-IgM F(ab’)2刺激的初始B细胞和/或B记忆细胞)分化为血浆细胞(如产生IgG的血浆细胞)。在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可遏制食蟹猴IL-21-介导的经刺激的B细胞分化为血浆细胞，但不遏制人IL-21-介导的B细胞分化为血浆细胞。
在某些方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可遏制由激活的CD4+T细胞驱动的B细胞分化为血浆细胞，该激活的CD4+T细胞产生共刺激分子(诸如CD40L)和B细胞趋向性细胞因子(诸如IL-21)。在其它方面，IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可抑制IL-21-驱动的人初始CD4+T细胞的增殖。
V.抗-IL-21抗体和抗原结合片段的制备
单克隆抗-IL-21抗体可使用杂交瘤方法制备，诸如由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495描述的那些方法。使用杂交瘤方法，如上所述使小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物免疫以引发淋巴细胞产生将特异性结合至免疫抗原的抗体。淋巴细胞还可被体外免疫。在免疫后，将淋巴细胞分离并使用例如聚乙二醇与适合的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞，然后可将杂交瘤细胞从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选出来。然后，如通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))测定，产生特异性针对选定抗原的单克隆抗体的杂交瘤可使用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，Academic Press，1986)在体外培养或在动物中体内繁殖为腹水瘤。然后可如上文对多克隆抗体所述，从培养基或腹水液纯化单克隆抗体。
可替代地，抗-IL-21单克隆抗体还可如美国专利No.4,816,567所述使用重组DNA方法制备。编码单克隆抗体的多核苷酸诸如通过使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物的RT-PCR从成熟B-细胞或杂交瘤细胞分离，并且使用常规程序测定其序列。然后将经分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到适当的表达载体中，当将该表达载体转染到诸如大肠杆菌、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞的不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中时，由该宿主细胞产生单克隆抗体。此外，所需物种的重组抗-IL-21单克隆抗体或其抗原结合片段可从表达如所述的所需物种的CDR的噬菌体展示文库分离CDR(McCafferty等(1990)Nature，348:552-554；Clackson等(1991)Nature，352:624-628；和Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597)。
编码抗-IL-21抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可使用重组DNA技术以多种不同的方式被进一步修饰以产生可替代的抗体。在一些实施方案中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可被取代为：(1)例如人抗体的那些区以产生嵌合抗体，或者(2)非-免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方案中，恒定区被截短或去除以产生单克隆抗体的所需的抗体片段。可变区的定点或高密度诱变可用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在某些实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段。人抗体可使用本领域已知的各种技术直接制备。可产生体外免疫的或从经免疫的个体分离的永生化人B淋巴细胞，所述永生化人B淋巴细胞产生针对靶抗原的抗体(参见如Cole等，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boemer等，1991，J.Immunol.，147(1):86-95；和美国专利5,750,373)。
此外，抗-IL-21人抗体或其抗原结合片段可选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达如例如在Vaughan等，1996，Nat.Biotech.，14:309-314；Sheets等，1998，Proc.Nat’l.Acad.Sci.，95:6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227:381及Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222:581中描述的人抗体。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利No.5,969,108、No.6,172,197、No.5,885,793、No.6,521,404、No.6,544,731、No.6,555,313、No.6,582,915、No.6,593,081、No.6,300,064、No.6,653,068、No.6,706,484和No.7,264,963；和Rothe等，2007，J.Mol.Bio.，doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(其各自通过引用以其整体并入)中。
亲和力成熟策略和链替换策略(Marks等，1992，Bio/Technology 10:779-783，其通过引用并入)是本领域已知的，且可用于产生高亲和力的人抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗-IL-21单克隆抗体可为人源化抗体。还可使用工程化、人源化或表面重塑非人抗体或人抗体的方法并且是本领域熟知的。人源化、表面重塑或类似工程化的抗体可具有非人(例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长动物或其它哺乳动物)来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基被通常被称为“引入”残基的残基替代，所述“引入”残基通常从已知的人序列的“引入”可变、恒定或其它的结构域取出。此类引入的序列可用于减少免疫原性或者减少、增强或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或如本领域已知的任何其它适合的特征。通常，CDR残基直接且大部分基本上参与影响IL-21结合。因此，保持部分或所有的非人或人CDR序列同时可将可变区和恒定区的非人序列用人氨基酸或其它氨基酸替代。
抗体还可任选地被人源化、表面重塑、工程化或人抗体工程化，同时保留对抗原IL-21的高亲和力和其它有利的生物特性。为了实现该目标，人源化(或人)或工程化抗-IL-21抗体和表面重塑抗体可任选地通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种常规人源化和工程化产物的方法制备。三维免疫球蛋白模型通常容易获得且为本领域技术人员所熟悉。可获得说明并展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些展示使得能够分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能化中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原(诸如IL-21)的能力的残基。这样，可从共有和引入序列选择并组合框架(FW)残基，使得获得所需的抗体特征，诸如增加的对靶标抗原的亲和力。
本发明的抗-IL-21抗体或其抗原-结合片段的人源化、表面重塑或工程化可使用任何已知的方法进行，所述方法诸如但不限于以下文献中描述的那些：Jones等，Nature321:522(1986)；Riechmann等，Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534(1988)；Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901(1987)；Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151:2623(1993)，美国专利No.5,639,641、No.5,723,323、No.5,976,862、No.5,824,514、No.5,817,483、No.5,814,476、No.5,763,192、No.5,723,323、No.5,766,886、No.5,714,352、No.6,204,023、No.6,180,370、No.5,693,762、No.5,530,101、No.5,585,089、No.5,225,539、No.4,816,567、No.7,557,189、No.7,538,195和No.7,342,110；国际申请PCT/US98/16280、PCT/US96/18978、PCT/US91/09630、PCT/US91/05939、PCT/US94/01234、PCT/GB89/01334、PCT/GB91/01134、PCT/GB92/01755；国际专利申请公布W090/14443、W090/14424、W090/14430；和欧洲专利公布No.EP229246；其各自通过引用整体并入本文，包括其中引用的参考文献。
抗-IL-21人源化抗体及其抗原结合片段还可在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小中制备，所述人免疫球蛋白基因座能够在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下经免疫产生人抗体的全套抗体库。该方法描述于美国专利No.5,545,807、No.5,545,806、No.5,569,825、No.5,625,126、No.5,633,425和No.5,661,016中。
在某些实施方案中，提供了抗-IL-21抗体片段。已知用于产生抗体片段的技术。传统地，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化得到(例如Morimoto等，1993，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117；Brennan等，1985，Science，229:81)。在某些实施方案中，重组产生抗-IL-21抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段均可在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达且从其分泌，因此使得产生大量的这些片段。此类抗-IL-21抗体片段还可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离。抗-IL-21抗体片段还可为如美国专利No.5,641,870所述的直链抗体。其它用于产生抗体片段的技术将对有经验的从业者显而易见。
根据本发明，多个技术可适用于产生对IL-21有特异性的单链抗体(参见如美国专利No.4,946,778)。此外，多个方法可适用于构建Fab表达文库(参见如Huse等，Science246:1275-1281(1989))以使得快速且有效地鉴定对IL-21具有所需特异性的单克隆Fab片段或者其衍生物、片段、类似物或同系物。抗体片段可通过本领域的技术产生，其包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段；(b)通过减少F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab片段；(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段，及(d)Fv片段。
在某些方面，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可被修饰以增加其血清半衰期。这可例如通过经由抗体或抗体片段中适当的区突变将补救性受体结合表位掺入抗体或抗体片段中，或者通过将表位掺入肽标签中、然后将肽标签融合至任一端或中部的抗体或抗体片段(如通过DNA或肽合成)，或者通过YTE突变实现。其它增加抗体或其抗原结合片段的血清半衰期的方法(如缀合至异源分子，诸如PEG)是本领域已知的。
异源缀合物抗-IL-21抗体及其抗原结合片段也在本发明的范围内。异源缀合物抗体由两个共价连接的抗体组成。例如已经提出此类抗体以将免疫细胞靶向到不需要的细胞上(参见如美国专利No.4,676,980)。应考虑异源缀合物抗-IL-21抗体及其抗原结合片段可使用合成蛋白化学已知的方法体外制备，包括涉及交联剂的那些方法。例如，免疫毒素可使用二硫交换反应或通过形成二醚键来构建。适用于该目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸盐。
如本文提供的经修饰的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可包含提供抗体或多肽与IL-21缔合的任何类型的可变区。就此而言，可变区可包含或源自于任何类型的哺乳动物，所述哺乳动物可以被诱导而加强体液应答和产生针对所需的抗原的免疫球蛋白。这样，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段的可变区可以例如来源于人、鼠、非人灵长动物(如食蟹猴、猕猴等)或狼。在一些实施方案中，经修饰的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段的可变区和恒定区两者是来自人。在其它实施方案中，相容性抗体(一般来自于非人来源)的可变区可以经工程化或特异性化以改善该分子的结合性质或降低该分子的免疫原性。就此而言，可以通过包含引入的氨基酸序列而使对本发明有用的可变区人源化或以其它方式使该其改变。
在某些实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段的重链和轻链两者中的可变结构域通过至少部分替代一个或多个CDR和/或通过部分框架区替代和序列改变而改变。尽管CDR可源自与从中获得框架区的抗体相同类别或者甚至是亚类的抗体，但是设想到CDR将源自不同类别的抗体且在某些实施方案中源自不同物种的抗体。没有必要用来自供体可变区的完整CDR替代所有CDR以将一个可变结构域的抗原-结合能力转移至另一个。而是，只需要转移对维持抗原结合位点活性所必需的那些残基。鉴于美国专利No.5,585,089、No.5,693,761和No.5,693,762中所示出的解释，通过进行常规实验或通过试验和错误检测以获得具有减少的免疫原性的功能性抗体将在本领域的技术人员的能力内。
虽然改变了可变区，但是本领域技术人员应当理解，本发明的经修饰的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段将包括抗体(如全长抗体或其抗原结合片段)，其中当与具有近似相同的免疫原性、包含天然或未改变的恒定区的抗体相比时，一个或多个恒定区结构域的至少一部分已被缺失或以其它方式改变以提供所需的生物化学特征，诸如增加的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一些实施方案中，经修饰的抗体的恒定区将包括人恒定区。对与本发明相容的恒定区的修饰包括一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文公开的经修饰的抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)和/或轻链恒定结构域(CL)的一个或多个的改变或修饰。在一些实施方案中，考虑了经修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分或完全缺失。在一些实施方案中，经修饰的抗体将包含结构域缺失构建体或变体，其中整个CH2结构域已被移除(ΔCH2构建体)。在一些实施方案中，所省掉的恒定区结构域可被提供通常由缺失恒定区赋予的某些分子柔性的短氨基酸间隔子(如10个残基)替代。
除了其构型，本领域已知的是恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的C1组分结合至抗体激活补体***。补体的激活在细胞病原体的调理素作用(opsonisation)和裂解中是重要的。补体的激活还刺激炎性应答，并且还可参与自身免疫性超敏性。此外，抗体经由Fc区结合至细胞，其中抗体Fc区上的Fc受***点结合至细胞上的Fc受体(FcR)。有大量的对不同类别抗体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)具有特异性的Fc受体。抗体结合至细胞表面上的Fc受体触发了许多重要且多样的生物应答，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被靶细胞的裂解(被称为抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性或ADCC)、炎性介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白生成的控制。
在某些实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段提供改变的效应子功能，这继而影响了所施用的抗体或其抗原结合片段的生物特征。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可以减少循环中经修饰的抗体的Fc受体结合。在其它情况下，其可为与本发明一致的恒定区修饰减弱了补体结合并因此减小了经缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。恒定区的另外其它的修饰可用于消除允许由于增加的抗原特异性或抗体柔性导致的增强的定位的二硫键或寡糖部分。类似地，根据本发明对恒定区的修饰可使用完全在技术人员的领域内的熟知的生物化学或分子工程化技术容易地进行。
在某些实施方案中，为抗体或其抗原结合片段的-IL-21结合分子不具有一种或多种效应子功能。例如，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段没有抗体-依赖性细胞细胞毒性(ADCC)活性和/或没有补体-依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段不结合至Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段不具有效应子功能。
在某些实施方案中，抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可被工程化以直接将CH3结构域融合至分别经修饰的抗体或其片段的铰链区。在其它构建体中，肽间隔子可***铰链区与经修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达相容构建体，其中CH2结构域已被缺失且使剩余的CH3结构域(经修饰或未修饰)用5-20个氨基酸间隔子连接至铰链区。例如，可添加此类间隔子以确保恒定结构域的调节元件保持游离且可接近或者使铰链区保持柔性。在某些情况中，氨基酸间隔子可能证实具有免疫原性并引发针对该构建体的不需要的免疫应答。因此，在某些实施方案中，添加至构建体的任何间隔子可相对地不具有免疫原性或甚至一起省掉，以保持经修饰的抗体所需的生物化学性质。
除了缺失整个恒定区结构域，本文提供的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段还可通过部分缺失或取代恒定区中的一些或甚至单个氨基酸来修饰。例如，CH2结构域的所选区域中的单氨基酸突变可能足以显著减少Fc结合并由此增加肿瘤定位。类似地，控制效应子功能(如补体C1Q结合)的一个或多个恒定区结构域可完全或部分缺失。恒定区的此类部分缺失可以改善抗体或其抗原结合片段的所选特性(如血清半衰期)同时保留与主题恒定结构域关联的其它所需功能完整。此外，所公开的抗-IL-21抗体及其抗原结合片段的恒定区可通过增强所得构建体的特征的一个或多个氨基酸的突变或取代修饰。在这点上，可以破坏由保守的结合位点提供的活性(如Fc结合)，同时基本上保持经修饰的抗体或其抗原结合片段的构型和免疫原性特性。某些实施方案可包括添加一个或多个氨基酸至恒定区以增强所需特征，诸如减少或增加效应子功能，或者提供更多的细胞毒素或碳水化合物粘附。在此类实施方案中，可能需要***或复制源自选定的恒定区结构域的特异性序列。
本发明还包括与本文示出的鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗-IL-21抗体或其抗原结合片段基本同源的变体和等效物。这些可含有例如，保守取代突变，即用类似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指用在相同常见类别的另一种氨基酸取代氨基酸，诸如，例如用另一种酸性氨基酸取代一种酸性氨基酸、用另一种碱性氨基酸取代一种碱性氨基酸或者用另一种中性氨基酸取代一种中性氨基酸。保守氨基酸取代的预期目的是本领域熟知的。
抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可经进一步修饰以含有并非蛋白质一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可改善蛋白质的溶解度、生物半衰期或吸收。该部分还可以减少或消除该蛋白质等的任何所需的副作用。对这些部分的概述可见于Remington’sPharmaceutical Sciences，第20版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(2000)。
VI.编码IL-21-结合分子的多核苷酸及其表达
本公开提供了包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码特异性结合IL-21或其抗原结合片段的多肽。例如，本发明提供包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码抗-IL-21抗体或编码此类抗体的抗原结合片段。本发明的多核苷酸可呈RNA的形式或呈DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；且可为双链或单链，且如果是单链则可为编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方案中，可分离多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸可为基本上纯的。在某些实施方案中，多核苷酸可为cDNA或源自cDNA。在某些实施方案中，多核苷酸可重组产生。在某些实施方案中，多核苷酸可包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合至有助于例如从宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸(如用作控制多肽从细胞转运的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是一种前体蛋白，且可使前导序列被宿主细胞裂解以形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码IL-21-结合前体蛋白，该前体蛋白是成熟蛋白加上额外的5’氨基酸残基。
在某些方面，本公开提供了包含编码抗体VL的核酸的经分离的多核苷酸，其中VL包含分别与以下序列相同或除了在一个或多个VL-CDR中具有八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13和14，SEQ ID NO：34、35和36，SEQ ID NO：48、49和50或SEQ ID NO：58、59和60。
本公开还提供了包含编码抗体VH的核酸的经分离的多核苷酸，其中VH包含分别与以下序列相同或除了在一个或多个VH-CDR中具有八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ IDNO：7、8和9，SEQ ID NO：29、30和31、SEQ ID NO：43、44和45，或SEQ ID NO：53、54和55。
本公开还提供了包含编码抗体VL的核酸的经分离的多核苷酸，其中VL包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：57。
此外，本公开提供了包含编码抗体VH的核酸的经分离的多核苷酸，其中VH包含与选自由以下组成的组的参考氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：52。
在某些方面，包含由如上所述的多核苷酸编码的VH或VL的抗体或其抗原结合片段可特异性结合至IL-21，如人IL-21或食蟹猴IL-21。在某些情况下，此类抗体或其抗原-结合片段可特异性结合至与包含19E3、9F11、8B6或9H10的VH和VL的抗体或其抗原结合片段相同的表位。在某些方面，本公开提供了编码结合分子、如特异性结合至IL-21的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或多核苷酸组合。
还提供了包含如上所述的多核苷酸的载体。适合的载体在本文的其它地方描述，且为本领域的普通技术人员已知。
在某些方面，本公开提供了包含如上所述的要求的多核苷酸或载体、还任选地包含一种或多种载体、稀释剂、赋形剂或其它添加剂的组合物，如药物组合物。
在某些方面，本公开提供了包含以下的多核苷酸组合物：包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸。根据本方面，VL和VH一起可包含分别与以下序列相同或除了在一个或多个CDR中具有八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代之外与以下序列相同的VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：12、13、14、7、8和9，SEQ ID NO：34、35、36、29、30和31，SEQ ID NO：48、49、50、43、44和45，或SEQ ID NO：58、59、60、53、54和55。
在另外的方面，本公开提供了包含以下的多核苷酸组合物：包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸，其中VL和VH分别包含与以下的参考氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：37和40、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：57。
在某些方面，VH和VL分别由与参考核酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：56至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的核酸序列编码。
在如上所述的多核苷酸组合物中，包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸可位于单个载体中，或可在单独的载体上。因此，本公开提供了一个或多个包含上文所述的多核苷酸组合物的载体。
在一些情况下，编码如上所述的VH和VL的多核苷酸组合物可编码可特异性结合至IL-21、如人IL-21或食蟹猴IL-21的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，多核苷酸组合物编码可特异性结合至与包含19E3、9F11、8B6或9H10的VH和VL的抗体或其抗原结合片段相同的表位的抗体或其抗原结合片段。
本公开还提供了包含如上所提供的多核苷酸、多核苷酸组合物、或载体的宿主细胞，其中宿主细胞在一些情况下可表达特异性结合至IL-21的抗体或其抗原结合片段。此类宿主细胞可用于制备如本文提供的抗体或其抗原结合片段的方法中，其中所述方法包括(a)培养宿主细胞和(b)分离从宿主细胞表达的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，该多核苷酸包含成熟IL-21-结合多肽(如在相同读码框中融合至标志序列的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段)的编码序列，所述标志序列允许例如纯化经编码的多肽。例如，在细菌宿主的情况中，该标志序列可以是由pQE-9载体提供的六聚组氨酸标签以纯化与该标志融合的成熟多肽，或者当使用哺乳动物宿主(如COS-7细胞)时标志序列可以是源自于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标记。
还提供了多核苷酸变体。多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或二者中含有变化。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的变化。在一些实施方案中，由于遗传密码子的简并性，多核苷酸变体通过沉默取代产生。可以为了各种理由，例如优化用于特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主诸如大肠杆菌偏好的那些密码子)来产生多核苷酸变体。还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。
在一些实施方案中，编码IL-21-结合分子(如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段)的DNA序列可通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成来构建。此类寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列和选择在会产生目标重组多肽的宿主细胞中偏好的那些密码子来设计。可以应用标准方法来合成编码经分离的目标多肽的经分离的多核苷酸序列。例如，可以使用完整氨基酸序列来构建反译(back-translated)基因。另外，可以合成含有编码特定经分离的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成几种编码所需多肽的一部分的小寡核苷酸并然后连接。各个寡核苷酸通常含有5’或3’悬垂以用于互补组装。
一旦进行组装(通过合成、定点诱变或另一方法)，则可将编码特定的经分离的目标多肽的多核苷酸序列***表达载体并可操作地连接至适合在所需宿主中表达所述蛋白质的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制作图和/或在适合的宿主中表达生物活性多肽来确认合适的组装。为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，可将该基因可操作地连接或缔合至在所选表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。
在某些实施方案中，重组表达载体可用于扩增和表达编码抗-IL-21抗体或其抗原结合片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码抗-IL-21抗体或和其抗原结合片段的多肽链的合成或cDNA-来源的DNA片段，所述DNA片段可操作地连接至源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调节元件。转录单元通常包括以下组件的组装体：(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录为mRNA并且翻译成蛋白的结构序列或编码序列，和(3)合适的转录和翻译起始和终止序列，如下文详述。此类调节元件可包括用于控制转录的操作子序列。在宿主中复制的能力通常由复制原点赋予，并且可以另外地掺入便于识别转化体的选择基因。当DNA区彼此功能上相关时，它们可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则信号肽的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子控制编码序列的转录，则启动子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点经定位而允许翻译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。旨在在酵母表达***中使用的结构元件包括能够使宿主细胞将翻译蛋白胞外分泌的前导序列。可替代地，当不具有前导序列或转运序列的情况下表达重组蛋白时，该蛋白质可包含N-末端甲硫氨酸残基。随后可以任选地从表达的重组蛋白中裂解下该残基以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以使用各种表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛***状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如包括pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物在内的来自大肠杆菌的质粒，以及诸如M13和其它丝状单链DNA噬菌体的广宿主范围质粒。
适用于表达IL-21-结合分子(如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段)的宿主细胞包括处于适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物，例如大肠杆菌或杆菌。高级真核细胞包括如下所述哺乳动物来源的已建立细胞系。还可以使用无细胞翻译***。关于包括抗体产生的蛋白质产生方法的另外信息可见于如美国专利公布No.2008/0187954、美国专利No.6,413,746和No.6,660,501，及国际专利公布WO 04009823中，其各自在此通过引用以其整体并入。
还可有利地使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养***来表达IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段。在哺乳动物细胞中表达重组蛋白可以进行，因为此类蛋白质通常正确地折叠、合适地修饰和具有完全功能。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、由Gluzman(Cell 23:175，1981)所述的猴肾细胞的COS-7系及其它细胞系(包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系)。哺乳动物表达载体可包括非转录元件，诸如复制原点、连接至待表达的基因的适合的启动子和增强子及其它5’或3’侧翼非转录序列，以及诸如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点及转录终止序列的5’或3’非翻译序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒***由Luckow和Summers，BioTechnology 6:47(1988)综述。
可以根据任何适合的方法对由经转化宿主产生的IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段进行纯化。此类标准方法包括色谱(如离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻柱色谱)、离心、差别溶解度或通过用于蛋白纯化的任何其它标准技术。诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶的亲和标记可以与蛋白质连接，以允许通过合适的亲和柱容易地进行纯化。还可使用诸如蛋白水解、核磁共振和x-射线晶体学对经分离的蛋白质进行物理表征。
例如，可以首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤装置浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的表达***的上清液。浓缩步骤后，可将浓缩物施加到适合的纯化基质。可替代地，可以使用阴离子交换树脂，例如具有悬垂二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。该基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白纯化中常用的其它类型。可替代地，可以使用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括各种包含磺丙基或羧甲基基团的不溶性基质。最终，可以使用一种或多种反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化IL-21-结合分子，所述RP-HPLC步骤采用如具有悬垂甲基或其它脂肪族基团的硅胶的疏水性RP-HPLC介质。还可以以各种组合使用上述纯化步骤中的一些或全部，以提供均一的重组蛋白质。
细菌培养物中产生的重组IL-21-结合蛋白质，如抗-IL-21抗体或其抗原-结合片段可例如通过起始提取从细胞团块中分离，然后是一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。对于最后的纯化步骤可以使用高效液相色谱(HPLC)。可以通过任何常规方法破坏重组蛋白表达中所用的微生物细胞，包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂。
本领域已知用于纯化抗体和其它蛋白质的方法还包括，例如美国专利公布No.2008/0312425、No.2008/0177048和No.2009/0187005中描述的那些，其各自在此通过引用以其整体并入。
VI.使用治疗性抗-IL-21抗体的治疗方法
提供了使用IL-21结合分子，如包括其抗原结合片段、变体和衍生物的抗-IL-21抗体治疗患有与IL-21表达或IL-21-分泌细胞相关的疾病的患者的方法。“IL-21-分泌细胞”意为表达IL-21的细胞，如激活的T-辅助细胞。用于检测IL-21表达的方法是本领域熟知的，且包括但不限于PCR技术、免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹、ELISA等。
以下讨论是指用IL-21-结合分子(如抗-IL-21抗体或者保留本文提供的抗-IL-21抗体的所需性质(如能够特异性结合IL-21且拮抗IL-21活性)的抗原结合片段、变体或衍生物)进行的各种疾病和病症的诊断方法和治疗方法。在一些实施方案中，IL-21-结合分子是鼠、人或人源化的抗体。在一些实施方案中，IL-21-抗体与鼠单克隆抗体19E3、9F11、9H10或8B6之一相同。在一些实施方案中，IL-21-抗体源自鼠单克隆抗体19E3、9F11、9H10或8B6之一。在某些实施方案中，衍生的抗体是人源化抗体。在其它实施方案中，IL-21-结合分子包含YTE-突变的人IgG1恒定区。在特定的实施方案中，IL-21-结合分子是K44Vha-N56Q。
在一个实施方案中，治疗包括施加或施用IL-21结合分子，如本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物至受试者或患者，或者施加或施用IL-21结合分子至从受试者或患者分离的组织或细胞系，其中该受试者或患者患有疾病、具有疾病症状或易患疾病。在另一个实施方案中，治疗还可包括施加或施用包含IL-21结合分子(如本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物)的药物组合物至受试者或患者，或者施加或施用包含IL-21结合分子的药物组合物至从患有疾病、具有疾病症状或易患疾病的受试者或患者分离的组织或细胞系。
IL-21结合分子，如本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可用于治疗各种炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症。此类炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症可为B-细胞驱动的疾病或T-细胞驱动的疾病。在一个实施方案中，提供IL-21结合分子，如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物用于治疗或预防炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症。炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的实例包括但不限于血管炎(如抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、ANCA-相关的血管炎(AAV)或巨细胞动脉炎(GCA)血管炎)、舍格伦氏综合征、炎性肠病(IBD)、寻常天疱疮、狼疮性肾炎、银屑病、甲状腺炎、I型糖尿病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、关节强硬性脊椎炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、重症肌无力、视神经脊髓炎(NMO)、IgG4-相关疾病、全身性硬化、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、强直性脊柱炎、特应性皮炎、葡萄膜炎和移植物抗宿主病(GVHD)。在一个实施方案中，提供IL-21结合分子、如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物用于治疗或预防B-细胞驱动的疾病或恶性肿瘤。B-细胞驱动的恶性肿瘤的实例可包括滤泡淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma，HL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)和多发性骨髓瘤(MM)。在一个实施方案中，提供IL-21结合分子，如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物用于治疗或预防T-细胞驱动的疾病或恶性肿瘤。T-细胞驱动的恶性肿瘤的实例可包括血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(其为源自滤泡辅助T细胞(Tfh)的恶性肿瘤)、间变性大细胞淋巴瘤、成人T-细胞白血病、表皮T-细胞淋巴瘤和塞扎里综合征(Sezary syndrome)。
根据本发明的方法，至少一种IL-21结合分子，如本文其它地方所定义的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物用于促进就自身免疫性响应而言的阳性治疗性应答。就自身免疫性治疗而言的“阳性治疗性应答”意为与这些结合分子、如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的活性相关的疾病情况的任何改善，和/或与该疾病相关的症状的改善。因此，例如疾病的改善可描述为完全应答。“完全应答”意为通过对任何先前的测试结果的归一化不存在临床可检测的疾病。此类应答可在一些情况下持续例如根据本发明的方法治疗之后至少一个月。可替代地，疾病的改善可被归类为部分应答。
临床应答可使用筛选技术评估，诸如磁共振成像(MRI)扫描、x-放射摄影影像、计算机断层摄影(CT)扫描、流式细胞术或荧光-激发的细胞分选(FACS)分析、组织学、总病理学和血液化学，包括但不限于通过ELISA、ELISPOT、RIA、色谱等可检测的变化。除了这些阳性治疗性应答之外，经受如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的IL-21结合分子治疗的受试者可经历与该疾病相关的症状改善的有益作用。
还提供了使用IL-21结合分子，如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物诊断性监测血液或组织中的蛋白质水平(如IL-21水平)作为临床测试程序的一部分，如以确定给定治疗方案的功效。例如，可通过将抗体偶联至可检测的底物来促进检测。可检测的底物的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；及适合的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
VII.药物组合物和施用方法
制备并施用IL-21结合分子、如本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的方法至有需要的受试者是本领域技术人员熟知或可容易确定的。IL-21结合分子、如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的施用途径可为例如经口、胃肠外、通过吸入或局部施用。如本文所用的术语胃肠外包括如静脉内、动脉内、腹腔内、肌内、皮下、经直肠或经***施用。尽管所有这些施用形式都清楚地考虑在本发明的范围内，但施用形式的另一个实例将为用于注射的溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适合的药物组合物可包含缓冲液(如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。在其它与本文教导内容相容的方法中，IL-21结合分子，如本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可直接递送到不利细胞群体的位点，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。在一个实施方案中，施用是直接至气道，如通过吸入或鼻内施用。
如本文所讨论，IL-21结合分子，如本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以药学有效量施用以用于体内治疗IL-21-介导的疾病，诸如炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症。在这方面，应理解可配制公开的结合分子以有利施用并促进活性剂稳定。根据本发明的药物组合物可包含药学上可接受的无毒无菌载体，诸如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。为了本申请的目的，药学有效量的IL-21结合分子，如缀合或未缀合的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物意指足以实现有效结合至靶标和获得益处(如改善疾病或疾患的症状或者检测物质或细胞)的量。适用于本文公开的治疗性方法中的制剂描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCo.)第16版(1980)。
本文提供的药物组合物可以任何可接受的剂型经口施用，该剂型包括如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。某些药物组合物还可通过鼻气溶胶或吸入施用。此类组合物可采用苯甲醇或其它适合的防腐剂、吸收促进剂制备为于盐水中的溶液以增强生物利用率和/或其它常见的增溶剂或分散剂。
IL-21结合分子、如抗-IL-21抗体或者其片段、变体或衍生物可与载体材料组合以产生单一剂型的量将根据治疗的受试者和特定施用模式变化。该组合物可以单剂量、多剂量或经确定的时间段在输注中施用。剂量方法还可经调整以提供最优所需应答(如治疗性或预防性应答)。
按照本公开的范围，可根据前述治疗方法，以足够产生治疗性效果的量将抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物施用给人或其它动物。本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以通过根据已知的技术将本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与常规药学上可接受的载体或稀释剂合并而制备的常规剂型施用给此类人或其它动物。药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征可用与其合并的活性成分的量、和施用途径及其它已知的变量来表示。还可使用包含一个或多个种类的IL-21结合分子、如本发明的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的混合物。
“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指IL-21结合分子、如抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物当施用时就待治疗的患有疾病或疾患的患者的治疗而言引起阳性治疗性应答的量。
本发明的组合物治疗IL-21-介导的疾病(诸如炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症)的治疗有效剂量根据许多不同的因子变化，包括施用形式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但还可治疗包括转基因哺乳动物的非人哺乳动物。治疗剂量可使用本领域技术人员常见的方法滴定以优化安全性和功效。
待施用的至少一种IL-21结合分子、如抗体或者其结合片段、变体或衍生物的量可由本领域普通技术人员容易地确定无需本公开给出的过多实验。影响至少一种IL-21结合分子、如其抗体、抗原结合片段、变体或衍生物的施用模式和各个量的因子包括但不限于经历治疗的个体的疾病严重性、病史和年龄、身高、体重、健康及身体状况。类似地，待施用的IL-21结合分子、如抗体或者其片段、变体或衍生物的量将取决于施用模式和受试者将是否经历单剂量或多剂量的该试剂。
本公开还提供了IL-21结合分子，如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物用于治疗炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的用途，该疾病或病症如血管炎，如ANCA或GCA血管炎、舍格伦氏综合征、全身性红斑狼疮和/或狼疮性肾炎、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、重症肌无力或GVHD。
本公开还提供IL-21结合分子，如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物在制造用于治疗炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症的药物中的用途，该疾病或病症如血管炎，如ANCA或GCA血管炎、舍格伦氏综合征、全身性红斑狼疮和/或狼疮性肾炎、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、重症肌无力或GVHD的医药。
VIII.诊断
本公开还提供了诊断IL-21-介导的疾病(诸如某些炎性、免疫介导性或自身免疫性疾病或病症)期间可用的诊断方法，所述方法涉及测量来自个体的IL-21蛋白质组织或体液的表达水平且比较经测量的水平与正常组织或体液中的标准IL-21表达水平，从而表达水平比标准物的增加指示可通过IL-21结合分子、如如本文提供的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段治疗的病症。
本文提供的抗-IL-21抗体及其抗原结合片段、变体和衍生物可用于使用本领域技术人员已知的典型免疫组织学方法测定生物样品中的IL-21蛋白质水平(如参见Jalkanen等，J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen等，J.Cell Biol.105:3087-3096(1987))。用于检测IL-21蛋白质表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀或蛋白质印迹。
“测定IL-21多肽的表达水平”意指直接(如通过决定或评估绝对蛋白质水平)或相对(如通过与第二生物样品中疾病相关多肽水平比较)在质量或数量上测量或评估第一生物样品中的IL-21多肽的水平。可测量或评估第一生物样品中的IL-21多肽表达水平，并将其与标准IL-21多肽水平比较，所述标准得自从未患有病症的个体获得的第二生物样品或者通过平均患有病症的个体的群体的水平来测定。如在本领域所理解的那样，一旦“标准”IL-21多肽水平是已知的，其可重复用作比较标准。
“生物样品”意指任何从潜在表达IL-21的个体、细胞系、组织培养物或其它来源的细胞获得的生物样品。用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域熟知的。
IX.包含IL-21-结合分子的试剂盒
本公开还提供了试剂盒，其包含了IL-21结合分子、如本文所述的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段且可用于进行本文所述的方法。在某些实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器中的至少一种经纯化的抗-IL-21抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，试剂盒含有所有进行检测测定所必需和/或足以进行检测测定的组分，包括所有对照、进行测定的所必需的指导及任何用于分析和呈现结果的软件。本领域技术人员将容易地识别经公开的IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或其抗原结合片段可容易地并入一种本领域熟知的经确定的试剂盒形式。
X.免疫测定
可通过本领域已知的任何方法测定本文提供的IL-21结合分子，如本文提供的分子的抗-IL-21抗体或者其抗原-结合片段、变体或衍生物的免疫特异性结合。可使用的免疫测定包括但不限于使用以下技术的竞争性和非-竞争性测定***，仅举几个例子，诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、ELISPOT、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体-固定测定、免疫放射度测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定。此类测试是本领域常规和熟知的(参见如Ausubel等编辑(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷，其通过引用以其整体并入本文)。
IL-21-结合分子，如本文提供的抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以组织学方式用于免疫荧光、免疫电子显微术或非免疫学测定中，以用于原位检测IL-21或者其保守变体或肽片段。原位检测可通过从患者移除组织学标本并向其上施加经标记的IL-21-结合分子、如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物(如通过叠加经标记的IL-21-结合分子(如及抗体或片段)施加至生物样品上)实现。通过使用此类程序，可以不仅确定IL-21或保守的变体或肽片段的存在，还可确定其在经检查的组织中的分布。使用本发明，本领域的普通技术人员将容易理解各种各样组织学方法中任一种(诸如染色程序)可被修改以实现此类原位检测。
给定批次的IL-21-结合分子、如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的结合活性可根据熟知的方法测定。本领域的技术人员将能够通过采用常规实验确定每次测定的操作和优化测定条件。
适用于测定经分离的IL-21-结合分子，如抗-IL-21抗体或者其抗原结合片段、变体或改变的/突变体衍生物的结合特性的方法和试剂是本领域已知的和/或可商购获得。经设计用于此类动力学分析的设备和软件可商购获得(如
Figure BDA0001172282280000591
Software，GE Healthcare；
Figure BDA0001172282280000592
Software，Sapidyne Instruments)。
除非另外指定，否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA及免疫学中常见的技术，其在本领域的技术范围内。此类技术可在文献中完全解释。参见例如，Sambrook等编辑(1989)Molecular Cloning ALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等编辑(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Springs Harbor Laboratory，NY)；D.N.Glover编辑(1985)DNA Cloning，第I和II卷；Gait编辑(1984)OligonucleotideSynthesis；Mullis等美国专利No.4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic AcidHybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of AnimalCells(Alan R.Liss,Inc.)；ImmobilizedCellsAnd Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；学术专著，Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.，N.Y.)；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors For MammalianCells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等编辑Methods In Enzymology，第154和155卷；Mayer和Walker编辑(1987)ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Academic Press，London)；Weir和Blackwell编辑(1986)Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷；Manipulating the MouseEmbryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.(1986)；及Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，Baltimore，Md.)。
抗体工程化的一般原理示于Borrebaeck编辑(1995)Antibody Engineering(第2版；Oxford Univ.Press)中。蛋白质工程化Rickwood等编辑(1995)Protein Engineering，APractical Approach(IRL Press,Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理示于：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(第2版；SinauerAssociates，Sunderland，Mass.)；和Steward(1984)Antibodies，Their Structure andFunction(Chapman and Hall，New York，N.Y.)中。此外，本领域已知且未具体描述的免疫学标准方法通过如在以下文献中那样进行：Current Protocols in Immunology，JohnWiley&Sons，New York；Stites等编辑(1994)Basic and Clinical Immunology(第8版；Appleton&Lange，Norwalk，Conn.)及Mishell和Shiigi(编辑)(1980)Selected Methods inCellular Immunology(W.H.Freeman and Co.，NY)。
提出免疫学一般原理的标准参考工作书包括：Current Protocols inImmunology，John Wiley&Sons，New York；Klein(1982)J.,Immunology:The Science ofSelf-Nonself Discrimination(John Wiley&Sons，NY)；Kennett等编辑(1980)MonoclonalAntibodies，Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press，NY)；Campbell(1984)“Monoclonal Antibody Technology”in Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Burden等编辑(Elsevere,Amsterdam)；Goldsby等编辑(2000)Kuby Immunology(第4版；H.Freemand&Co.)；Roitt等(2001)Immunology(第6版；London:Mosby)；Abbas等(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版；Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann和Dubel(2001)AntibodyEngineering(Springer Verlan)；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(PrenticeHall 2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring HarborPress)。
以上引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。
以下实施例通过说明的方式而非限制的方式提供。
实施例
本公开的实施方案可通过引用以下非限制性实施例来进一步定义，所述实施例详细描述了本公开的某些抗体的制备及使用本公开的抗体的方法。对于本领域的技术人员显而易见的是可在不偏离本公开的范围下实施对材料和方法两者的许多修改。
实施例1.抗-IL-21鼠单克隆抗体的产生和人源
小鼠和抗-IL-21杂交瘤产生的免疫
六周龄雌性Balb/c小鼠接受8轮的腹腔内(IP)和经跖交替注射经纯化的重组人IL-21同缀合至BSA的食蟹猴IL-21蛋白质(Imject Maleimide-Activated BSAKit，Pierce)。简而言之，从第1天开始，按照制造商的说明书，用10μg IP和2.5μg经跖于ImjectAlum中乳化的免疫原(Thermo Scientific)免疫小鼠。免疫以4天的间隔持续28天。在第15天和28天经由眼球后出血收集测试出血于血清分离管中。通过ELISA测定血清与IL-21的直接结合和与IL-21R的竞争。基于竞争ELISA中的中和滴度，选择小鼠接受用10μg缀合至BSA的人IL-21的预-融合加强并在第30天处死。收集脾细胞和***细胞并将其使用PEG融合至P3-X63-Ag8.653骨髓瘤以产生杂交瘤。通过在如前所述的直接结合和竞争ELISA中筛选杂交瘤上清液鉴定抗-IL-21特异性杂交瘤。在基于细胞的测定中使用STAT3磷酸化的下调作为读出(通过STAT3的IL-21信号)，进一步测试阳性杂交瘤的中和活性。然后对中和杂交瘤进行有限稀释克隆并扩增以用于抗体纯化。
在整个杂交瘤活动期间，使用竞争ELISA来鉴定IL-21免疫后小鼠的良好应答者，然后用相同的方法筛选中和杂交瘤。简而言之，在4℃下用于磷酸盐-缓冲盐水(PBS)中的2μg/ml的IL-21R-F涂覆Maxisorp ELISA板(NUNC)过夜。然后将板在室温下用于PBST(PBS+0.1％Tween)中的3％BSA阻断1小时。平行地，连续稀释测试出血(以筛选良好应答者)，或者将杂交瘤培养物上清液的IgG浓缩物归一化并与2nM生物素化的IL-21预孵育。预孵育之后，然后将混合物添加至每个ELISA板孔并在室温下在孵育半小时。洗涤后，添加链霉亲和素-HRP至每个孔以检测结合的IL-21的水平作为测试出血或杂交瘤IgG抑制IL-21/IL-21R-Fc相互作用的规格。
分离、克隆、测序、表达和纯化抗-IL-21鼠mAb
按照竞争ELISA中所述的程序，分析杂交瘤培养物上清液的抑制L-21/IL-21R-Fc相互作用的能力。使阳性物经受有限稀释克隆(LDC)程序以保障克隆性。在确认了亚克隆的官能度之后，使它们经受分子克隆。
使用Dynabeads mRNA Direct试剂盒，根据制造商的说明书分离来自杂交瘤的mRNA。然后通过逆转录酶聚合酶链反应，使用SuperScript III逆转录酶将mRNA转化为cDNA。合成两套cDNA以避免PCR不准确。cDNA用作模板来扩增轻链和重链的抗体可变区(VL和VH)。使用Invitrogen高保真Taq聚合酶和Novagen小鼠Ig引物组进行PCR，所述引物组包括六个VH引物组和七个VL引物组。将经扩增的VL和VH PCR产物纯化并克隆至InvitrogenpCR 2.1Topo载体中，所述载体可容易地连接DNA序列与T-A相容性末端。将转化的大肠杆菌涂铺在X-gal/Carb琼脂板上。含有PCR***物的细菌菌落看起来是白色的。选择随机的白色菌落用于PCR以进一步验证***。
每次转化选择48个白色菌落进行测序。将菌落接种在96-孔板的LB/Carb培养基内，然后压印在LB/Carb琼脂板上。使用M13正向引物对琼脂板上生长的菌落测序。基于该序列的结果，创建允许PCR扩增VL和VH添加限制酶位点的引物，该位点与人IgG pOE表达载体相容。进行限制酶消化和连接以将VL和VH克隆至载体中，从而产生含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体构建体。将质粒DNA使用293转染试剂(293transfectin reagent)转染至293F细胞中。细胞上清液中的IgG表达水平由Octet评估。将上清液中的IgG使用蛋白质-A柱纯化。在SDS-PAGE上分析经纯化的IgG。
使用ELISA测试首要克隆(lead clone)的交叉反应性。经测试的细胞因子包括Il-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15。在4℃下将Maxisorp ELISA板(NUNC)用于PBS中的2μg/ml的不同细胞因子涂覆过夜。然后将板在室温下用于PBST(PBS+0.1％Tween)中的3％BSA阻断1小时。将经纯化的首要克隆IgG于PBST+3％BSA中连续稀释，然后将混合物添加至每个ELISA板孔并在室温下再孵育半小时。洗涤后，添加二抗-HRP至每个孔持续1小时。将各孔首先用PBST洗涤，然后用PBS洗涤，并添加来自Pierce的TMB溶液以检测二抗。5秒后，通过添加1N硫酸终止反应。然后将板在ELISA读取仪中在450nm下读取以检测结合。
各种抗-IL-21鼠mAb的人源化
产生鼠mAb 9F11并用MedImmune表征，所述MedImmune显示了所需的生物活性，即对IL-21的结合KD为10nM。人源化工作在Shanghai ChemPartner Co.使用CDR移植技术进行。验证成功人源化抗体候选物9F11-4、9F11-6和9F11-11的性质(结果在下文中呈现)。9F11和人源化9F11克隆的V区序列显示于图1A中。
将19E3的CDR移植至所选的人种系框架上进行鼠mAb 19E3的人源化。将鼠mAb19E3的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列与公开的NCBI数据库中可获得的人抗体种系序列比较。基于最高序列同源性鉴定人受体框架。当选择最佳受体框架时，使用若干种其它标准，包括匹配关键残基(Vernier区、正准类残基和VH/VL界面残基)、免疫原性(种系频率)、稳定性和表达。在这种情况下，一个种系家族被鉴定为VH的受体框架：VH1-46。在框架4和J-区段上比较J-区段基因与亲本序列，并选择JH4的VH。这种完全人种系受体模板被称为Ha。为了获得最高同源性VL受体序列，将来自这三种不同的人种系的单个框架区合并以设计一种最佳的杂合种系受体序列。经选择用于VL链的人模板(被称为K1)是O14(框架1)、O18(框架2)、L23(框架3)和JK1(框架4)的组合。鼠序列与人模板的框架同源性对于VH为约71％且对于VL为79％。
鉴定被认为影响CDR环、稳定可变区结构且影响VH和VL链内堆积和/或相互作用的关键小鼠框架残基，并将其选择性引回到人种系框架中以最佳保留19E3结合表位和亲和力。在这种情况下，将在44V和87F处的小鼠残基在VL链人模板中回复突变为第二受体框架模板(被称为K2)。亲本VL链与这些受体框架的比对显示于图1B中。
如果完全人受体模板(Ha)丧失结合亲和力，则为VH链设计两种另外的人受体框架模板作为鉴定可影响19E3的结合活性的框架的工具。一个模板，被称为Hb，通过融合鼠框架1与VH1-46/JH4人模板来设计；另一个模板，被称为Hc，通过融合鼠框架3与VH1-46/JH4人模板来设计。亲本VH链与这些受体框架的比对显示于图1B中。
将由Kabat定义的CDR残基融合至为VH和VL两者设计的用于产生人源化抗体的受体框架中。总之，由GeneART合成三个人源化VH基因(Ha、Hb和Hc)和两个VL基因(K1和K2)，然后将其克隆至IgG1表达载体中。已产生一组人源化变体，并将其在生物化学测定和生物测定中表征。开发HTRF表位竞争测定以评估人源化变体的IL-21结合活性。完全人源化VH模板Ha展示了与鼠19E3VH、以及杂合变体Hb和Hc相当的IL-21结合活性。K2，在位置44V和87F处具有两个小鼠残基的人源化VL模板展现了比完全人源化K1变体更好的结合活性。所得的人源化变体(K2Ha)显示具有与19E3类似的抗原结合亲和力和表位特异性。为了最小化表现最好的人源化变体(K2Ha)中的小鼠残基含量，将在87F处而非44V处的小鼠残基用相当的人残基替代，44V对保留对IL-21的结合活性是关键的。将高风险N-糖基化位点(NYT)在CDR2中的位置56处的19E3重链内鉴定，并用Q替代N来去除。仅具有一个小鼠残基的最终人源化抗体(K44VhaN56Q)与小鼠19E3相比展现了无区别的结合活性，且显示了在所有测定的生物测定中生物活性在19E3的2-3倍内。
鼠mAb9F11显示了所需的生物活性，其对IL-21的结合Kd为10nM。人源化工作在Shanghai ChemPartner Co.使用CDR移植技术进行。验证成功人源化抗体候选物9F11-4、9F11-6和9F11-11的性质，显示了与亲本鼠9F11相比抗体完全保留对IL-21的结合亲和力和生物活性。9F11和人源化9F11克隆的V区序列显示于图1中。
本文提供的各种抗-IL-21抗体的性质显示于表2中。
表2：示例性抗-IL-21抗体
Figure BDA0001172282280000651
ND：未进行
实施例2.K44Vha-N56Q与重组人IL-21和食蟹猴IL-21的结合亲和力
该实施例显示K44Vha-N56Q与人IL-21蛋白质和食蟹猴IL-21蛋白质的相互作用的溶液相平衡结合常数(Kd)的测定。使用KinExA(动力学排除测定(Kinetic ExclusionAssay))3000平台(Sapidyne，Boise，ID)，测量K44Vha-N56Q与重组人(hu)IL-21和食蟹猴(cyno)IL-21的相互作用的平衡解离常数(Kd)。根据仪器制造商说明书，将50mg单独量的Azlactone珠粒(Thermo Scientific，Rockford，IL)用75μg/mL或150μg/mL浓度的huIL-21(从Protein Sciences/ADPE获得)或cyno IL-21(从Protein Sciences/ADPE获得)涂覆。将珠粒洗涤并在含10mg/mL牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MPO)的1M Tris缓冲液(pH 8)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中阻断，并在4℃下贮藏直至使用。在样品缓冲液(磷酸盐-缓冲盐水(PBS，Invitrogen)，pH 7.4，0.1％BSA，0.02％叠氮化钠(NaN3，Sigma-Aldrich))中，制备浓度为500fM和50pM(分别为500fM和50pM K44Vha-N56Q系列)的K44Vha-N56Q的批量体积；将其各自分散至2个具有13个管的单独组中(每个系列1个组)。将人IL-21或食蟹猴IL-21以4nM(50pM K44Vha-N56Q)或100pM(500fM K44Vha-N56Q系列)的浓度添加至每个系列的1个管，然后经11个剩余管连续稀释，每个系列剩下1个样品管作为仅K44Vha-N56Q受体对照。各个样品混合物中的最终人IL-21或食蟹猴IL-21浓度的范围为1.95fM至100pM(500fM K44Vha-N56Q)，和78.1fM至4nM(50pM K44Vha-N56Q)。将这些样品混合物在室温下平衡2至7天，并在KinExA平台上分析。将IL-21-涂覆的Azlactone珠粒浆液用仪器缓冲液(PBS，pH7.4，0.02％NaN3)在珠粒小瓶中稀释至30mL并固定至KinExA仪器。使用者-限定的定时程序用于将IL-21/Azlactone珠粒顺序转移至仪器中的毛细管流动池，并将各个样品混合物注射至IL-21-涂覆珠粒上。通过用仪器缓冲液洗涤珠粒，去除未结合的样品溶液。使得1μg/mL或2μg/mL的DyLight649-标记的山羊-抗-huIgG(H+L)第二试剂的溶液(ThermoScientific)经过珠粒以检测仍然结合至IL-21-涂覆珠粒的受体(K44Vha-N56Q)。将珠粒用仪器缓冲液再次洗涤以去除过量(未结合)的标签。测量仍然与珠粒缔合的荧光的量，并将信号转化为游离受体(K44Vha-N56Q)百分比。在样品之间，将珠粒包(bead pack)从流动池冲刷并用新鲜的IL-21-涂覆的Azlactone珠粒充满以为下一样品作准备。一旦已收集到每个系列(500fM和50pM K44Vha-N56Q)中的所有样品的数据，就生成等温线，其对在各个浓度的IL-21下检测的游离K44Vha-N56Q的量作图。然后使用仪器评价软件(KinExA ProSoftware，v.2.0.1.26，Sapidyne)，在双重曲线分析中评价所得的两个结合曲线，从中推断出每个相互作用的各个KD。
通过KinExA测量K44Vha-N56Q至人IL-21和食蟹猴IL-21的结合。制备两个浓度序列的K44Vha-N56Q：500fM和50pM，且将人IL-21或食蟹猴IL-21蛋白质经每个系列连续稀释。一旦达到平衡，使用KinExA仪器测量每个样品混合物中剩余的游离K44Vha-N56Q的浓度。这通过记录在每种混合物的样品经过珠粒和随后暴露于荧光标记的抗-IgG试剂之后仍然与IL-21-涂覆珠粒缔合的荧光的量进行。制备记录的游离K44Vha-N56Q的量对比huIL-21或cynoIL-21蛋白质浓度的绘图，并使用KinExA平台的评价软件将每个数据集拟合成单位点亲和力模型。KinExA软件全局地拟合双重-曲线分析中的两个结合曲线(500fM和50pM IgG)(图2A和2B)，分别是同时返回若干参数的最佳解并计算真正的溶液-相结合常数。在这些条件下，对于K44Vha-N56Q结合至huIL-21蛋白质的KD经计算为515fM(对于KD，95％CI：279fM至844fM)，而对于K44Vha-N56Q结合至cynoIL-21蛋白质的KD经计算为352fM(对于KD，95％CI：134fM至685fM)。
如在KinExA平台上所测量，证明K44Vha-N56Q可以μM的亲和力较弱结合至鼠IL-21。
实施例3.抗-IL-21单克隆抗体的作用机制研究
抗-IL-21克隆阻断IL-21诱导的STAT3磷酸化
如下所述，测定经纯化的抗-IL-21抗体抑制人IL-21-诱导的和cyno IL-21-诱导的STAT3磷酸化(pSTAT3)的能力。
简而言之，根据制造商的说明书，将总人外周血单核细胞(PBMC)在离心后从CPT管(BD Vacutainer)分离。将抗-IL-21抗体用人IL-21或cyno IL-21(20pM)在96-孔圆底板中在37度下预孵育60分钟。在此次孵育后，迅速添加PBMC(0.4x106/孔)至每个孔，并与IL-21/IgG在37度下孵育15分钟。在刺激后，将细胞用100μl/孔预热的裂解/固定缓冲液(BDPhosflow)固定10分钟(在37度下)，然后在冰上用225μl/孔电烫缓冲液III(BD Phosflow)透化30分钟。将细胞洗涤两次(PBS/2％BSA)，并用抗-pSTAT3(pY705，BD Phosflow)在室温下染色30分钟。将细胞用染色缓冲液洗涤并使用FACSDiva软件在LSR II流式细胞仪(BDBiosciences)上分析。
用如所述的人IL-21和cyno IL-21刺激诱导总人PBMC中的pSTAT3的水平增加3-5倍(图3A)。表明抗-IL-21抗体抑制IL-21-诱导的pSTAT3上调的代表性图表显示于图3B中。所有测试的克隆在该测定中达到100％抑制。在pSTAT3中，抗-IL-21克隆的IC50值概述于表3中。这些数据显示所述的抗-IL-21抗体能够抑制IL-21R下游的早期信号传导事件。
表3：pSTAT3测定中抗-IL-21抗体的IC50值
pSTAT3测定中指定克隆的IC50
克隆 人IL-21 cyno IL-21
K2Ha-N56Q 18.7+/-5.1pM 15.63+/-5.4pM
K44VHa-N56Q 17.2+/-7.8pM 19.28+/-7.8pM
K44VHa6-N56Q 5.5+/-1.7pM 9.75+/-3.14pM
19E3 3.15+/-1pM 5.99+/-1.8pM
9F11 21.73+/-6.03pM 83.17+/-335.1pM
9H10 328.2+/-101pM 160.5+/-141pM
8B6 114.9+/-71.2pM 228.2+/-223pM
9F11-4 12.05pM 52.18pM
9F11-6 13.17pM 50.77pM
9F11-11 13.57pM 45.88pM
K44Vha-N56Q已显示较弱地结合至鼠IL-21。用鼠IL-21刺激小鼠脾细胞诱导磷酸化的STAT3的胞内水平增加4倍。K44Vha-N56Q不能抑制鼠IL-21诱导的STAT3磷酸化。这些数据表明K44Vha-N56Q不中和鼠IL-21的生物活性。
IL-21是γc受体细胞因子家族的成员，其使用与特异性受体一致的常见γ链以介导生物活性。在存在或不存在K44Vha-N56Q或对照人IgG1-YTE抗体的情况下，将人血淋巴细胞通过利用IL-2、IL-4、IL-7、IL-15或IL-21细胞因子的γc链刺激。通过评估适用于每种细胞因子的STAT分子的磷酸化测量下游信号传导。K44Vha-N56Q对相关IL-2、IL-4、IL-7或IL-15细胞因子的下游信号传导没有影响。这些数据显示K44Vha-N56Q特别用于中和人细胞中的IL-21途径。
通过其同源受体的IL-21信号传导导致STAT3的激活和磷酸化。本文所述的数据证明K44Vha-N56Q可抑制响应于人IL-21和cyno IL-21两者而非小鼠IL-21的pSTAT3上调。此外，该抑制对IL-21是特异性的，因为K44Vha-N56Q不影响激活相关的γc细胞因子受体(诸如IL-2、IL-4、IL-7和IL-15的受体)下游的STAT分子的激活。因此，K44Vha-N56Q是IL-21R信号传导事件的有效且特异性的抑制剂。
IL-21封闭遏制NK-92细胞产生IFNγ
如下评估经纯化的抗-IL-21抗体对IL-21诱导的由NK-92细胞产生IFNγ的影响。
将NK-92细胞在完全生长培养基中生长，所述培养基由补充有碳酸氢钠(1.5g/L)、肌醇(O.2mM，Sigma Aldrich)、2-巯基乙醇(O.1mM)、叶酸(O.02mM，Sigma Aldrich)、重组IL-2(100U/ml，R&D Systems)、马血清(12.5％)和胎牛血清(12.5％)的MEM α Glutamax载体介质组成。除非另外指定，否则所有试剂购自Invitrogen。将细胞洗涤并重悬浮于不含IL-2的培养基中持续16-24小时，之后用IL-21刺激。为了评估抗-IL-21克隆的效价，将抗体与人IL-21或cyno IL-21(200pM)在96-孔平底板中在37度下预孵育60分钟。然后将O.5x105个NK-92细胞添加至板中，并在37度下孵育24小时。根据制造商说明书(Meso ScaleDiscovery)，使用MSD人IFNγ单重测定定量在上清液中的IFNγ产生。
抗-IL-21克隆抑制人IL-21和cyno IL-21诱导的NK-92细胞产生IFNγ的能力在图4中表示。克隆K2Ha-N56Q、K(44V)Ha-N56Q和K(44V)Ha6-N56Q能够以针对人IL-21和cynoIL-21的类似的效价完全抑制这些培养物中的IFNγ产生。在NK-92细胞测定中评估的克隆的IC50值的概述提供于表4中。这些数据证明，如通过在24小时完全阻断IFNγ的产生证明，经测试的抗-IL-21抗体调控NK-92细胞的活性。
表4NK-92测定中抗-IL-21抗体的IC50值
NK-92细胞测定中指定克隆的IC50
克隆 人IL-21 cyno IL-21
K2Ha-N56Q 99+/-36.2pM 83.4+/-40pM
K44VHa-N56Q 92.7+/-38pM 80.8+/-37.8pM
K44VHa6-N56Q 54.8+/-14.9pM 60.3+/-38.1pM
19E3 41+/-2pM 37+/-6pM
9F11 462+/-1pM 867+/-66pM
9H10 20.21nM 3.43nM
8B6 943.9pM 770.7pM
抗-IL-21克隆抑制由外源性IL-21诱导的血浆细胞分化
为了确定抗-IL-21抗体对B细胞活性的影响，进行血浆细胞分化测定。
根据制造商的说明书，将人PBMC在离心后从CPT管(BD Vacutainer)分离。使用MACS细胞分离试剂(人B细胞分离试剂盒II，Miltenyi Biotec)，阴性选择B细胞。使用该技术的常规B细胞纯度＞97％。注意，使用该方法分离的总B细胞制备物含有初始B细胞和记忆B细胞两者的群体，但由于CD43的表达排除PC，其通过MACS试剂盒的抗体选择混合物靶向。用于这些实验中的培养基是补充有10％FCS、青霉素-链霉素(100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素)、2-巯基乙醇(55μM)、L-谷氨酰胺(2mM)和HEPES(5mM)的RPMI 1640(Invitrogen)。将抗-IL-21抗体与刺激混合物在96-孔圆底板中在37度下预孵育60分钟，所述混合物包含人IL-21或cyno IL-21(2nM)、抗-CD40(0.1μg/ml，山羊IgG，R&D Systems)和抗-IgM F(ab’)2(5.0μg/ml，Jackson TmmunoResearch Laboratories)。然后将(0.5-1.0)x105个B细胞添加至该板至150μl的最终体积。
6天刺激后，将细胞染色并使用流式细胞术分析以定量培养的血浆细胞的频率。将细胞洗涤(PBS/2％FBS)并在4度下用抗-IgD(FITC或PE)；抗-CD38(别藻蓝蛋白，克隆HB7)(BD Pharmingen)染色30分钟，并在LSRII流式细胞仪上使用FACSDiva软件分析。此外，收集上清液，并通过ELISA定量Ig产生。简而言之，将96-孔平底板在4℃下用于PBS中稀释的5μg/ml的山羊抗-人IgG(Bethyl Laboratories)涂覆过夜。将板洗涤并用于PBS中的0.2％BSA阻断。将上清液稀释并在板上孵育过夜。用在阻断缓冲液中稀释的山羊抗-人IgG-碱性磷酸酶(0.2μg/ml，Bethyl Laboratories)检测结合的Ig。将板用SigmaFast对硝基苯基磷酸盐片(Sigma Aldrich)显色，并且使用SpectraMax读板仪(Molecular Devices)在405nm下测量比吸光度。
用人IL-21或cyno IL-21刺激如上所述的人B细胞导致产生IgD-CD38hi PC群体(图5A和图5B)。包括19E3.1、9F11.1和9H10.1的若干个克隆能够在这些条件下完全抑制PC分化(图5A和图5B)。克隆8B6.1抑制由cyno IL-21而非人IL-21诱导的PC分化。抗-IL-21克隆的IC50值概述于表5中。此外，在对照条件下，用IL-21、抗-CD40和抗-IgM刺激导致到第6天产生在30μg/ml至40μg/ml范围内的Ig(图5C)。克隆19E3.1和9F11.1以剂量依赖性方式抑制由人B细胞分泌Ig(图5C)。克隆19E3.1能够抑制响应于人IL-21和cyno IL-21的IgG产生>99％，而9F11.1分别将由人IL-21和cyno IL-21产生IgG抑制97％和79％。累积地，这些数据表明所述的抗-IL-21克隆能够显著抑制由外源性人IL-21和cyno IL-21诱导的人血浆细胞分化和Ig分泌。
表5：血浆细胞分化测定中抗-IL-21抗体的IC50值
PC分化测定中指定克隆的IC50
克隆 人IL-21 cyno IL-21
K2Ha-N56Q 618+/-155pM 1.32+/-0.39nM
K44VHa-N56Q 777+/-201pM 1.06+/-0.15nM
K44VHa6-N56Q 573+/-385pM 659.3+/-124pM
19E3 1.53nM 775pM
9F11 47.3+/-32.6nM 74+/-81nM
9H10 115.5nM 29.8nM
886 ＞200nM 8.9nM
抗-IL-21克隆抑制由激活的CD4+T细胞诱导的PC分化
在如下所述的共培养测定中，测试抗-IL-21克隆阻断由激活的CD4+T细胞诱导的血浆细胞分化的能力。
将人PBMC在离心后从CPT管(BD Biosciences)分离。使用MACS细胞分离试剂(Miltenyi Biotec)阴性选择B细胞和CD4+T细胞。总B细胞和CD4+T细胞的常规纯度为＞97％。将CD4+T细胞在37℃下用丝裂霉素-C(30μg/ml，Sigma Aldrich)处理30分钟，然后洗涤并在完全培养基中在37℃下再静置30分钟。将1.0x 105个丝裂霉素-C处理的CD4+T细胞和O.5x 105个纯化的B细胞(每孔)与抗-CD3/抗-CD28珠粒以200μl的最终体积共培养(5∶1T细胞与珠粒比率)。用于所有实验的培养基是补充有10％FCS、青霉素-链霉素(100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素)、2-巯基乙醇(55μM)、L-谷氨酰胺(2mM)和HEPES(5mM)的RPMI1640(Invitrogen)。以O-200nM的浓度将抗-IL-21抗体添加至培养物。培养7天后，使用流式细胞术定量血浆细胞。洗涤细胞(PBS/2％FBS)并在4度下用抗-IgD(FITC或PE)；抗-CD38(别藻蓝蛋白，克隆HB7)(BD Pharmingen)染色30分钟，并在LSRII流式细胞仪上使用FACSDiva软件分析。在相同的时间收集所有条件，因此展现的事件的数目反映了相对细胞数。然而，使用AccuCount Particles(Spherotech)测定总细胞数。
B细胞与激活的CD4+T细胞的共培养导致出现IgD-CD38h1 PC群体，其中到第7天68.5％的CD19+细胞表达这种PC表型(图6A)。添加19E3.1或9F11.1以剂量依赖性方式抑制了PC分化，其各自分别获得了80％和78％的最大抑制(图6B和图6C)。这些数据表明抗-IL-21克隆可极大地阻断通过由激活的T细胞从头产生IL-21诱导的血浆细胞分化。
抗IL-21克隆抑制初始CD4+T-细胞扩增
IL-21已显示支持在次最佳引发条件下的CD4+T-细胞增殖。在存在或不存在亲本抗体19E3.1的情况下，将人初始CD4+T细胞纯化并用抗-CD3和IL-21体外刺激。在培养四天后通过测量ATP累积评估增殖。如前所报道，检测的ATP的量与培养的有代谢活性的细胞的数目呈直接比例。19E3.1以剂量依赖性方式钝化IL-21-诱导的增殖(对于两个供体，平均IC50＝61.02pM)。这些数据显示K44Vha-N56Q(MEDI7169)亲本抗体19E3.1抑制IL-21-驱动的人初始CD4+T-细胞的增殖(图7)。
药物代谢动力学
K44VhaN56Q，即一种YTE抗体的药物代谢动力学(PK)在三个研究中使用猴作为动物模型来评价，该模型可以合理的精确度预测人PK(Oitate等，DrugMetab.Pharmacokinet.26(4):423-430(2011))。清除率是从动物数据放大的人PK预测的主要PK参数；更小的CL值表明分子可在体内停留得更久。猴中K44VhaN56Q的CL值的范围为1.08mL/d/kg至4.37mL/d/kg。典型的治疗性抗体，诸如贝伐单抗
Figure BDA0001172282280000721
达利珠单抗
Figure BDA0001172282280000722
英夫利昔单抗
Figure BDA0001172282280000723
和利妥昔单抗
Figure BDA0001172282280000724
与各个CL值5.78、5.30、11.5和17.0(mL/d/kg)相关(Dong等，Clin Pharmacokinet.50(2):131-142(2011)。假定猴体重为3kg)。这些CL值比对K44VhaN56Q所估计的值更大。因此，期望K44VhaN56Q可在体内比典型的治疗性抗体停留更久。
实施例4.使用抗-IL-21单克隆抗体预防移植物抗宿主病(GVHD)
异种GVHD小鼠模型
当转移的(供体)T细胞感知到由宿主(接受者)MHC/HLA分子呈递的外源抗原时，GVHD出现。NOD/SCID/IL-2受体γ链缺陷型(NSG)小鼠缺乏成熟的T细胞和B细胞、功能性NK细胞和巨噬细胞。这些小鼠证明由于丧失γc受体导致细胞因子信号传导减少。
在GVHD的异种模型中，将人PMBC转移至NSG小鼠接受者。因为小鼠是免疫受损的，所以人细胞不被小鼠免疫***排斥。人细胞识别小鼠环境为外源的，并且被激活并增殖。经激活的人细胞产生“细胞因子风暴”，导致严重的免疫反应性级联，影响肝脏、胃肠道和皮肤，从而最终导致动物死亡。大量产生IL-21的细胞可从GVHD小鼠的血液分离。
将三十五只雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wjl/SzJ；The JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)用于预防性研究中。在研究开始时小鼠为5至7周龄且重为16.8克至22.4克。
分离人外周血
将人血从两个健康供体收集至含有肝素钠的细胞制备管(CPT)(BectonDickinson，San Jose，CA)中。根据制造商说明书将单核细胞从CPT管分离。简而言之，将管在室温下在1700x g下离心25分钟。离心后，收集单核细胞。将细胞在PBS中通过以400x g的相对离心力离心10分钟洗涤两次。然后对细胞计数并在适当量的PBS中重新悬浮，并保持在室温下直至注射(在最后洗涤后立即)。
抗体
使用人IgG1κ-YTE(NIP-228-YTE；Medlmmune，Cambridge，UK)在该实施例中作为对照mAb。将对照mAb等分并在-80℃下冷冻作为储液。配制缓冲液为25mM组氨酸、1％蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80(pH6.0)。通过用磷酸盐-缓冲盐水PBS稀释储液(60.6mg/mL)的等份试样至1mg/mL来制备给药溶液。将工作制备物在4℃至8℃下保存。
将K44Vha-N56Q(MEDI7169)作为等分且冷冻的储液在-80℃下保存。配制缓冲液为25mM组氨酸、205mM蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80(pH6.0)。通过用PBS稀释储液(47.6mg/mL)的等份试样至1mg/mL来制备给药溶液。将工作制备物在4℃至8℃下保存。
注射人细胞、治疗和评估GVHD
如表6所示进行给药。简而言之，在第0天，将来自供体1的12.71x 106个经纯化的人PBMC或来自供体2的13.46x106个经纯化的人PBMCIP注射到5至7周龄雌性NSG小鼠中。从第-1天开始IP一周三次施用两百微克(200μL体积)的K44Vha-N56Q(MEDI7169)、对照mAb或等体积的PBS(媒介物)(单独)，之后注射人PBMC。
表6.预防性研究中的组名称和剂量水平
Figure BDA0001172282280000741
F＝雌性；Fr＝星期五；IP＝腹腔内；mAb＝单克隆抗体；Mo＝星期一；N/A＝不适用，因为未对动物给药；PBMC＝外周血单核细胞；PBS＝磷酸盐-缓冲盐水；ROA＝施用途径；W＝星期三；
在整个研究期间单独测量体重，每周至少一次。当确定小鼠体重减轻20％时或如果小鼠消瘦/垂死或另外疼痛或痛苦，将小鼠安乐死。出于跟踪存活的目的，死亡和人道的安乐死同义使用。
通过流式细胞术评估T-细胞数目和表型
将小鼠从眶后窦放血至肝素微量采集管中。在所有实验中，在所有时间点，使用100μL血液。使用ACK裂解缓冲液(Life Technologies，Grand Island，NY)进行红细胞裂解步骤，将剩余的细胞与TruStain Fc阻断剂(BioLegend，San Diego，CA)孵育(1:4稀释)10分钟，然后在4℃下用以下抗体混合物染色30分钟以显现CD4T细胞和CD8T细胞：V500-缀合的抗-人CD45(克隆HI130；BioLegend，San Diego，CA)、AF700-缀合的抗-人CD4(克隆RPA-T4；BioLegend，CA)和BV711-缀合的抗-人CD8(缀合的RPA-T8；BioLegend，SanDiego，CA)。将样品洗涤、在2％多聚甲醛中固定并在Becton Dickinson LSRII流式细胞仪上使用FACSDiva软件运行。使用FlowJo软件(9版)分析样品。人细胞由表达人CD45抗原的那些鉴定。将用于所有条件的经染色的血液(100μL)以相同的体积收集在LSRII上，因此展现的事件的数目反映了不同治疗的相对细胞数。
通过多重ELISA评估来自处理的小鼠的血清中的人细胞因子
按照制造商的说明书，收集纵向血清样品并使用人Thl7多重试剂盒(磁珠，预混合)(Merck Millipore，Billerica，MA)用Luminex 200分析仪分析。
使用GraphPad Prism(6.0d版，对于Mac OS X)。将来自K44Vha-N56Q(MEDI7169)处理的小鼠的血清细胞因子结果与对照mAb处理的小鼠(供体1)的血清细胞因子结果或组合的对照mAb和PBS(媒介物)处理的小鼠的(供体2)的血清细胞因子结果比较。除非通过F-检验确定变量显著不同，否则使用具有韦尔奇校正(Welch’s correction)的未配对的t-检验分析这些数据，然后进行曼恩惠特尼检验(Mann Whitney tests)。对于所有显著差异，P<0.05。
K44Vha-N56Q(MEDI7169)抑制异种GVHD-诱导的消耗和T-细胞扩增
已报道了IL-21影响T-细胞功能。因此，研究K44Vha-N56Q(MEDI7169)抑制异种GVHD的能力，该抑制主要由CD4+T细胞介导。将人PBMC注射至如上所述的免疫受损的NSG小鼠中，并到第21天在接受对照mAb(人IgG1mAb)(图8A)或PBS媒介物的小鼠中注意到消耗病。从第-1天开始一周三次接受200μg的K44Vha-N56Q(MEDI7169)的小鼠看起来健康(图8B)且不能与未接受人细胞的对照小鼠区分。分析血液揭示了在接受对照mAb(或PBS)的小鼠中已扩增了人CD45+细胞(图8C)。相较而言，接受K44Vha-N56Q(MEDI7169)的小鼠具有在血液中存在的显著减少的人CD45+细胞(图8D)。在对照mAb(和PBS)处理的小鼠中，这种人CD45+细胞的扩增主要由CD4阳性细胞组成(图8E)，而CD4阳性细胞的百分比在K44Vha-N56Q(MEDI7169)处理的小鼠中极大减少，诸如在第35天所注意到(图8F)。这些结果与移植人PBMC至免疫受损的小鼠中之后K44Vha-N56Q(MEDI7169)抑制人CD4+T细胞扩增一致。
当随时间跟踪小鼠时，发现接受PBS媒介物或对照mAb的动物的人CD45+细胞的数目稳定增加。然而，这些细胞在接受K44Vha-N56Q(MEDI7169)的小鼠中不扩增(图9)。重要的是，K44Vha-N56Q(MEDI7169)戒断后约3周，发现人CD45+细胞启动扩增，该扩增然后在恢复治疗之后下降(图9)。这些数据证明K44Vha-N56Q(MEDI7169)可显著抑制T-细胞扩增，其在戒断后可逆。
K44Vha-N56Q(MEDI7169)预防GVHD-诱导的重量减轻和死亡
在小鼠中监测体重减轻和存活，所述小鼠未接受人细胞(首次接触实验的)，或者接受人PBMC与小鼠接受人PBMC之前一天(第-1天)开始的PBS媒介物、对照mAb或K44Vha-N56Q(MEDI7169)。发现接受PBS或对照mAb的小鼠体重快速减轻(图10A)，并当体重下降20％时死亡或安乐死。到在接受人PBMC之后的第37个研究日，在两个单独研究中的所有用PBS或对照mAb注射的小鼠(n＝16)死亡或安乐死(图10B)。相比之下，所有接受K44Vha-N56Q(MEDI7169)的小鼠(n＝10)存活并保持健康直至戒断K44Vha-N56Q(MEDI7169)(图10B)。在一个实验中，小鼠在戒断K44Vha-N56Q(MEDI7169)之后保持健康约20天，然后快速衰弱并在第31个研究日之后立即死亡或安乐死(图10B)。在单独的研究中，使用第二供体的人PBMC，小鼠停止K44Vha-N56Q(MEDI7169)之后保持存活约40天。这些数据证明K44Vha-N56Q(MEDI7169)可保护免受死亡，这当戒断K44Vha-N56Q(MEDI7169)时是可逆的。
K44Vha-N56Q(MEDI7169)抑制若干种细胞因子的产生且是可逆的
在各个时间点收集来自用供体2(图11)或供体1(图12)细胞注射的小鼠的血清，并使用Millipore的MILLIPLEX MAP***分析25种细胞因子的表达。超过一半的经检查的细胞因子低于检测水平。对于可检测的细胞因子，K44Vha-N56Q(MEDI7169)在两个单独的实验中诱导了GM-CSF、IL-10和TNF的显著减少。在一个实验中，IFNγ显著减少且在第二个实验中呈下降趋势。发现IL-17A和IL-9在两个实验的一个中显著减少。在两个实验中，发现IL-5显著增加(图11)。使用Sysmex XT-2000iv血液学分析仪进行全血计数(CBC)，并且重要的是未注意到在具有增加的IL-5的小鼠中嗜酸粒细胞增加。发现IL-21在两个实验中增加。增加的IL-21与在毒性研究中在食蟹猴内获得的IL-21一致，其中增加的IL-21反映了结合至细胞因子并中和细胞因子的循环药物的量。
如图9所示，K44Vha-N56Q(MEDI7169)抑制CD4+T细胞扩增，这当截断药物时可逆。这在第二研究中得以确认(图12)。值得注意的是，细胞扩增之后，若干种细胞因子也增加，包括TNF、IFNγ和IL-10(图12)。这些数据显示抗-IL-21抗体，即K44Vha-N56Q(MEDI7169)抑制T-细胞扩增和细胞因子产生，这当停止K44Vha-N56Q(MEDI7169)时都是可逆的。
实施例5.使用抗-IL-21单克隆抗体治疗移植物抗宿主病(GVHD)
实验设计
将二十只雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ；The JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)用于治疗性研究中。在研究开始时小鼠为8周龄大且重为18.0克至22.3克。
收集人血并如上在实施例4中所述制备。
获得对照和测试mAb，将其如上在实施例4中所述处理并保存。
如表7所述进行给药。简而言之，在第0天，将来自供体1的12x 106个经纯化的人PBMC注射到8周龄雌性NSG小鼠中。在第7天开始，一周三次IP注射两百微克(200μL体积)的K44Vha-N56Q(MEDI7169)或对照mAb。在第14天开始，向另一组一周三次IP注射K44Vha-N56Q(MEDI7169)(200μg于200μL中)。
表7.治疗性研究中的组名称和剂量水平
Figure BDA0001172282280000781
F＝雌性；Fr＝星期五；IP＝腹腔内；mAb＝单克隆抗体；Mo＝星期一；N/A＝不适用，因为未对动物给药；PBMC＝外周血单核细胞；PBS＝磷酸盐-缓冲盐水；ROA＝施用途径；W＝星期三
如上实施例4中所述进行在血清中的GVHD、T-细胞数目和表型及人细胞因子的评估。
自动评估全血计数
使用Sysmex XT-2000iv自动血液分析仪(Sysmex America，Mundelein，IL)评估白血细胞数目以及红血细胞数目、血细胞比容和血红蛋白值。在第7天、14天和21天，将小鼠从眶后窦放血至肝素微量采集管中。进行1:10稀释(将20μL每个全血样品在180μL PBS中稀释)，然后将样品进入分析仪中，并将所得数据乘以稀释因子10。
用K44Vha-N56Q(MEDI7169)进行的治疗性治疗保护小鼠免受GVHD
为了确定治疗性给出的K44Vha-N56Q(MEDI7169)是否具有保护小鼠免受GVHD的能力，如上所述注射人PBMC，并在注射人细胞之后7天或14天给出K44Vha-N56Q(MEDI7169)。如图13所示，接受对照mAb的小鼠开始在接受人细胞后两周内死亡，并到第26天全部死亡。使得在第7天接受K44Vha-N56Q(MEDI7169)的小鼠完全免受GVHD-诱导的死亡。在第14天(在对照小鼠开始死亡之后)接受K44Vha-N56Q(MEDI7169)的小鼠受到部分保护；当所有对照小鼠已死亡时，在第14天组5只小鼠中的2只在第26天后存活。在第7天接受人细胞和对照mAb的小鼠出现了严重的GVHD-诱导的贫血。在第7天开始接受K44Vha-N56Q(MEDI7169)的小鼠能够维持更高的正常红血细胞、血细胞比容和血红蛋白值，其与未接受细胞的首次接触实验的动物的那些正常红血细胞、血细胞比容和血红蛋白值更接近(图14)。
这些数据显示抗-IL-21抗体即K44Vha-N56Q通过减少或消除与该疾病相关的症状保护小鼠免受GVHD。
在前的对特定实施方案的描述将完全揭示本发明的一般本质，使得其他人可通过运用在本领域技术内的知识容易地修改和/或改变用于各种应用此类特定实施方案，而无需过多实验且不偏离本发明的一般概念。因此，基于本文呈现的教导内容和指导，此类修改和改变意在所公开的实施方案的等效方案的含义和范围内。应理解本文中的措辞或术语为了描述且不限制的目的，使得本说明书的术语或措辞由技术人员借鉴教导内容和指导理解。本发明由以下权利要求进一步描述。
序列表
<110> 麦迪纽有限责任公司
<120> 对IL-21具有特异性的结合分子及其用途
<130> IL21-100P1
<160> 65
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 564
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
ctgaagtgaa aacgagacca aggtccagct ctactgttgg tacttatgag atccagtcct 60
ggcaacatgg agaggattgt catctgtctg atggtcatct tcttggggac actggtccac 120
aaatcaagct cccaaggtca agatcgccac atgattagaa tgcgtcaact tatagatatt 180
gttgatcagc tgaaaaatta tgtgaatgac ttggtccctg aatttctgcc agctccagaa 240
gatgtagaga caaactgtga gtggtcagct ttttcctgtt ttcagaaggc ccaactaaag 300
tcagcaaata caggaaacaa tgaaaggata atcaatgtat caattaaaaa gctgaagagg 360
aaaccacctt ccacaaatgc agggagaaga cagaaacaca gactaacatg cccttcatgt 420
gattcttatg agaaaaaacc acccaaagaa ttcctagaaa gattcaaatc acttctccaa 480
aagatgattc atcagcatct gtcctctaga acacacggaa gtgaagattc ctgaggatct 540
aacttgcagt tggacattgt taca 564
<210> 2
<211> 161
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
85 90 95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
100 105 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Glu
115 120 125
Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln
130 135 140
Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp
145 150 155 160
Ser
<210> 3
<211> 489
<212> DNA
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 3
atgagatcca gtcctggcaa catggagagg atagtcatct gtctgatggt catcttcttg 60
gggacactgg tccacaaatc aagctcccaa ggtcaagatc gccacatgat tagaatgcgt 120
caacttatag atattgttga tcagctgaaa aattatgtga atgacttgga ccctgaattt 180
ctgccagctc cagaagatgt agagacaaac tgtgagtggt cagctatttc ctgttttcag 240
aaggcccaac taaagtcagc aaatacagga aacaatgaaa ggataatcaa tttatcaatt 300
aaaaagctga agaggaaatc accttccaca ggtgcagaga gaagacagaa acacagacta 360
acatgccctt catgtgattc ttatgagaaa aaaccaccca aagaattcct agaaagattc 420
aaatcacttc tccaaaagat gattcatcag catctgtcct ctagaacaca tggaagtgaa 480
gattcctga 489
<210> 4
<211> 162
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 4
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Asp Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Ile Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
85 90 95
Asn Leu Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Ser Pro Ser Thr Gly Ala
100 105 110
Glu Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asp Ser
<210> 5
<211> 357
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 5
gaagtggagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcttgtgctg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaagcg aagctgataa tcatccaaca 180
tactatgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacagtg gcatttatta ctgtactgaa 300
tatgattacg aggggtttgt acactggggc caggggacgc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 7
Asp Tyr Trp Met His
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 8
Thr Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 9
Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 10
gatatccagc tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagacacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 11
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 13
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 14
Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg Thr
1 5
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K2Ha-N56Q 合成的
人源化VH区序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Gln Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K2Ha-N56Q 合成的
人源化VH + 人CH区序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Gln Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K2Ha-N56Q 合成的
人源化VH区序列
<400> 17
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K2Ha-N56Q 合成的
人源化VL + 人CL区序列
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-N56Q 合成的
人源化VH区序列
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Gln Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-N56Q 合成的
人源化VH + 人CH区序列
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Gln Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-N56Q 合成的
人源化VL区序列
<400> 21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-N56Q 合成的
人源化VL + 人CL区序列
<400> 22
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 23
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-6N56Q 合成的
人源化VH区序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Gln Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-6N56Q 合成的
人源化VH + 人CH区序列
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Gln Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-6N56Q 合成的
人源化VL区序列
<400> 25
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: K44VHa-6N56Q 合成的
人源化VL + 人CL区序列
<400> 26
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 27
gaagtggagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcttgtgctg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaagcg aagctgataa tcatccaaca 180
tactatgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacagtg gcatttatta ctgtactgaa 300
tatgattacg aggggtttgt acactggggc caggggacgc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 28
Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ala Asp Asn His Pro Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 29
Asp Ala Trp Met Asp
1 5
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 30
Glu Ile Arg Ser Glu Ala Asp Asn His Pro Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 31
Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val His
1 5
<210> 32
<211> 333
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 32
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttca ctagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatatggct atagttatat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcaac acagtaggga gcttccgctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aag 333
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 33
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 34
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 35
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 36
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: Hu-9F11 VH-4, VH-11 合成的
人源化VH区序列
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ala Asp Asn His Pro Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: Hu-9F11 VH-6 合成的
人源化VH区序列
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ala Asp Asn His Pro Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: Hu-9F11 VL, VL-4, VL-6 合成的
人源化VL区序列
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: Hu-9F11 VL-11 合成的
人源化VL区序列
<400> 40
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 41
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggact cactttcagt cactattaca tgtattgggt tcgccagacg 120
ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaatc attagtgatg gtggtgatta cacccactac 180
tcagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 240
ctacaaatga gcagtctgca gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aggagattac 300
ggatatggtt acgaggggtg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
aca 363
<210> 42
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Asp Tyr Gly Tyr Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr
115 120
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 43
His Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 44
Ile Ile Ser Asp Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 45
Asp Tyr Gly Tyr Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 46
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat acttatgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaagcact gatttattcg acatcctatc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtggac gttcggtgga 300
ggcactaagc tggaaatcaa a 321
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 47
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 48
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 49
Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 50
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 51
<211> 360
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 51
gaggtccagc tgcaacagtt tggagctgag gtggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcact gactacaaca tgaactgggt gaagcagagc 120
catgaaaaga gccttgagtg gattggagat attcatccta agtttcatag tactaactac 180
aaccagaaat tcaagggaaa ggccacattg actatagaca cgtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcaacctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc acgagttggt 300
aactacgttt actttgttat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 52
Glu Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile His Pro Lys Phe His Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Asn Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Asn Tyr Val Tyr Phe Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 53
Asp Tyr Asn Met Asn
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 54
Asp Tyr Asn Met Asn Asp Tyr Asn Met Asn
1 5 10
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 55
Val Gly Asn Tyr Val Tyr Phe Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 56
agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttact 60
ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120
gggcagtctc ctaaactcct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180
cgcttcagtg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatacct ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 57
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 58
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 59
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 60
Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 61
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的
19E3 VH序列的合成的人源化变体
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的
19E3 VH序列的合成的人源化变体
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的
19E3 VH序列的合成的人源化变体
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Ile Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的
19E3 VL序列的合成的人源化变体
<400> 64
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的
19E3 VL序列的合成的人源化变体
<400> 65
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (19)

1.一种抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中，
(a)所述VH的CDR1的氨基酸序列是DYWMH(SEQ ID NO:7)，所述VH的CDR2的氨基酸序列是在位置7处Asn(N)被谷氨酰胺(Q)替代的TIDPSDNYTIYSQNFKG(SEQ ID NO:8)，并且所述VH的CDR3的氨基酸序列是YGFAMDY(SEQ ID NO:9)；和
(b)所述VL的CDR1的氨基酸序列是RASQDISNFLN(SEQ ID NO:12)，所述VL的CDR2的氨基酸序列是YTSRLHS(SEQ ID NO:13)，并且所述VL的CDR3的氨基酸序列是QQGHTLPRT(SEQ IDNO:14)；
其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合至IL-21。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，
(a)所述VH包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列；和
(b)所述VL包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，还包含重链恒定区，其中，所述重链恒定区包含IgG恒定结构域。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述IgG恒定结构域包含相对于野生型IgG恒定结构域的一个或多个氨基酸取代，并且具有与具有所述野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比增加的半衰期。
5.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述IgG恒定结构域是人IgG1恒定结构域。
6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：24。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包含轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：26。
8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包含
(a)包含SEQ ID NO：20的重链氨基酸序列；和
(b)包含SEQ ID NO：22的轻链氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或重组抗体。
10.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段为Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv和sc(Fv)2。
11.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段缀合至选自由以下组成的组的试剂：抗微生物剂、前药、肽、蛋白质、脂质、生物反应调节剂、可检测标签、聚乙二醇PEG及其任意组合。
12.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段缀合至治疗剂。
13.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段缀合至药剂。
14.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段缀合至选自由以下组成的组的试剂：酶、淋巴因子、异源抗体或其片段、及其任意组合。
15.一种药物组合物，包含如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，以及可选的一种或多种药学上可接受的载体、或者稀释剂。
16.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防受试者中的自身免疫性疾病或病症的制剂中的用途，其中，所述自身免疫性疾病是舍格伦氏综合征SS、ANCA-相关的血管炎AAV、巨细胞动脉炎GCA血管炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、类风湿性关节炎RA、克罗恩氏病、重症肌无力、寻常天疱疮、特发性血小板减少性紫癜ITP、I型糖尿病、IgG4-相关疾病、或其任意组合。
17.如权利要求16所述的用途，其中，所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。
18.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测样品中IL-21表达水平的试剂盒中的用途。
19.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防受试者中的移植物抗宿主病的制剂中的用途。
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