CN106770937A - 一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型及其检测方法。所述生物模型基于在不同谷氨酸钠条件的NGM培养基Ⅰ培养的秀丽线虫，经裂解、离心得沉淀，将沉淀清洗悬起后，在NGM培养基Ⅱ上培育至第一期幼虫。待线虫长到成年时期，挑n只到相应的新的培养板上，每隔一天将其继续转移到新的培养板上，直至产卵结束。在该过程中对这n只线虫在体式显微镜下进行如下指标的测定和记录。本发明研究谷氨酸钠对人类健康的影响具有重大意义；对推测谷氨酸钠是否具有对后代成长不利具有重要的提示作用；简单估算安全的食用味精类产品的浓度范围；实验过程周期短、简洁方便高效，对仪器的要求少，应用价值大。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型及其检测方法。
背景技术
秀丽线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)作为科学研究中常用且非常重要的一种模式动物，具有以下特点和优势：个体较小，成虫约1.5mm长，成本便宜，便于在实验室上大量培养和操作；身体半透明状，在微分干涉显微镜下很容易观察其体内各个组织甚至细胞的形态和结构；雌雄同体占群体大部分，雄性个体一般在群体中约占0.2％。雌雄同体可自体受精产生后代，也可与雄性个体交配进行双性繁殖。每只成虫一生约能产生300多卵，与雄虫交配后能产生1400个以上的后代，对于群体统计非常便利；生活周期短：在20℃下平均生活史为3.5天，便于快速进行表型分析；遗传背景简单清楚，每一个体细胞的发育情况都研究得较为清楚，便于追踪；基因组相对较小约97Mb，分布于6条染色体，且已经全部测序完成，其中40％的基因与人类同源，从而为高等动物中相似的细胞分子调控机制提供了重要的线索。因此，在人类衰老与寿命及一些遗传疾病、动物的应激反应、植物病虫害治疗、环境生物学等方面均得到了广泛的应用。
谷氨酸钠是味精类调味料的主要成分，多用于汤和调味汁，其作用主要是增加食品的鲜味，引起人们的食欲，提高人体对食物的消化率，在中国的菜肴中用得尤为多。一般食盐用水冲淡400倍已感觉不出咸味，但谷氨酸钠盐用水稀释3000倍人能感觉到鲜味。通常认为，味精在100℃加热半小时，只有0.3％的谷氨酸钠生成焦谷氨酸钠，对人体影响甚微，但在碱性环境中，味精会经过化学反应产生一种谷氨酸二钠的物质，可能会对人体产生影响，但具体有什么危害却知之甚少。
发明内容
本发明为解决味精类产品食品安全检测的技术难题，公开了一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型及其检测方法。
为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：
一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型，所述生物模型基于在不同浓度谷氨酸钠条件的NGM培养基Ⅰ培养的秀丽线虫，秀丽线虫经裂解、离心得沉淀，将沉淀清洗悬起后，在NGM培养基Ⅱ上培育至第一期幼虫。
所述不同浓度谷氨酸钠的配制方法如下：以LB液体培养基为溶剂溶解谷氨酸钠，配制谷氨酸钠储液。
一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型的检测方法，步骤如下：
(1)从培养基Ⅱ上切下含有第一期幼虫的琼脂块到A、B、C、D培养板上，每组平行取4个板，分别标记为A1-A4，B1-B4，C1-C4，D1-D4；卵孵化后长到幼虫4期，此时培养板上的线虫标记为P0代线虫；
(2)P0代线虫长到成年期，挑n只到培养板Ⅱ上，每隔一天将其转移到新的培养板上，直至产卵结束；
(3)在显微镜下观察并记录步骤(1)-(2)过程中A1-A4(指A1、A2、A3、A4)，B1-B4(指B1、B2、B3、B4)，C1-C4(指C1、C2、C3、C4)，D1-D4(指D1、D2、D3、D4)培养板上P0代线虫的各项指标。
所述P0代线虫的各项指标的测定如下：
(1)对A1-D1(指A1、B1、C1、D1)P0代线虫的生殖***的可能影响进行如下指标的测定：
a.挑选10只进入幼虫4时期36h的秀丽线虫到新板上，检测2小时内对照组和不同处理组的产卵数；
b.后代数目：即整个产卵期的所有卵数；
c.世代时间：P0代成虫产卵到其F1代成虫产卵的时间间隔；
(2)对A2-D2(指A2、B2、C2、D2)P0代线虫的运动能力的可能影响进行如下指标的测定：
a.头部摆动的频率：记录同时期的成虫在1min内头部摆动的次数；
b身体弯曲的频率：记录同时期的成虫在30s内弯曲的次数；
(3)对A3-D3(指A3、B3、C3、D3)P0代线虫生长发育可能造成的影响的进行如下指标的测定：
a.寿命：以线虫卵孵化记为生命起始的0天，以粘虫器轻触虫体无反应为线虫生命的终止，记录从生命起始到终止的时间；
b.体长：测量进入幼虫4时期36h的秀丽线虫并制片，利用正置显微镜拍照后，统计从头部到尾部中轴线的长度；
(4)对A4-D4(指A4、B4、C4、D4)P0代线虫其它重要生理方面功能进行以下指标的测定：
a.肠道***及自发荧光量的测定：通过正置荧光显微镜拍照计算秀丽线虫体内脂褐质积累的水平，主要检测成虫的衰老程度；
b.细胞凋亡情况：检测生殖腺在进入幼虫4时期36h及48h的秀丽线虫细胞凋亡的情况；
c.ROS水平的检测：利用荧光探针H2DCF-DA检测，具体方法如下：
①分别挑选对照组和各处理组30只L4之后60h时期的成虫到50μL lysis buffer中；
②12000rpm室温离心1分钟；
③液氮速冻，室温溶解后加入50μL 100μM H2DCF-DA，涡旋混匀；
④放入37℃摇床，150转孵育1h(整个过程中注意避光处理)；
⑤用酶标仪检测荧光值(excitation/emission:485/525nm)：设定每隔20min测定一次，持续测定90min。
按照所述P0代线虫的各项指标的测定方法，检测F1-F3代的各项相关生理指标，并分析。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明公开了一种用秀丽线虫建立谷氨酸钠(味精类产品)可能产生的深远影响模型及方法，为人们的食用安全提供理论和技术基础。
(2)本发明研究谷氨酸钠(味精类产品)对人类健康的影响具有重大意义；对推测谷氨酸钠(味精类产品)是否具有对后代成长不利具有重要的提示作用；简单估算安全的食用味精类产品的可能浓度范围；实验过程周期短、简洁方便高效，对仪器的要求少，应用价值大。
附图说明
图1为不同浓度的谷氨酸钠溶液对产卵数的影响。
图2为不同浓度的谷氨酸钠溶液对头部摆动频率的影响。
图3为不同浓度的谷氨酸钠溶液对身体弯曲频率的影响。
具体实施方式
一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型，所述生物模型基于在不同浓度谷氨酸钠条件的NGM培养基Ⅰ培养的秀丽线虫，秀丽线虫经裂解、离心得沉淀，将沉淀清洗悬起后，在NGM培养基Ⅱ上培育至第一期幼虫。
所述不同浓度谷氨酸钠的配制方法如下：以LB液体培养基为溶剂溶解谷氨酸钠，配制谷氨酸钠储液。
一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型的检测方法，步骤如下：
(1)从培养基Ⅱ上切下含有第一期幼虫的琼脂块到A、B、C、D培养板上，每组平行取4个板，分别标记为A1-A4，B1-B4，C1-C4，D1-D4；卵孵化后长到幼虫4期，此时培养板上的线虫标记为P0代线虫；
(2)P0代线虫长到成年期，挑n只到培养板Ⅱ上，每隔一天将其转移到新的培养板上，直至产卵结束；
(3)在显微镜下观察并记录步骤(1)-(2)过程中A1-A4(指A1、A2、A3、A4)，B1-B4(指B1、B2、B3、B4)，C1-C4(指C1、C2、C3、C4)，D1-D4(指D1、D2、D3、D4)培养板上P0代线虫的各项指标。
所述P0代线虫的各项指标的测定如下：
(1)对A1-D1(指A1、B1、C1、D1)P0代线虫的生殖***的可能影响进行如下指标的测定：
a.挑选10只进入幼虫4时期36h的秀丽线虫到新板上，检测2小时内对照组和不同处理组的产卵数；
b.后代数目：即整个产卵期的所有卵数；
c.世代时间：P0代成虫产卵到其F1代成虫产卵的时间间隔；
(2)对A2-D2(指A2、B2、C2、D2)P0代线虫的运动能力的可能影响进行如下指标的测定：
a.头部摆动的频率：记录同时期的成虫在1min内头部摆动的次数；
b身体弯曲的频率：记录同时期的成虫在30s内弯曲的次数；
(3)对A3-D3(指A3、B3、C3、D3)P0代线虫生长发育可能造成的影响的进行如下指标的测定：
a.寿命：以线虫卵孵化记为生命起始的0天，以粘虫器轻触虫体无反应为线虫生命的终止，记录从生命起始到终止的时间；
b.体长：测量进入幼虫4时期36h的秀丽线虫并制片，利用正置显微镜拍照后，统计从头部到尾部中轴线的长度；
(4)对A4-D4(指A4、B4、C4、D4)P0代线虫其它重要生理方面功能进行以下指标的测定：
a.肠道***及自发荧光量的测定：通过正置荧光显微镜拍照计算秀丽线虫体内脂褐质积累的水平，主要检测成虫的衰老程度；
b.细胞凋亡情况：检测生殖腺在进入幼虫4时期36h及48h的秀丽线虫细胞凋亡的情况；
c.ROS水平的检测：利用荧光探针H2DCF-DA检测，具体方法如下：
①分别挑选对照组和各处理组30只L4之后60h时期的成虫到50μL lysis buffer中；
②12000rpm室温离心1分钟；
③液氮速冻，室温溶解后加入50μL 100μM H2DCF-DA，涡旋混匀；
④放入37℃摇床，150转孵育1h(整个过程中注意避光处理)；
⑤用酶标仪检测荧光值(excitation/emission:485/525nm)：设定每隔20min测定一次，持续测定90min。
按照所述P0代线虫的各项指标的测定方法，检测F1-F3代的各项相关生理指标，并分析。
下面结合具体实验步骤，对本发明进行详细描述：
一、实验试剂(均需无菌操作)：
NGM培养基
根据wormbook中既定的方法，在2L的锥形瓶中分别加入3g NaCl(国产)，17g agar(进口)，and 2.5g peptone(进口)，后加入975mL ddH2O，高压灭菌20min。灭菌后在55℃平衡15min-30min，然后分别加入1mL 1M CaCl2,1mL 5mg/mL cholesterol(用无水乙醇配置),1mL 1M MgSO4and 25mL 1M KPO4buffer(108.3g KH2PO4,35.6g K2HPO4,加水定容至1L，高压灭菌)，混匀后倒入事先准备好的培养皿中，过夜后铺OP50菌，晾干后放入4℃备用。
Bleach buffer的配置(现用现配)，配置10mL的量如下：
500μL NaClO+1mL NaOH(5M)，后加ddH2O定容至10mL。
Lysis buffer的配置,配置1L的量如下：
3.725g KCL，10mL Tris(1M,PH 8.3)，0.2375g MgCl2，4.5mL NP40，4.5ml Tween-20，0.1g Gelatin，加ddH2O定容至1L。
M9的配置:
3g KH2PO4,6g Na2HPO4,5g NaCl,1mL 1M MgSO4,加水定容至1升，高温高压灭菌后备用。
谷氨酸钠溶液的配置:
首先配置谷氨酸钠的储液7.4×10-1g/mL，此时选用溶解谷氨酸钠的溶剂为常规液体LB培养基，高温高压灭菌后备用。
1.制备3.7×10-1g/mL的谷氨酸钠+OP50 20mL：分别取10mL谷氨酸钠的储液(7.4×10-1g/mL)后加入10mL的新鲜培养的OP50菌液(37℃培养箱静置培养约16小时)，混匀后铺板300μL，晾干后放置4℃备用。
2.制备7.4×10-2g/mL的谷氨酸钠+OP50 20mL：分别取2mL谷氨酸钠的储液(7.4×10-1g/mL)后加入18mL的新鲜培养的OP50菌液(37℃培养箱静置培养约12小时)，混匀后铺板300μL，晾干后放置4℃备用。
3.制备7.4×10-3g/mL的谷氨酸钠+OP50 20mL：分别取200μL谷氨酸钠的储液(7.4×10-1g/mL)后加入19.8mL的新鲜培养的OP50菌液(37℃培养箱静置培养约10小时)，混匀后铺板300μL，晾干后放置4℃备用。
二、实验步骤
(1)制备包含线虫的NGM培养基Ⅰ的3CM培养皿，然后将NGM培养皿分四组(每组至少准备10个)，第一组上面涂布有线虫正常生长需要的食物大肠杆菌300μL OP50(标记为A)，第二组涂布有OP50+3.7×10-1g/mL的谷氨酸钠(标记为B)，第三组涂布有300μL OP50+7.4×10-2g/mL的谷氨酸钠(标记为C)，第四组涂布有300μLOP50+7.4×10-3g/mL的谷氨酸钠(标记为D)。
(2)获得同步化的秀丽线虫第一期幼虫(L1时期)：用M9从3-4个NGM培养板上收集大量的雌雄同体野生型成虫N2到1.5mL EP管中，2000rpm离心1min，弃上清，然后加入2倍体积的线虫裂解液，上下颠倒混匀5min后2000rpm离心1min，弃上清。加入1mL M9将沉淀清洗3遍，每次离心条件同上，最后用等体积的M9将沉淀悬起，平铺只有NGM的培养基Ⅱ的皿上放入20℃培养箱中培育12h。
(3)从2中的培养皿中切含有较多L1幼虫的琼脂块(约小拇指甲盖大小)到A、B、C、D四组板，每组平行取4个板，分别标记为A1-A4,B1-B4,C1-C4,D1-D4。
(4)A、B、C、D四个培养板上的卵孵化后长到幼虫4期(即L4)时(大约两天时间)，检查每组每个板上的虫子个数并保证每只培养板上线虫个数如下：
(5)A1、B1、C1、D1各10只，A2、B2、C2、D2各10只，A3、B3、C3、D3各10只，A4、B4、C4、D4各10只，此时本批次培养板上的线虫标记为P0代。
(6)P0代线虫长到成年时期时(大约第三天时间)，挑10只到相应的新的培养板上，每隔一天将其继续转移到新的培养板上，直至产卵结束。在该过程中对这10只线虫在体式显微镜下进行如下指标的测定和记录：
a.对A1-D1P0代线虫的生殖***的可能影响进行如下指标的测定：
1)在特定的相同时间内成虫的产卵个数。
2)后代数目：即整个产卵期的所有卵数。
3)世代时间：P0代成虫产卵到其F1代成虫产卵的时间间隔
b.对A2-D2P0代线虫的运动能力的可能影响进行如下指标的测定：
1)头部摆动的频率：记录同时期的成虫在1min内头部摆动的次数(身体弯曲达到体长的一般时作为一次头部摆动)。
2)身体弯曲的频率：记录同时期的成虫在30s内弯曲的次数。
c.对A3-D3P0代线虫生长发育可能造成的影响的进行如下指标的测定：
1)寿命：以线虫卵孵化记为生命起始的0天，以pick末端轻触虫体无反应为线虫生命的2)终止，记录从生命起始到终止的时间。
3)体长：测量进入L4时期36h的秀丽线虫并制片，利用正置显微镜拍照后，统计从头部到尾部中轴线的长度。
d.对A4-D4P0代线虫其它重要生理方面功能进行以下指标的测定：
1)肠道***及自发荧光量的测定：通过正置荧光显微镜拍照计算秀丽线虫体内脂褐质积累的水平，主要检测成虫的衰老程度。
2)细胞凋亡情况：检测生殖腺在进入L4时期36h及48h的秀丽线虫细胞凋亡的情况。3)ROS水平的检测：利用荧光探针H2DCF-DA检测，具体方法如下：
①分别挑选对照组和各处理组30只L4之后60h时期的成虫到50μL lysis buffer中；
②12000rpm室温离心1分钟；
③液氮速冻，室温溶解后加入50μL 100μM H2DCF-DA，涡旋混匀；
④放入37℃摇床，150转孵育1h(整个过程中注意避光处理)；
⑤用酶标仪检测荧光值(excitation/emission:485/525nm)：设定每隔20min测定一次，持续测定90min。
上述四组板上的成虫到产卵期时分别挑到相应的新培养板上产卵1h后放回原板，继续进行各指标的测定。产卵的批次板标记为F1代，然后将F1代重复4-5步骤进行统计，计算F1代的受影响程度。
F1代长到产卵期时再挑到相应新板上产卵1h放回F1代板，继续测定各个指标(数据及分析)。新产卵的批次板标记为F2代，然后重复4-5步骤进行统计，计算F2代的受影响程度。
F2代长到产卵期时再挑到相应新板上产卵1h放回F1代板，继续测定各个指标。新产卵的批次板标记为F3代，然后重复4-5步骤进行统计，计算F3代的受影响程度。
三、检测结果
1.不同浓度的谷氨酸钠对秀丽线虫各项指标的检测结果如下：
2.不同浓度的谷氨酸钠对秀丽线虫P0,F1,F2代的生育情况影响趋势一样，即谷氨酸钠(G)的浓度越高，产卵数越少，以p0代为例，检测数据如表1所示，结果趋势如图1所示：
表1
3.不同浓度的谷氨酸钠对秀丽线虫P0,F1,F2代的运动方面影响不大，结果如图2、图3所示，图2显示不同浓度的谷氨酸钠溶液对秀丽线虫P0,F1,F2代的头部摆动频率影响不大，图3显示不同浓度的谷氨酸钠溶液对秀丽线虫P0,F1,F2代的身体弯曲频率的影响不显著。
其他生理指标，如体长，细胞凋亡情况及衰老程度的检测没有特别显著的差异，综上，本实验结果证明：谷氨酸钠对生育方面的影响比较大。
Claims (5)
1.一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型，其特征在于：所述生物模型基于在不同浓度谷氨酸钠条件的NGM培养基Ⅰ培养的秀丽线虫，秀丽线虫经裂解、离心得沉淀，将沉淀清洗悬起后，在NGM培养基Ⅱ上培育至第一期幼虫。
2.如权利要求1所述的利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型，其特征在于，所述不同浓度谷氨酸钠的配制方法如下：以LB液体培养基为溶剂溶解谷氨酸钠，配制谷氨酸钠储液。
3.一种利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）从培养基Ⅱ上切下含有第一期幼虫的琼脂块到A、B、C、D培养板上，每组平行取4个板，分别标记为A1-A4，B1-B4，C1-C4，D1-D4；卵孵化后长到幼虫4期，此时培养板上的线虫标记为P0代线虫；
（2）P0代线虫长到成年期，挑n只到培养板Ⅱ上，每隔一天将其转移到新的培养板上，直至产卵结束；
（3）在显微镜下观察并记录步骤（1）-（2）过程中A1-A4，B1-B4，C1-C4，D1-D4培养板上P0代线虫的各项指标。
4.如权利要求3所述的利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型的检测方法，其特征在于，所述P0代线虫的各项指标的测定如下：
（1）对A1-D1 P0代线虫的生殖***的可能影响进行如下指标的测定：
a.挑选10只进入幼虫4时期36h的秀丽线虫到新板上，检测2小时内对照组和不同处理组的产卵数；
b. 后代数目：即整个产卵期的所有卵数；
c. 世代时间：P0代成虫产卵到其F1代成虫产卵的时间间隔；
（2）对A2-D2 P0代线虫的运动能力的可能影响进行如下指标的测定：
a. 头部摆动的频率：记录同时期的成虫在1min内头部摆动的次数；
b 身体弯曲的频率：记录同时期的成虫在30s内弯曲的次数；
（3）对A3-D3 P0代线虫生长发育可能造成的影响的进行如下指标的测定：
a. 寿命：以线虫卵孵化记为生命起始的0天，以粘虫器轻触虫体，无反应为线虫生命的终止，记录从生命起始到终止的时间；
b. 体长：测量进入幼虫4时期36h的秀丽线虫并制片，利用正置显微镜拍照后，统计从头部到尾部中轴线的长度；
（4）对A4-D4 P0代线虫其它重要生理方面功能进行以下指标的测定：
a. 肠道***及自发荧光量的测定：通过正置荧光显微镜拍照计算秀丽线虫体内脂褐质积累的水平，主要检测成虫的衰老程度；
b. 细胞凋亡情况：检测生殖腺在进入幼虫4时期36h及48h的秀丽线虫细胞凋亡的情况；
c. ROS水平的检测：利用荧光探针H2DCF-DA检测，具体方法如下：
①分别挑选对照组和各处理组30只L4之后60h时期的成虫到50μL lysis buffer中；
②12000rpm室温离心1分钟；
③液氮速冻，室温溶解后加入50μL 100 μM H2DCF-DA，涡旋混匀；
④放入37℃摇床，150转孵育1h；
⑤用酶标仪检测荧光值：设定每隔20min测定一次，持续测定90min。
5.如权利要求3或4所述的利用秀丽线虫建立谷氨酸钠影响的生物模型的检测方法，其特征在于：按照所述P0代线虫的各项指标的测定方法，检测F1-F3代的各项相关生理指标，并分析。
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Application publication date: 20170531 |