CN104569330A - 一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法 - Google Patents

一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，属于水样的环境毒理学检测技术领域。本发明的主要步骤包括环境水样的灭菌处理，线虫的培养，环境水样的生物样品暴露，及水样的毒理学检测几个过程。本方法的特点在于综合评价环境水样中多种类、多价态混合物作用于生物体的复杂效应；所需水样量小，操作简单，解决以往污染物毒理学研究中废液量多处理难及可能造成的二次污染问题；在生物样品暴露过程中，解决了由于水分蒸发造成水样所含物质浓度变化所引致的实验误差；实现水样作用于生物体毒理学的快速检测，解决了以往水样毒理学检测耗时长、成本高等问题，同时增加环境水样评价的准确性和精确性。

Description

一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法
技术领域：
本发明属于环境毒理学检测技术领域，更具体地说，涉及一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法。
背景技术：
环境毒理学是指利用毒理学方法从医学及生物学的角度研究环境中有害物质对人类及其他物种、生态环境造成的影响及潜在危害的学科。通过对环境污染物的生物效应、作用机制及损伤类型进行研究，对该污染物的环境卫生标准进行确定，为该污染物的环境治理方法及过程提供科学依据。
该学科主要通过观察和检测环境污染物对实验动物的毒理学效应来评估该污染物的损伤和作用机理，确定该污染物造成生物体不同损伤的剂量效应关系，制定环境卫生标准，并确定该污染物的清理方法。动物实验比细胞生物学实验相对复杂，个体水平的生物学变化更加难以检测。但动物实验在污染物对机体损伤的研究中更具有现实意义，能够更好地评估环境污染物的剂量阈值，确定其作用的靶器官及作用机理；动物实验还可评估自然水体环境中多种污染物共同作用条件下对生物体相互协同、拮抗作用的方式，完善人们对有毒物质作用于生命体危害的程度及作用机理的认识。
中国专利申请号为201310101778. 7，申请日为2013年03月27日，发明创造名称为：一种有机农药检测用高通量微流控装置及其水样检测方法，所述的模型结构中设置有水样取样模块、有机农药微流控模块及拉曼光谱检测模块；该申请案采用的模型是使用拉曼光谱技术研究水样中有机农药的污染情况检测，未曾考虑该农药的毒理学效应、剂量效应及其与水样中其他污染物相互作用对毒理学产生的影响。中国专利号201310546068.5，申请日为2013年11月06日，发明创造名称为：环境水样中PFOS的荧光快速检测方法，该专利利用PFOS与化学试剂相互作用，产生在280 nm处有发射光的荧光物质，建立此荧光值与水样中PFOS含量的对应关系，从而检测环境水样中PFOS的含量。该方法可快速检测水样中PFOS的含量，但只针对了这一种污染物且没有相关毒理学效应评估检测。中国专利申请号为201210346777.4，申请日为2012年09月19日，发明创造名称为：一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒及检测方法，该申请是利用抗原抗体的特异性相互作用，将双酚A抗体、标准品、反应终止液及底物等制成方便使用的试剂盒，通过简单的操作，高灵敏度地检测双酚A的环境浓度。该专利同样是针对单一物质的环境水平检测，并未评价双酚A环境毒理效应，及其在环境中的迁移转化过程和物理化学性质的变化对其毒理效应的影响。中国专利申请号为201210235805.5，申请日为2012年07月09日，发明创造名称为：毒理基因组学指数预警饮用水源水致癌风险的方法，该申请是利用基因芯片技术，根据美国EPA对人体致癌风险的标准阈值，计算饮用水涉癌毒理基因组学指数值，评价水源水的致癌风险度。该专利是针对可导致人类癌症的污染物环境水平检测，且基因芯片技术及小鼠养殖成本高昂，水样暴露后的小鼠处理复杂，RNA提取、cDNA合成及分子杂交过程操作繁琐，耗时长。
由此可见，针对多种类、多价态混合物共存的环境水样的毒理学效应个体水平的评价，缺乏适当的研究对象和相应的研究方法，作为指导环境水样污染物毒理学评估的重要参照。因此研制一种简单有效、快速地评价环境水样毒理学效应的方法，且可同时检测环境水样的生殖毒理、氧化压力和应激及DNA损伤水平的变化，具有非常重要的应用价值，同时也是一个技术难点。本发明正是针对上述问题，着重围绕环境水样毒理学效应检测方面进行了改进。
 发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于解决现有技术中关于环境水样个体水平毒理学效应评价的检测方法及DNA损伤和氧化应激相关评价方法的不足，提供了一种快速检测环境水样毒理学效应的方法。通过使用不同品系的秀丽隐杆线虫作为研究对象，采用不同的染色试剂可对环境水样的生殖毒理、氧化压力和应激及DNA损伤进行快速检测，解决了以往环境水样毒理学评价过程耗时长、成本高及检测过程复杂的问题。
技术方案
为实现上述检测目的，本发明的技术步骤具体为：
步骤一、环境水样的灭菌处理
使用0.22 μm的微孔滤膜，放置在对应尺寸的滤器中间，将组装好的滤器进行121摄氏度20分钟的灭菌处理，再对环境水样进行过滤处理；其中，为保证水样的灭菌效果，所使用的滤膜为两片；为保证线虫的生长状态，水样的过滤过程尽量在无菌的条件下操作；为验证水样的灭菌步骤，在过滤后应检查滤膜的完整情况，如破损需重新过滤。
步骤二、秀丽隐杆线虫的培养过程
将秀丽隐杆线虫（N2、WS1433、CF1553）使用同步化试剂处理（5 mol/L NaOH、NaClO）的方法进行同步化处理，在同步化处理24小时后，观察线虫的卵，有95%以上的卵发育至L1期幼虫时，将其分别接入实验组和对照组的铺有NGM及OP50的平皿中，以16-25 摄氏度的恒温培养环境进行48-72小时的培养，线虫发育至L4幼虫期。
步骤三、环境水样的生物样品暴露过程
在线虫成长至L4期且环境水样已完成灭菌处理之后，将线虫通过4500-6000 rpm的转速进行离心后转移到环境水样中，对照组转入同样体积的蒸馏水中，并分别加入1-2%体积的大肠杆菌OP50作为食物，再次进行4500-6000 rpm的离心，通过虹吸作用将线虫和水样吸到毛细玻璃管中，保持3.5-6.0 cm的毛细管水样高度，通过使用0.5-2%的琼脂糖进行两端的密封，进行12-24小时的暴露处理。
步骤四、荧光显微镜和微分干涉相差显微镜的毒理学测定
在暴露过程结束后准备两个载玻片，分别在其中心滴一滴20-200 μmol/L的NaN3溶液，将实验组和对照组的线虫转移到该溶液中进行麻醉，使用盖玻片盖上，等待3-5分钟线虫进入麻醉状态。使用荧光显微镜对野生型线虫体内生殖腺细胞的亮点聚集情况、野生型线虫CM-DCFDA染色后体内ROS的荧光强度、WS1433品系线虫的荧光物质分布情况和CF1553品系的荧光强度进行测定，使用微分干涉相差功能对线虫体内各器官的情况进行观察。通过两种功能的共定位确定环境水样作用于线虫的毒理学过程。
有益效果
本发明所表述的实验方案，与现有技术相比，具有以下特点：
本发明所表述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，通过使用体积小、通体透明、遗传背景清楚的秀丽隐杆线虫作为实验对象，所需水样量小，只需要2 μL水样即可完成毒理学检测，解决了以往污染物毒理学研究中废液量多处理难及废液可能造成的二次污染问题。线虫培养简单，同时还降低了成本。解决了以往使用小鼠等个体水平检测毒理学变化评价过程耗时长、成本高、实验操作复杂等问题；
本发明所表述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，通过选择不同品系的线虫，可以完成不同检测终点的毒理学评价，使得该方法能够在生殖毒理、氧化应激水平及氧化压力、DNA损伤及修复等多个毒理学检测中得到应用。
本发明所表述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，通过选择内径在50-85 μm之间的玻璃毛细管，使得检测所需的水样量极小（2 μL）保证了L4期线虫能够正常进入毛细管，而又不会重叠导致密度过大，同时，还可以直接在毛细管中观察线虫的行为及各器官的形态，使得实验最后的检测步骤可以进一步优化。
本发明所表述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，通过在玻璃毛细管的两端添加0.5-2%的琼脂层，保证了水样不会由于蒸发造成其所含物质的浓度变化，确保实验的准确性；同时线虫对乏氧环境的耐受极强，保证了线虫在水样中的暴露状态，确保实验的精确性。
本发明所表述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，通过选择显微镜的荧光功能和微分干涉相差功能，能够实现虫体内荧光强度和分布的同时观察，从而确定环境水样在个体水平损伤中主要的靶器官，使实验检测结果更加***和精确。
本发明所表述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，实验操作简单，耗时短，实验结果***清楚。
附图说明
图1为本发明检测环境水样毒理学效应的示意图；
图2为实施例1中使用荧光显微镜检测线虫生殖腺细胞凋亡现象的荧光图；
图3为实施例2中使用荧光显微镜检测线虫氧化压力的荧光图；
图4为实施例3中使用荧光显微镜检测线虫体内SOD-3表达量的荧光图；
图5为实施例4中使用荧光显微镜检测线虫DNA损伤情况的荧光图。
具体实施方式
为进一步解释本发明的内容，实施例以0.5 mM双氧水为处理水样，以下结合图例对本发明的具体步骤做详细描述。
实施例1: 基于秀丽隐杆线虫的微量水样生殖腺细胞凋亡检测方法
本实施例表述的是一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样生殖腺细胞凋亡检测方法，其步骤包括环境水样的灭菌处理、秀丽隐杆线虫的培养过程、环境水样的生物样品暴露过程、荧光显微镜和微分干涉相差显微镜的毒理学测定过程。
步骤一、环境水样的灭菌处理
使用2片0.22 μm的微孔滤膜，放置在对应尺寸的滤器中间，将组装好的滤器进行121摄氏度20分钟灭菌处理，再对环境水样进行过滤处理；
步骤二、秀丽隐杆线虫的培养过程
将野生型秀丽隐杆线虫（N2）使用同步化试剂处理（5 mol/L NaOH、NaClO）的方法进行同步化处理，在同步化处理24小时后，观察线虫的卵，有95%以上卵发育为L1期幼虫时，分别接入实验组和对照组的铺有NGM及OP50的平皿中，以16-25 摄氏度的恒温培养环境进行48-72小时的培养，线虫发育至L4期幼虫；
步骤三、环境水样的生物样品暴露过程
在线虫成长至L4期且环境水样已完成灭菌处理之后，将线虫通过4500-6000 rpm的转速进行离心后转移到环境水样中，对照组转入同样体积的蒸馏水中，并分别加入1-2%体积的大肠杆菌OP50作为食物，再次进行4500-6000 rpm的离心，通过虹吸作用将线虫和水样吸到内径为55-80 μm的毛细玻璃管中，保持3.5-6 cm的毛细管水样高度，通过使用0.5-2%的琼脂糖进行两端的密封，进行12-24小时的暴露处理；在暴露后加入5 μg/mL的吖啶橙进行染色1小时。同时将该毛细管做避光处理。
步骤四、荧光显微镜和微分干涉相差显微镜的毒理学测定
在染色过程结束后准备两个载玻片，分别在其中心滴一滴20-200 μmol/L的NaN3溶液，将实验组和对照组的线虫分别转移到该溶液中进行麻醉，使用盖玻片盖上，等待3-5分钟线虫进入麻醉状态。使用微分干涉相差功能对线虫生殖腺的位置进行确定，使用荧光显微镜对野生型线虫体内生殖腺细胞的亮点聚集情况进行计数，通过两种功能的共定位确定环境水样作用于线虫的生殖腺细胞的损伤情况。
实施例2: 基于秀丽隐杆线虫的微量水样氧化应激水平检测方法
本实施例基本方法同实施例1，不同之处在于步骤二中将线虫的染色试剂换为10 μg/mL的 CM-DCFDA，步骤四中使用荧光显微镜观测线虫体内的荧光强度并使用Image pro plus软件进行荧光强度的分析。
实施例3: 基于秀丽隐杆线虫的微量水样氧化压力检测方法
本实施例基本方法同实施例1，不同之处在于步骤二中将线虫的品系替换为CF1553，该品系是在野生型线虫的基础上将绿色荧光蛋白偶联了SOD-3 的启动子，使得绿色荧光蛋白的强度等同于SOD-3的表达量。而SOD-3是线虫体内氧化自由基的抑制剂，通过观测SOD-3的表达量即可检测线虫体内氧化压力的水平。不同之处还有步骤四中使用荧光显微镜观测线虫体内的荧光强度并使用Image pro plus软件进行荧光强度的分析。
实施例4: 基于秀丽隐杆线虫的微量水样DNA损伤检测方法
本实施例基本方法同实施例1，不同之处在于步骤二中将线虫的品系替换为WS1433，该品系是在野生型线虫的基础上将绿色荧光蛋白偶联了HUS-1的启动子，使得绿色荧光蛋白的强度等同于HUS-1的表达量。而HUS-1是线虫体内DNA损伤响应的关键蛋白，该蛋白平时在线虫的细胞质表达，当DNA损伤后，聚集到细胞核位置，其荧光表现为点状聚集。通过观测HUS-1的表达部位及数量即可验证线虫体内氧化压力的水平。不同之处还有步骤四中使用荧光显微镜观测线虫体内的荧光分布及点状聚集数量并使用微分干涉相差功能确定荧光蛋白的位置。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，只为说明本发明的技术思路及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或改进，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：其步骤包括环境水样的灭菌处理过程、秀丽隐杆线虫的培养过程、环境水样的生物样品暴露过程、荧光显微镜和微分干涉相差显微镜的毒理学测定过程；其中，环境水样的灭菌处理步骤包括将水样通过已灭菌的微孔滤膜过滤，获取可用于毒理学检测的无菌水样；秀丽隐杆线虫的培养过程步骤包括将同步化的卵孵化后培养至L4期线虫；环境水样的生物样品暴露步骤包括将线虫置于处理过的水样中，并使用琼脂糖将其固定在毛细玻璃管里；荧光显微镜和微分干涉相差显微镜的毒理学测定步骤包括对上述步骤中暴露处理过的线虫进行生殖毒理、氧化应激水平、DNA损伤情况评价。
2.根据权利要求1所述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：其步骤具体如下：
步骤一、环境水样的灭菌处理
使用2片0.22 μm的微孔滤膜，放置在对应大小的滤器中间，将组装好的滤器进行121摄氏度20分钟灭菌处理，再对环境水样进行过滤处理。
步骤二、秀丽隐杆线虫的培养过程
将秀丽隐杆线虫使用同步化试剂或者L1期饥饿的方法进行同步化处理，分成实验组和对照组，同时放置在NGM培养基上以16-25 摄氏度的恒温培养环境进行48-72小时的培养。
步骤三、环境水样的生物样品暴露过程
在线虫成长至L4期且环境水样已完成灭菌处理之后，将线虫通过4500-6000 rpm的转速进行离心后转移到环境水样中，并加入1-2%体积的大肠杆菌OP50作为食物，再次进行4500-6000 rpm的离心，通过虹吸作用将线虫和水样吸到毛细玻璃管中，保持3.5-6 cm的毛细管水样高度，通过使用0.5-2%的琼脂糖进行两端的密封，进行12-24小时的暴露处理。
步骤四、荧光显微镜和微分干涉相差显微镜的毒理学测定
在暴露过程结束后准备两个载玻片，分别在其中心滴一滴20-200 μmol/L的NaN3溶液，将实验组和对照组的线虫转移到该溶液中进行麻醉，盖上盖玻片，等待3-5分钟线虫进入麻醉状态。使用荧光显微镜对线虫体内的荧光物质分布和荧光强度进行测定，使用微分干涉相差功能对线虫体内各器官的情况进行观察。通过两种功能的共定位确定环境水样作用于线虫的毒理学过程。
3.根据权利要求2所述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：所述的滤膜为2片0.22 μm的微孔滤膜，且预先要经过灭菌处理以获得无菌的环境水样。
4.根据权利要求2所述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：所述的生物为秀丽隐杆线虫，所述的大肠杆菌品系为OP50，通过同步化处理在培养箱中固定培养温度和时间获得发育到L4期的个体。
5.根据权利要求2所述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：步骤三中所述毛细玻璃管的内径为50-85 μm，保持的水样高度为3.5-6 cm。
6.根据权利要求2所述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：步骤三中使用0.5-2%的琼脂糖进行毛细管两端的封闭。
7.根据权利要求2所述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：所述的镜检测定可以采用488 nm的激发光进行线虫荧光强度的测定，使用40倍微分干涉相差显微镜进行线虫的器官镜检。
8.根据权利要求2所述的一种基于秀丽隐杆线虫的微量水样毒理学检测方法，其特征在于：检测生殖损伤的时候使用的是线虫品系是N2，采用吖啶橙染色的方法，毛细管需要用锡箔纸包裹避光；检测DNA损伤的时候使用的线虫品系是WS1433，采用分析绿色荧光蛋白分布的方法，不需要避光；检测氧化损伤时使用的线虫品系是N2，使用CM-DCFDA探针，避光；检测氧化压力应激时使用的线虫品系是CF1553，采用分析绿色荧光蛋白分布的方法，不需要避光。
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