CN106771260A

CN106771260A - 检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN106771260A
Application number: CN201710205483.2A
Authority: CN
Inventors: 张国中; 赵静; 何梓榕; 阮思凡
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法。所述ELISA试剂盒包括：ELISA反应板，重组FAdV‑4 fiber‑2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。本发明试剂盒和检测方法适用于血清4型禽腺病毒的快速检测，具有操作简单、高特异性、高灵敏度、低成本的特点。

Description

检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及一种用于检测血清4型禽腺病毒(FAdV-4)抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)。该病毒粒子无囊膜，直径约70-90nm，呈二十面体对称，由衣壳、纤突、核酸芯髓及相关蛋白构成。根据群特异性抗原的不同，禽腺病毒可分为3群(I-III群)。其中I群禽腺病毒包括从鸡、火鸡、鹅及其它禽类分离获得的腺病毒，其包含5个基因型(A-E)、12个血清型(1-11，8a，8b)。在FAdV的编码蛋白中，F2纤突蛋白(fiber-2)的氨基酸组成不保守，表面带有亚群及型的特异性抗原表位；同时，fiber-2蛋白可识别宿主细胞上的特异性受体，使病毒能够吸附于宿主细胞，这一功能与病毒的感染能力、组织嗜性及毒力密切相关。

FAdV可经粪便、气管和鼻腔粘膜水平传播，也可垂直传播，主要为种鸡产蛋期感染后1～2周内经蛋传播给子代。鸡群感染后表现为包含体肝炎和心包积液的临床症状，引起死亡率在10％-80％之间，其中肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardiumsyndrome)也称“安卡拉”病是由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起，也是致病性最强的一个血清型。近年来国内报道FAdV-4感染有增多的趋势，给国内养禽业造成巨大经济损失。

FAdV-4的诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定，琼脂扩散试验，酶联免疫吸附试验等，病毒的分离与鉴定结果准确可信，但是检测周期长，操作繁琐，不利于疾病的快速诊断。

目前国内市场上仅有的针对I群FAdV的通用抗体检测的商品化ELISA试剂盒，由于是国外进口产品，价格昂贵，并且不能用于血清4型FAdV抗体的特异性检测和FAdV-4疫苗免疫效果的评价。因此急需研发出针对血清4型FAdV的ELISA抗体检测试剂盒。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其具有操作简单、高特异性、高灵敏度、低成本的特点。

本发明的另一目的在于提供一种通过所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，从而可以更简便、快捷、准确地检测血清4型禽腺病毒抗体。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括：ELISA反应板，重组FAdV-4fiber-2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白是通过如下步骤获得的：

原核表达：以NCBI数据库中血清4型FAdV JSJ13株(GenBank登录号为KM096544)基因组序列作为参考，设计特异性引物，扩增FAdV-4JSJ13株fiber-2基因完整的开放阅读框，将其克隆至pET-32a原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中通过加入0.4-0.8mMIPTG诱导重组蛋白进行表达；

蛋白纯化和复性：将重组菌株超声处理后，提取菌体沉淀进行亲和层析纯化，进而通过梯度透析法复性，获得可溶性FAdV-4fiber-2蛋白；

蛋白鉴定：利用Western blotting方法对纯化后的FAdV-4fiber-2蛋白进行鉴定。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，所述FAdV-4fiber-2蛋白的基因序列扩增引物如下：

上游引物：5’-CCGGATATCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’，***EcoR V酶切位点；

下游引物：5’-CCGAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’，***Hind III酶切位点。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，

所述包被液为碳酸盐缓冲液，其通过称取NACO₃ 1.5g及NaHCO₃2.9g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得；

可选的，所述洗涤液为PBST，并且所述PBST为含有体积分数0.05％吐温-20的PBS溶液；

可选的，所述封闭液为5％脱脂乳，其通过将5g脱脂乳溶解于100mL PBS中获得；

可选的，所述底物显色液为双组份TMB显色液；

可选的，所述终止液为2mol/L稀硫酸。

本发明还提供了一种通过所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，包括如下步骤：

(1)包被：使用包被液将重组FAdV-4fiber-2蛋白稀释，将已稀释的蛋白加至ELISA反应板中，4℃包被过夜；

(2)洗涤；

(3)封闭：将封闭液加至ELISA反应板中，于37℃封闭；

(4)洗涤；

(5)孵育待检血清：以封闭液稀释待检血清样品，将已稀释的待检血清样品加至ELISA反应板中，于37℃孵育；

(6)洗涤；

(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体加至ELISA反应板中，于37℃孵育；

(8)洗涤；

(9)显色：每孔加入显色液，于37℃显色；

(10)终止：每孔加入终止液，终止显色反应；

(11)读数：将ELISA反应板置于酶标仪中，在450nm波长下测定OD₄₅₀；

(12)检测：利用统计学方法计算出阴性标准样品的平均值和标准差(SD)，样品则判定该样品为FAdV-4阳性。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的方法在另一种实施方式中，包括如下步骤：

(1)包被：使用包被液将重组FAdV-4fiber-2蛋白稀释至1-2μg/mL，将已稀释的蛋白以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，4℃包被过夜；

(2)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(3)封闭：将封闭液以300μL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃封闭2h；

(4)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(5)孵育待检血清：以封闭液稀释待检血清样品50-300倍，将已稀释的待检血清样品以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃孵育15-45min；

(6)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体4000-8000倍，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体以100μL/孔加至ELISA反应板中，于37℃孵育15-45min；

(8)每孔加入300μL洗涤液洗涤ELISA反应板3次；

(9)显色：将每孔加入100μL已混均的显色液，37℃显色5-15min；

(10)终止：每孔加入50μL的终止液，终止显色反应；

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的方法在另一种实施方式中，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白被稀释至1.5μg/mL，所述待检血清样品被稀释200倍，所述酶标二抗被稀释6000倍，在所述步骤(5)和(7)中的孵育时间均为30min，所述显色时间为10min。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的方法在另一种实施方式中，所述样品OD_450nm大于临界值0.130则判定该样品为FAdV-4阳性。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的方法在另一种实施方式中，所述阴性标准血清为采集自无特定病原的鸡血清。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的方法在另一种实施方式中，所述待检血清还包括阳性标准血清，并且所述阳性标准血清为经噬斑纯化后FAdV-4型毒株灭活后通过皮下注射途径免疫无特定病原鸡，21天后再经滴口途径感染无特定病原鸡，二次免疫后14天采集免疫鸡的血分离的血清。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1)用于包被的fiber-2蛋白其氨基酸组成不保守，与不同血清型的抗原特异性相关，与其他血清型FAdV无交叉，利于较好的检出FAdV-4，特异性佳；2)将FAdV-4标准阳性血清进行系列稀释后，发现进行6400倍稀释后利用本方法仍能检测出FAdV-4阳性，表明该方法具有较高的敏感性；3)本发明对同一血清进行多次板内及板间重复试验，表明该方法变异系数小于10％，具有较好的重复性；4)该方法对其它常见禽病病原，如H5亚型禽流感病毒(AIV-H5)、H7亚型禽流感病毒(AIV-H7)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、血清2型副粘病毒(APMV-2)、减蛋综合征病毒(EDS)的阳性血清的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法亦具有良好的特异性；5)本发明对10份血清样品测定的OD450值与样品的中和效价具有良好的对应关系；6)本发明方法适用于养禽生产中进行FAdV-4血清抗体的检测，具有高特异性、高敏感性、高重复性、低成本的特点，可在2h内对FAdV-4的临床血清样品进行快速鉴别诊断，弥补了目前商品化试剂盒仅能检测I群FAdV群特异性抗体的缺陷，针对引发肝炎-心包积液综合征(安卡拉病)的FAdV-4抗体能进行快速检测，并且为FAdV-4的血清学调查研究提供了可靠的技术手段。

附图说明

图1是使用特异性引物扩增fiber-2基因的ORF；

其中，1-M：Trans 5k Marker，1-1：fiber-2基因的ORF。

图2是0.6mM IPTG诱导重组fiber-2蛋白表达的结果；

其中，2-M：Protein ladder，2-1：空载体对照，2-2：未诱导重组菌株，2-3：诱导后重组菌株上清，2-4：诱导后重组菌株沉淀。

图3是重组fiber-2蛋白纯化结果；

其中，3-M：Protein ladder，3-1：流穿液，3-2：洗液1，3-3：洗

液2，3-4：重组蛋白。

图4是纯化后fiber-2蛋白的Western Blotting结果；

其中，4-M：Protein ladder，4-1：以His-tag单抗为一抗，4-2：以FAdV-4阳性血清为一抗。

图5是本发明方法的阴性临界值测定结果。

图6是本发明方法的敏感性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下列实施例中常规的实验方法，参见Crowther编写的ELISA指导。仪器的使用参照仪器操作说明。Biometra PCR自动循环仪购自北京北方华奥贸易有限公司；超声波组织破碎仪购自Cole Parmer公司产品；Centrifuge 5810R低温台式离心机购自德国Eppendorf公司；恒温振荡培养箱购自太仓市实验设备厂；SK-O180-E标准型圆周摇床购自美国SCILOGEX公司；MCO-15AC二氧化碳培养箱购自上海***实业有限公司医疗设备厂；LHS-100CH温箱购自上海一恒科学仪器有限公司Infinite F200PRO酶标仪购自TECON公司；protein ladder购自北京全式金生物技术有限公司；Prime STAR，dNTP及5×Buffer购自北京索莱宝科技有限公司；T4连接酶、Hind III及EcoR V限制性内切酶购自北京百灵克生物科技有限责任公司；蛋白Loading buffer购自中科迈晨科技有限公司；双组份TMB显色液购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物技术有限公司；即用型透析袋购自北京索莱宝科技有限公司；ELISA酶标反应板、细胞培养板、培养瓶购自北京明豪至远医药技术开发中心。

本发明实施例中选用的生物材料如下：BL21(DE3)感受态大肠杆菌购自北京全式金生物技术有限公司；鸡肝癌细胞系、无特定病原鸡血清、禽流感病毒阳性血清、新城疫病毒阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、血清2型副粘病毒阳性血清、减蛋综合征阳性血清、血清4型禽腺病毒JSJ13株及其阳性血清均由中国农业大学动物医学院保藏和提供。

实施例1用于包被抗原的fiber-2蛋白的表达

1、根据FAdV-4JSJ13株的fiber-2基因序列，设计带有EcoRV及HindIII限制性内切酶位的特异性引物。上游引物：5’-CCG GATATC ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’(EcoR V)，下游引物：5’-CCG AAGCTT TTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’(Hind III)。将特异性引物用于扩增fiber-2基因的开放阅读框(ORF)，长度为1440bp。

2、使用DNAVzol法提取JSJ13株的基因组，以其基因组为模板对fiber-2基因片段进行扩增。PCR反应体系如下：

Prime STAR高保真酶的PCR反应程序如下：

3、将目的片段进行胶回收纯化后与pET-32a载体共同使用EcoR V及Hind III进行双酶切，酶切反应体系如下：

将酶切后的线性pET-32a及fiber-2基因片段再次进行胶回收纯化。

4、将带有EcoR V及Hind III酶切位点的FAdV-4JSJ13株的fiber-2基因及pET-32a载体进行连接，反应在16℃金属浴中过夜，连接体系如下：

将连接产物即重组质粒pET-32a-fib2转化至BL21(DE3)感受态细胞中。具体步骤按照感受态细胞转化使用说明书进行。

5、将序列测定正确的重组菌种接种于LBA液体培养基中，置于37℃恒温摇床200r/min振荡培养过夜。将培养过夜的菌液按1:100比例接种于10mL LBA液体培养基中，置于37℃恒温摇床200r/min振荡培养2h。当菌液OD₆₀₀值达到0.4-0.6时，在菌液中加入IPTG至其终浓度至0.6mM，并将其置于30℃恒温摇床200r/min振荡培养5h。空载体转化后的菌株及不添加IPTG的重组菌株对照。将诱导后的重组菌株进行超声处理，如图2所示，重组蛋白以包含体及可溶形式同时表达。

实施例2用于包被抗原的fiber-2蛋白的纯化

弃去重组菌株裂解后的菌体上清，保留菌体沉淀。按照His-tag包含体蛋白纯化试剂盒说明书进行操作。纯化完成后，收集流穿液与洗脱液进行SDS-PAGE检验。检验结果如图3所示，通过使用高浓度的咪唑洗脱镍柱，得到了纯度较高的fiber-2蛋白。

实施例3用于包被抗原的fiber-2蛋白的特异性鉴定及复性

1、分别吸取25μL纯化后蛋白至于新的离心管中，加入5μL6×Protein LoadingBuffer充分混匀。将混匀后的样品100℃水浴5min，冰浴2min。

2、配制凝胶后，将处理好的样品重复加入上样孔并进行垂直电泳90min。取出凝胶后，切取整个蛋白分子质量大小的胶，并剪下面积相同的两张PVDF膜浸泡于甲醇中活化。70V恒压转印60min。转印完成后，将PVDF膜浸于5％脱脂乳中，37℃封闭1h。封闭完成后，将PVDF膜置于PBST中洗涤3次，5min/次。将两张相同的PVDF膜分别浸于1:1000稀释的His-tag单抗及1:200倍稀释的JSJ13株阳性血清中。置于圆周摇床上，低速转动，4℃孵育过夜。从稀释的抗体中取出PVDF膜置于PBST中洗涤3次，10min/次。将PVDF膜浸于1:10000稀释的酶标二抗中，置于圆周摇床上，室温低速转动1h。从稀释的酶标二抗中取出PVDF膜置于PBST中洗涤3次，10min/次。向PVDF膜上加入化学发光试剂，置于化学发光成像***下成像。

3、纯化后的重组fiber-2蛋白放入即用型透析袋中，用夹子将两端夹紧。浸于含有6M尿素的PBS溶液中，4℃透析12h。再更换溶液为含4M尿素的PBS溶液、2M尿素的PBS溶液及PBS中，透析时间不变。透析后吸出可溶性fiber-2蛋白，利用BCA法测定fiber-2蛋白的浓度。

实施例4检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法最佳抗原包被浓度、最佳显色时间的摸索

本发明的间接ELISA步骤如下：

(1)利用1×ELISA包被液稀释重组fiber-2蛋白，每孔加入100μL已稀释的蛋白至ELISA反应板中，4℃过夜包被。

(2)每孔加入300μL PBST洗涤反应板3次，每次3min。

(3)将已配制的5％脱脂乳加至反应板中，每孔300μL，并将反应板置于温箱中，37℃封闭2h。

(4)每孔加入300μL PBST洗涤反应板3次，每次3min。干燥后可放于-20℃保存备用。

(5)以封闭液稀释待检血清样品，每孔加入100μL稀释后血清至ELISA反应板中。将反应板置于温箱中37℃孵育30min。

(6)每孔加300μL PBST洗涤反应板3次，每次3min。

(7)以封闭液稀释酶标二抗，每孔加入100μL已稀释的酶标二抗至ELISA反应板中，将反应板置于温箱中37℃孵育30min。

(8)每孔加300μL PBST洗涤反应板3次，每次3min。

(9)将显色A、B液混合，每孔加入100μL已混均的显色液。将反应板置于37℃进行显色反应。

(10)每孔加入50μL的2M硫酸，终止显色反应。将反应板置于酶标仪中，在450nm波长下测定OD值(OD₄₅₀)。

选取蛋白包被浓度及显色时间两个条件进行摸索。

1、使用包被液将可溶性的fiber-2蛋白稀释至1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL，每孔加入100μL已稀释的蛋白进行包被。测定不同蛋白包被浓度下标准阳性血清及标准阴性血清的OD₄₅₀值。如表1所示，蛋白的最佳包被浓度为1.5μg/mL。

表1最佳抗原包被浓度的确定

2、在37℃条件下显色，分别在显色5min、10min、15min后加入终止液终止反应。测定不同显色时间下的标准阳性血清及标准阴性血清的OD₄₅₀值。确定本方法的最佳显色时间。如表2所示，显色液最佳作用时间为10min。

表2显色液最佳作用时间的确定

实施例5检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法最佳血清样品、酶标二抗稀释倍数的摸索

本发明选取了血清样品最佳稀释倍数及酶标二抗最佳稀释倍数进行摸索。

1、将标准阳性血清及标准阴性血清进行1:50、1:100、1:200、1:300三个梯度稀释，测定不同血清样品稀释度下，标准阳性血清及标准阴性血清的OD₄₅₀值。如表3所示，血清样品的最佳稀释倍数为1:200。

表3血清样品最佳稀释倍数的确定

2、将兔抗鸡酶标二抗按照1:4000、1:6000、1:8000三个梯度进行稀释。测定这三种条件下，标准阳性血清及标准阴性血清的OD₄₅₀值。摸索酶标二抗最佳稀释度的结果如表4所示，1:6000为最佳条件。

表4酶标二抗最佳稀释倍数的确定

实施例6检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法阴性临界值确定

本发明选取已经确定的间接ELISA最佳反应条件，测定35份FAdV-4阴性血清的OD₄₅₀值。利用统计学方法计算出35个阴性样品的平均值和标准差(SD)。

样品则判定该样品为FAdV-4阳性。结果如图5所示，计算出阴性临界值为0.130

实施例7检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法敏感性与重复性检测

1、将FAdV-4标准阳性血清按照1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800的比例进行稀释。使用已建立的I-ELISA方法对不同稀释倍数的血清进行检测，测定间接ELISA的最低检测限量。如图6所示，在将标准阳性血清稀释6400倍后仍能有效检出FAdV-4的抗体，说明本发明具有较高的敏感性。

2、利用建立的间接ELISA方法检测标准阳性及阴性血清的重复性。在同一板内及不同板间，每份血清重复10次，计算间接ELISA测得的OD₄₅₀平均值标准差(SD)和变异系数(CV)。重复性结果如表5、6所示，标准阳性及阴性血清的板内与板间重复性均小于10％，说明本发明具有较好的重复性。

表5同一板内阳性、阴性血清重复性试验结果

表6不同板间阳性、阴性血清重复性试验结果

实施例8检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法交叉反应性检测

使用本发明方法测定临床禽病病原H5亚型禽流感病毒(AIV-H5)、H7亚型禽流感病毒(AIV-H7)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、血清2型副粘病毒(APMV-2)、减蛋综合征病毒(EDS)的阳性血清的OD₄₅₀值。结果如表7所示，交叉反应均为阴性，说明本发明与其他临床常见禽病病原不存在交叉反应。

表7本发明方法与其他病原阳性血清的交叉反应

实施例9检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法与血清中和试验的对应关系

选取本发明方法测定OD₄₅₀值后的9份血清，及标准阳性血清(共10份)进行血清中和试验，确定本发明方法与血清中和试验是否具有对应关系。具体步骤如下：

(1)将JSJ13毒株稀释为200TCID₅₀病毒液，用于以下试验。

(2)向血清中加入等体积青链霉素混合溶液，4℃过夜处理后56℃水浴30min，灭活血清。

(3)使用DMEM将血清样品连续2倍比稀释。向每一稀释度血清中加入等体积的病毒液，37℃孵育1h。

(4)倒掉96孔细胞原有的细胞培养液，用PBS洗涤细胞一次。将病毒与血清混合液接种于细胞中，每孔100μL，37℃孵育2h。每个血清样品的每个稀释梯度重复4孔。

(5)倒弃细胞孔中的血清病毒混合液，每孔加入200μL细胞维持液，37℃培养7天。

培养期结束后，将细胞板至于显微镜下观察每孔细胞状态。若细胞变大变圆，发生聚集则为细胞病变，记录10个血清每一稀释度的细胞病变数，用Reed-Muench法(Reed andMuench，1983)计算血清中和效价。结果如表8所示，本发明测定的FAdV抗体效价与中和试验测定的血清中和效价具有良好的对应关系。

表8血清样品OD450值与血清中和试验结果的比较

实施例10使用本发明检测临床样品中FAdV-4特异性抗体

选取15个来自河北、北京、辽宁和山东的肉种鸡场，其中每个种鸡场采集样品30份。450份临床血清样品的背景信息如表9所示。利用本发明方法测定450份血清样品的OD₄₅₀值。鸡群1到9为未免疫种鸡，使用本发明检测9个鸡群的FAdV-4抗体阳性率低，且抗体滴度较低。来自这9个鸡群的样品OD₄₅₀值范围多在0.00-0.253之间。鸡群10到15免疫了FAdV-4组织灭活疫苗，使用本发明检测这6个鸡群的FAdV-4抗体，阳性率均大于73.3％，且血清抗体滴度较高，多数血清样品OD₄₅₀值＞1.0。对15个鸡群FAdV的血清抗体检测结果显示，未经免疫的健康鸡只体内含有的FAdV-4抗体滴度较低，而免疫了FAdV疫苗的鸡只体内可产生较高的FAdV-4抗体。本发明建立的间接ELISA方法对来自不同采样时间及不同采样地点的血清样本均适用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法

<130> P170359DD1F

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccggatatca tgctccgggc ccctaaaaga ag 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccgaagcttt tacgggaggg aggccgctgg 30

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> 禽腺病毒属（Fowl aviadenovirus C）

<400> 3

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

<210> 4

<211> 479

<212> PRT

<213> 禽腺病毒属（Fowl aviadenovirus C）

<400> 4

Met Leu Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met

20 25 30

Val Arg Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala

35 40 45

Asp Pro Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Val Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp

85 90 95

Val Asn Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr

115 120 125

Val Met Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser

130 135 140

Gly Gly Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro

180 185 190

Asn Met Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Asp Ser Ser Gly Val Gly

210 215 220

Val Ser Val Asp Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Tyr Asp Thr Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr

260 265 270

Val Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser

275 280 285

Gly Ser Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ala Asn Ala Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln

305 310 315 320

Gly Leu Leu Val Thr Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met

325 330 335

Gly Asn Arg Pro Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr

340 345 350

Phe Trp Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln

355 360 365

Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro

370 375 380

Met Ala Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly

385 390 395 400

Tyr Tyr Glu Pro Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val

405 410 415

Thr Gly Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val

420 425 430

Pro Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu

435 440 445

Gln Cys Thr Asn Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met

450 455 460

Ile Val Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro

465 470 475

Claims

1.一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括：ELISA反应板，重组FAdV-4fiber-2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。

2.根据权利要求1所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白是通过如下步骤获得的：

(1)原核表达：以NCBI数据库中血清4型FAdV JSJ13(KM096544)基因组序列作为参考，设计特异性引物，扩增FAdV-4fiber-2基因完整的开放阅读框，将其克隆至pET-32a原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达；

(2)蛋白纯化和复性：将重组菌株超声处理后，提取菌体沉淀进行亲和层析纯化，然后通过梯度透析法复性，获得FAdV-4fiber-2蛋白。

3.根据权利要求2所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述FAdV-4fiber-2蛋白的基因序列扩增引物如下：

上游引物：5’-CCGGATATCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’；

下游引物：5’-CCGAAGCTT TTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’。

4.根据权利要求1所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：

所述包被液为碳酸盐缓冲液，其通过称取NACO₃ 1.5g及NaHCO₃ 2.9g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得；

可选的，所述底物显色液为双组份TMB显色液；

可选的，所述终止液为2mol/L稀硫酸。

5.一种使用权利要求1所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)洗涤；

(3)封闭：将封闭液加至ELISA反应板中，于37℃封闭；

(4)洗涤；

(6)洗涤；

(8)洗涤；

(9)显色：每孔加入显色液，于37℃显色；

(10)终止：每孔加入终止液，终止显色反应；

6.一种根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(3)封闭：将封闭液以300uL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃封闭2h；

(4)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(6)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；

(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体4000-8000倍，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃孵育15-45min；

(8)每孔加入300μL洗涤液洗涤ELISA反应板3次；

(9)显色：每孔加入100μL显色液，37℃显色5-15min；

(10)终止：每孔加入50μL的终止液，终止显色反应；

7.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述重组FAdV-4fiber-2蛋白被稀释至1.5μg/mL，所述待检血清样品被稀释200倍，所述酶标二抗被稀释6000倍，在所述步骤(5)和(7)中的孵育时间均为30min，所述显色时间为10min。

8.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述样品OD_450nm大于临界值0.130则判定该样品为FAdV-4阳性。

9.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述阴性标准血清为采集自无特定病原的鸡血清。

10.根据权利要求5所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于：所述待检血清还包括阳性标准血清，并且所述阳性标准血清为经噬斑纯化后FAdV-4型毒株灭活后通过皮下注射途径免疫无特定病原鸡，21天后再经滴口途径感染无特定病原鸡，二次免疫后14天采集免疫鸡的血分离的血清。