CN106754874A - 一种从人体粪便样本中提取dna的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒及其使用方法，所述试剂盒中含有裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、蛋白质沉淀液Ⅰ、蛋白质沉淀液Ⅱ、DNA沉降液、漂洗液、洗脱溶解液和0.1‑1mm灭菌玻璃珠，使用方法包括振荡裂解、蛋白沉淀、DNA沉淀、冷漂、洗脱溶解备用。本发明的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒及其使用方法具有提取迅速，较好提取效果，安全环保，所获得DNA量大，质量高的特点。

Description

一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒及其使用方法。

背景技术

人体肠道内定植着一群十分复杂又相对稳定的微生物，这些微生物在人体肠道内形成了一个复杂而动态的微生物***，对人体的健康有着非常重要的影响。肠道内微生物***的细微变化都会对人机体产生巨大的影响。根据研究表明，人体肠道内微生物对人体健康至关重要。肠道内的微生物与人体多种疾病密切相关，相关研究表明：一些常见的疾病包括糖尿病、哮喘、慢性腹泻、肠易激综合症(IBS)、炎症性肠道病(IBD)、肥胖症、免疫力低下等都被发现与细菌分布平衡的失调有密切关联。随着研究不断深入，科学家们还发现多种癌症的发生与肠道菌群的细微改变息息相关。

由于肠道长度长，很难直接对肠道内菌群进行检测，对粪便中的微生物进行分析，能间接反映人体肠道内菌群状况，有助于了解人体肠道微生态变化。所以，对粪便样本内微生物检测已成为了解肠道微生态的主要手段。

结肠直肠癌(carcinoma of colon and rectum)是常见的消化道恶性肿瘤。我国的结直肠癌每年新发病例约33.1万人，发病率在全部恶性肿瘤中排名第四位；每年死于该病的患者有15.9万人，死亡率则位居癌症死亡原因第五位。腺瘤是直肠癌形成之前的一个阶段，从腺瘤发展到癌一般要经历5-15年或更长，这就为结直肠癌的筛查和早诊早治提供了可能。因此，找到一种简单、快速、灵敏的早期检测方法是控制结直肠癌病死率的一个行之有效的方法。目前，对结直肠癌的诊断主要为结肠镜检查，然而结肠镜检查属于侵入式检查，很容易引起不适和并发症。近年来，通过对结直肠癌患者和健康人的肠道菌群检测发现菌群在分布上有明显差异，肠道菌群可能参与了结直肠癌发展。如果对受试者的粪便进行分析，就能确定是否有可能患有结直肠癌，就能很好的对普通人群进行筛查，从而做到对结直肠癌早发现早治疗。

由于肠道环境的特殊性，肠道微生物只有很少一部分能够在体外培养，这严重阻碍了人们对肠道微生物的结构以及多样性的认知。随着分子生物学技术的不断发展，人们可以直接从DNA水平上对肠道菌群进行研究。由于粪便成分复杂(含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物)，而且肠道内细菌种类繁多，对不同的提取方法敏感度不一，导致了不同提取方法的提取效果及效率不一。进而导致后续分析结果不尽人意，甚至产生偏差。

目前粪便微生物DNA提取的方法有很多，常见的有机械法，如磁珠法、冻融法；化学法，如SDS法，苯酚法，酶法(如溶菌酶、蛋白酶K等)和试剂盒法。这些方法的组合是实验室提取粪便DNA的常规方法。一般用SDS、溶菌酶、超声波等裂解细胞释放DNA，再用酚-氯仿、磁珠等进行抽提，最后无水乙醇沉淀。试剂盒法操作简单，效率高，但是提取的总DNA浓度低，处理大批样本成本高。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种快速、有效而且经济的从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，及简单、快速、高质量、高效率且价格合适的使用方法。

本发明的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，所述试剂盒中含有裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、蛋白质沉淀液Ⅰ、蛋白质沉淀液Ⅱ、DNA沉降液、漂洗液、洗脱溶解液和0.1-1mm灭菌玻璃珠，其中

所述裂解液Ⅰ包含物质的量浓度为0.1-2M的NaCl，物质的量浓度为10-150mM、PH＝8的Tris-HCl，物质的量浓度为10-150mM、PH＝8的EDTA，质量浓度为1-5％的SDS和质量浓度为0.5-2％的PVP；

所述裂解液Ⅱ包含质量浓度为5-30mg/ml的蛋白酶K溶液；

所述蛋白质沉淀液Ⅰ包含物质的量浓度为1-5M的乙酸钾溶液；

所述蛋白质沉淀液Ⅱ包含物质的量浓度为4-6M NaCl溶液；

所述DNA沉降液包含无水乙醇；

所述漂洗液包含体积分数为60-80％的乙醇溶液；

所用洗脱溶解液包含PH＝8的1×TE Buffer。

进一步的，所述裂解液Ⅰ包含物质的量浓度为0.5M的NaCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的Tris-HCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的EDTA，质量浓度为4％的SDS和质量浓度为1％的PVP。

进一步的，所述裂解液Ⅱ包含质量浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

进一步的，所述蛋白质沉淀液Ⅰ包含物质的量浓度为2M的乙酸钾溶液。

进一步的，所述蛋白质沉淀液Ⅱ包含物质的量浓度为6M NaCl溶液。

进一步的，所述漂洗液包含体积分数为70％的乙醇溶液。

进一步的，所述洗脱溶解液的PH＝8的1×TE Buffer由物质的量浓度为10mM、PH＝8的Tris-HCl和物质的量浓度为1mM、PH＝8的EDTA制成。

在本试剂盒中，裂解液Ⅰ提供细胞裂解环境，并且含有Dnase抑制物。裂解液Ⅱ能消化蛋白质释放DNA。蛋白质沉淀液Ⅰ、Ⅱ用于沉淀蛋白质等杂质。DNA沉降液可以使DNA分子沉淀下来。漂洗液用于冲洗掉DNA上残留的杂质，在一定浓度的乙醇环境中，DNA不会较大的损失。洗脱溶解液提供一个低盐稳定PH环境，用于洗脱DNA。

一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)取0.1-0.2g人体粪便样本，0.1-0.3g的0.1-1mm灭菌玻璃珠加入300-600μl裂解液Ⅰ使用振荡器震荡混匀3-5min；

2)向步骤1)所得溶液中加入5-20μl裂解液Ⅱ，振荡器震荡混匀5-20s，60-75℃水浴10-50min，每隔10min取出振荡器震荡5-20s离心取上清液；

3)向步骤2)所得上清液中加入50-200μl蛋白质沉淀液Ⅰ，上下颠倒充分混匀，冰上孵育10-30min，离心取上清液；

4)向步骤3)所得上清液中加入1/4体积的蛋白质沉淀液Ⅱ，上下颠倒充分混匀，离心取上清液；

5)向步骤4)所得上清液中加入2倍体积的DNA沉淀液，上下颠倒混匀，将溶液转移至吸附柱，离心，去除离心管内液体；

6)向吸附柱中加入0.5-1.5ml 2-8℃预冷漂洗液，静置1-5min，离心去离心管内液体，重复1-2遍；

7)取下吸附柱，静置3-8min、充分晾干；

8)向吸附柱中加入40-70μl 60-75℃预热的洗脱溶解液，静置溶解2-8min，离心；

9)将步骤8)所得溶液放置-20℃冰箱保存。

在本发明中，利用了人类粪便样本中微生物细胞膜及细胞壁的特点，以及DNA与蛋白质的相关性质，创造了一种新的提取人类粪便微生物总DNA的试剂盒。与其他同类试剂盒相比，本发明具有以下几个优点：

1、提取迅速，使用本试剂盒能在在4小时内完成较高质量的人类粪便DNA提取，与其他同类试剂盒相比极大提高了粪便样本DNA提取效率；

2、具有较好提取效果，本试剂盒能有效裂解人类粪便样本中各类微生物，能有效提取人类粪便样本中各类微生物总DNA；

3、与传统的DNA提取方法相比，本试剂盒不使用酚、氯仿等有毒试剂，而是使用醋酸钾、氯化钠等无毒的试剂去除样本中含有的蛋白质、多糖等杂质，安全环保；

4、使用本试剂盒所获得DNA量大，质量高，本试剂盒针对人类粪便样本中微生物的细胞膜及细胞壁特点，选择合适的裂解液能有效裂解人类粪便样本中的各类微生物，针对人类粪便样本中各类PCR抑制物选用合适的抑制物除去剂除去各类PCR抑制物，使用有效的DNA沉淀液沉淀DNA，使用合适的洗涤液多次洗涤DNA沉淀，最终得到较多且纯度较高能够很好的用于后续试验的DNA产物。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒及其使用方法，试剂盒中含有裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、蛋白质沉淀液Ⅰ、蛋白质沉淀液Ⅱ、DNA沉降液、漂洗液、洗脱溶解液和0.1-1mm灭菌玻璃珠，其中

裂解液Ⅰ包含物质的量浓度为0.5M的NaCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的Tris-HCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的EDTA，质量浓度为4％的SDS和质量浓度为1％的PVP。

裂解液Ⅱ包含质量浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

蛋白质沉淀液Ⅰ包含物质的量浓度为2M的乙酸钾溶液。

蛋白质沉淀液Ⅱ包含物质的量浓度为6M NaCl溶液。

DNA沉降液包含无水乙醇；

漂洗液包含体积分数为70％的乙醇溶液。

洗脱溶解液为PH＝8的1×TE Buffer，由物质的量浓度为10mM、PH＝8的Tris-HCl和物质的量浓度为1mM、PH＝8的EDTA制成。

一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)取0.1g人体粪便新鲜样本，0.2g灭菌玻璃珠加入500μl裂解液Ⅰ使用振荡器震荡混匀5min；

2)向步骤1)所得溶液中加入10μl裂解液Ⅱ，振荡器震荡混匀10s，70℃水浴30min，每隔10min取出振荡器震荡10s，10000rpm离心5min取上清液；

3)向步骤2)所得上清液中加入100μl蛋白质沉淀液Ⅰ，上下颠倒充分混匀，冰上孵育10min，10000rpm离心5min取上清液；

4)向步骤3)所得上清液中加入1/4体积的蛋白质沉淀液Ⅱ，上下颠倒充分混匀，10000rpm离心5min取上清液；

5)向步骤4)所得上清液中加入2倍体积的DNA沉淀液，上下颠倒混匀，将溶液转移至吸附柱，10000rpm离心5min取上清液，去除离心管内液体；

6)向吸附柱中加入1ml 4℃预冷漂洗液，静置2min，10000rpm离心5min去离心管内液体，重复1-2遍；

7)取下吸附柱，静置5min、充分晾干；

8)向吸附柱中加入60μl 70℃预热的洗脱溶解液，静置溶解5min，10000rpm离心5min；

9)将步骤8)所得溶液放置-20℃冰箱保存。

实施例2

本实施例的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒及其使用方法，试剂盒中含有裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、蛋白质沉淀液Ⅰ、蛋白质沉淀液Ⅱ、DNA沉降液、漂洗液、洗脱溶解液和0.1-1mm灭菌玻璃珠，其中

裂解液Ⅰ包含物质的量浓度为0.5M的NaCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的Tris-HCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的EDTA，质量浓度为4％的SDS和质量浓度为1％的PVP。

裂解液Ⅱ包含质量浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

蛋白质沉淀液Ⅰ包含物质的量浓度为2M的乙酸钾溶液。

蛋白质沉淀液Ⅱ包含物质的量浓度为6M NaCl溶液。

DNA沉降液包含无水乙醇；

漂洗液包含体积分数为70％的乙醇溶液。

洗脱溶解液为PH＝8的1×TE Buffer，由物质的量浓度为10mM、PH＝8的Tris-HCl和物质的量浓度为1mM、PH＝8的EDTA制成。

一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)取0.1g人体粪便-80℃冷藏样本，0.2g灭菌玻璃珠加入500μl裂解液Ⅰ使用振荡器震荡混匀5min；

2)向步骤1)所得溶液中加入10μl裂解液Ⅱ，振荡器震荡混匀10s，70℃水浴30min，每隔10min取出振荡器震荡10s，10000rpm离心5min取上清液；

3)向步骤2)所得上清液中加入100μl蛋白质沉淀液Ⅰ，上下颠倒充分混匀，冰上孵育10min，10000rpm离心5min取上清液；

4)向步骤3)所得上清液中加入1/4体积的蛋白质沉淀液Ⅱ，上下颠倒充分混匀，10000rpm离心5min取上清液；

5)向步骤4)所得上清液中加入2倍体积的DNA沉淀液，上下颠倒混匀，将溶液转移至吸附柱，10000rpm离心5min取上清液，去除离心管内液体；

6)向吸附柱中加入1ml 4℃预冷漂洗液，静置2min，10000rpm离心5min去离心管内液体，重复1-2遍；

7)取下吸附柱，静置5min、充分晾干；

8)向吸附柱中加入60μl 70℃预热的洗脱溶解液，静置溶解5min，10000rpm离心5min；

9)将步骤8)所得溶液放置-20℃冰箱保存。

以上实施例的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒及其使用方法具有：

1、提取迅速，使用本试剂盒能在在4小时内完成较高质量的人类粪便DNA提取，与其他同类试剂盒相比极大提高了粪便样本DNA提取效率；

2、具有较好提取效果，本试剂盒能有效裂解人类粪便样本中各类微生物，能有效提取人类粪便样本中各类微生物总DNA；

3、与传统的DNA提取方法相比，本试剂盒不使用酚、氯仿等有毒试剂，而是使用醋酸钾、氯化钠等无毒的试剂去除样本中含有的蛋白质、多糖等杂质，安全环保；

4、使用本试剂盒所获得DNA量大，质量高，本试剂盒针对人类粪便样本中微生物的细胞膜及细胞壁特点，选择合适的裂解液能有效裂解人类粪便样本中的各类微生物，针对人类粪便样本中各类PCR抑制物选用合适的抑制物除去剂除去各类PCR抑制物，使用有效的DNA沉淀液沉淀DNA，使用合适的洗涤液多次洗涤DNA沉淀，最终得到较多且纯度较高能够很好的用于后续试验的DNA产物。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、蛋白质沉淀液Ⅰ、蛋白质沉淀液Ⅱ、DNA沉降液、漂洗液、洗脱溶解液和0.1-1mm灭菌玻璃珠，其中

所述裂解液Ⅰ包含物质的量浓度为0.1-2M的NaCl，物质的量浓度为10-150mM、PH＝8的Tris-HCl，物质的量浓度为10-150mM、PH＝8的EDTA，质量浓度为1-5％的SDS和质量浓度为0.5-2％的PVP；

所述裂解液Ⅱ包含质量浓度为5-30mg/ml的蛋白酶K溶液；

所述蛋白质沉淀液Ⅰ包含物质的量浓度为1-5M的乙酸钾溶液；

所述蛋白质沉淀液Ⅱ包含物质的量浓度为4-6M NaCl溶液；

所述DNA沉降液包含无水乙醇；

所述漂洗液包含体积分数为60-80％的乙醇溶液；

所用洗脱溶解液包含PH＝8的1×TE Buffer。

2.根据权利要求1所述的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述裂解液Ⅰ包含物质的量浓度为0.5M的NaCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的Tris-HCl，物质的量浓度为50mM、PH＝8的EDTA，质量浓度为4％的SDS和质量浓度为1％的PVP。

3.根据权利要求1所述的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述裂解液Ⅱ包含质量浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

4.根据权利要求1所述的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质沉淀液Ⅰ包含物质的量浓度为2M的乙酸钾溶液。

5.根据权利要求1所述的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质沉淀液Ⅱ包含物质的量浓度为6M NaCl溶液。

6.根据权利要求1所述的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液包含体积分数为70％的乙醇溶液。

7.根据权利要求1所述的一种从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述洗脱溶解液的PH＝8的1×TE Buffer由物质的量浓度为10mM、PH＝8的Tris-HCl和物质的量浓度为1mM、PH＝8的EDTA制成。

8.一种根据权利要求1所述的从人体粪便样本中提取DNA的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)取0.1-0.2g人体粪便样本，0.1-0.3g的0.1-1mm灭菌玻璃珠加入300-600μl裂解液Ⅰ使用振荡器震荡混匀3-5min；

2)向步骤1)所得溶液中加入5-20μl裂解液Ⅱ，振荡器震荡混匀5-20s，60-75℃水浴10-50min，每隔10min取出振荡器震荡5-20s离心取上清液；

3)向步骤2)所得上清液中加入50-200μl蛋白质沉淀液Ⅰ，上下颠倒充分混匀，冰上孵育10-30min，离心取上清液；

4)向步骤3)所得上清液中加入1/4体积的蛋白质沉淀液Ⅱ，上下颠倒充分混匀，离心取上清液；

5)向步骤4)所得上清液中加入2倍体积的DNA沉淀液，上下颠倒混匀，将溶液转移至吸附柱，离心，去除离心管内液体；

6)向吸附柱中加入0.5-1.5ml 2-8℃预冷漂洗液，静置1-5min，离心去离心管内液体，重复1-2遍；

7)取下吸附柱，静置3-8min、充分晾干；

8)向吸附柱中加入40-70μl 60-75℃预热的洗脱溶解液，静置溶解2-8min，离心；

9)将步骤8)所得溶液放置-20℃冰箱保存。