CN106755454A - 一种分子标签核酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分子标签核酸检测方法，包括以下步骤：(1)待测核酸DNA末端修复、加A；(2)产物和带有多个分子标签的DNA接头连接；(3)使用通用引物对连接产物进行扩增；(4)扩增产物和捕获探针进行杂交；(5)捕获产物用带有样本识别作用的分子标签引物进行扩增，最终产物通过高通量测序进行检测。分析方法为，综合分子标签、DNA片段的起始位置双重校正因素均一化测序结果，从而得到真实的突变、脱氧核糖核苷酸多态性(SNP)定性、定量分析结果。本发明可供高通量测序仪检测的测序文库，可定性定量检测核酸片段中的突变、SNP情况。

Description

一种分子标签核酸检测方法
技术领域
本发明属于DNA核酸检测领域，具体涉及一种用于检测脱氧核糖核酸中具体碱基突变、SNP的定性、定量方法。
背景技术
高通量测序是通过大规模平行测序，每次检测数千万条序列，可以快速廉价地进行DNA检测。然而目前大规模测序的整体错误率仍然较高，市场上主流的高通量测序仪的错误率基本在1～2％作用。错误率主要来自于测序过程本身会有一定的错误，同时PCR扩增过程中，也有PCR出错的可能，也存在某一个特定模板得到大量扩增，此位点在原有模板中真正的含量没有办法估算，最终只能得到一个定性的结果，常规的建库方法来直接进行高通量测序很难进行精准的定性和定量。
在肿瘤液态活检中，外周血中存在来自肿瘤脱落细胞的低峰度突变，希望可以做到万分之一的灵敏度，以便能更早发现肿瘤、及术后伴随诊断，及时调整有效的靶向药物。
常规的单基因病检测、诊断方法需要抽取羊水，在羊水中的胎儿脱落细胞为检测基质，进行PCR、荧光定量PCR、基因芯片或高通量测序。1997年科学界发现在孕妇外周血中含有胎儿的DNA，从而一直希望可以无需抽羊水，通过孕妇的外周血浆中检测无创地来检测胎儿是否有单基因病遗传。胎儿DNA在孕妇外周血浆中占比在10％左右，胎儿DNA中有50％来自于母亲，还有50％来自于父亲。如果要进行无需羊水穿刺的无创单基因病检测，遇到的最大挑战就是如何精准定量外周血中的突变和SNP，避免母体遗传的高背景造成的干扰。
综合高通量测序仪技术本身的错误率，以及肿瘤液态活检、无创单基因病的检测本质需求，迫切需要开发能区分测序错误、***错误，最终灵敏地定性定量分析碱基突变的技术流程。
发明内容
鉴于肿瘤液态活检需要极高的灵敏度，万分之一的检测灵敏度；无创单基因病检测要求能精准定量突变频率，从而判断孕妇所怀小孩是否带有单基因遗传病，需要开发能降低测序错误，并能检测微量突变的技术。
常规的高通量测序需要构建一个测序文库，测序文库主要是在待测DNA的两端接上通用的DNA接头，该接头序列和后续测序仪所使用的测序芯片进行杂交后，测序仪从DNA接头上的通用位置开始测序。为了确定单基因突变，通常需要对特定模板测序100次以上，如果随机出现的低频突变，会被认为是测序错误或者是PCR扩增中引发的错误而被忽略，因此常规的方法适合于来自于体细胞的突变检测，并不适用于检测样本中含有极低含量突变的样本。
本发明提供了一种新型建库方法和分析手段，两者的结合，从而可以将以往没有办法区分的测序错误、PCR错误等等降到最低，从而实现精确定性定量低频突变。
一种分子标签核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测脱氧核糖核酸(DNA)中加入DNA末端补平酶和dNTP，补平DNA末端，并在DNA的3’端增加碱基A；
2)直接往步骤1反应体系中加入DNA连接试剂，使步骤1所得产物与带有多个分子标签的DNA接头连接；
3)使用通用引物进行PCR扩增；
4)将步骤3所得扩增产物和捕获探针进行杂交，得到捕获产物；
5)捕获产物用带有样本识别作用的分子标签引物进行扩增，最终产物用于高通量基因测序；
6)测序后，通过接头两端序列可以获知DNA两端在染色体的起始位置，综合分子标签、DNA片段的起始位置双重校正因素得出测序结果：1.标签序列一致，DNA起始位置一致的为一个来源的DNA；2.标签一致，起始位置不一致的为不同模板DNA；3.标签不一致，起始位置一致为不同模板DNA；4.标签不一致，起始位置不一致为不同模板来源DNA。
本方法的创新在于，对常规DNA接头进行了结构修改，在通用部分和待测片段之间增加了分子标签的序列，分子标签可以为数个DNA碱基；和以往建库方法都不同的是，在一个样本中同时加入多个分子标签的DNA接头，待测DNA和接头连接后可能会出现两端为同一标签序列接头或者不同标签序列接头。
连接后的产物，通过接头中的通用部分进行扩增，增大模板量，随后和捕获探针进行杂交。捕获探针为特定目标片段、区域DNA的互补序列组合，可以为DNA或RNA探针。捕获的意义在于可以一次抓取多个位点或区域的DNA进行检测，不仅加快了获得特定片段的速度，同时也降低后期的测序费用，只需要对研究感兴趣的区域进行测序就可以。
完成捕获以后，采用和DNA接头通用部分互补引物进行扩增，此引物内含有针对该样本本身的唯一对应的序列标签，通过此次扩增，完成了文库构建。
本发明的测序文库需要采用双端测序的方法进行测序，即对建库中DNA的5’和3’端先后进行测序，两端的DNA序列通过比对可以知道DNA的在染色体上的起始位置，这样得到的数据整合分子标签的序列可以进行测序数据均一化处理。
进一步地，步骤1中DNA末端补平酶为T4DNA聚合酶、Klenowexo-、T4DNA磷酸激酶(T4DNA PNK)、Taq聚合酶或Klenow酶中的一种或多种。步骤1反应条件是37℃20分钟，反应后无需纯化。
步骤2所述DNA连接试剂主要由T4DNA连接酶和DNA接头组成，DNA接头由共同序列、分子标签序列组成，每一个样本加入多个分子标签。步骤2反应条件是20℃15～20分钟，反应后无需纯化。
步骤3使用和DNA接头通用部分互补的引物，进行PCR扩增。
步骤4扩增产物和需要捕获区域的探针进行杂交，捕获探针为DNA或RNA探针。
步骤5用带有唯一分子标签的引物对样本进行扩增，此标签用来区分具体样本。
综上所述，本发明创新地引入了两套分子标签体系，并结合测序所得DNA起始位置不同，来区分测得数据和原始样本的直接联系，从而大大规避了建库、PCR、测序过程中可能会引发的错误而造成的分析干扰。从而在现有的技术平台上实现了基因突变的高精度定性定量检测。
本发明具有以下技术特点：
(1)灵敏度高：通过引物双重标签和DNA起始位置，进行多维度校正，从而大大规避了测序错误、PCR错误等***误差的干扰，将整体检测灵敏度提升到万分之一的高度。
(2)多靶点：产物和捕获探针进行杂交，捕获区域定制灵活，可以是单个基因，也可以是全染色体所有基因的编码区。
(3)成本低：由于同时实现了多个区域的捕获，单一位点的检测成本急剧下降，并且由于建库的文库长度不长，无需长片断的测序试剂，因而实施方便，价格便宜。
(4)速度快：整体试验流程较其他产品使用简单，文库长度短，测序用时短。
说明书附图
图1是本发明方法流程示意图。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
本发明中使用的生物材料来源：
(1)DNA样本来源于孕妇血浆、肿瘤病人血浆、组织。
(2)DNA接头由大连宝生物公司合成。
实施例1
本实施例用于说明本方法构建孕妇外周血游离DNA测序文库，用于无创单基因病检测。
1. 2ml孕妇血浆，经由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提血浆游离DNA。
2.加入8单位/ul末端补平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液组成，反应条件是37℃20分钟。
3.直接在试管中加入1ul CAP，37℃1分钟，75℃5分钟变性。
4.直接在试管中加入DNA连接试剂：100单位/ul的DNA连接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris缓冲液，30mM的二硫苏糖醇及DNA接头组成，此接头序列为多个带有序列标签的接头的混合物。
5.反应条件是20℃20分钟，反应结束后直接由硅胶柱或磁性颗粒纯化
6. 10ul产物，加入文库扩增引物，10ul 2X Taq PCR mix，PCR仪器(95度10分钟，95度30秒、60度1分钟15个循环，72度10分钟)
7. PCR产物通过硅胶柱或磁性颗粒纯化成10ul产物
8. 10ul产物和10ul目标区域捕获探针结合，80ul杂交缓冲液(4M TrisHCL，pH8.0)，65度杂交过夜
9. 100ul杂交产物通过硅胶柱或磁性颗粒纯化成10ul产物
10.加入1ul带有样本标签的PCR扩增引物，95度10分钟，95度30秒、60度1分钟15个循环，72度10分钟
11. PCR产物经过硅胶柱或磁性颗粒纯化成20ul文库产物
12.文库可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。
13.数据分析，采用本发明分析策略，计算突变比例，从而推算孕妇所怀胎儿是否具有单基因遗传病。
实施例2
本实施例用于说明本方法构建肿瘤病人血浆游离DNA测序文库，用于液态活检。
1. 4ml肿瘤病人血浆，经由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提血浆游离DNA。
2.加入8单位/ul末端补平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液组成，反应条件是37℃20分钟。
3.直接在试管中加入1ul CAP，37℃1分钟，75℃5分钟变性。
4.直接在试管中加入DNA连接试剂：100单位/ul的DNA连接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris缓冲液，30mM的二硫苏糖醇及DNA接头组成，此接头序列为多个带有序列标签的接头的混合物。
5.反应条件是20℃20分钟，反应结束后直接由硅胶柱或磁性颗粒纯化
6. 10ul产物，加入文库扩增引物，10ul 2X Taq PCR mix，PCR仪器(95度10分钟，95度30秒、60度1分钟15个循环，72度10分钟)
7. PCR产物通过硅胶柱或磁性颗粒纯化成10ul产物
8. 10ul产物和10ul目标区域捕获探针结合，80ul杂交缓冲液(4M TrisHCL，pH8.0)，65度杂交过夜
9. 100ul杂交产物通过硅胶柱或磁性颗粒纯化成10ul产物
10.加入1ul带有样本标签的PCR扩增引物，95度10分钟，95度30秒、60度1分钟15个循环，72度10分钟
11. PCR产物经过硅胶柱或磁性颗粒纯化成20ul文库产物
12.文库可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。
13.数据分析，采用本发明分析策略，计算突变比例，从而推算该病人是否有靶向药物适应症。

Claims (8)

1.一种分子标签核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测脱氧核糖核酸(DNA)中加入DNA末端补平酶和dNTP，补平DNA末端，并在DNA的3’端增加碱基A；
2)直接往步骤1反应体系中加入DNA连接试剂，使步骤1所得产物与带有多个分子标签的DNA接头连接；
3)使用通用引物进行PCR扩增；
4)将步骤3所得扩增产物和捕获探针进行杂交，得到捕获产物；
5)捕获产物用带有样本识别作用的分子标签引物进行扩增，最终产物用于高通量基因测序；
6)测序后，通过接头两端序列可以获知DNA两端在染色体的起始位置，综合分子标签、DNA片段的起始位置双重校正因素得出测序结果：1.标签序列一致，DNA起始位置一致的为一个来源的DNA；2.标签一致，起始位置不一致的为不同模板DNA；3.标签不一致，起始位置一致为不同模板DNA；4.标签不一致，起始位置不一致为不同模板来源DNA。
2.根据权利要求1所述的分子标签核酸检测方法，其特征在于，步骤1中DNA末端补平酶为T4 DNA聚合酶、Klenowexo-、T4 DNA磷酸激酶(T4 DNA PNK)、Taq聚合酶或Klenow酶中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的分子标签核酸检测方法，其特征在于，步骤1反应条件是37℃20分钟，反应后无需纯化。
4.根据权利要求1所述的分子标签核酸检测方法，其特征在于，步骤2所述DNA连接试剂主要由T4DNA连接酶和DNA接头组成，DNA接头由共同序列、分子标签序列组成，每一个样本加入多个分子标签。
5.根据权利要求4所述的分子标签核酸检测方法，其特征在于，步骤2反应条件是20℃15～20分钟，反应后无需纯化。
6.根据权利要求1所述的分子标签核酸检测方法，其特征在于，步骤3使用和DNA接头通用部分互补的引物，进行PCR扩增。
7.根据权利要求1所述的分子标签核酸检测方法，其特征在于，步骤4扩增产物和需要捕获区域的探针进行杂交，捕获探针为DNA或RNA探针。
8.根据权利要求1所述的分子标签核酸检测方法，其特征在于，步骤5用带有唯一分子标签的引物对样本进行扩增，此标签用来区分具体样本。
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