CN106715457A - 一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供一种含有可在肿瘤微环境中特异激活的可***连接基团的抗癌化合物及其用途。所述抗癌化合物如下式所示，其中R1为常规功能基团或保护基团；R2为Ala、Thr、Val或Tle；R3为Ala、Val或Asn；R4为通过羟基或氨基连接的药物基团，该药物的通式为R4H。所述抗癌化合物只在肿瘤局部激活，不但避免了传统化疗药物损伤免疫***的缺陷，而且通过除去肿瘤免疫抑制性细胞来促进抗肿瘤免疫。该抗癌化合物或其药物组合物同免疫治疗联合使用，不仅增加了治愈肿瘤的效果，而且能有效抑制肿瘤转移和骨转移。

Description

一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途 技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种抗肿瘤药物化合物，具体地，一种肿瘤微环境特异激活的可***连接基团，含偶联体的抗癌化合物及其用途。
背景技术
传统细胞毒性化疗药物对人体正常细胞，免疫***具有巨大毒性。例如，多烯紫杉醇和紫杉醇是目前广泛使用的有效的抗肿瘤剂，主要用于各种实体肿瘤如卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。临床上应用这一化合物因为具有严重的毒副作用(如骨髓抑制)和致敏反应，而被限制其使用剂量。多烯紫杉醇具有骨髓毒性，造成中性粒细胞减少，具有神经毒性和心血管毒性，并能够引发过敏反应，溢出血管外可引起局部的炎症、脱发、乏力甚至带来肝脏毒性。丝裂霉素是目前广泛使用的另一种有效的抗肿瘤剂，主要用于各种实体肿瘤如胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和癌性胸腹水等。然而，临床上应用这一化合物因为具有严重的毒副作用和不良反应，而被限制其使用剂量。丝裂霉素能够具有骨髓毒性，造成白细胞、血小板减少。能够引发静脉炎、溢出血管外可引起组织坏死，脱发，乏力和带来肝肾功能损害。
在肿瘤微环境中，肿瘤细胞表达分泌大量的天冬酰胺肽链内切酶。肿瘤相关巨噬细胞(M2型)区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞(M1型)的确认标记也是天冬酰胺肽链内切酶的表达。肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞则能够刺激产生强烈的免疫抑制，并直接帮助肿瘤细胞浸润和转移，同时肿瘤细胞转移时通常分泌大量的蛋白水解酶以降解细胞间质。因此，通过化学合成，结合生物化学及药效药理学检测筛选，可筛选出被天冬酰胺肽链内切酶激活、二级激活连接臂的偶联体、偶 联体能够根据需要，偶联不同的增溶，修饰基团到特定细胞毒等化疗药物，产生新的具有靶向、激活、稳定、溶解性、代谢、毒性和药效等新功能的新型药物。
发明内容
本发明为开发抗肿瘤药物而创造新的具有靶向偶联激活和溶解治疗特性等功能发生变化的可***连接基团，并提供含有可***连接基团的化合物，如式(I)(II)所示。本发明肿瘤微环境特异激活的可***连接基团使用能够有效封闭被联接药物R4的毒性，然后只在肿瘤微环境中利用天冬酰胺肽链内切酶靶向激活，然后对氨基苯甲醇(4-氨基苄基-OC(O)-)自释放，使最终药物带有了新的靶向、激活和代谢特性。
具体而言，所述含有可***连接基团结构的化合物，可***连接基团为引号中一段修饰的三肽-R2-R3-Asn-4-氨基苄基-OC(O)-，化合物通过可***连接基团连接R1和R4，R1的羰基形成酰胺键连接可***连接基团，R4包括两种连接方式，R4的氧原子形成碳酸酯连接可***连接基团，或R4的氮原子形成氨基甲酸酯连接可***连接基团：
R1{-R2-R3-Asn-4-氨基苄基-OC(O)-}R4   (I)
式中，
R1为常规功能基团或保护基团；
R2是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和异亮氨酸，R2与R1形成羰基酰胺键；
R3是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和天冬酰胺；
R2与R3以及R3与Asn分别形成酰胺键连接；Asn通过其羰基与-NH-连接；
R4为通过其羟基或氨基连接的药物基团，通过形成碳酸酯或氨基甲酸酯而与可***连接基团连接；
含可***连接基团的化合物具有与天冬酰胺内肽酶接触而裂解，与R1分离；
含可***连接基团的化合物具有天冬酰胺内肽酶接触而裂解后，引发导致与R4形成的碳酸酯或氨基甲酸酯连接进一步断裂，导致R4与可***连接基团分离。
本发明通过合成含有可***连接基团的化合物，本发明上述含有可***连接基团的化合物(I)(II)具有以下结构和被激活的构效关系：(1)可***连接基团可以通过基团转换，与R4的毒性功能关键部位的适宜活化度的羟基或氨基反应，偶联形成新结构的药 物。最终偶联的化合物因为空间位阻具有不同的被天冬酰胺肽链内切酶激活的效率，这是因为天冬酰胺肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部，切割位点需要接近酶活中心，这时所连接的化合物对切割位点是否产生空间位阻，对连接位点的极性变为非常重要。通过对氨基苯甲醇(4-氨基苄基-OC(O)-)连接臂的延长和二次断裂，可有效降低了部分药物的空间位阻。但是本文中的S6、S20和没公布的化合物，仍然因为空间位阻而导致无法激活，虽然能合成，但是却无法形成含可***连接基团的有功能的化合物。(2)通过肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞特异表达的天冬酰胺肽链内切酶的特异性激活，含有可***连接基团的化合物在肿瘤局部被靶向激活而具有靶向细胞毒性，因空间位阻无法激活的化合物，药物是一个无细胞毒性或低毒的药物，不会成为抗癌药物。(3)偶联体连接化合物后药物的毒性大大降低，因为偶联体是与药物的羟基或氨基反应，而表面活跃羟基或氨基通常是药物毒性的关键基团。(4)含有可***连接基团的化合物在非肿瘤微环境的部位是稳定的，如血液，正常器官，免疫***和中性pH值也是稳定，因此带来低毒性或无毒性。(5)天冬酰胺肽链内切酶是从Asn处切断偶联体，从代谢产物分析只有断裂才启动对氨基苯甲醇(4-氨基苄基-OC(O)-)和R4间的激活，起到了级联激活的辅助作用。(6)对氨基苯甲醇(4-氨基苄基-OC(O)-)作为连接臂延长连接，能够有效降低连接上R4化合物后对天冬酰胺肽链内切酶反应中心接近的空间位阻，但天冬酰胺肽链内切酶的接触激活，仍然还会受到R4结构和极性的影响。(7)R1带来的极性，溶解性也与偶联体的激活效率相关，并对可***连接基团的化合物的溶解性、稳定性和有效性都密切相关。R1除了连接常规基团，还可以连接特殊的亲水基团或靶向基团，给含可***连接基团的化合物带来特殊功能，如实施例中提高溶解性和提高药效。(8)含有可***连接基团的化合物根据天冬酰胺肽链内切酶分布特点，能在多种肿瘤激活，加上溶解性的改变，能够直接改变被连接药物肿瘤适应症限制的情况，开发成为广谱性或特殊针对性抗肿瘤药物。(9)肿瘤细胞转移时通常分泌大量的天冬酰胺肽链内切酶以降解细胞间质，因此连接后的靶向药物对肿瘤转移治疗具有特殊的疗效。(10)含有可***连接基团的化合物具有低毒高效的特点，对免疫***无毒性，能够同期与免疫治疗联合治疗，产生协同药效。
具体的产生的系列化合物和实施例说明如下表：
(1)化合物S1－S43,S15’,B15和E15:说明可***连接基团通过两种连接方式可合成多种不同的新型抗癌化合物(实施例1～9)，其连接抗癌化合物不同带来不同的合成效率和毒性降低变化(实施9)，也带来不同的激活效率(实施例10，11)和疗效(实施例12),并提供了不同R1,R2,R3时可***的连接基团的比较研究(实施例13～14)；
(2)化合物S2’－S4’和S10’－S24’；化合物A1、A3－A4和A10－A24：说明可合成含有不同R1，R2，R3的可***连接基团连接的紫杉醇化合物(实施例16，17，27，28)， 其连接位置，空间位阻，连接长度，R1的变化带来溶解性不同(实施例17，28改善水溶性)，也带来不同的激活效率(实施例20，30)和低毒，高疗效和新适应症特性(实施例20～26，31～35，66)；
(3)化合物B1、B3－B4和B10－B24；化合物D2－D4和D10－D24：说明可合成含有R1，R2，R3的可***连接基团连接的多烯紫杉醇化合物(实施例36，37，46，47)，其连接位置，空间位阻，连接长度，R1的变化带来溶解性不同(实施例37，47改善水溶性)，也带来不同的激活效率(实施例38，49)和低毒，高疗效和新适应症特性(实施例40～45，50～54)；
(4)化合物E2－E4和E10－E24。说明可合成含有不同R1，R2，R3的可***连接基团连接的丝裂霉素化合物(实施例56，57)，其连接位置，空间位阻，连接长度，R1的变化带来溶解性不同(实施例57改善水溶性)，也带来不同的激活效率(实施例58)和低毒，高疗效和新适应症特性(实施例59～65)。
在一个具体实施例中，所述式(II)化合物具有下式(IIA)、(IIB)、(IIC)、(IID)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所示的结构式：
式中，
R1选自：6-马来酰亚胺C1-10烷基羰基、羟基氨基羰基C1-10烷基羰基、C1-4烷氧基-(C1-4烷氧基)n-C1-6烷基羰基、或
其中，各R独立为C1-4烷基，各n独立为1～300、优选1～150的任意整数；
R2为Ala、Thr、Val或Ile；
R3为Ala、Thr、Val或Asn；
R5是具有羟基的抗癌化合物(R5-OH)的活性部分(即除该用于连接的OH外的其它部分)，所述抗癌化合物选自喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇和多烯紫杉醇；和
R6为具有氨基的抗癌化合物(R6-NH2)的活性部分(即除该用于连接的NH2基团外 的其它部分)，所述抗癌化合物选自柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌和丝裂霉素。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明提供式(III)或式(IV)化合物的制备方法，所述方法如下所示：
其中，式(III)化合物的制备中，R1-R2-R3-Asn-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有醇羟基的药物(R5-OH)反应，生成式(III)化合物，所述药物为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇或多烯紫杉醇；
式(IV)化合物的制备中，R1-R2-R3-Asn-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有氨基的药物(R6-NH2)反应，生成式(IV)化合物，所述药物为柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌或丝裂霉素；
其中，R1为常规功能基团或保护基团；R2为Ala、Thr、Val或Ile；R3为Ala、Thr、Val或Asn。
本发明还提供式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
本发明还提供式(IX)所示的丝裂霉素衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防眼科疾病的药物中的用途。
本发明还提供式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞、抑制肿瘤生长、抑制血管新生、抑制癌细胞的浸润和转移和/或促进抗肿瘤免疫用的药物中的用途。
本发明还提供一种癌症治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物。
本发明还提供一种降低抗癌化合物毒副作用的方法，所述方法包括将该抗癌化合物与R1-R2-R3连接，其中，R1为常规功能基团或保护基团；R2为Ala、Thr、Val或Ile；R3为Ala、Thr、Val或Asn，所述抗癌化合物选自喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、紫杉醇、多烯紫杉醇和丝裂霉素。
附图说明
图1显示莱古杉醇与凯素、紫杉醇注射液在HT1080模型中高剂量等摩尔剂量和等毒剂量的对比实验。
图2显示紫杉醇和莱古杉醇的免疫刺激特性实验结果，显示莱古杉醇处理的肿瘤组织渗透出现更多的毒性CD8 T细胞(见右图箭头所指)。
图3显示紫杉醇和莱古杉醇的免疫刺激特性实验结果。
具体实施方式
一、化合物
本发明化合物包括式(A)所示的偶联体和该偶联体与药物R4偶联后所得的式(II)合物。本发明式(II)化合物能在肿瘤部位聚集，并被专一性激活而释放抗肿瘤化合物。
本发明式(A)化合物具有以下所示结构：
式中，R1为常规功能基团或保护基团；R2为Ala、Thr、Val或Ile；R3为Ala、Thr、Val或Asn；和R7为H、XC(O)-或任选取代(例如任选地被1、2或3个选自硝基、C1-4烷基、卤素、羟基、氨基的取代基取代)的苄氧基羰基，其中，X为卤素；其中，R1通过其羰基与R2形成酰胺键而与R2连接，R2与R3、R3与Asn以及Asn与-NH-分别形成酰胺键连接。
本发明还提供下式II的化合物：
式中，R1为常规功能基团或保护基团；R2为Ala、Thr、Val或Ile；R3为Ala、Thr、Val或Asn；和R4为通过羟基或氨基连接的药物基团，该药物的通式为R4-H。
在某些实施例中，本发明化合物中，R1通过其羰基与R2形成酰胺键而与R2连接，R2、R3和Asn形成三肽；Asn通过其羰基与-NH-连接；R4通过其氧原子与所述可***连接基团形成碳酸酯而与所述可***连接基团连接，或通过其氮原子与所述可***连接接头形成氨基甲酸酯而与所述可***连接基团连接。
在某些优选的实施例中，R4通过其芳香环上的氨基取代基的氮原子与所述可***连接接头形成氨基甲酸酯而与所述可***连接基团连接；或通过其芳香环或杂环上的羟基取代基的氧原子与所述可***连接基团形成碳酸酯而与所述可***连接基团连接。
在某些实施例中，R3优选为Ala。
本发明中，R1可以是氢或氨基保护基团。例如，R1可以是亲水基团或疏水基团。或者，R1可以选自C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基)、聚乙二醇-C1-C5烷基羰基、琥珀酰、葡糖苷酸、马来酰亚胺C1-10烷基羰基(例如6-马来酰亚胺己酰基)，2-甲氧基乙氧基C1-6烷基羰基、羟基氨基羰基C1-10烷基羰基(例如N-羟基氨基-1,8-辛二酸-1-单酰基)和己酰基(即C1-5烷基羰基)中的任意一种。
优选地，R1可以是如下的基团：6-马来酰亚胺C1-10烷基羰基、羟基氨基羰基C1-10烷基羰基、C1-4烷氧基-(C1-4烷氧基)n-C1-6烷基羰基、或
其中，各R独立为C1-4烷基，各n独立为1～300、优选1～150的任意整数。
优选地，当R4-H为水不溶性药物时，R1优选为PEG型基团，例如聚乙二醇-C1-C5烷基羰基，或者为
通常，R1与R2氨基酸的氨基相连；当R1与R2相连的基团为羰基时，形成酰胺键(-CO-NH-)。
本发明中，R4代表抗癌化合物的活性部分，所述抗癌化合物包括但不限于喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、紫杉醇、多烯紫杉醇和丝裂霉素。
式(II)化合物的例子包括下列结构式的化合物：
在一个具体实施例中，R4为-O-R5，通式(II)化合物如下式(III)所示：
其中，R5是具有羟基的抗癌化合物(R5-OH)的活性部分(即除该用于连接的OH外的其它部分)，所述抗癌化合物选自喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇和多烯紫杉醇。
在一个具体实施例中，R4为R6-NH，通式(II)化合物如下式(IV)所示：
式中，R6为具有氨基的抗癌化合物(R6-NH2)的活性部分(即除该用于连接的NH2基团外的其它部分)，所述抗癌化合物选自柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌和丝裂霉素。式(IV)中，“(H)”表示H可存在或不存在；当不存在时，N将以双键与R6连接。
本发明各结构式中的n通常为1～300的整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10……100、101、102、103……201、202、203……295、296、297、298、299和300。应理解，此处虽然没有具体描述1～300之间的各整数数值，但该范围内的各整数数值对于本领域技术 人员而言是显而易见的，且应认为本发明已具体公开这些整数数值。本发明中，各结构式中的n通常为1～250、1～200、1～150、1～100、1～50，以及例如5～10、5～50、5～100不等。
在一个具体实施例中，式(III)化合物的例子包括：
(1)化合物S1，其中，R1为2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基，R2为Thr，R3为Ala，R4为10-羟基喜树碱
(2)化合物S2，其中，R1为2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基，R2为Ala，R3为Ala，R4为喜树碱
(3)化合物S3，其中，R1为(N-羟基氨基)-1,8-辛二酸-1-单酰基，R2为Ala，R3为Ala，R4为卡培他滨
(4)以及化合物S7～S18，其中，R1为2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基，R2为Thr，R3为Ala，R4分别为喜树碱(S7)、10-羟基喜树碱(S8)、拓扑替康(S9)、氟脲苷(S10)、去氧氟尿苷(S11)、阿糖胞苷(S12)、氟达拉滨(S13)、依托泊苷(S14)、卡培他滨(S15)、吉西他滨(S16)、长春新碱(S17)、埃坡霉素B(S18),其连接的化合物及羟基位置如下：
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-喜树碱(S7)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-10-羟基喜树碱(S8)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-拓扑替康(S9)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-氟脲苷(S10)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-去氧氟尿苷(S11)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-阿糖胞苷(S12)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-氟达拉滨(S13)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-依托泊苷(S14)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-卡培他滨(S15)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-吉西他滨(S16)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-长春新碱(S17)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-埃坡霉素B(S18)
在一个具体实施例中，式(IV)化合物的例子包括：
(1)化合物S4，其中，R1为2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基R2为Thr，R3为Ala，R4为柔红霉素
(2)化合物S5，其中，R1为6-马来酰亚胺基己酰，R2为Ala，R3为Ala，R4为柔红霉素
(3)以及化合物S19～S28，其中，R1为2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基，R2和R3都是 Ala，R4分别是柔红霉素(S19)、表阿霉素(S20)、氟达拉滨(S21)、吉西他滨(S22)、尼莫司汀(S23)、米托蒽醌(S24)、甲氨蝶呤(S25)、阿糖胞苷(S26)、美法仑(S27),阿酶素(S28)，其化合物结构和连接氨基位置如下：
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-柔红霉素(S19)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-表柔比星(S20)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-氟达拉滨(S21)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-吉西他滨(S22)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-尼莫司汀(S23)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-米托蒽醌(S24)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-甲氨蝶呤(S25)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-阿糖胞苷(S26)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-美法仑(S27)
肿瘤微环境特异激活的可***连接基团-阿霉素(S28)
在一个具体实施例中，本发明提供了肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，该衍生物具有下式(V)所示的结构：
其中，R2选自Ala、Thr、Val或Ile；R3选自Ala、Thr、Val或Asn；n选自1～300、优选1～150中的任意整数。
式(V)化合物的具体实例包括但不限于以下所列的化合物：
(1)化合物S1’，其中，n＝1，R2为Ala，R3为Ala
(2)化合物S2’，其中n＝5，R2为Ala，R3为Ala
(3)化合物S3’，其中n＝11，R2为Ala，R3为Ala
(4)化合物S4’，其中n＝300，R2为Ala，R3为Ala
(5)以及下表S10’～S24’，其n为1，R2和R3分别如表中所示：
化合物编号 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> n
S10’ 丙氨酸 苏氨酸 1
S11’ 丙氨酸 缬氨酸 1
S12’ 丙氨酸 天门冬酰胺 1
S13’ 苏氨酸 丙氨酸 1
S14’ 苏氨酸 苏氨酸 1
S15’ 苏氨酸 缬氨酸 1
S16’ 苏氨酸 天门冬酰胺 1
S17’ 缬氨酸 丙氨酸 1
S18’ 缬氨酸 苏氨酸 1
S19’ 缬氨酸 缬氨酸 1
S20’ 缬氨酸 天门冬酰胺 1
S21’ 异亮氨酸 丙氨酸 1
S22’ 异亮氨酸 苏氨酸 1
S23’ 异亮氨酸 缬氨酸 1
S24’ 异亮氨酸 天门冬酰胺 1
在一个具体实施例中，本发明提供一种水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物，该化合物具有下式(VI)所示结构：
式中，R2选自Ala、Thr、Val或Ile；R3选自Ala、Thr、Val或Asn；n选自1～300、优选1～150中的任意整数。
式(VI)化合物的具体实例包括但不限于以下所列的化合物：
(1)化合物A1，其中n＝1，R2为Ala，R3为Ala
(2)化合物A2，其中n＝5，R2为Ala，R3为Ala
(3)化合物A3，其中n＝11，R2为Ala，R3为Ala
(4)化合物A4，其中n＝150，R2为Ala，R3为Ala
式(VI)的其它化合物例子还包括以下化合物，其中n为5，R2和R3如下表所示：
化合物编号 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub>
A10 丙氨酸 苏氨酸
A11 丙氨酸 缬氨酸
A12 丙氨酸 天门冬酰胺
A13 苏氨酸 丙氨酸
A14 苏氨酸 苏氨酸
A15 苏氨酸 缬氨酸
A16 苏氨酸 天门冬酰胺
A17 缬氨酸 丙氨酸
A18 缬氨酸 苏氨酸
A19 缬氨酸 缬氨酸
A20 缬氨酸 天门冬酰胺
A21 异亮氨酸 丙氨酸
A22 异亮氨酸 苏氨酸
A23 异亮氨酸 缬氨酸
A24 异亮氨酸 天门冬酰胺
本发明还提供一种水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，该多烯紫杉醇衍生物的结构式如下式(VII)所示：
其中，R2为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；n＝1～300、优选1～150中的任意整数。
式(VII)化合物的具体实例包括但不限于以下所列的化合物：
(1)化合物B1，其中，n＝1，R2取Ala氨基酸，R3取Ala氨基酸
(2)化合物B2，其中n＝5，R2取Ala氨基酸，R3取Ala氨基酸
(3)化合物B3，其中n＝11，R2取Ala氨基酸，R3取Ala氨基酸
(4)化合物B4，其中，n＝150，R1取Ala氨基酸，R2取Ala氨基酸
式(VII)的其它化合物例子还包括以下化合物：
化合物编号 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> n
B10 丙氨酸 苏氨酸 5
B11 丙氨酸 缬氨酸 5
B12 丙氨酸 天门冬酰胺 5
B13 苏氨酸 丙氨酸 5
B14 苏氨酸 苏氨酸 5
B15 苏氨酸 缬氨酸 5
B16 苏氨酸 天门冬酰胺 5
B17 缬氨酸 丙氨酸 5
B18 缬氨酸 苏氨酸 5
B19 缬氨酸 缬氨酸 5
B20 缬氨酸 天门冬酰胺 5
B21 异亮氨酸 丙氨酸 5
B22 异亮氨酸 苏氨酸 5
B23 异亮氨酸 缬氨酸 5
B24 异亮氨酸 天门冬酰胺 5
本发明还提供一种肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，所述肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物结构式如下式(VIII)所示：
式中，R2为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；n选择1～300、优选1～150、更优选1～20、最优选1～11中的任意整数。
式(VIII)的化合物实例包括：
(1)化合物D1，其中n＝1，R2和R3都为Ala
(2)化合物D2，其中n＝5，R2和R3都为Ala
(3)化合物D3，其中n＝11，R2和R3都为Ala
(4)化合物D4，其中，n＝300，R2和R3都为Ala
式(VIII)的其它化合物例子包括：
化合物编号 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> n
D10 丙氨酸 苏氨酸 1
D11 丙氨酸 缬氨酸 1
D12 丙氨酸 天门冬酰胺 1
D13 苏氨酸 丙氨酸 1
D14 苏氨酸 苏氨酸 1
D15 苏氨酸 缬氨酸 1
D16 苏氨酸 天门冬酰胺 1
D17 缬氨酸 丙氨酸 1
D18 缬氨酸 苏氨酸 1
D19 缬氨酸 缬氨酸 1
D20 缬氨酸 天门冬酰胺 1
D21 异亮氨酸 丙氨酸 1
D22 异亮氨酸 苏氨酸 1
D23 异亮氨酸 缬氨酸 1
D24 异亮氨酸 天门冬酰胺 1
在一个具体实施例中，本发明提供一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，所述靶向激活释放的丝裂霉素衍生物结构式如下式(IX)所示：
式中，R2为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；n选择1～300、优选1～150、更优选1～20、最优选1～11中的任意整数。
式(IX)的化合物实例包括：
(1)化合物E1，其中n＝1，R2和R3都是Ala
(2)化合物E2，其中n＝5，R2和R3都是Ala
(3)化合物E3，其中，n＝11，R2和R3都是Ala
(4)化合物E4，其中n＝300，R2和R3都是Ala
式(IX)的化合物例子还包括：
化合物编号 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> n
E10 丙氨酸 苏氨酸 1
E11 丙氨酸 缬氨酸 1
E12 丙氨酸 天门冬酰胺 1
E13 苏氨酸 丙氨酸 1
E14 苏氨酸 苏氨酸 1
E15 苏氨酸 缬氨酸 1
E16 苏氨酸 天门冬酰胺 1
E17 缬氨酸 丙氨酸 1
E18 缬氨酸 苏氨酸 1
E19 缬氨酸 缬氨酸 1
E20 缬氨酸 天门冬酰胺 1
E21 异亮氨酸 丙氨酸 1
E22 异亮氨酸 苏氨酸 1
E23 异亮氨酸 缬氨酸 1
E24 异亮氨酸 天门冬酰胺 1
本发明包括上述化合物的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的例子包括无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马 来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。
二、化合物的制备
本发明以R1-R2-R3-Asn-对氨基苯甲醇为关键中间体制备制备本发明化合物。优选的，制备本发明化合物的反应路线如下：
方案1
方案2
方案1中，R1-R2-R3-Asn-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有醇羟基的药物R5-OH反应，生成偶联体碳酸二酯产物。方案1适合用于制备R4为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇或多烯紫杉醇的本发明化合物。
方案2中，R1-R2-R3-Asn-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有氨基的药物R6-NH2反应，生成偶联体碳酸二酯产物。方案2适合用于制备R4为柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌或丝裂霉素的化合物。
对于制备方法中涉及的其它试剂、反应条件、纯化方法等，本领域技术人员在阅读了本文说明书实施例中的制备例之后将是显而易见的。
三、药物组合物
本发明包括药物组合物，该药物组合物含有本发明上述结构式之一所述的化合物或其药学上可接受的盐。
药物组合物中还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。载体或赋形剂可以是本领域周知的各种药学上可接受的载体或赋形剂，并依药物剂型或施用方式不同而不同。
在一具体实施例中，药物组合物中含有溶媒、增溶剂/助溶剂、pH调节剂、冻干赋形剂和渗透压调节剂中的一种或多种。
适用于本发明的冻干赋形剂包括糖类(例如乳糖、麦芽糖、右旋糖酐、葡萄糖、果糖)、氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、甘露醇、酒石酸、马来酸、柠檬酸、氯化钠和环糊精(例如羟丙基β环糊精、磺丁基β环糊精)中的一种或多种。
适用于本发明的pH调节剂包括盐酸、磷酸、硫酸、碳酸、硝酸、醋酸、枸橼酸、DL-酒石酸、D-酒石酸、L-酒石酸、氢氧化钠、氢氧化钾、葡甲胺、马来酸、乙二胺、三乙胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种。
适用于本发明的溶媒优选为有机溶媒，包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、叔丁醇、甘油、吐温、大豆油、羟丙基β环糊精溶液和磺丁基β环糊精溶液中的一种或多种。
适用于本发明的渗透压调节剂包括葡萄糖、氯化钠、甘露醇和乳酸钠中的一种或多种。
适用于本发明的增溶剂/助溶剂包括吐温80、吐温60、波洛沙姆、羟丙基β环糊精、聚乙二醇(PEG)、十二羟基硬脂酸锂、磺丁基β环糊精、PVP、甘油和聚氧乙烯蓖麻油中的一种或多种。
一般情况下，对哺乳动物每天口服给予本发明化合物或其药学上可接受的盐，药量通常为约0.0025到50毫克/公斤体重，最好是约0.01到10毫克/公斤体重。如果同时施用一个已知的抗癌药物或施与其它治疗，其剂量应可有效地实现其预期的目的。这些已知的抗癌药物的最佳剂量是本领域技术人员所熟知的。
单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是约0.1到10毫克的本发明化合物或其药学上可接受的盐。单位剂量可给予一次或多次，每天为一剂或多剂，每剂含有约0.1到50毫克，合宜地约0.25到10毫克的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
本发明药物组合物可以被制备成任何合适的剂型，包括但不限于片剂、胶囊、注射剂等。可通过本领域周知的途径给予本发明的药物组合物，例如口服、静脉注射、肌肉内注射等。
四、化合物和药物组合物的用途
肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制，并能直接帮助肿瘤细胞浸润和转移。肿瘤相关巨噬 细胞(M2型)区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞(M1型)的确认标记是天冬酰胺肽链内切酶的表达。本发明的化合物能在天冬氨酸肽链内切酶存在的条件下被激活释放。由于天冬酰胺肽链内切酶特异性激活的偶联体的不同部分对最终药物在靶向、激活、稳定、毒性和药效等功能产生巨大影响，因此，使用本发明天冬酰胺肽链内切酶特异性激活的偶联体能够有效降低被连接药物的毒性，使最终药物带有了新的靶向、激活和代谢特性，增加了***的效果，并产生了新的肿瘤适应症和对抗肿瘤转移产生作用，产生了全新的结构和功能。
本发明还发现，本发明肿瘤微环境释放性偶联体(例如，式(III)到式(IX)化合物)具有杀伤肿瘤相关巨噬细胞，减弱微环境中免疫抑制的细胞因子和促进毒性CD8细胞的免疫增强现象。更重要的是，这些肿瘤微环境释放性化合物只在肿瘤局部激活，不同于传统化疗药物会损伤整体免疫***。在实验中肿瘤微环境释放性化合物和PD-1(程序性死亡分子1，programmed death-1)抑制抗体(PDL1-抗体，市售，是目前认为具有免疫治疗效果的候选药物)具有强烈协同治疗作用，能够解决免疫治疗很难和化疗药物结合使用的弊端。
因此，本发明化合物、其药学上可接受的盐、或药物组合物可用来治疗或预防本领域已知喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇、多烯紫杉醇、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌或丝裂霉素能够治疗的各种疾病，包括癌症和眼科疾病。
例如，本领域已知，喜树碱可用来治疗或预防恶性肿瘤、银屑病、疣、急/慢性白血病以及血吸虫病引起的肝脾肿大等；10-羟基喜树碱可用于治疗胃癌、肝癌、头颈部癌及白血病等；紫杉醇主要用来治疗卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤等也有疗效；丝裂霉素可用于治疗慢性淋巴瘤，慢性骨髓性白血病，食管癌、胃癌，结肠癌、直肠癌，肺癌，胰癌，肝癌，子***，子宫体癌，卵巢癌，乳癌，头颈部肿瘤，***，恶性腔内积液等。
因此，例如，可用本发明化合物、其药学上可接受的盐或药物组合物治疗或预防的疾病包括但不限于膀胱、脑、***/乳腺、宫颈、结肠-直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、***、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液等部位的癌症。具体而言，这些癌症包括膀胱癌、脑癌、***/乳腺癌、***、结肠-直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、***癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌和血癌。
在一个具体实施例中，本发明式(IX)所示的丝裂霉素衍生物或其药学上可接受的盐还可用于治疗或预防眼科疾病，包括治疗或预防伤愈疤痕或脉络膜新生血管，或抑制巨 噬细胞。在其它实施例中，式(IX)所示的丝裂霉素衍生物还可用于治疗或预防角膜移植、青光眼、翼状胬肉手术的后遗症等。
本发明的化合物或药物组合物还可用于阻止肿瘤转移，尤其是阻止肿瘤肺转移。在一个实施例中，本发明的化合物或药物组合物可用于阻止乳腺癌肺转移。
因此，本发明包括疾病治疗或预防方法，包括给予需要的对象治疗或预防有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，或含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本发明还包括阻止肿瘤转移的方法，包括给予需要的对象有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，或含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。阻止肿瘤转移包括但不限于阻止肿瘤肺转移和/或骨转移。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)作为一种关键的炎性细胞，在肿瘤相关炎症中扮演极其重要的角色。在肿瘤微环境中，TAM通过影响肿瘤各方面的生物学特性来促进肿瘤发展。它分泌一些分子(如EGF)来直接促进肿瘤细胞的生长，促进血管新生，从而为癌细胞的浸润和转移创造条件，同时还能抑制获得性免疫行使功能。因此，本发明还包括抑制肿瘤相关巨噬细胞的方法，包括给予需要的对象有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，或含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。通过抑制肿瘤相关巨噬细胞，可抑制肿瘤生长、抑制血管新生，并抑制癌细胞的浸润和转移，促进抗肿瘤免疫，从而实现癌症的预防和/或治疗。在一个具体实施例中，肿瘤相关巨噬细胞表达天冬氨酸肽链内切酶，为M2型。
本发明上述方法可与本领域已知的放疗或免疫疗法联用。
因此，本发明还包括用于上述各种方法或用途的本发明化合物、其药学上可接受的盐，或本发明药物组合物。
本发明也包括本发明化合物或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物在制备治疗或预防上述疾病(例如癌症及癌症转移)用的药物中的用途。本发明还包括本发明化合物或其药学上可接受的盐或本发明药物组合物在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞、抑制肿瘤生长、抑制血管新生、抑制癌细胞的浸润和转移和/或促进抗肿瘤免疫用的药物中的用途。
本发明还提供一种降低抗癌化合物(R4-H)毒副作用的方法，所述方法包括将该抗癌化合物与R1-R2-R3连接，其中，R1、R2和R3如前文所述。
本发明的治疗或预防方法包括将本发明的化合物或药物组合物施与有此需要的对象。施用方法包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射等。对象包括哺乳动物，尤其是人。
应理解，本发明“含有”、“包括”也包括“由……组成”、“由……构成”。所有重量 百分比或体积百分比之和应等于100％。实施例中使用到的各种试剂和产品，除非另有说明，否则为市售产品；对于所涉及的方法，除非另有说明，否则按常规技术实施。下述实施例并非是对本发明范围的限制。
五、实施例
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地说明。
实施例1：化合物中间体的合成
1)N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸甲酯(I)的合成
将N-苄氧羰基-L-丙氨酸(100g，0.45mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(简称HOBt，72.6g，0.54mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称EDC，103.3g，0.54mol)，搅拌反应1小时后，冰浴至0℃下滴加L-丙氨酸甲酯(46.2g，0.45mol)和N，N-二异丙基乙基胺(173.8g，1.34mol)的N,N-二甲基甲酰胺(1L)溶液，滴加完毕后在室温下搅拌10h，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到白色固体I，(101g，收率：73.1％)。
2)N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸(II)的合成
将N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸甲酯(100g，0.34mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却至0℃下滴加1M的氢氧化锂溶液(400mL)，搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至pH<6，旋转蒸发除去大部分四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II(88g，收率：92.2％)。
3)4-N-(N-芴甲氧羰基-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(III)的合成
于三口瓶中加入N-芴甲氧羰基-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺(20g，0.03mol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(15g，0.04mol)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(200mL)，搅拌30min。然后0℃下分别加入对氨基苄醇(4.1g，0.03mol)的DMF溶液(5mL)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(8.7g，0.06mol)，室温下搅拌3h，旋转蒸发除去大部分DMF，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经打浆得白色固体III(21.3g，收率：90％)。
4)4-N-(N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(IV)的合成
将4-N-(N-芴甲氧羰基-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(13.0g，18mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中，加入哌啶(30mL)，室温下搅拌2h，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得淡黄色固体IV，未经纯化直接用于下一步。
5)4-N-(N-(N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(V)的合成
于三口瓶中加入N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸(6.0g，20.4mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(11.6g，30.6mmol)和DMF(50mL)，冰浴下搅拌30min。然后0℃下分别加入化合物4-N-(N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇的DMF溶液(50mL)和N,N-二异丙基乙胺(7.89g，61.2mmol)，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经重结晶得白色固体V(15g，收率：97％)。
6)4-N-(N-(L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(VI)的合成
将4-N-(N-(N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(5.0g，6.61mmol)溶于THF(150mL)中，加入10％钯炭(1g)，通入氢气，常温常压下搅拌反应5h，过滤除去钯炭，用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，旋转蒸发除去大部分溶剂得到粗品，经柱层析得到白色固体VI(2.0g，收率：49％)。
7)4-N-(N-N-(N-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰基)-L-丙氨酰基)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(VII)的合成
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(432mg，3.22mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(1.83g，4.83mmol)，搅拌30min，然后滴加4-N-(N-(L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(2.0g，3.22mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.24g，9.61mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，完毕后缓慢升至室温搅拌10h。减压蒸除大部分DMF，所得残余物溶于乙酸 乙酯(200mL)，依次用饱和的氯化铵溶液和饱和的氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析得白色固体VII(1.2g，收率：50％)。
8)4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(VIII)的合成
将化合物4-N-(N-N-(N-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰基)-L-丙氨酰基)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(VII)(1.0g，1.36mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温下搅拌5小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟乙酸，粗品经柱层析分离得VIII(600mg，收率：89％)。
9)4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的合成
化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(500mg，1.01mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰浴至5℃下，氮气保护下依次滴加氯甲酸对硝基苯酯(406mg，2.02mmol)的二氯甲烷溶液和吡啶(160mg，2.03mmol)，完毕后室温下搅拌过夜，反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，所得粗产品经柱层析分离得产物为淡黄色固体(450mg，收率：67％)。
实施例2：化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-苏氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-10-羟基喜树碱-碳酸二酯(S1)的合成
将4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)- 氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(330mg，0.5mmol)和10-羟基喜树碱(182mg，0.5mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶解，冷却至0℃下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)(122mg，1.0mmol)和1-羟基苯并三氮唑(27mg，0.2mmol)，室温搅拌过夜。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，依次用水(50mL×3)和饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离纯化得目标产物S1为淡黄色固体(82mg，收率：19％)。
实施例3：化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-喜树碱-碳酸二酯(S2)的合成
将三光气(600mg，2.02mmol)溶于干燥的二氯甲烷(10mL)中，冷至-10℃下，氮气保护下滴加化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(500mg，1.01mmol)和吡啶(0.35mL，12.12mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，0℃下搅拌反应1小时，自然升至室温下搅拌2小时后，滴加喜树碱(348mg，1mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，室温下反应6小时，反应液依次用水(30mL)，饱和碳酸氢钠(20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸干，残余物经硅胶柱层析得到白色固体(291mg，53.5％)。
实施例4：化合物4-N-(N-(N-(N-(8-(N-羟基氨基)-1，8-辛二酸-1-单酰基)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-卡培他滨-碳酸二酯(S3)的合成
将4-N-(N-(N-(N-(8-(N-羟基氨基)-1，8-辛二酸-1-单酰基)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(715mg，1.0mmol)和卡培他滨(360mg，1.0mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)溶解，冷却至0℃下加入DMAP(244mg， 2.0mmol)和1-羟基苯并三氮唑(27mg，0.2mmol)，室温搅拌过夜。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，依次用水(100mL×3)和饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离纯化得目标产物S3为淡黄色固体(198mg，收率：21％)。
实施例5：化合物4-N-(N-(N-(N-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-苏氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-柔红霉素-氨基甲酸酯(S4)的合成
将4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-苏氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(264mg，0.4mmol)和N，N-二异丙基乙基胺(1mL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，20℃下滴加柔红霉素(211mg，0.4mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液，完毕后室温下反应3小时，反应液倒入甲基叔丁基醚中，搅拌半小时后过滤，所得红色固体经柱层析纯化后得到红色固体产物S4(177mg，产率：42.2％)。
实施例6：化合物S5的合成
1)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺己酰-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇的合成
6-马来酰亚胺己酸(120mg，0.57mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入1-羟基苯并三氮唑(92mg，0.68mmol)和N，N-二异丙基乙基胺(0.19mL，1.15mmol)，氮气保护下加入4-N-(N-(N-(L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇(353mg，0.57mmol)，搅拌半小时后冰浴至0℃下滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(120mg，0.62mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液，完毕后升至室温下搅拌过夜，将反应液倒入乙酸乙酯(150mL)中，依次用水(100mL×3)、5％稀盐酸(50mL)和5％碳酸钠(50mL)洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干后硅胶柱层析得到产物为白色固体(300mg，收率：64.8％)。
2)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇的合成
化合物4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺己酰-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇(163mg，0.2mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温下搅拌5小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟乙酸，粗品经柱层析分离得产物为淡黄色固体(97mg，收率：85％)。
3)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的合成
化合物4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇(814mg，1.0mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，冰浴至0℃，氮气保护下依次滴加氯甲酸对硝基苯酯(406mg，2.0mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液和吡啶(0.16mL，2.0mmol)。滴加完毕后升至室温下搅拌过夜，反应液经水洗分液后，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，所得粗产品经柱层析分离得产物为白色固体(597mg，收率：81％)。
4)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-柔红霉素-氨基甲酸酯(S5)的合成
4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(200mg，0.27mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入柔红霉素盐酸盐(152mg，0.27mmol)，下冰浴至5℃，氮气保护滴加N，N-二异丙基 乙基胺(0.1mL，0.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的溶液，完毕后升至室温下搅拌反应过夜，反应液倒入甲基叔丁基醚(600mL)中，搅拌半小时后，过滤，收集红色沉淀经硅胶柱层析得到产物为红色固体S5(164mg，收率：54％)。
实施例7：化合物4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-MMAE-氨基甲酸酯(S6)的合成
4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(298mg，0.40mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入MMAE(monomethyl auristatin的简称)盐酸盐(305mg，0.40mmol)，下冰浴至5℃，氮气保护滴加N，N-二异丙基乙基胺(0.1mL，0.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的溶液，完毕后升至室温下搅拌反应过夜，反应液倒入甲基叔丁基醚(600mL)中，搅拌半小时后，过滤，收集红色沉淀经硅胶柱层析得到产物为红色固体S6(434mg，收率：82.4％)。
化合物S1，S2，S3，S4，S5的合成结果如下表1，质谱(MS)检测结果S1，S2，S3，S4，S5的对应质荷比分别为916，885，880，1079和1513，与结构计算获得分子量相同，如表1所示。
表1：S1-S5的性状和质谱测试数据
R2和R3的不同，只是氨基酸连接时原料不同，其不同氨基酸侧链对于合成过程没有影响，与上述的方法一致，只是将对应的R2氨基酸和R3氨基酸用于合成过程。R4的连接反应如上述，只是催化条件和反应药物的不同。
实施例8：肿瘤微环境特异激活的可***连接基团连接不同R4化合物的条件各不相同
1)所述化合物中，R4通过羟基连接与通过氨基连接的方法完全不同。
R1R2R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与药物R6通过氨基连接的反应是否可以成功取决于R6的选择，例如R1R2R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与喜树碱的反应不同于与MMAE的反应，主要在于与MMAE的反应是通过其MMAE的氨基的强亲核性发生反应(82.4％)，而与喜树碱的反应是通过喜树碱上羟基的亲核性置换对硝基苯酚的反应，由于羟基的亲核性要弱于氨基的亲核性，与对硝基苯酚相当或稍弱，因此使该步反应理论上无法进行。
我们发现，只有当在该步反应中加入HOBT等作为催化剂使用，并严格固定到所筛选的温度，并在最后通过控制反应截止时间时，由于HOBT的羟基能与对硝基苯酚(PNP)交换互变，从而形成更易离去的结合HOBT过渡态，由此才能有效的与喜树碱的羟基发生交换，而不产生大量反应杂质，得到目前的最大产率(53.5％)。
2)AAN-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与药物R5的通过氨基连接的反应是否可以成功完全取决于R5的选择
R5上的氨基的空间位阻以及取代基对连接反应有决定性影响，脂肪族取代的氨基与R1-R2-R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的连接反应可以在温和条件下获得较高产量(如MMAE)，但是芳香族氨基由于氨基的孤对电子与芳香环共轭，降低了其亲核性，同样反应条件下得不到产物。只有通过高通量的筛选、剧烈的反应条件，例如尼莫司汀与R1-R2-R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的连接反应，最终筛选到只有用DMAP做碱，在80℃到85℃的温度，才能得到少量产物(收率：20％)。
3)所述化合物中R1选择对R4连接有不同影响
不同的R1基团对R1-R2-R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与R4的对接反应的条件有重要影响，比如4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与喜树碱对接反应得不到产物。因此只有通过筛选不同的反应物和实验条件才能获得产物，例如，采用4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧 基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯才可以与喜树碱在特定的温度条件下得到相应产物。
实施例9：肿瘤微环境特异激活的可***连接基团可连接产生的化合物和毒性变化
当R1选择2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基，R2选择Thr，R3选择Ala时，采用与S1～S3反应相似催化剂时,筛选出的可***连接基团可与羟基连接的化合物:即R4是喜树碱(S7)、10-羟基喜树碱(S8)、拓扑替康(S9)、氟脲苷(S10)、去氧氟尿苷(S11)、阿糖胞苷(S12)、氟达拉滨(S13)、依托泊苷(S14)、卡培他滨(S15)、吉西他滨(S16)、长春新碱(S17)、埃坡霉素B(S18)、紫杉醇(S13’)、多烯紫杉醇(B13)。，
当R1选择2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基，R2和R3选择Ala时，采用与S4～S5反应相似催化剂时，肿瘤微环境特异激活的偶联体可以成功通过氨基连接的化合物:即R4是柔红霉素(S19)、表阿霉素(S20)、氟达拉滨(S21)、吉西他滨(S22)、尼莫司汀(S23)、米托蒽醌(S24)、甲氨蝶呤(S25)、阿糖胞苷(S26)、美法仑(S27)、阿霉素(S28)、丝裂霉素(E13)。
表2：可合成化合物的性状和质谱测试数据
毒性检测方法:体外细胞毒性试验采用标准通用试验方案,2500个HEK293细胞被培养在96孔板，并允许在一夜之间增长。不同浓度的细胞毒化合物和对应偶联后化合物被添加到每个孔中，与细胞孵育72小时在37℃,用MTT试剂处理,读出OD值变化,比较改造药物和毒素IC50得到毒性变化的大约倍数。
实施例10：肿瘤微环境特异激活的可***连接基团连接不同的化合物具有不同的激活效率
连接基团与连接的化合物基团间的相互构效关系决定了激活效果。在37℃下10微克/毫升酸化的天冬酰胺肽链内切酶中或不同肿瘤组织匀浆(30微克/毫升)中加入1毫克/毫升的S1，S2，S3，S4，S5和S6，通过HPLC检测反应物的减小和产物增加，从而比较这些化合物的激活效率(指被酶剪切而释放出来的药物占原化合物的比例，激活效率越大激活效率越高)，通过筛选发现S1，S2，S3，S4和S5具有很高的被肿瘤组织激活的效 率，而S6被肿瘤组织激活的效率较低(表2)。我们的实验结果发现，S3中R1为(N-羟基氨基)-1，8-辛二酸-1-单酰基能够靶向结合肿瘤高表达的金属蛋白酶mmp2，而S5中R1为6-马来酰亚胺基己酰能够靶向结合肿瘤高表达的组织蛋白酶，因此更为提高靶向激活效果。
表3：S1，S2，S3，S4，S5和S6的激活效率(％)
  产生肿瘤的细胞 S1 S2 S3 S4 S5 S6
天冬酰胺肽链内切酶 / 88.4 87.5 84.8 84.3 83.3 24.5
人纤维肉瘤 HT-1080 78.3 75.6 94.9 78.4 98.4 24.3
人乳腺癌 MDA-MB435 67.3 78.4 70.1 83.5 96.7 25.6
人卵巢癌 SK-OV-3 78.3 74.6 94.3 78.4 97.4 23.5
人结肠癌 HT-29 63.7 78.3 81.7 83.5 78.4 22.4
人慢性白血病 K562 46.6 63.7 93.2 64.5 73.5 28.4
人胰腺癌 Panc-1 78.4 68.4 91.6 67.3 97.4 17.3
人非小细胞肺癌 A549 68.7 68.3 80.7 64.5 96.7 27.4
人***癌 PC-3 78.5 75.4 98.3 78.3 97.3 13.2
人肝癌 Hepg2 86.4 63.7 94.5 67.3 67.3 26.7
人肾癌 OS-RC-2 84.5 53.6 67.4 78.5 98.3 20.4
人心脏 / 1.2 0.5 1.6 2.8 3.5 5.3
实施例11：肿瘤微环境特异激活的可***连接基团连接不同的化合物具有不同的激活效率
连接基团与连接的化合物基团间的相互构效关系决定了激活效果。在37℃10微克/毫升酸化的天冬酰胺肽链内切酶中加入1毫克/毫升的S7～S27化合物，通过HPLC检测反应物的减小和产物增加比较这些化合物的激活效率，结果如表3所示。
表4：S7～S27的激活效率(％)
化合物 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14
激活效率(％) 75.7 65.5 86.4 95.4 66.2 73.6 79.6 85.3
化合物 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22
激活效率(％) 84.6 13.4 89.4 93.5 89.3 76.7 95.4 97.5
化合物 S23 S24 S25 S26 S27 S27 S28  
激活效率(％) 91.5 90.7 74.4 78.5 73.5 63.5 66.5  
由表4可以看出，通过实验发现最终不同化合物具有不同的被天冬酰胺肽链内切酶激活的效率，筛选合成的S7～S27化合物激活效率基本大于60％，S6，S16激活效率很低小30％。天冬酰胺肽链内切酶的激活位点是天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇的连接处，激活断裂后，对氨基苯甲醇(4-氨基苄基-OC(O)-)能够自释放，而进一步释放出R4-H药物。天冬酰胺肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部，切割位点需要接近酶活中心，这时所连接的化合物对切割位点是否有空间位阻和改变连接位点的极性变为非常重要。通过实验的结果，发现S6，S16空间位阻和极性影响激活，因此出现S6，S16激活效率很低，其他化合物激活效率较高的情况。
结果与讨论：结果说明该肿瘤微环境特异激活的可***连接基团可以连接和激活不同的化合物，其中因空间位阻不同而分为可激活和不可激活两类。
实施例12：S1，S2，S3，S4，S5，S6，S16，S22和S28注射液在裸鼠中的药效研究
试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1，S2，S3，S4，S5，S6，S16，S22和S28化合物的抗肿瘤药效。
治疗药物S1，S2，S3，S4，S5，S6，S16，S22和S28注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)人乳腺癌MDA-MB231(细胞)从美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106MDA-MB231细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程：根据S1，S2，S3，S4，S5，S6，S16，S22和S28临床用药使用IV(静脉)注射，S1，S2，S3，S4，S5，S6，S16，S22和S28，喜树碱，卡培他滨和柔红霉素都使用13.2微摩/公斤的剂量，每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表5所示。
表5：S1，S2，S3，S4，S5，S6，S16，S22和S28药物对裸鼠***的效果
5)结果与讨论：如表5所示，与对照组、喜树碱组、卡培他滨组和柔红霉素组相比，S1，S2，S3，S4，S5，S22和S28具有强肿瘤生长抑制的效果，而S6，S16因为没有激活而疗效不大，说明偶联体对药物的疗效带来的巨大的提高，也说明激活效率决定了治疗效果。比较S6,S4,S5,S19～S27的结构发现,S6中MMAE被结合的氨基位置是MMAE中两个相连疏水性的缬氨酸的氨基上,连接4-氨基苄基-OC(O)-连接臂后，S6反而因为缬氨酸的疏水性区域和小肽被带到相对于天冬酰胺肽链内切酶活性中心不利的位置而造成空间位阻而妨碍天冬酰胺肽链内切酶的活性中心的接近切割键,从而被切割激活的效率很低。S6的激活效率低于AANVV多肽，4-氨基苄基-OC(O)-连接臂在此是无效的。从合成的角度加入4-氨基苄基-OC(O)-连接臂要比形成肽键复杂。而S4,S5,S19～S27被结合的氨基位置不是位于肽中的氨基,而是都是位于芳香环上的氨基，我们首先意外地发现芳香环对连接臂的极性的影响不大，所以使用4-氨基苄基-OC(O)-连接臂能够消除直接连接氨基的空间位阻，从而取得很好的激活效果，激活效率普遍高于直接联接的化合物，而且这个作用不局限于芳香环化合物。
实施例13对MMAE和阿霉素的不同可***连接基团的比较研究
当R1选择2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基,R3选择Ala时，对含有不同可***连接基团的进行了激活研究和药效研究,其研究方法与实施例10,11,12相同,采用天冬酰胺肽链内切酶检测体外激活效率,采用人乳腺癌MDA-MB231模型检测抑瘤率。
表6：对MMAE和阿酶素的不同可***连接基团的比较研究
实施例14
化合物S29～S43的合成方法与化合物S1相同，就是合成采用的氨基酸原料不同。本实施例对具有不同氨基酸结构的化合物的激活特性、抑瘤率分别进行了测试，测试方法与上述实施例4，6，8，12，13相同，测试结果如下表7所示：
表7：化合物S28～S43的激活特性、抑瘤率结果
结果与讨论：如表7所示，S29～S43都具有一定激活活性和肿瘤生长和转移抑制效果，实验结果证明高效激活化合物中：R2可为Thr，Val，Ile或Ala中的任意一种氨基酸；R3可为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸。
实施例15：S1，S2，S3，S4，S5和S6药物在D121肿瘤免疫模型的药效研究
试验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解S1，S2，S3，S4，S5和S6药物的抗肿瘤药效。
试验药物：S1，S2，S3，S4，S5，S6，喜树碱，卡培他滨和柔红霉素都采用13.2微摩/公斤，PDL1-抗体为5微克/公斤。
动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性。
产生肿瘤模型：
1)D121肺癌肿瘤细胞从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤免疫：小鼠腹腔注射5×105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。
3)肿瘤产生：在第32天，将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗。
4)肿瘤CD8+T细胞分析。肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例。
5)分组与结果测量如表8所示。
表8：S1、S2、S3、S4、S5、S6及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果
6)结果与讨论：与免疫对照组和其他治疗对照组相比较，S1，S2，S3，S4，S5在C57小鼠的治疗效果大大提高，S6组与柔红霉素组相比，治疗效果也有一定程度的提高。S1与PDL1-抗体具有良好的协同促进免疫和协同治疗效果作用。实验结果证明S1，S2，S3，S4，S5能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。
实施例16：肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的合成
1)(R)-2-(2-(R)-(苄氧羰基)氨基)丙酰氨基)丙酸甲酯(I)的合成
将N-苄氧羰基-L-丙氨酸(100g，0.45mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(72.6g，0.54mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(103.3g，0.54mol)，0-5℃搅拌反应1小时后，冰浴下滴加L-丙氨酸甲酯(46.2g，0.45mol)和N，N-二异丙基乙基胺(173.8g，1.34mol)的N,N-二甲基甲酰胺(1L)溶液，滴加完毕后在室温(25℃)下搅拌10h，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到白色固体I(101g，收率：73.1％)。LC-MS:309[M+1]+。
2)(R)-2-(2-(R)-(苄氧羰基)氨基)丙酰氨基)丙酸(II)的合成
将(R)-2-(2-(R)-(苄氧羰基)氨基)丙酰氨基)丙酸甲酯(100g，0.34mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却至0℃下滴加1M的氢氧化锂溶液(400mL)，室温(25℃)搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至pH<6，旋转蒸发除去大部分四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II(88g，收率：92.2％)。LC-MS:295[M+1]+。
3)(R)-2-((9H-芴-9-基)甲氧羰基氨基)-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(III)的合成
于500mL三口瓶中加入(R)-2-((9H-芴-9-基)甲氧羰基氨基)-4-(三苯甲基氨基)丁酸(20g，0.03mol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(15g，0.04mol)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL)，搅拌30min。然后0℃下分别加入对氨基苄醇(4.1g，0.03mol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)和N,N-二异丙基乙胺(8.7g，0.06mol)，室温(25℃)下搅拌3h，旋转蒸发除去大部分N,N-二甲基甲酰胺，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经正己烷/乙酸乙酯(5/1，300mL)打浆得白色固体III(21.3g，收率：90％)。LC-MS:702[M+1]+。
4)(R)-2-氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(IV)的合成
将(R)-2-((9H-芴-9-基)甲氧羰基氨基)-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(13.0g，18mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中，加入哌啶(30mL)，室温(25℃)下搅拌2h，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥(100℃)除去少量的哌啶，得淡黄色固体IV(8.43g，收率：95％)，未经纯化直接用于下一步。
5)(R)-2-((R)-2-((R)-2-苄氧羰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(V)的合成
于三口瓶中加入(R)-2-((R)-2-(苄氧羰基氨基)丙酰氨基)丙酸(6.0g，20.4mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(11.6g，30.6mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(50mL)，冰浴下搅拌30min。于0℃下分别加入化合物(R)-2-氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液(50mL)和N,N-二异丙基乙胺(7.89g，61.2mmol)，室温(25℃)下搅拌17小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液(100mL)、饱和氯化钠溶液(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经重结晶得白色固体V(15g，收率：97％)。LC-MS:756[M+1]+。
6)(R)-2-((R)-2-((R)-氨基丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(VI)的合成
将(R)-2-((R)-2-((R)-2-苄氧羰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(5.0g，6.61mmol)溶于THF(150mL)中，加入10％钯炭(1g)，通入氢气，常温(22℃)下搅拌反应5h，过滤除去钯炭，用甲醇(100mL)洗涤，合并滤液和洗液，旋转蒸发除去大部分溶剂得到粗品，经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝20/1-10/1，2.5L)得到白色固体VI(2.0g，收率：49％)。LC-MS:622[M+1]+。
7)(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(VII)的合成
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(432mg，3.22mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(1.83g，4.83mmol)，搅拌30min，然后滴加(R)-2-((R)-2-((R)-氨基丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(2.0g，3.22mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.24g，9.61mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，完毕后缓慢升至室温(25℃)搅拌10h。减压蒸除大部分N,N-二甲基甲酰胺，所得残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和的氯化铵溶液(150mL)和饱和的氯化钠溶液(150mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝20/1-10/1，2L)得白色固体VII(1.2g，收率：50％)。LC-MS:738[M+1]+。
8)(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-1-羟 甲基苯基丁二酸二酰胺(VIII)的合成
将(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(VII)(1.0g，1.36mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温(25℃)下搅拌5小时。反应液经水洗(20mL)后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，蒸除残余的三氟乙酸，粗品经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝15/1-8/1，1.5L)分离得X(600mg，收率：89％)。LC-MS:496[M+1]+。
9)4-((R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-氨基丁二酰基))氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IX)的合成
于50mL三口瓶加入化合物(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-1-羟甲基苯基丁二酸二酰胺(500mg，1.01mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰浴(0-5℃)下、氮气保护下分别滴加氯甲酸对硝基苯酯(406mg，2.02mmol)，吡啶(160mg，2.03mmol)。室温(25℃)下搅拌18小时。反应液经水(10mL)洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝30/1-20/1，1L)得IX(450mg，收率：67％)。LC-MS:661[M+1]+。
10)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基紫杉醇(化合物S1’)的合成
将4-((R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-氨基丁二酰基))氨基苄基紫杉醇碳酸酯(250mg，0.293mmol)和紫杉醇(194mg，0.293mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶解，冷却至0℃下加入4-二甲氨基吡啶(54mg，0.44mmol)，室温(25℃)下搅拌18小时。将反应液倒入乙酸乙酯(20mL)中，合并有机相，水(30mL)洗，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝20/1-15/1，500mL)得目标产物化合物S1(150mg，收率：57％)。LC-MS:1375[M+1]+。LC-MS检测结果如下：8.59洗脱峰的对应质荷比为1375，与结构计算获得分子量1374.5相对应。
化合物S2’，S3’，S4’的合成参照S1’的合成，结果如下表，区别仅在于步骤7)的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量的不同。其中，S2’的合成是以3,6,9,12,15,18-六氧杂十九酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；S3’的合成是以3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十七酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；S4’的合成是以直接购买的长链多氧杂脂肪酸(吉尔生化定制，n＝300聚合物)替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；质谱(MS)检测结果S2’， S3’的对应质荷比分别为1551和1816，与结构计算获得分子量1550.6和1815.9相一致。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测S4’分子量约为14524，与结构计算获得分子量14524.7相一致。
表9
编号 n 性状 质谱检测 荧光 产量(毫克) 收率
S1’ 1 白色粉末 1375 无 150 57％
S2’ 5 白色粉末 1551 无 178 48％
S3’ 11 白色粉末 1816 无 159 56％
S4’ 150 白色粉末 14524 无 525 38％
实施例17：S10’～S24’的合成
合成方法与化合物S1’相近，只是氨基酸连接时原料不同，如下表10所示。将对应的R2氨基酸和R3氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，分别加入相同的缩合剂(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺，于0℃-25℃反应2-24h得到三肽。质谱(MS)检测结果确认S10’-S24’化合物(n＝1)分子量依次如下表，与结构计算预测的分子量相一致。
表10
实施例18：肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物与对照化合物的性能比较
(1)样品处理
化合物S1’，S2’，S3’和S4’(实施例16制得)和对照化合物C1、C2、C3、C4、C5和C6经过冷冻干燥(-70℃)，在无菌室进行分装。在动物实验前，S1’，S2’，S3’和S4’在无菌室中可按下面两种溶剂方案复溶:溶剂1(注射用水)，或溶剂2(50％注射用水，42％～49％丙二醇，1％～8％吐温80)。S1’，S2’，S3’和S4’在溶剂1和溶剂2中能够完全溶解，复溶浓度可达10毫克/毫升，再用注射用水稀释到所需浓度，而对比化合物(C1、C2、C3、C4、C5)不满足药物的制剂要求，如下表11所示。
表11：对照化合物中近似成分的缺失或紫杉醇7位或2位连接(即，分别将基团连接到紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)对药物制剂溶解性影响
化合物 溶剂1 溶剂2
C1:AAN-基团2-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C2:基团1-AAN-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C3:AAN-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C4:基团1-AAN-基团2-紫杉醇(7位连接) 不溶 不溶
C5:基团1-AANL-基团2-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C6:基团1-AANK-基团2-紫杉醇(2位连接) 溶解 溶解
S1’ 溶解 溶解
S2’ 溶解 溶解
S3’ 溶解 溶解
S4’ 溶解 溶解
基团1：基团2：
表11中的AAN、AANL、AANK分别代表化合物中小肽氨基酸的连接，A：Ala、 N：Asn、L：Leu、K：Lys。溶剂1为注射用水；溶剂2含50％注射用水，45％～49％丙二醇和1％～5％吐温80，溶解浓度为10毫克/毫升。
表11结果说明，本发明的紫杉醇衍生物溶解性能发生巨大变化，在溶剂1或溶剂2中的溶解性增加，溶解特性的变化对药物的制剂有巨大影响。而对比化合物(C1、C2、C3、C4、C5)的溶解性不能满足药物的制剂要求。因此与不溶于水的紫杉醇药物相比，S1’，S2’，S3’和S4’可制备可溶性的药物制剂，能提高注射剂量和疗效，避免已有紫杉醇药物使用过敏性辅料蓖麻油等的缺陷，具有非常好的创新性和应用前景。
实施例19：S1’，S2’，S3’和S4’含量测定的方法及含量范围
S1’，S2’，S3’和S4’使用分析型HPLC(安捷伦1220(Agilent 1220series)，C8柱5μm，4.6mm ID x 250mm，流动相为0～95％乙腈(ACN)，测得纯度在95％-99％。
实施例20：肿瘤组织对肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物的激活效率试验
使用溶剂(50％注射用水，45％～49％酒精和1％～5％吐温80)统一溶解S1’，S2’，S3’和S4’样品化合物，并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在37℃，在100微克酸化的肿瘤组织匀浆(pH6.0)中加入1毫克/毫升的样品化合物，肿瘤组织匀浆中的酶能够导致释放紫杉醇，通过HPLC检测化合物的减小和紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率，通过筛选发现S1’，S2’，S3’和S4’连接在筛选的化合物中具有最高的激活效率。
表12：不同肿瘤组织匀浆中的S1’，S2’，S3’和S4’的化合物激活比例(％)
  产生肿瘤的细胞 S1’ S2’ S3’ S4’
人纤维肉瘤 HT-1080 74.7 75.4 67.9 74.6
人乳腺癌 MDA-MB435 92.3 91.4 90.4 92.8
人卵巢癌 SK-OV-3 88.4 84.6 79.3 63.8
人结肠癌 HT-29 79.4 89.9 91.4 90.6
人慢性白血病 K562 64.7 73.3 70.2 74.2
人胰腺癌 Panc-1 94.8 93.8 91.5 93.1
人非小细胞肺癌 A549 86.4 89.4 81.4 83.6
人***癌 PC-3 97.3 98.4 96.3 93.5
人肝癌 Hepg2 95.3 84.6 83.5 74.2
人肾癌 OS-RC-2 86.4 91.5 86.4 90.5
人心脏   无 无 无 无
使用溶剂(50％注射用水，42％～49％酒精，1％～8％吐温80)统一溶解S1’、S2’、S3’ 和S4’样品化合物，并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在37℃，在100微克酸化的人乳腺癌(MDA-MB435)肿瘤组织匀浆(pH6.0)中加入1毫克/毫升的样品化合物，肿瘤组织匀浆中的酶能够导致释放紫杉醇，通过HPLC检测化合物的减小和紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率。结果显示在下表13中。
表13：筛选对比化合物中近似成分的缺失对激活药物的的影响。
化合物 激活效率(％)
C1:AAN-基团2-紫杉醇(2位连接) 67.4
C2:基团1-AAN-紫杉醇(2位连接) 54.8
C3:AAN-紫杉醇(2位连接) 34.9
C4:基团1-AAN-基团2-紫杉醇(7位连接) 12.1
C5:基团1-AANL-基团2-紫杉醇(2位连接) 57.4
C6:基团1-AANK-基团2-紫杉醇(2位连接) 47.7
S1’ 94.3
S2’ 93.1
S3’ 91.5
S4’ 87.8
上述结果说明：本发明肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物不同基团的连接与紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。S1’，S2’，S3’和S4’在不同肿瘤类型中(10种不同肿瘤)的激活说明了药物激活的广谱性(表13)。同时比较化合物筛选过程中产生的特定化合物，分析在同一人乳腺癌MDA-MB435肿瘤组织中的激活效率，实验证明S1’，S2’，S3’和S4’化合物的各基团选择是相对激活效率更高的搭配(表13)。
本发明提供的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到紫杉醇上的2位或7位(即分别将复杂化合物连接到紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)，再通过肿瘤组织激活效率的大小进行筛选，并依次筛选所得化合物在R2、R3，以及n取不同值时对肿瘤的抑制作用。肿瘤组织特异性的激活位点是AAN与基团2之间的连接处，激活断裂后，基团2能够自释放，而进一步释放出紫杉醇。因为天冬氨酸酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部，切割位点需要接近酶活中心，这时复杂化合物对切割位点是否有空间位阻变为非常重要。
通过筛选实验的结果，本发明推测基团2的连接可以有效避免直接连接紫杉醇带来 的空间位阻，而不影响天冬氨酸酶的接近。而基团1的构效关系能够增加切割位点的极性，使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位点，而增加切割效率。连接到紫杉醇第2位也显然减少了紫杉醇对蛋白酶的空间位阻和暴露的更多的整体亲水极性基团，增加切割效率和水溶性。而如果分别多添加一个极型K和一个极型L氨基酸则降低了激活效率。
实施例21：肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物受试药静脉用药最大耐受剂量(MTD)的测定
试验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD(最大耐受量)实验，了解本发明紫杉醇衍生物的急性毒性。
试验药物：使用溶剂(50％注射用水，42％～49％酒精，1％～8％吐温80)统一溶解S1’、S2’、S3’和S4’样品化合物，试验时用生理盐水稀释到相应剂量，获得S1’、S2’、S3’和S4’注射液。
动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，体重19-21g，全为雌性。
方法和结果：受试BALB/C小鼠36只，按体重随机分为7组，每组6只。如表14所示，按0mg/kg，25mg/kg，50mg/kg，60mg/kg，70mg/kg，80mg/kg，960mg/kg，分别一次性静脉注射S1’、S2’、S3’和S4’。并进行生理盐水组、紫杉醇组注射液(市售，北京悦康)的对照试验，每个小鼠给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。
表14：受试小鼠分别接受不同剂量的S1’、S2’、S3’和S4’注射液与生理盐水、紫杉醇注射液的死亡率结果对照
组别   剂量(mg/kg) 动物(只) 死亡数(只) 死亡率(％)
1 生理盐水 0mg/kg 10 0 0
2 S1’ 125mg/kg 10 0 0
3 S1’ 150mg/kg 10 0 0
4 S1’ 175mg/kg 10 0 0
5 S1’ 200mg/kg 10 1 10
6 S2’ 125mg/kg 10 0 0
7 S2’ 150mg/kg 10 0 0
8 S2’ 175mg/kg 10 0 0
9 S2’ 200mg/kg 10 1 10
10 S3’ 125mg/kg 10 0 0
11 S3’ 150mg/kg 10 0 0
12 S3’ 175mg/kg 10 0 0
13 S3’ 200mg/kg 10 1 10
14 S4’ 125mg/kg 10 0 0
15 S4’ 150mg/kg 10 0 0
16 S4’ 175mg/kg 10 0 0
17 S4’ 200mg/kg 10 0 10
18 紫杉醇 25mg/kg 10 0 0
19 紫杉醇 30mg/kg 10 1 10％
20 紫杉醇 35mg/kg 10 4 40％
21 紫杉醇 40mg/kg 10 8 90％
结果与讨论：本发明注射S1’、S2’、S3’和S4’溶液的小鼠组，在90mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表11所示。S1’和S2’溶液的MTD值(最大耐受剂量)为90mg/kg，远大于紫杉醇的MTD值6mg/kg。受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的紫杉醇的毒性比紫杉醇显著降低。
实施例22：S1’、S2’、S3’和S4’在裸鼠中的药效研究
试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1’、S2’、S3’和S4’化合物的抗肿瘤药效。
试验药物：S1’、S2’、S3’和S4’溶液(同实施例21样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度，对照组为生理盐水。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性，购自上海斯莱克实验动物有限公司。
2.产生肿瘤模型
1)人***癌PC-3细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5x106Panc-1细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据S1’、S2’、S3’和S4’临床用药使用IV注射。S1’、S2’、S3’和S4’都使用小于1/6MTD的剂量，即24毫克/公斤剂量，紫杉醇使用1/3MTD的剂量8毫克/公斤剂量，对照组使用生理盐水，每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表15所示
表15：S1’、S2’、S3’、S4’、紫杉醇及对照组对裸鼠***的效果
5)结果与讨论：如表15所示，与等摩尔浓度的紫杉醇药物治疗组对照组比较，S1’、S2’、S3’和S4’治疗组的肿瘤生长抑制效果大大提高。
实施例23：S1’、S2’、S3’和S4’化合物在D121肿瘤免疫模型的药效研究
试验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解S1’、S2’、S3’和S4’化合物的抗肿瘤药效。
动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性，购自上海斯莱克实验动物有限公司。
试验药物：S1’、S2’、S3’和S4’溶液(同实施例21样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度，对照组为生理盐水。
产生肿瘤模型：
1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤免疫：小鼠腹腔注射5x105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。下表16中的免疫组就是用D121肺癌细胞免疫，而无D121死肿瘤细胞免疫组注射生理盐水为对照。
3)肿瘤产生：在免疫过程结束之后(4周后)，将106个活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗，记录计小鼠肿瘤大小(mm3)，并计算抑瘤率。
4)肿瘤CD8+T细胞(T淋巴细胞亚群)分析。肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例。
5)分组与结果测量显示在表16中。
表16：S1’、S2’、S3’、S4’、紫杉醇治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果
6)结果与讨论：与免疫对照组和其他治疗对照组相比较，S1’、S2’、S3’和S4’化合物在C57小鼠的治疗效果大大提高，S1’与PDL1-抗体具有良好的协同促经免疫和协同治疗效果作用，能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。
实施例24：S1’、S2’、S3’和S4’在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究
试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1’、S2’、S3’和S4’的抗肿瘤药效。
试验药物：S1’、S2’、S3’和S4’溶液(同实施例21样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度，对照组为生理盐水。
1.动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠，6-8周龄，全为雌性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
2.产生肿瘤模型
1)4T1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤转移的产生，将106T1细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。
3)治疗过程：使用IV注射，S1’、S2’、S3’和S4’都使用1/6MTD的剂量，即12毫克/公斤剂量；紫杉醇药物治疗组使用1/6MTD的剂量，即4毫克/公斤剂量；对照组使用生理盐水；每三天一次给药，共4次。
4)分组与结果测量如表17所示
表17：S1’、S2’、S3’、S4’、紫杉醇治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果
组别 动物(只) 转移肿瘤数量(个) 抑制转移率
S1’组 10 2±3 99.2％
S2’组 10 8±7 94.1％
S3’组 10 13±8 90.44％
S4’组 10 15±16 89.0％
紫杉醇治疗组 10 128±25 5.9％
模型对照组 10 136.0±46 —
5)结果与讨论：如表17所示，与紫杉醇治疗组对照组比较，在S1’、S2’、S3’和S4’组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。
实施例25：S1’化合物在多肿瘤模型的药效研究
试验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解S1’的抗肿瘤药物的广谱性。
治疗药物：S1’溶液(同实施例21样品)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性，购自上海斯莱克实验动物有限公司。
2.产生肿瘤模型
1)对应的细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代 一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5x106对应细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据S1’溶液使用IV注射，S1’都使用1/6MTD的剂量，即17.6微摩/公斤；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共3周。
4)分组与结果测量如下表18所示。
表18：S1’在多肿瘤模型的治疗效果
组别 肿瘤细胞 抑瘤率(第26天)
人乳腺癌 MDA-MB435 90.7％
人卵巢癌 SK-OV-3 85.6％
人结肠癌 HT-29 89.7％
人慢性白血病 K562 77.9％
人直肠癌 HT1080 94.3％
人胰腺癌 Panc-1 88.59％
人非小细胞肺癌 A549 94.6％
人肝癌 Hepg2 84.3％
人肾癌 OS-RC-2 85.7％
5)结果与讨论：如表18所示，S1’在多种肿瘤模型中具有良好的药效，说明药物可以成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。
实施例26：S10’～S24’的激活特性、抑瘤率和抑制转移率
对于S10’～S24’的激活特性、抑瘤率及抑制转移率分别进行了测试，测试方法与上述实施例20，22，24相同，测试结果如表19所示。
表19：S10’～S24’的激活特性、抑瘤率及抑制转移率结果
化合物 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> 激活特性(％) 抑瘤率(38天) 抑制转移率
S10’ Ala Thr 65.4％. 65.6％ 75％.3
S11’ Ala Val 42.6％ 46.2％ 44.5％
S12’ Ala Asn 38.4％ 49.5％ 81.6％
S13’ Thr Ala 75.7％ 61.3％ 87.4％
S14’ Thr Thr 37.5％ 52.4％ 29.4％
S15’ Thr Val 54.6％ 45.8％ 39.3％
S16’ Thr Asn 33.2％ 68.3％ 56.8％
S17’ Val Ala 30.6％ 58.3％ 64.8％
S18’ Val Thr 65.8％ 69.8％ 80.1％
S19’ Val Val 38.5％ 55.2％ 68.3％
S20’ Val Asn 43.5％ 47.8％ 71.4％
S21’ Ile Ala 49.6％ 43.4％ 63.9％
S22’ Ile Thr 69.9％ 59.5％ 70.5％
S23’ Ile Val 57.5％ 65.2％ 45.5％
S24’ Ile Asn 49％ 47.48％ 54.2％
本发明还合成了其他的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇化合物，其中，n为1-300中的任意整数，R2为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；并做了上述的激活测试(方法同实施例17)、对肿瘤的疗效研究(方法同实施例23、24)、转移疗效(方法同实施例25)及多肿瘤疗效(方法同实施例26)的实验，并取得了与S1’-S4’相似的实验结果。经实验证明，n＝1-300范围内，随着n增大，抑瘤率轻微下降。随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔剂量的药物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在n选自1～300的范围内，均能到达S1’-S4’相近的技术效果。
实施例27：水溶性靶向激活的紫杉醇的合成
1)二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸乙酯(I)的合成
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(161mg，1.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，冰浴冷却后，搅拌下加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(462mg，1.2mmol)、N，N-二异丙基乙基胺(313mg，2.4mmol)和L-赖氨酸乙酯二盐酸盐(100mg，0.4mmol)，加毕，室温搅拌过夜，减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得I(128mg，收率：77.8％)。
2)二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸(II)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸(122mg，0.3mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中，冷却至0℃下滴加氢氧化锂(39mg，0.9mmol)水溶液(5mL)，室温搅拌反应2小 时。冰浴冷却下以浓盐酸调pH至2，蒸除四氢呋喃后冻干，得粗品II(112mg，收率：99％)，未经纯化直接用于下一步。
3)二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(III)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸(112mg，0.3mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，冷却至0℃下滴加3-(二乙氧基邻酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮(109mg，0.36mmol)、L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(188mg，0.3mmol)和N，N-二异丙基乙基胺(117mg，0.9mmol)，加毕，室温下搅拌过夜。减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得III(159mg，收率：54.0％)。
4)二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IV)的合成
于三口瓶加入二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(167mg，0.17mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，冷却至0℃下滴加氯甲酸对硝基苯酯(73mg，0.36mmol)和吡啶(39mg，0.50mmol)。室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得IV(153mg，收率：78.5％)。
5)二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(V)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IV)(100mg，0.087mmol)溶于三氟乙酸(1mL)中，滴入两滴水，立即用油泵抽干，得粗品V(80mg)，未经纯化直接用于下一步。
6)二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基紫杉醇(A1)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(80mg，0.088mmol)和紫杉醇(76mg，0.089mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶解，冷却至0℃下加入DMAP(22mg，0.18mmol)，室温搅拌过夜。再加入紫杉醇(38mg，0.044mmol)，继续搅拌过夜。将反应液倒入乙酸乙酯中，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，粗品经反相制备柱纯化得目标产物A1(25mg，收率：37.5％)。LC-MS检测结果如下：洗脱峰的对应质荷比为1619。与结构计算获得分子量相对应。
7)化合物A2、A3、A4的合成参照A1的合成，区别仅在于步骤7)的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量不同。其中，A2的合成是以3,6,9,12,15,18-六氧杂十九酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；A3的合成是以3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十七酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；A4的合成是以多氧杂脂肪酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；质谱(MS)检测结果A2、A3、A4的对应质荷比分别为1619、1972、2500，与结构计算获得分子量1619.71、1972.13和2500.77相对应。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测A4分子量约为14739，与结构计算获得分子量14739.59相对应。具体检测结果列于下表20。
表20
编号 n 性状 质谱检测 荧光 产量(毫克) 收率
A1 1 白色粉末 1619 无 25 37.5％
A2 5 白色粉末 1972 无 245 43.3％
A3 11 白色粉末 2500 无 456 66.4％
A4 150 白色粉末 14739 无 645 34.6％
8)化合物A10～A24(这些化合物中的n为5)的合成方法与化合物A2相近，只是氨基酸连接时原料不同，如下表21所示。将对应的R2氨基酸和R3氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，分别加入缩合剂(如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺，于0℃-25℃反应2-24h。反应液经后用纯化处理，得到3肽，将三肽按前述方法替代Ala-Ala-Asn为合成中间替制备A10-A24化合物。质谱(MS)检测结果确认A10-A24化合物分子量依次如下表21，与结构计算预测的分子量相符合。
表21
实施例28：本发明水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物与对照化合物的性能比较
冷冻干燥(-70℃)化合物A1、A2、A3、A4和对照化合物C1、C2、C3、C4、C5和C6，在无菌室进行分装。在动物实验前，A1、A2、A3和A4在无菌室中可按下面两种溶剂方案复溶：溶剂1(注射用水)或溶剂2(45％酒精和55％注射用水)。A1、A2、A3和A4在溶剂1和溶剂2中能够完全溶解，复溶浓度可达10毫克/毫升，再用注射用水稀释到所需浓度，而对比化合物(C1、C2、C3、C4、C5和C6)不满足药物的制剂要求，如下表22所示。
表22：对照化合物中近似成分的缺失或紫杉醇7位或2位连接(即，分别将基团连接到紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)对药物制剂溶解性影响
化合物 溶剂1 溶剂2
C1:AAN-基团2-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C2:基团1-AAN-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C3:AAN-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C4:基团1-AAN-基团2-紫杉醇(7位连接) 不溶 不溶
C5:基团1-AANL-基团2-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C6:基团1-AANK-基团2-紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
A1 不溶 溶解
A2 溶解 溶解
A3 溶解 溶解
A4 溶解 溶解
基团1:基团2:
表22中的AAN、AANL、AANK分别代表化合物中小肽氨基酸的连接，A：Ala、N：Asn、L：Leu、K：Lys。
如表22所示，紫杉醇不溶于水，改造后的紫杉醇溶解特性发生巨大变化，在水中的溶解度增加，溶解特性的变化对药物的制剂方案有巨大影响。与传统的不溶于水的紫杉醇药物相比，A1、A2、A3和A4可产生可溶性的药物制剂，A2、A3和A4能够直接水溶，可提高注射剂量和疗效，避免如紫杉醇使用过敏性辅料蓖麻油，是药物可开发使用的巨大进步，表明了水溶性靶向激活的紫杉醇具有非常好的创新性和应用前景。而对比化合物(C1、C2、C3、C4、C5、C6)的溶解性不能满足药物的制剂要求。
实施例29：A1、A2、A3和A4含量测定的方法及含量范围。
A1、A2、A3和A4使用分析型HPLC(安捷伦1220(Agilent 1220series)，C8柱5μm，4.6mm ID x 250mm，流动相为0～95％乙腈(ACN)，测得纯度在95％-99％。
实施例30：肿瘤组织对本发明水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物的激活效率试验
使用溶剂(50％注射用水，45％～49％酒精，1％～5％吐温80)统一溶解A1、A2、A3和A4样品化合物，并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在37℃，在100微克酸化的肿瘤组织匀浆(pH6.0)中加入1毫克/毫升的样品化合物，肿瘤组织匀浆中的酶能够导致释放紫杉醇，通过HPLC检测化合物的减小和紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率。通过筛选发现，化合物A1、A2、A3和A4在筛选的化合物中具有最高的激活效率。
表23：不同肿瘤组织匀浆中的A1、A2、A3和A4的化合物激活比例(％)
  产生肿瘤的细胞 A1 A2 A3 A4
人纤维肉瘤 HT-1080 77.7 78.4 70.3 77.2
人乳腺癌 MDA-MB435 95.6 94.4 93.4 97.8
人卵巢癌 SK-OV-3 91.4 88.6 82.8 66.4
人结肠癌 HT-29 82.4 92.9 94.6 93.6
人慢性白血病 K562 67.7 76.3 73.2 77.2
人胰腺癌 Panc-1 97.8 93.8 94.5 96.1
人非小细胞肺癌 A549 89.5 92.4 84.4 86.2
人***癌 PC-3 100.3 101.4 99.3 96.5
人肝癌 Hepg2 98.3 87.6 86.5 77.0
人肾癌 OS-RC-2 89.2 94.5 89.4 93.5
人心脏   无 无 无 无
筛选对比化合物中近似成分的缺失对激活药物的的影响。使用溶剂(50％注射用水，42％～49％酒精，1％～8％吐温80)统一溶解A1、A2、A3和A4样品化合物，并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在37℃，在100微克酸化的人乳腺癌(MDA-MB435)肿瘤组织匀浆(pH6.0)中加入1毫克/毫升的样品化合物，肿瘤组织匀浆中的酶能够导致释放紫杉醇，通过HPLC检测化合物的减小和紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率。结果如表24所示。
表24
化合物 激活效率(％)
C1:AAN-基团2-紫杉醇(2位连接) 64.4
C2:基团1-AAN-紫杉醇(2位连接) 51.9
C3:AAN-紫杉醇(2位连接) 32.7
C4:基团1-AAN-基团2-紫杉醇(7位连接) 11.6
C5:基团1-AANL-基团2-紫杉醇(2位连接) 54.7.4
C6:基团1-AANK-基团2-紫杉醇(2位连接) 43.3
A1 95.1
A2 96.3
A3 94.5
A4 84.3
上述结果说明：本发明水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物不同基团的连接与紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。A1、A2、A3和A4在不同肿瘤类型中(10种不同肿瘤)的激活说明了药物激活的广谱性(表24)。同时比较化合物筛选过程中产生的特定化合物，分析在同一人乳腺癌MDA-MB435肿瘤组织中的激活效率，实验证明A1、A2、A3和A4化合物的各基团选择是相对激活效率更高的搭配(表24)。
本发明提供的水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物A1～A4和A10～A23，实验设计思路 来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到紫杉醇上的2位或7位(即分别将复杂化合物连接到紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)，再通过肿瘤组织激活效率的大小进行筛选，并依次筛选所得化合物在R2、R3，以及n取不同值时对肿瘤的抑制作用。肿瘤组织特异性的激活位点是AAN与基团2之间的连接处，激活断裂后，基团2能够自释放，而进一步释放出紫杉醇。因为天冬氨酸酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部，切割位点需要接近酶活中心，这时复杂化合物对切割位点是否有空间位阻变为非常重要。
通过筛选实验的结果，本发明推测基团2的连接，可以有效避免直接连接紫杉醇带来的空间位阻，而不影响天冬氨酸酶的接近。而基团1的构效关系能够增加切割位点的极性，使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位点，而增加切割效率。连接到紫杉醇第2位也显然减少了紫杉醇对蛋白酶的空间位阻和暴露的更多的整体亲水极性基团，增加切割效率和水溶性。而如果分别多添加一个极型K和一个极型L氨基酸则降低了激活效率。
实施例31：水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物受试药静脉用药最大耐受剂量(MTD)的测定
试验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD实验，了解本发明紫杉醇衍生物的急性毒性。
试验药物：使用溶剂(50％注射用水，42％～49％酒精，1％～8％吐温80)统一溶解A1、A2、A3和A4，试验时用生理盐水稀释到相应剂量，制备A1、A2、A3和A4注射液。
动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，体重19-21g，全为雌性。
方法和结果：受试BALB/C小鼠36只，按体重随机分为7组，每组6只。如表25所示，按0mg/kg，25mg/kg，50mg/kg，60mg/kg，70mg/kg，80mg/kg，960mg/kg，分别一次性静脉注射A1、A2、A3和A4。并进行生理盐水组、紫杉醇组注射液(市售，北京悦康)的对照试验，每个小鼠给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。
表25：受试小鼠分别接受不同剂量的A1，A2，A3和A4注射液与生理盐水、紫杉醇注射液的死亡率结果对照
组别   剂量(mg/kg) 动物(只) 死亡数(只) 死亡率(％)
1 生理盐水 0mg/kg 10 0 0
2 A1 125mg/kg 10 0 0
3 A1 150mg/kg 10 0 0
4 A1 175mg/kg 10 0 0
5 A1 200mg/kg 10 2 10
6 A2 125mg/kg 10 0 0
7 A2 150mg/kg 10 0 0
8 A2 175mg/kg 10 0 0
9 A2 200mg/kg 10 1 10
10 A3 125mg/kg 10 0 0
11 A3 150mg/kg 10 0 0
12 A3 175mg/kg 10 0 0
13 A3 200mg/kg 10 2 20
14 A4 125mg/kg 10 0 0
15 A4 150mg/kg 10 0 0
16 A4 175mg/kg 10 0 0
17 A4 200mg/kg 10 0 10
18 紫杉醇 25mg/kg 10 0 0
19 紫杉醇 30mg/kg 10 1 10％
20 紫杉醇 35mg/kg 10 4 40％
21 紫杉醇 40mg/kg 10 8 90％
结果与讨论：本发明注射A1、A2、A3和A4溶液的小鼠组，在90mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表25所示，A1和A2溶液液的MTD值(最大耐受剂量)为90mg/kg，远大于紫杉醇的MTD值6mg/kg，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的紫杉醇的毒性比紫杉醇显著降低。
实施例32：本发明A1、A2、A3和A4溶液在裸鼠中的药效研究
试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解A1、A2、A3和A4化合物的抗肿瘤药效。
试验药物：A1、A2、A3和A4溶液(同实施例31样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度，对照组为生理盐水。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)人***癌PC-3细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5x106Panc-1细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据A1、A2、A3和A4临床用药使用IV注射，A1、A2、A3和A4都使用小于1/6MTD的剂量，即24毫克/公斤剂量；紫杉醇治疗组使用1/3MTD的剂量，即8毫克/公斤剂量；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表26所示。
表26：A1、A2、A3、A4、紫杉醇及对照组对裸鼠***的效果
5)结果与讨论：如表26所示，与等摩尔浓度的紫杉醇药物治疗组对照组比较，在A1、A2、A3和A4治疗组的肿瘤生长抑制效果大大提高。
实施例33：A1、A2、A3和A4化合物在D121肿瘤免疫模型的药效研究
试验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解A1、A2、A3和A4化合物的抗肿瘤药效。
动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性。
试验药物：A1、A2、A3和A4溶液(同实施例31样品)，紫杉醇注射液(市售， 同上)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度；对照组为生理盐水。
产生肿瘤模型：
1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤免疫：小鼠腹腔注射5x105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。下表免疫组就是用D121肺癌细胞免疫，而无D121死肿瘤细胞免疫组注射生理盐水为对照。
3)肿瘤产生：在免疫过程结束之后(4周后)，将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗，记录计小鼠肿瘤大小(mm3)，并计算抑瘤率。
4)肿瘤CD8+T细胞(T淋巴细胞亚群)分析。肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例。
5)分组与结果测量的结果显示在表27中。
表27：A1、A2、A3、A4、紫杉醇治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果
6)结果与讨论：如表27所示，与免疫对照组和其他治疗对照组相比较，A1、A2、A3和A4化合物在C57小鼠的治疗效果大大提高，A1与PDL1-抗体具有良好的协同促经免疫和协同治疗效果作用，能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。
实施例34：A1、A2、A3和A4药物在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究
试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解A1、A2、A3和A4的抗肿瘤药效。
试验药物：A1、A2、A3和A4溶液(同实施例31样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度；对照组为生理盐水。
1.动物：BALB/C小鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)4T1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤转移的产生，将106T1细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。
3)治疗过程：使用IV注射，A1、A2、A3和A4都使用1/6MTD的剂量，即12毫克/公斤剂量；紫杉醇药物治疗组使用1/6MTD的剂量，即4毫克/公斤剂量；对照组使用生理盐水；每三天一次给药，共4次。
4)分组与结果测量如表28所示。
表28：A1、A2、A3、A4、紫杉醇治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果
组别 动物(只) 转移肿瘤数量(个) 抑制转移率(％)
A1组 10 3±4 97.95918
A2组 10 9±5 93.87755
A3组 10 16±9 89.11565
A4组 10 12±18 91.83673
紫杉醇治疗组 10 137±32 6.802721
对照组 10 147.0±46 —
5)结果与讨论：如表28所示，与紫杉醇治疗组对照组比较，在A1、A2、A3和A4 组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。
实施例35：A1化合物在多肿瘤模型的药效研究
试验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解A1的抗肿瘤药物的广谱性。
治疗药物：A1溶液(同实施例31样品)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)对应的细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5x106对应细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
使用IV注射，每组都使用1/6MTD的剂量，即17.6微摩/公斤剂量；对照组使用生理盐水。每周一次给药，共3周。
4)分组与结果测量如下表29所示。
表29：A1在多肿瘤模型的治疗效果
组别 肿瘤细胞 抑瘤率(第26天)
人乳腺癌 MDA-MB435 91.2％
人卵巢癌 SK-OV-3 84.4％
人结肠癌 HT-29 87.5％
人慢性白血病 K562 76.9％
人直肠癌 HT1080 95.6％
人胰腺癌 Panc-1 89.2％
人非小细胞肺癌 A549 95.3％
人肝癌 Hepg2 85.4％
人肾癌 OS-RC-2 86.6％
5)结果与讨论：如表29所示，A1在多种肿瘤模型中具有良好的药效，说明药物可以成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。
本发明的另一些实施例(A10～A24)中，对于不同氨基酸结构的水溶性靶向激活的紫杉醇的激活特性、抑瘤率及抑制转移率分别进行了测试，测试方法与上述实施例30，32，34相同，测试结果如表30所示：
表30：A10-A24的激活特性、抑瘤率及抑制转移率结果
化合物编号 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> 激活特性(％) 抑瘤率(％)(38天) 抑制转移率(％)
A10 Ala Thr 70.4 69.85 82.5
A11 Ala Val 46.86 50.82 48.95
A12 Ala Asn 42.24 53.79 89.76
A13 Thr Ala 83.27 67.1 96.14
A14 Thr Thr 41.25 57.64 32.34
A15 Thr Val 60.06 50.6 43.23
A16 Thr Asn 36.52 75.13 62.48
A17 Val Ala 33.66 64.13 71.28
A18 Val Thr 72.38 76.78 88.11
A19 Val Val 42.35 60.72 75.13
A20 Val Asn 47.85 52.58 78.54
A21 Ile Ala 54.56 47.74 70.29
A22 Ile Thr 76.89 65.45 77.55
A23 Ile Val 63.25 71.72 50.05
A24 Ile Asn 76.44 86.4 78.45
结果与讨论：如表30所示，A10～A24的化合物具有一定激活活性和肿瘤生长和转移抑制效果，说明我们的筛选过程能优化激活和疗效。通过上述优选化合物的实施例，应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的R2和R3位的氨基酸替换和改变都将是显而易见的。
在本发明的一些实施例中，还合成了其他的水溶性靶向激活的紫杉醇化合物，其中，n＝1-150中的任意整数，R2为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；并做了上述的激活测试(方法同实施例28)、对肿瘤的疗效研究(方法同实施例32、33)、转移疗效(方法同实施例34)及多肿瘤疗效(方法同实施例35)的实验，并取得了与A1-A4相似的实验结果。经实验证明，n＝1-300范围内，随着n增大，抑瘤率轻微下降。随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔剂量的药 物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在n选自1～150的范围内，均能到达本发明实施例A1-A4相近的技术效果。
实施例36：水溶性靶向激活的多烯紫杉醇B1的合成
1.二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸乙酯(I)的合成
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(161mg，1.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，冰浴冷却后，搅拌下加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(462mg，1.2mmol)、N，N-二异丙基乙基胺(313mg，2.4mmol)和L-赖氨酸乙酯二盐酸盐(100mg，0.4mmol)，加毕，室温搅拌过夜，减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得I(128mg，收率：77.8％)。
2.二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸(II)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸乙酯I(122mg，0.3mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中，冷却至0℃下滴加氢氧化锂(39mg，0.9mmol)水溶液(5mL)，室温搅拌反应2小时。冰浴冷却下以浓盐酸调pH至2，蒸除四氢呋喃后冻干，得粗品II(112mg，收率：99％)，未经纯化直接用于下一步。
3.二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(III)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-赖氨酸(112mg，0.3mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，冷却至0℃下滴加3-(二乙氧基邻酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮(109mg，0.36mmol)、L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(188mg，0.3mmol)和N，N-二异丙基乙基胺(117mg，0.9mmol)，加毕，室温下搅拌过夜。减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得III(159mg，收率：54.0％)。
4.二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IV)的合成
于三口瓶加入二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(167mg，0.17mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，冷却至0℃下滴加氯甲酸对硝基苯酯(73mg，0.36mmol)和吡啶(39mg，0.50mmol)。室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，粗品经反相制备柱纯化得IV(153mg，收率：78.5％)。
5.二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(V)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IV)(100mg，0.087mmol)溶于三氟乙酸(1mL)中，滴入两滴水，立即用油 泵抽干，得粗品V(80mg)，未经纯化直接用于下一步。
6.二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基多烯紫杉醇(B1)的合成
将二(2-甲氧基乙氧基乙酰基)-L-Lys-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(1176mg，1.3mmol)和多烯紫杉醇(1293mg，1.6mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)溶解，冷却至0℃下加入DMAP(318mg，2.6mmol)，室温搅拌过夜。将反应液倒入二氯甲烷中，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，粗品经反相制备柱纯化得目标产物B1(511mg，收率：25％)。质谱(MS)检测结果B1的对应质荷比为1573，与结构计算获得分子量1573.69相对应。
B2，B3，B4的合成参照B1的合成，区别仅在于第1步的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量的不同。B2的合成是以3,6,9,12,15,18-六氧杂十九酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；B3的合成是以3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十七酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；B4的合成是以多氧杂脂肪酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸。质谱(MS)检测结果B2，B3的对应质荷比分别为1926和2454，与结构计算获得分子量1926.11和2454.74相对应。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测B4分子量约为14964，与结构计算获得分子量14964.56相对应，如表31所示。
表31：化合物B1-B4的性状、质谱及荧光测试结果
编号 n 性状 质谱检测分子量 荧光
B1 1 白色粉末 1573 无
B2 5 白色粉末 1926 无
B3 11 白色粉末 2454 无
B4 150 白色粉末 14964 无
实施例37：化合物B10～B24的合成
合成方法与实施例B1相近，只是氨基酸连接时原料不同，如下表32所示。
将对应的R2氨基酸和R3氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，分别加入缩合剂(如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺，于0℃-25℃反应2-24h。反应液经后用纯化处理，得到3肽，将三肽按实施例36中的方法替代Ala-Ala-Asn为合成中间体制备B10-B24化合物。质谱(MS)检测结果确认B10-B24化合物分子量依次如下表，与结构计算预测的分子量相符合。
表32：化合物B10-B24的性状及质谱结果
编号 R<sub>2</sub>氨基酸 R<sub>3</sub>氨基酸 性状 质谱检测 结构计算分子
          量
B10 丙氨酸 苏氨酸 白色粉末 1604 1603.72
B11 丙氨酸 缬氨酸 白色粉末 1602 1601.67
B12 丙氨酸 天门冬酰胺 白色粉末 1617 1616.64
B13 苏氨酸 丙氨酸 白色粉末 1604 1603.72
B14 苏氨酸 苏氨酸 白色粉末 1634 1633.74
B15 苏氨酸 缬氨酸 白色粉末 1632 1631.77
B16 苏氨酸 天门冬酰胺 白色粉末 1647 1646.74
B17 缬氨酸 丙氨酸 白色粉末 1602 1601.74
B18 缬氨酸 苏氨酸 白色粉末 1632 1631.77
B19 缬氨酸 缬氨酸 白色粉末 1630 1629.80
B20 缬氨酸 天门冬酰胺 白色粉末 1645 1644.77
B21 异亮氨酸 丙氨酸 白色粉末 1616 1615.77
B22 异亮氨酸 苏氨酸 白色粉末 1646 1645.80
B23 异亮氨酸 缬氨酸 白色粉末 1644 1643.83
B24 异亮氨酸 天门冬酰胺 白色粉末 1659 1658.80
实施例38：水溶性靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团对药物的制剂方案的巨大影响
合成的B1、B2、B3和B4和各种对照化合物分别经过真空干燥，通过气体灭菌无菌处理，在无菌室进行分装。在动物实验前，B1、B2、B3和B4在无菌室中用溶剂1(注射用水)或溶剂2(30％酒精，70％注射用水)溶解，再用注射用水稀释到所需浓度；而对比化合物(C1’、C2’、C3’、C4’、C5’、C6’)不满足药物的制剂要求，如下表33所示。多烯紫杉醇不溶于水，改造后的多烯紫杉醇溶解特性发生巨大变化，在水中的溶解度增加，溶解特性的变化对药物的制剂方案有巨大影响。与传统的不溶于水的多烯紫杉醇药物相比，B1、B2、B3和B4可产生可溶性的药物制剂，能提高注射剂量和疗效，避免如多烯紫杉醇使用过敏性辅料蓖麻油，是药物可开发使用的巨大进步，表明了水溶性靶向激活的多烯紫杉醇具有非常好的创新性和应用前景。
表33：采用筛选药物溶解性试验，对照化合物中近似成分的缺失或多烯紫杉醇7位或2位连接(即，分别将基团2连接到多烯紫杉醇的2位或7位的-OH上)对药物制剂溶解性影响
化合物 溶剂1 溶剂2
C1’:AAN-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C2’:基团1-AANL-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C3’:AAN-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C4’:基团1-AAN-基团2-多烯紫杉醇(7位连接) 不溶 不溶
C5’:基团1-AANL-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 可溶
C6’:基团1-AANK-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
B1 不溶 可溶
B2 可溶 可溶
B3 可溶 可溶
B4 可溶 可溶
基团1：基团2：
下文中涉及的基团1与基团2与此相同。
表33中的AAN、AANL、AANK分别代表化合物中小肽氨基酸的连接符号，A代表Ala、N代表Asn、L代表Leu、K代表Lys。
本发明提供的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到多烯紫杉醇上的2位或7位(即分别将复杂化合物连接到多烯紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)，再通过肿瘤组织或天冬酰胺肽链内切酶存在时激活效率的大小进行多烯紫杉醇效率筛选，并依次筛选所得化合物在R2、R3，以及n取不同值时对肿瘤的抑制作用.肿瘤组织特异性的激活位点是AAN与基团2之间的连接处，激活断裂后，基团2能够自释放，而进一步释放出多烯紫杉醇。因为天冬酰胺肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部，切割位点需要接近酶活中心，这时复杂化合物对切割位点是否有空间位阻变为非常重要。
通过筛选实验的结果，我们推测基团2的连接，可以有效避免直接连接多烯紫杉醇带来的空间位阻，而不影响天冬酰胺肽链内切酶的接近。而基团1的构效关系能够增加切割位点的极性，使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位点，而增加切割效率。连接到多烯紫杉醇第2位也显然减少了多烯紫杉醇对蛋白酶的空间位阻和暴露的更多的整体亲水极 性基团，增加切割效率和水溶性。
实施例39：B1、B2、B3和B4含量测定的方法及含量范围。
B1、B2、B3和B4使用分析型HPLC(安捷伦1220(Agilent 1220series)，C8柱5μm，4.6mm ID×250mm，流动相为0～95％乙腈(ACN)，测得纯度在95％-99％。
实施例40：水溶性靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团的连接与多烯紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响
多烯紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。在37℃温度下100微克酸化的肿瘤组织匀浆中的蛋白酶加入1毫克/毫升的化合物，肿瘤组织匀浆能够促使释放多烯紫杉醇。通过HPLC检测化合物的减小和多烯紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率。
表34：B1、B2、B3和B4的激活测定(％)，不同肿瘤组织匀浆中的B1、B2、B3和B4的化合物激活比例
表35：筛选对比化合物中近似成分的变化或多烯紫杉醇7位或2位连接对MDA-MB231肿瘤激活药物的影响
化合物 激活效率(％)
C1’:AAN-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 17.5
C2’:基团1-AANL-多烯紫杉醇(2位连接) 46.6
C3’:AAN-多烯紫杉醇(2位连接) 38.5
C4’:基团1-AAN-基团2-多烯紫杉醇(7位连接) 16.3
C5’:基团1-AANL-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 67.4
C6’:基团1-AANK-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 56.6
B1 93.4
B2 91.6
B3 90.6
B4 88.5
表35中，基团1:基团2:
由表35可看出，多烯紫杉醇2位连接的激活效率远远高于7位连接。
上述结果说明：本发明水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物不同基团的连接与紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。B1、B2、B3和B4在不同肿瘤类型中(10种不同肿瘤)的激活说明了药物激活的广谱性(表36)。同时比较化合物筛选过程中产生的特定化合物，分析在同一人乳腺癌MDA-MB435肿瘤组织中的激活效率，实验证明B1、B2、B3和B4化合物的各基团选择是相对更高激活效率(表36)。
实施例41：受试药静脉用药最大耐受剂量(MTD)的测定
试验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD实验，了解本新药制剂的急性毒性。
治疗药物：B1、B2、B3和B4注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠，体重19-21g，全为雌性。
方法和结果：受试BALB/C小鼠210只，按体重随机分为21组，每组10只。如表37所示，按0mg/kg，125mg/kg，150mg/kg，175mg/kg，200mg/kg一次性静脉注射B1、B2、B3和B4注射液，并且进行生理盐水组、多烯紫杉醇组注射的对照试验，给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14 天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。
表37：受试小鼠分别接受不同剂量的B1、B2、B3和B4注射液与生理盐水、多烯紫杉醇注射液的死亡率结果对照
组别   剂量(mg/kg) 动物(只) 死亡数(只) 死亡率(％)
1 生理盐水 0mg/kg 10 0 0
2 B1 125mg/kg 10 0 0
3 B1 150mg/kg 10 0 0
4 B1 175mg/kg 10 0 0
5 B1 200mg/kg 10 2 20
6 B2 125mg/kg 10 0 0
7 B2 150mg/kg 10 0 0
8 B2 175mg/kg 10 0 0
9 B2 200mg/kg 10 2 20
10 B3 125mg/kg 10 0 0
11 B3 150mg/kg 10 0 0
12 B3 175mg/kg 10 0 0
13 B3 200mg/kg 10 3 3
14 B4 125mg/kg 10 0 0
15 B4 150mg/kg 10 0 0
16 B4 175mg/kg 10 0 0
17 B4 200mg/kg 10 1 10
18 多烯紫杉醇 25mg/kg 10 0 0
19 多烯紫杉醇 30mg/kg 10 3 30％
20 多烯紫杉醇 35mg/kg 10 6 60％
21 多烯紫杉醇 40mg/kg 10 10 100％
结果与讨论：注射B1、B2、B3和B4注射液的小鼠组，在175mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表37所示，B1和B2注射液的MTD值约为150mg/kg，远大于多烯紫杉醇的MTD值25mg/kg，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的多烯紫杉醇的毒性比多烯紫杉醇显著降低。
实施例42：B1、B2、B3和B4注射液在裸鼠中的药效研究
试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解B1、B2、B3和B4药物的抗肿瘤药效。
治疗药物：B1、B2、B3和B4注射液和多烯紫杉醇注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)人***癌PC-3细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106Panc-1细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据B1、B2、B3和B4临床用药使用静脉注射(即IV注射)，B1、B2、B3和B4都使用小于1/6MTD的剂量，即25毫克/公斤剂量；多烯紫杉醇药物治疗组使用1/3MTD的剂量，即8.3毫克/公斤剂量；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表38所示
表38：B1、B2、B3和B4药物、多烯紫杉醇及对照组对裸鼠***的效果
5)结果与讨论：由表38可知，与等摩尔浓度的多烯紫杉醇药物治疗组对照组比较，在B1、B2、B3和B4治疗组的肿瘤生长抑制效果被大大提高。
实施例43：B1、B2、B3和B4药物在D121肿瘤免疫模型的药效研究
试验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解B1、B2、B3和B4药物的抗肿瘤药效。
试验用药：B1、B2、B3、B4和多烯紫杉醇都以13.2umol/kg的剂量给药，PDL1-抗体的剂量为5微克/公斤。
动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性。
产生肿瘤模型：
1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤免疫：小鼠腹腔注射5×105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。
3)肿瘤产生：在第32天，将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗。
4)肿瘤CD8+T细胞分析：肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和T淋巴细胞抗原CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例，该比例升高则显示T淋巴免疫细胞增多，表明了动物体内的针对肿瘤的免疫力提高。
5)分组与结果测量如表39所示。
表39：B1、B2、B3和B4药物、多烯紫杉醇治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果
6)结果与讨论：由表39可知，与免疫对照组和其他治疗对照组相比较，B1、B2、B3和B4在C57小鼠的治疗效果大大提高，B1与PDL1-抗体具有良好的协同促进免疫和协同治疗效果作用，能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。
实施例44：B1、B2、B3和B4在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究
试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解B1、B2、B3和B4的抗肿瘤药效。
治疗药物：B1、B2、B3和B4注射液和多烯紫杉醇注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
1.动物：BALB/C小鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)4T1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤转移的产生，将106T1细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。
3)治疗过程：根据B1、B2、B3和B4临床用药使用IV注射，B1、B2、B3和B4和都使用1/6MTD的剂量，17.6微摩/公斤剂量，多烯紫杉醇药物治疗组使用1/6MTD的剂量3微摩/公斤剂量，对照组使用生理盐水，每三天一次给药，共4次。
4)分组与结果测量如表40所示
表40：B1、B2、B3、B4、多烯紫杉醇治疗组及对照组对裸鼠肿瘤转移抑制的效果
组别 动物(只) 转移肿瘤数量(个) 抑制转移率(％)
B1组 10 5±3 96.0
B2组 10 11±7 91.3
B3组 10 17±11 86.5
B4组 10 18±16 85.7
多烯紫杉醇治疗组 10 85±17 32.5
模型对照组 10 126±37 /
5)结果与讨论：如表40所示，与多烯紫杉醇治疗组对照组比较，在B1、B2、B3和B4组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。
实施例45：B1注射液在多肿瘤模型的药效研究
试验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解B1的抗肿瘤药物的广谱性。
治疗药物：B1注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)对应的细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106对应细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据B1临床用药使用IV注射，B1都使用1/6MTD的剂量，即17.6微摩/公斤剂量；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共3周。
4)分组与结果测量如下表41所示。
表41：B1在多肿瘤模型的治疗效果
组别 肿瘤细胞 抑瘤率(第26天)
人乳腺癌 MDA-MB435 78.84％
人卵巢癌 SK-OV-3 74.67％
人结肠癌 HT-29 74.56％
人慢性白血病 K562 72.56％
人直肠癌 HT1080 84.46％
人胰腺癌 Panc-1 73.56％
人非小细胞肺癌 A549 74.56％
人肝癌 Hepg2 81.56％
人肾癌 OS-RC-2 86.67％
5)结果与讨论：如表41所示，B1在多种肿瘤模型中具有良好的药效，说明药物已经成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。
本发明对不同氨基酸结构的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇(化合物B10～B24)的激活特性、抑瘤率及抑制转移率分别进行了测试，测试方法与上述实施例40、42、44相同，测试结果如表42所示。
表42：化合物B10～B24的激活特性、抑瘤率及抑制转移率结果
结果与讨论：如表42所示，化合物B10～B24的化合物具有一定激活活性和肿瘤生长和转移抑制效果，说明我们的筛选过程能优化激活和疗效，通过上述优选化合物的实施例，应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的R2和R3位的氨基酸替换和改变都将是显而易见的。
在本发明的一些实施例中，还合成了其他的水溶性靶向激活的多烯紫杉醇化合物，其中，n＝1-150中的任意整数，R2为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；并做了上述的制剂(方法同实施例38)、MTD测 试(方法同实施例41)、对肿瘤的疗效研究(方法同实施例42、43)、转移疗效(方法同实施例44)及多肿瘤疗效(方法同实施例45)的实验，并取得了与B1-B4相似的实验结果。经实验证明，n＝1-150范围内，随着n增大，抑瘤率轻微下降。随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔剂量的药物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在n选自1～150的范围内，均能到达本发明化合物B1-B4相近的技术效果。
实施例46：肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物的合成。
该合成过程包含以下步骤：
步骤1：Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(苄氧羰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸甲酯)(I)的合成。
将N-苄氧羰基-L-丙氨酸(N-Cbz-L-Ala)(100g，0.45mol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(72.6g，0.54mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(103.3g，0.54mol)，搅拌反应1小时后，冰浴至0℃下滴加L-丙氨酸甲酯(46.2g，0.45mol)和N，N-二异丙基乙基胺(173.8g，1.34mol)的N,N-二甲基甲酰胺(1L)溶液，滴加完毕后在室温下搅拌10h，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到白色固体I，(101g，收率：73.1％)。
步骤2：Cbz-L-Ala-L-Ala-OH(II)的合成。
将步骤1所得的Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(100g，0.34mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却至0℃下滴加1M的氢氧化锂溶液(400mL)，搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至pH<6，旋转蒸发除去大部分四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II(88g，收率：92.2％)。
步骤3：Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(III)的合成。
在三口瓶中加入Fmoc-L-Asn(Trt)-OH(芴甲氧羰基-三苯甲基-L-天冬酰胺)(20g，0.03mol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(15g，0.04mol)、DMF(200mL)，搅拌30min。然后0℃下分别加入对氨基苄醇(4.1g，0.03mol)的DMF溶液(5mL)和N,N-二异丙基乙胺(8.7g，0.06mol)，室温下搅拌3h，旋转蒸发除去大部分DMF，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经打浆得白色固体III(21.3g，收率：90％)。
步骤4：L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(IV)的合成。
将步骤3所得的Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(13.0g，18mmol)溶于N,N-二甲基 甲酰胺(80mL)中，加入哌啶(30mL)，室温下搅拌2h，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得淡黄色固体IV，未经纯化直接用于下一步。
步骤5：Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(V)的合成。
在三口瓶中加入步骤2所得的Cbz-L-Ala-L-Ala-OH(6.0g，20.4mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(11.6g，30.6mmol)和DMF(50mL)，冰浴下搅拌30min。然后0℃下分别加入化合物L-Asn(Trt)-对氨基苄醇的DMF溶液(50mL)和N,N-二异丙基乙胺(7.89g，61.2mmol)，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经重结晶得白色固体V(15g，收率：97％)。
步骤6：L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(VI)的合成。
将步骤5所得的Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(5.0g，6.61mmol)溶于THF(150mL)中，加入10％钯炭(1g)，通入氢气，常温常压下搅拌反应5h，过滤除去钯炭，用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，旋转蒸发除去大部分溶剂得到粗品，经柱层析得到白色固体VI(2.0g，收率：49％)。
步骤7：2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(VII)的合成。
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(432mg，3.22mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(1.83g，4.83mmol)，搅拌30min，然后滴加步骤6所得的L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(2.0g，3.22mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.24g，9.61mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，完毕后缓慢升至室温搅拌10h。减压蒸除大部分DMF，所得残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和的氯化铵溶液和饱和的氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析得白色固体VII(1.2g，收率：50％)。
步骤8：2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄醇(VIII)的合成。
将步骤7所得的化合物2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(1.0g，1.36mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温下搅拌5小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟乙酸，粗品经柱层析分离得X(600mg，收率：89％)。
步骤9：2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IX)的合成。
在三口瓶加入步骤8所得的化合物2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄醇(500mg，1.01mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰浴下、氮气保护下分别滴 加氯甲酸对硝基苯酯(406mg，2.02mmol)，吡啶(160mg，2.03mmol)的二氯甲烷溶液。室温下搅拌过夜。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，所得粗产品经柱层析分离得IX(450mg，收率：67％)。
步骤10：2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基多烯紫杉醇(C1)的合成。
将步骤9所得的2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(880mg，1.3mmol)和多烯紫杉醇(1.3g，1.6mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)溶解，冷却至0℃下加入DMAP(326mg，2.6mmol)，室温搅拌过夜。将反应液倒入二氯甲烷中，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离纯化得目标产物D1(340mg，收率：49.2％)。
D2，D3，D4的合成参照D1的合成，区别仅在于步骤7中的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量的不同。D2的合成是以3,6,9,12,15,18-六氧杂十九酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；D3的合成是以3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十七酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；D4的合成是以多氧杂脂肪酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；质谱(MS)检测结果D1，D2，D3的对应质荷比分别为1329，1505和1770，与结构计算获得分子量1329.40，1505.61和1769.93相对应。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测D4分子量约为14497，与结构计算获得分子量14497.31相对应，如表43所示。
表43：化合物C1～C4的性状、质谱及荧光测试结果。
编号 n 性状 质谱检测分子量 荧光 产量(毫克) 收率
D1 1 白色粉末 1329 无 340 49.2％
D2 5 白色粉末 1505 无 157 49％
D3 11 白色粉末 1770 无 365 46％
D4 300 白色粉末 14497 无 345 28％
实施例47：肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团对药物在制剂方面的影响。
肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团对药物在制剂方面有巨大影响。合成的D1，D2，D3，D4和各种对照化合物经过真空干燥，通过气体灭菌无菌处理，在无菌室进行分装。在动物实验前，D1，D2，D3和D4在无菌室中可用溶剂1(注射用水)或溶剂2(45％酒精，55％注射用水)溶解，再用注射用水稀释到所需浓度，而对比化合物(C1’、C2’、C3’、C4’、C5’、C6’)不满足药物的制剂要求，如下表44。多烯紫杉醇不溶于 水，改造后的多烯紫杉醇溶解特性发生巨大变化，在水中的溶解度增加，溶解特性的变化对药物的制剂方案都有巨大影响。与传统的不溶于水的多烯紫杉醇药物相比，D1、D2、D3和D4可产生可溶性的药物制剂，能提高注射剂量和疗效，避免多烯紫杉醇使用过敏性辅料，是药物可开发使用的巨大进步，表明了肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇具有非常好的创新性和应用前景。
表44：对照化合物中近似成分的缺失或多烯紫杉醇7位或2位连接(即，分别将基团连接到多烯紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)对药物制剂溶解性影响
化合物 溶剂1 溶剂2
C1’:AAN-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C2’:基团1-AANL-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C3’:AAN-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
C4’:基团1-AAN-基团2-多烯紫杉醇(7位连接) 不溶 不溶
C5’:基团1-AANL-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 可溶
C6’:基团1-AANK-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 不溶 不溶
D1 不溶 可溶
D2 不溶 可溶
D3 可溶 可溶
D4 可溶 可溶
基团1:基团2:
下文中涉及的基团1与基团2与此相同。
表44中的AAN、AANL、AANK分别代表化合物中小肽氨基酸的连接，A：Ala、N：Asn、L：Leu、K：Lys。
肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇的基团1对整体药物的激活和药效有重要的影响，没有基团1时对溶解性，激活效率都有着重大影响。
肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇的基团2对整体药物的激活和药效有重要的影响，没有基团2时对激活效率和封闭毒性都有着重大影响。
本发明提供的肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到多烯紫杉醇上的2位或7位(即分别将复杂化合物连接到多烯紫杉醇分子式上的第7位或第2 位的OH上)，再通过肿瘤组织或天冬氨酸肽链内切酶存在时激活效率的大小进行多烯紫杉醇效率筛选，并依次筛选所得化合物在R2、R3，以及n取不同值时对肿瘤的抑制作用。肿瘤组织特异性的激活位点是AAN与基团2之间的连接处，激活断裂后，基团2能够自释放，而进一步释放出多烯紫杉醇。因为天冬氨酸肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部，切割位点需要接近酶活中心，这时复杂化合物对切割位点是否有空间位阻变为非常重要。
通过筛选实验的结果，我们推测基团2的连接，可以有效避免直接连接多烯紫杉醇带来的空间位阻，而不影响天冬氨酸肽链内切酶的接近。而基团1的构效关系能够增加切割位点的极性，使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位点，而增加切割效率。连接到多烯紫杉醇第2位也显然减少了多烯紫杉醇对蛋白酶的空间位阻和暴露的更多的整体亲水极性基团，增加切割效率和水溶性。
实施例48：所得产物中D1、D2、D3和D4的含量测定的方法及含量范围。
对所得产物中的D1、D2、D3和D4使用分析型HPLC(安捷伦1220(Agilent 1220series)，C8柱5μm，4.6mm ID×250mm，流动相为0～95％乙腈(ACN)，测得D1、D2、D3和D4的纯度均在95％-99％范围内。
实施例49：肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团的连接与多烯紫杉醇对药物在肿瘤组织激活的影响。
肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇中化合物不同基团的连接与多烯紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。多烯紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。在我们的实验中，在37度温度下100微克酸化的肿瘤组织匀浆中的蛋白酶加入1毫克/毫升的化合物，肿瘤组织匀浆能够导致释放多烯紫杉醇，通过HPLC检测化合物的减小和多烯紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率，通过筛选发现本发明的化合物连接在筛选的化合物中具有最高的激活效率，同时在不同肿瘤类型中的激活也说明了药物治疗的广谱性(表45)。同时比较化合物筛选过程中产生的特定化合物，分析在同一组织中的计划激活效率，实验证明D1化合物的各基团选择是最有效的搭配(表45)，而D2～D4的在不同肿瘤组织匀浆中激活与D1的相接近。
表45：不同肿瘤组织匀浆中的D1、D2、D3和D4的化合物激活比例
表46：筛选对比化合物中近似成分的变化或多烯紫杉醇7位连接与2位连接对MDA-MB231肿瘤激活药物的影响。
化合物 激活效率(％)
C1’:AAN-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 23.2
C2’:基团1-AANL-多烯紫杉醇(2位连接) 50.4
C3’:AAN-多烯紫杉醇(2位连接) 34.4
C4’:基团1-AAN-基团2-多烯紫杉醇(7位连接) 16.8
C5’:基团1-AANL-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 39.7
C6’:基团1-AANK-基团2-多烯紫杉醇(2位连接) 57.4
D1 91.5
D2 91.1
D3 90.8
D4 89.5
由上表46可知，多烯紫杉醇2位连接的激活效率优于7位连接。
上述结果说明：本发明肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物不同基团的连接与紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。
实施例50：受试药静脉用药最大耐受剂量(MTD)的测定
实验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD实验，了解本新药制剂的急性毒性。
治疗药物：D1、D2、D3和D4注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠，体重19-21g，全为雌性。
方法和结果：受试BALB/C小鼠210只，按体重随机分为21组，每组10只。如表47所示，按0mg/kg，125mg/kg，150mg/kg，175mg/kg，200mg/kg，分别一次性静脉注射D1、D2、D3和D4，并进行生理盐水组、多烯紫杉醇组注射的对照实验，给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。
表47：受试小鼠分别接受不同剂量的D1、D2、D3和D4注射液与生理盐水、多烯紫杉醇注射液的死亡率结果对照。
组别 注射成分 剂量(mg/kg) 动物(只) 死亡数(只) 死亡率(％)
1 生理盐水 0mg/kg 10 0 0
2 D1 125mg/kg 10 0 0
3 D1 150mg/kg 10 0 0
4 D1 175mg/kg 10 0 0
5 D1 200mg/kg 10 1 10
6 D2 125mg/kg 10 0 0
7 D2 150mg/kg 10 0 0
8 D2 175mg/kg 10 0 0
9 D2 200mg/kg 10 2 20
10 D3 125mg/kg 10 0 0
11 D3 150mg/kg 10 0 0
12 D3 175mg/kg 10 0 0
13 D3 200mg/kg 10 1 10
14 D4 125mg/kg 10 0 0
15 D4 150mg/kg 10 0 0
16 D4 175mg/kg 10 0 0
17 D4 200mg/kg 10 0 10
18 多烯紫杉醇 25mg/kg 10 0 0
19 多烯紫杉醇 30mg/kg 10 2 20％
20 多烯紫杉醇 35mg/kg 10 5 50％
21 多烯紫杉醇 40mg/kg 10 10 100％
结果与讨论：注射D1、D2、D3和D4注射液的小鼠组，在150mg/kg剂量时，动物 没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表47所示D1和D2注射液的MTD值约为150mg/kg，远大于多烯紫杉醇的MTD值25mg/kg，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的多烯紫杉醇的毒性比多烯紫杉醇显著降低。
实施例51：D1、D2、D3和D4注射液在裸鼠中的药效研究
实验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解D1、D2、D3和D4药物的抗肿瘤药效。
治疗药物：D1、D2、D3和D4注射液和多烯紫杉醇注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)人***癌PC-3细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106PC-3细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据D1、D2、D3和D4临床用药使用IV注射(静脉注射)，D1、D2、D3和D4都使用小于1/6MTD的剂量，即25mg/kg剂量；多烯紫杉醇药物治疗组使用1/3MTD的剂量，即8.3mg/kg剂量；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表48所示
表48：D1、D2、D3、D4、多烯紫杉醇及对照组对裸鼠***的效果
5)结果与讨论：如表48所示，与等摩尔浓度的多烯紫杉醇药物治疗组对照组比较， 在D1、D2、D3和D4治疗组的肿瘤生长抑制效果被大大提高。
实施例52：D1、D2、D3和D4药物在D121肿瘤免疫模型的药效研究。
实验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解D1、D2、D3和D4药物的抗肿瘤药效。
实验药物：D1、D2、D3、D4和多烯紫杉醇以13.2umol/kg的剂量给药，PDL1-抗体的剂量为5微克/公斤。
动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性。
产生肿瘤模型：
1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤免疫：小鼠腹腔注射5×105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。
3)肿瘤产生：在第32天，将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗。
4)肿瘤CD8+T细胞分析。肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和T淋巴细胞抗原CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例，该比例升高则显示T淋巴免疫细胞增多，表明了动物体内的针对肿瘤的免疫力提高。
5)分组与结果测量如表49所示。
表49：D1、D2、D3、D4、多烯紫杉醇治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果
6)结果与讨论：与免疫对照组和其他治疗对照组相比较，D1、D2、D3和D4在C57小鼠的治疗效果大大提高，D1与PDL1-抗体具有良好的协同促经免疫和协同治疗效果作用，能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。
实施例53：D1、D2、D3和D4药物在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究。
实验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解D1、D2、D3和D4药物的抗肿瘤药效。
治疗药物：D1、D2、D3和D4注射液和多烯紫杉醇注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
1.动物：BALB/C小鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)4T1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤转移的产生，将106T1细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。
3)治疗过程：根据D1、D2、D3和D4临床用药使用IV注射，D1、D2、D3和D4和都使用1/6MTD的剂量，即25mg/kg剂量；多烯紫杉醇药物治疗组使用1/6MTD的剂量，即4.2mg/kg剂量；对照组使用生理盐水；每三天一次给药，共4次。
4)分组与结果测量如表50所示。
表50：D1、D2、D3、D4、多烯紫杉醇治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果
组别 动物(只) 转移肿瘤数量(个) 抑制转移率(％)
D1组 10 5±3 95.2
D2组 10 13±8 97.3
D3组 10 17±13 93.0
D4组 10 19±13 90.8
多烯紫杉醇治疗组 10 156±24 89.7
模型对照组 10 185±35 /
5)结果与讨论：如表50所示，与多烯紫杉醇治疗组对照组比较，在D1、D2、D3和D4组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。
实施例54：C1注射液在多肿瘤模型的药效研究。
实验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解C1的抗肿瘤药物的广谱性。
治疗药物：C1注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)对应的细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106对应细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据D1临床用药使用IV注射，D1都使用1/6MTD的剂量(25mg/kg剂量)，对照组使用生理盐水，每周一次给药，共3周。
4)分组与结果测量如下表51所示。
表51：D1在多肿瘤模型的治疗效果
组别 肿瘤细胞 抑瘤率(第26天)
人乳腺癌 MDA-MB435 93.5％
人卵巢癌 SK-OV-3 82.9％
人结肠癌 HT-29 68.6％
人慢性白血病 K562 84.6％
人直肠癌 HT1080 94.6％
人胰腺癌 Panc-1 89.4％
人非小细胞肺癌 A549 90.4％
人肝癌 Hepg2 75.7％
人肾癌 OS-RC-2 87.7％
5)结果与讨论：如表51所示，D1在多种肿瘤模型中具有良好的药效，说明药物已经成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。
本发明还制备了化合物D10～D24，其合成方法与化合物D1的合成方法相近，只是氨基酸连接时原料不同，如下表52所示。将对应的R2氨基酸和R3氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，分别加入相同的缩合剂(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺，于0℃-25℃反应2-24h得到三肽。质谱(MS)检测结果确认D10-D24化合物(n＝1)分子量依次如下表47，与结构计算预测的分子量相一致。
其中，对于不同氨基酸结构的肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇的激活特性、抑瘤率及抑制转移率分别进行了测试，测试方法与上述实施例49，51，53相同，测试结果如表47所示。由于实施例49，51，53说明在n值优选的取值范围为1～11时，治疗效果一致，因此以下化合物D10～D24中除了R2、R3的选择不同，n值都选择为1。
表52：化合物D10～D24的肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇的激活特性、抑瘤率及抑制转移率结果。
结果与讨论：如表52所示，化合物D10～D24具有一定激活活性和肿瘤生长和转移抑制效果，说明我们筛选的过程具有优化激活和疗效的实际意义。
在本发明的另一些实施例中，还合成了其他的肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物，其中，n＝1～300中的任意整数，R2为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；并做了上述的制剂方的研究、MTD测试、对肿瘤的疗效研究、转移疗效及多肿瘤疗效的实验，均取得了与D1～D4相似的实验结果。经实验证明，n＝1～300范围内，随着n增大，抑瘤率轻微下降。随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔剂量的药物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在n选自1～300的范围内，均能到达本发明实施例D1～D4相近的技术效果。
实施例55：靶向肿瘤微环境的丝裂霉素的合成。
1)Fmoc-L-Ala-L-Ala-OMe(芴甲氧羰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸甲酯)(I)的合成。
将Fmoc-L-Ala-OH(芴甲氧羰基-L-丙氨酸)(33g，0.1mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(20.2g，0.15mol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(34g，0.15mol)和L-丙氨酸甲酯(13.9g，0.1mol)和N，N-二异丙基乙基胺(25.8g，0.2mol)的N,N-二甲基甲酰胺(500mL)溶液，室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到纯品为白色固体I(30g，收率：75.1％)。
2)Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH(芴甲氧羰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸)(II)的合成。
将Fmoc-L-Ala-L-Ala-OMe(40g，0.1mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却后加入1M氢氧化锂溶液(400mL)，搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至pH<6，减压蒸除四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II(36g，收率：94％)。
3)Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(III)的合成。
在三口瓶中加入Fmoc-L-Asn(Trt)-OH(芴甲氧羰基-三苯甲基-L-天冬酰胺)(20g，0.03mol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(15g，0.04mol)、DMF(200mL)，搅拌30min后分别加入对氨基苄醇(4.1g，0.03mol)的DMF溶液(5mL)，N，N-二异丙基乙基胺(8.7g，0.06mol)，室温下搅拌3h，减压蒸除溶剂，残余物溶于 乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品打浆得白色固体III(21.3g，收率：90％)。
4)L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(IV)的合成。
将Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(13g，18mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中，加入哌啶(30ml)，室温下搅拌2小时后，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得淡黄色固体到IV，未经纯化直接用于下一步。
5)Fmoc-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(V)的合成。
在三口瓶中加入Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH(5.4g，14mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(8g，21mmol)、DMF(50mL)，冰浴下、氮气保护下搅拌30min。然后0℃下分别加入化合物L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(6.7g，14mmol)的DMF溶液(50mL)，N，N-二异丙基乙基胺(5.5g，42mmol)，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品打浆得白色固体V(18.5g，收率：78％)。
6)L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(VI)的合成。
将Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(864mg，1mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)的混合溶液中，加入哌啶(10mL)，室温下搅拌2小时后，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体VI，未经纯化直接用于下一步。
7)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(VII)的合成。
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(134mg，1mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，冷却至0℃下加入3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)(450mg，1.5mmol)，搅拌半小时，加入L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(621mg，1mmol)和N，N-二异丙基乙基胺(387mg，3mmol)，避光下反应温度缓慢升高至室温下搅拌5小时，将反应液倒入200mL醋酸水溶液中，二氯甲烷萃取，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到橙红色粗产物，经硅胶柱层析纯化得白色粉末VII(479mg，收率：65％)。
8)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(VIII)的合成。
在三口瓶中加入2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(1.9g，2.6mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，滴加氯甲酸对硝基苯酯(1g，5.2mmol)，吡啶(400mg，5.2mmol)的二氯甲烷溶液。室温下搅拌过夜。反应液经水洗分液后，有机相无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，所得粗产品硅胶柱层析纯化得VIII(1.8g，收率：80％)。
9)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IX)的合成。
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯溶于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温下搅拌2小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，粗品经柱层析分离得IX(625mg，收率：47％)。
10)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基丝裂霉素(E1)的合成。
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(400mg，0.6mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入丝裂霉素C(200mg，0.6mmol)，1-羟基苯并***(HOBT)(17mg，0.12mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(156mg，1.2mmol)，完毕后升至室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于二氯甲烷(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后蒸除溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析得淡黄色固体目标化合物E1(237mg，收率：46％)。
E2，E3，E4的合成参照E1的合成，区别仅在于第7步的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量的不同。E2的合成是以3,6,9,12,15,18-六氧杂十九酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；E3的合成是以3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十七酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；E4的合成是以多氧杂脂肪酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；质谱(MS)检测结果E1，E2，E3的对应质荷比分别为855，1032和1296，与结构计算获得分子量855.85，1032.06和1296.37相对应。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测E4分子量约为14032，与结构计算获得分子量14023.76相对应，如表48所示。
表53：化合物E1～E4的性状、质谱及荧光测试结果。
实施例56：获得注射剂E1、E2、E3和E4
合成的E1、E2、E3和E4经过真空干燥，通过气体灭菌无菌处理，在无菌室进行分装。在动物实验前，在无菌室中E1用含有50％酒精的注射用水溶解，再用注射用水稀 释到所需浓度。E2，E3和E4可用注射用水直接稀释到所需浓度。
实施例57：所得产物中E1、E2、E3和E4的含量测定的方法及含量范围。
使用分析型HPLC(安捷伦1220(Agilent 1220series)，C8柱5μm，4.6mm ID×250mm，流动相为0～95％乙腈(ACN)，测得E1、E2、E3和E4的纯度均在纯度均在95％-99％范围内。
实施例58：肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素在不同肿瘤组织激活的影响。
在37度温度下100微克酸化的肿瘤组织匀浆中的蛋白酶加入1mg/ml的化合物，肿瘤组织匀浆能够导致释放丝裂霉素，通过HPLC能够检测化合物的减小和丝裂霉素的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率，通过筛选发现目前的化合物连接在筛选的化合物中具有最高的激活效率，同时在不同肿瘤类型中的激活也说明了药物治疗的广谱性，参见下表54。
表54：即不同肿瘤组织匀浆中的E1，E2，E3，E4的化合物激活比例
实施例59：受试药静脉用药最大耐受剂量(MTD)的测定
实验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD实验，了解本新药制剂的急性毒性。
治疗药物：E1、E2、E3和E4注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠，体重19-21g，全为雌性。
方法和结果：受试BALB/C小鼠210只，按体重随机分为21组，每组10只。如表 55所示，按0mg/kg，50mg/kg，70mg/kg，90mg/kg，110mg/kg，分别一次性静脉注射E1、E2、E3和E4，并进行生理盐水组、丝裂霉素组注射的对照实验，给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。
表55：受试小鼠分别接受不同剂量的E1、E2、E3和E4注射液与生理盐水、丝裂霉素注射液的死亡率结果对照。
组别   剂量(mg/kg) 动物(只) 死亡数(只) 死亡率(％)
1 生理盐水 0mg/kg 10 0 0
2 E1 50mg/kg 10 0 0
3 E1 70mg/kg 10 0 0
4 E1 90mg/kg 10 0 0
5 E1 110mg/kg 10 1 10
6 E2 50mg/kg 10 0 0
7 E2 70mg/kg 10 0 0
8 E2 90mg/kg 10 0 0
9 E2 110mg/kg 10 1 10
10 E3 50mg/kg 10 0 0
11 E3 70mg/kg 10 0 0
12 E3 90mg/kg 10 0 0
13 E3 110mg/kg 10 1 10
14 E4 50mg/kg 10 0 0
15 E4 70mg/kg 10 0 0
16 E4 90mg/kg 10 0 0
17 E4 110mg/kg 10 0 10
18 丝裂霉素 6mg/kg 10 0 0
19 丝裂霉素 7mg/kg 10 1 10％
20 丝裂霉素 8mg/kg 10 4 40％
21 丝裂霉素 9mg/kg 10 9 90％
结果与讨论：注射E1、E2、E3和E4注射液的小鼠组，在90mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表55所示E1 和E2注射液的MTD值约为90mg/kg，远大于丝裂霉素的MTD值6mg/kg，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的丝裂霉素的毒性比丝裂霉素显著降低。
实施例60：E1、E2、E3和E4注射液在裸鼠中对Panc-1细胞的药效研究。
实验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解E1、E2、E3和E4的抗肿瘤药效。
治疗药物：E1、E2、E3和E4注射液和丝裂霉素注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)Panc-1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106Panc-1细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据E1、E2、E3和E4临床用药使用IV注射(静脉注射)，E1、E2、E3和E4都使用1/6MTD的剂量，即15mg/kg剂量；丝裂霉素药物治疗组使用1/3MTD的剂量，即2mg/kg剂量；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表56所示。
表56：E1、E2、E3、E4、丝裂霉素及对照组对裸鼠***的效果
5)结果与讨论：如表56所示，与等摩尔浓度的丝裂霉素药物治疗组对照组比较， 在E1、E2、E3和E4治疗组的肿瘤生长抑制效果被大大提高。
实施例61：E1、E2、E3和E4注射液在裸鼠中对HT1080细胞的药效研究。
实验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解E1、E2、E3和E4药物的抗肿瘤药效。
治疗药物：E1、E2、E3和E4注射液和丝裂霉素注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)HT1080(细胞)从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106HT1080细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据E1、E2、E3和E4临床用药使用IV注射，E1、E2、E3和E4和都使用1/6MTD的剂量，即15mg/kg剂量；丝裂霉素药物治疗组使用1/3MTD的剂量，即2mg/kg剂量；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表52所示。
表57：E1、E2、E3和E4药物、丝裂霉素及对照组对裸鼠***的效果
5)结果与讨论：如表57所示，与等摩尔浓度的丝裂霉素药物治疗组对照组比较，在E1、E2、E3和E4治疗组的肿瘤生长抑制效果被大大提高。
实施例62：E1、E2、E3和E4药物在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究。
实验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解E1、E2、E3和E4药物的抗肿瘤药效。
治疗药物：E1、E2、E3和E4注射液和丝裂霉素注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
1.动物：BALB/C小鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型
1)4T1细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤转移的产生，将106T1细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。
3)治疗过程：根据E1、E2、E3和E4临床用药使用IV注射，E1、E2、E3和E4和都使用1/6MTD的剂量，即15mg/kg剂量；丝裂霉素药物治疗组使用1/6MTD的剂量，即1mg/kg剂量；对照组使用生理盐水；每三天一次给药，共4次。
4)分组与结果测量如表58所示。
表58：E1、E2、E3、E4、丝裂霉素治疗组及对照组对于BALB/C小鼠肿瘤转移抑制的效果
组别 动物(只) 转移肿瘤数量(个) 抑制转移率
E1组 10 2±3 99.2％
E2组 10 8±7 94.1％
E3组 10 13±8 90.44％
E4组 10 15±16 89.0％
丝裂霉素治疗组 10 128±25 5.9％
模型对照组 10 136.0±46 /
5)结果与讨论：如表58所示，与丝裂霉素治疗组和对照组比较，在E1、E2、E3和E4组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。
实施例63：E1、E2、E3和E4药物在D121肿瘤免疫模型的药效研究。
实验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解E1、E2、E3和E4药物的抗肿瘤药效。
实验药物：E1、E2、E3、E4和丝裂霉素各自都以13.2umol/kg的剂量给药，PDL1-抗体的剂量为5微克/公斤。
动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性。
产生肿瘤模型：
1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤免疫：小鼠腹腔注射5x105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。
3)肿瘤产生：在第32天，将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗。
4)肿瘤CD8+T细胞分析。肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例，该比例升高则显示T淋巴免疫细胞细胞增多，表明了动物体内的针对肿瘤的免疫力提高。
5)分组与结果测量如表59所示。
表59：E1、E2、E3、E4、丝裂霉素治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果
6)结果与讨论：与免疫对照组和其他治疗对照组相比较，E1、E2、E3和E4在C57小鼠的治疗效果大大提高，E1与PDL1-抗体具有良好的协同促经免疫和协同治疗效果作用，能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。
实施例64：E1注射液在多肿瘤模型的药效研究。
实验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解E1的抗肿瘤药物的广谱性。
治疗药物：E1注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。
2.产生肿瘤模型。
1)对应的细胞从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生：将5×106对应细胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程
根据E1临床用药使用IV注射，E1都使用1/6MTD的剂量，即15mg/kg剂量；对照组使用生理盐水；每周一次给药，共3周。
4)分组与结果测量如下表60所示。
表60：E1在多肿瘤模型的治疗效果。
组别 肿瘤细胞 抑瘤率(第26天)
人乳腺癌 MDA-MB435 86.3％
人卵巢癌 SK-OV-3 84.5％
人结肠癌 HT-29 86.7％
人慢性白血病 K562 77.3％
人直肠癌 HT1080 95.4％
人胰腺癌 Panc-1 86.5％
人非小细胞肺癌 A549 95.3％
人肝癌 Hepg2 85.7％
人肾癌 OS-RC-2 81.3％
5)结果与讨论：如表60所示，E1在多种肿瘤模型中具有良好的药效，说明药物已经成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。
实施例65：E1、E2、E3和E4滴眼液抑制疤痕和脉络膜新生血管(CNV)的研究。
动物：C57小鼠，16周龄，全为雌性，每组8只。
伤愈产生和治疗：150mW，激光光凝固定照射后，然后每日滴入E1、E2、E3和E4药物，2周后每组4只取眼部组织进行免疫组化(HE)染色。另外4只在50mW，激光光凝固定照射后治疗后48小时，取眼部组织匀浆，过滤分离出疤痕和CNV组织中单个细胞，用缓冲液洗两次，使用biotin-conjugated anti-F4/80(生物素标记的巨噬细胞的前体细胞抗原)和FITC-conjugated anti-CD45(异硫氰酸荧光素标记的白细胞共同抗原)在室温1小时结合染色，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中巨噬细胞的前体抗原阳性细胞的比例，该比例降低则显示该巨噬细胞的前体抗原阳性细胞减少，表明了动物体内的有关该疾病的巨噬细胞受到抑制。结果如下表61所示。
表61：E1、E2、E3和E4滴眼液抑制疤痕和脉络膜新生血管(CNV)的研究。
组别 动物(只) 病理染色观察最大伤痕半径(像素) CDF4/80CD45(％)
对照组 8 1246±335 16.2±3.2
E1 8 332±124 7.1±1.4
E2 8 348±146 7.7±1.7
E3 8 369±185 8.3±2.4
E4 8 484±252 9.2±2.1
丝裂霉素 8 953±249 14.6±2.4
结果与讨论：与对照组和丝裂霉素治疗对照组相比较，E1、E2、E3和E4在伤痕半径和抑制巨噬细胞的治疗效果大大提高。
本发明还合成了化合物E10～E24，其合成方法与E1相近，只是氨基酸连接时原料不同如下表62所示。具体而言，将对应的R2氨基酸和R3氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，分别加入缩合剂(如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺；，于0℃-25℃反应2-24h。反应液经后用纯化处理，得到3肽，将三肽按实施例55中的方法替代Ala-Ala-Asn为合成中间替制备E10-E24化合物。质谱(MS)检测结果确认E10-E24化合物分子量依次如下表57，与结构计算预测的分子量相符合。
表62：化合物E10～E24的性状及质谱测试结果
化合物编号 R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> 性状 质谱检测 结构计算分子量
E10 丙氨酸 苏氨酸 浅蓝色 886 885.88
E11 丙氨酸 缬氨酸 浅蓝色 884 883.83
E12 丙氨酸 天冬氨酸 浅蓝色 899 898.80
E13 苏氨酸 丙氨酸 浅蓝色 886 885.88
E14 苏氨酸 苏氨酸 浅蓝色 916 915.90
E15 苏氨酸 缬氨酸 浅蓝色 914 913.93
E16 苏氨酸 天冬氨酸 浅蓝色 929 928.90
E17 缬氨酸 丙氨酸 浅蓝色 884 883.90
E18 缬氨酸 苏氨酸 浅蓝色 914 913.93
E19 缬氨酸 缬氨酸 浅蓝色 912 911.96
E20 缬氨酸 天冬氨酸 浅蓝色 927 926.93
E21 异亮氨酸 丙氨酸 浅蓝色 898 897.93
E22 异亮氨酸 苏氨酸 浅蓝色 928 927.96
E23 异亮氨酸 缬氨酸 浅蓝色 926 925.99
E24 异亮氨酸 天冬氨酸 浅蓝色 941 940.96
对上述实施例分别做了上述的MTD测试(方法同实施例59)、对肿瘤的疗效研究(方法同实施例60、61)、转移疗效(方法同实施例62)及多肿瘤疗效(方法同实施例64)的实验，并取得了与E1-E4相似的实验结果。经实验证明，n＝1-300范围内，随着n增大，抑瘤率轻微下降。随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔剂量的药物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在n选自1～300的范围内，均能到达本发明实施例E1-E4相近的技术效果。
实施例66：莱古杉醇(S1’)的肿瘤模型毒性，药效和免疫特性对比研究
实验目的：考察产品的药效和刺激抗肿瘤免疫特性。
实验方法和结果如下：
小鼠尾静脉注射莱古杉醇，每周一次，共3次，21天观察期的毒性实验结果剂量分别为140、150、160mg/kg/天的试验也无死亡，因此莱古杉醇的治疗窗口至少可达到160mg/kg/day。
进行了莱古杉醇与凯素、紫杉醇注射液在HT1080模型中高剂量等摩尔剂量和等毒剂量的对比实验。治疗结果出现较大的药效差异，紫杉醇注射液在第三次治疗后出现死亡。见图1。
我们进一步了解莱古杉醇的免疫刺激特性。我们在肿瘤治疗小鼠免疫检测发现，带瘤组和带瘤紫杉醇治疗组的肿瘤免疫抑制T细胞(T reg：CD4+,CD25+,Foxp3+)指标大幅度上升，莱古杉醇治疗组肿瘤免疫抑制T细胞指标却因为靶向化疗而下降(见图3的a图和b图)，同时肿瘤组织渗透出现更多的毒性CD8 T细胞(附图2中棕色为CD 8+阳性，见箭头所指)。因此通过肺癌肿瘤治疗模型，说明莱古杉醇的具有强烈的免疫刺激特性。
固体肿瘤治疗中，传统的化疗药物紫杉醇的***毒性对人体免疫的伤害以及因此而导致的抗药性是影响病人癌症治愈的关键障碍。我们的试验发现，紫杉醇等传统化疗药物对白细胞伤害很大。莱古杉醇只在肿瘤局部激活，避免了传统化疗药物会损伤免疫***的缺陷。更为重要的是莱古杉醇具有刺激抗肿瘤免疫的作用，因此能协同免疫治疗联合使用，完全治愈癌症。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。从S1到S27的实施例可看出，肿瘤微环境特异激活的可***连接基团可以连接和激活不同的化合物，所以对于本发明的R4位基团的药物或化合物替换和改变都将是显而易见，从R1选择氢、亲水基团或靶向基团的实施例可看出，对于本发明的R1位基团的药物或化合物替换和改变都将是显而易见。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (17)

  1. 具有下式(I)(II)所示含有可***连接基团的化合物，其特征在于，所述可***连接基团为-R2-R3-Asn-4-氨基苄基-OC(O)-，R1通过可***连接基团与R4连接，R1通过其羰基与R2形成酰胺键而与可***连接基团连接，R4通过其氧原子与所述可***连接基团形成碳酸酯而与所述可***连接基团连接，或通过其氮原子与所述可***连接接头形成氨基甲酸酯而与所述可***连接基团连接，
    R1{-R2-R3-Asn-4-氨基苄基-OC(O)-}R4  (I)
    式中，
    R1为增加溶解性的功能基团或保护基团；
    R2是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和异亮氨酸；
    R3是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和天冬酰胺；
    R2与R3以及R3与Asn形成酰胺键连接；Asn通过其羰基与-NH-相连；
    R4为与4-氨基苄基-OC(O)-连接的化合物；
    所述可***连接基团具有与天冬酰胺内肽酶接触而断裂的特征，
    且所述化合物具有通过天冬酰胺内肽酶接触和断裂可***连接基团、释放R4的特征。
  2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1选自：6-马来酰亚胺C1-10烷基羰基、羟基氨基羰基C1-10烷基羰基、C1-4烷氧基-(C1-4烷氧基)n-C1-6烷基羰基、2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基或
    其中，各R独立为C1-4烷基，各n独立为1～300、优选1～150的任意整数。
  3. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R4代表抗癌化合物的活性部分，所 述抗癌化合物选自喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇、多烯紫杉醇、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、阿霉素和丝裂霉素。
  4. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有下式(IIA)、(IIB)、(IIC)、(IID)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所示的结构式：
    式中，
    R1选自：6-马来酰亚胺C1-10烷基羰基、羟基氨基羰基C1-10烷基羰基、C1-4烷氧基-(C1-4烷氧基)n-C1-6烷基羰基、或
    其中，各R独立为C1-4烷基，各n独立为1～300、优选1～150的任意整数；
    R2为Ala、Thr、Val或Ile；
    R3为Ala、Thr、Val或Asn；
    R5是具有羟基的抗癌化合物(R5-OH)的活性部分(即除该用于连接的OH外的其它部分)，所述抗癌化合物选自喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇和多烯紫杉醇；和
    R6为具有氨基的抗癌化合物(R6-NH2)的活性部分(即除该用于连接的NH2基团外的其它部分)，所述抗癌化合物选自柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、阿霉素和丝裂霉素。
  5. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
  6. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
    (1)化合物S1-S5，S7-S15，S17-S43；
    (2)化合物S2’－S4’和S10’－S24’；
    (3)化合物A1、A3－A4和A10－A24；
    (4)化合物B1、B3－B4和B10－B24；
    (5)化合物D2－D4和D10－D24；和
    (6)化合物E2－E4和E10－E24。
  7. 一种含有可***连接基团和下列激活过程的化合物:
    其特征在于，可***连接基团克服R4的空间位阻而允许天冬酰胺内肽酶Legumain接触激活，而导致4-氨基苄基-OC(O)-R4与R1-R2-R3-Asn-分离；
    其中，R1为增加溶解性的功能基团或保护基团；
    R2是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和异亮氨酸，R2与R1形成羰基酰胺键；
    R3是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和天冬酰胺，R2与R3形成酰胺键连接；
    R4为通过羟基或氨基连接的化合物。
  8. 一种含有可***连接基团和下列激活过程的化合物，：
    其特征在于，可有效克服R4空间位阻和极性依然允许天冬酰胺内肽酶的接触和切割，而后导致4-氨基苄基-OC(O)-和R4之间断裂，从而使R4与可***连接基团分离，释放R4；
    其中，R1为增加溶解性的功能基团或保护基团；
    R2是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和异亮氨酸，R2与R1形成羰基酰胺键；
    R3是一种氨基酸基团，选自丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸和天冬酰胺，R2与R3形成酰胺键连接；
    R4为通过羟基或氨基连接的化合物。
  9. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1－8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
  10. 式(III)或式(IV)化合物的制备方法，其特征在于，所述方法如下所示：
    其中，式(III)化合物的制备中，R1-R2-R3-Asn-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有醇羟基的药物(R5-OH)反应，生成式(III)化合物，所述药物为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇或多烯紫杉醇；
    式(IV)化合物的制备中，R1-R2-R3-Asn-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有氨基的药物(R6-NH2)反应，生成式(IV)化合物，所述药物为柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、阿霉素或丝裂霉素；
    其中，R1为增加溶解性的功能基团或保护基团；R2为Ala、Thr、Val或Ile；R3为Ala、Thr、Val或Asn。
  11. 如权利要求1-8所述化合物和权利要求9的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂的用途，其特征在于，所述癌症为膀胱、脑、***/乳腺、宫颈、结肠-直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、***、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液部位的癌症。
  12. 式(IX)所示的丝裂霉素衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防眼科疾病的药物中的用途。
  13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述用途为治疗或预防伤愈疤痕或脉络膜新生血管，抑制巨噬细胞，或治疗或预防角膜移植、青光眼、翼状胬肉手术的后遗症。
  14. 权利要求1－8中所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求9所述的药物组合物在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞、抑制肿瘤生长、抑制血管新生、抑制癌细胞的浸润和转移和/或促进抗肿瘤免疫用的药物中的用途。
  15. 一种癌症治疗或预防方法，其特征在于，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的权利要求1－8中所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求9所述的药物组合物。
  16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括同时或先后给予该对 象放疗或免疫治疗。所述还包括用于清除或抑制肿瘤免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞和Treg细胞，增加T细胞在肿瘤的浸润，抑制肿瘤相关巨噬细胞生长，促经抗肿瘤免疫的用途。
  17. 如权利要求15所述的方法，其特征在于用于运送药物到癌细胞转移和肿瘤骨转移位置，和用于降低抑制癌细胞转移和减少或治愈肿瘤的骨转移。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113274507A (zh) * 2020-02-20 2021-08-20 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 靶向递送和激活的免疫刺激性偶联复合物的制备和用途

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3228650B1 (en) * 2014-12-04 2022-03-09 Delta-Fly Pharma, Inc. Novel peg derivative
CN107375288B (zh) * 2016-05-16 2019-08-23 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 多臂的聚合靶向抗癌偶联物
CN110312533B (zh) * 2016-12-21 2023-11-03 拜耳公司 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药
CN108314703B (zh) 2017-01-17 2022-02-01 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 分子定点靶向和激活的激酶抑制剂的制备和用途
CN108727583B (zh) * 2017-04-21 2022-03-22 高瑞耀业(北京)科技有限公司 多臂靶向抗癌偶联物
CN111670051A (zh) * 2017-11-08 2020-09-15 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 生物分子偶联物及其用途
CN110227164B (zh) 2018-03-06 2021-11-23 江苏吉贝尔药业股份有限公司 含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物及其缀合物、含有缀合物的纳米制剂及其制备方法及应用
CN109675035A (zh) * 2018-12-14 2019-04-26 中山大学 LIN28/let-7信号通路抑制剂在制备调控PD-L1表达的药物中的应用
CN112915211B (zh) * 2021-02-07 2022-05-06 成都中医药大学 一种pd-l1靶向肽药物偶联物及其合成方法和应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1040593A (zh) * 1988-08-23 1990-03-21 乔治敦大学 具有较低骨髓毒性的丝裂霉素衍生物及其制备方法和应用
CN101374856A (zh) * 2005-11-29 2009-02-25 斯克里普斯研究学院 抑制肿瘤细胞浸润、转移和血管生成
CN103044521A (zh) * 2012-12-26 2013-04-17 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物、其制备方法和用途
CN103965458A (zh) * 2013-01-28 2014-08-06 天津键凯科技有限公司 聚乙二醇-氨基酸寡肽-达沙替尼结合物及其药物组合物
CN104147612A (zh) * 2014-08-22 2014-11-19 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途
CN104177474A (zh) * 2014-08-22 2014-12-03 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 一种肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及其用途
CN104231045A (zh) * 2014-08-22 2014-12-24 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物及其用途
CN104231047A (zh) * 2014-08-22 2014-12-24 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途
CN104262455A (zh) * 2014-08-22 2015-01-07 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6251382B1 (en) * 1998-04-17 2001-06-26 Enzon, Inc. Biodegradable high molecular weight polymeric linkers and their conjugates
CA2536357A1 (en) * 2003-05-29 2004-12-23 The Scripps Research Institute Targeted delivery to legumain-expressing cells
CN1712399B (zh) 2004-06-24 2010-08-11 中国医学科学院药物研究所 紫杉醇和免疫增强剂胞壁酰二肽共轭物的制备及用途
CN100381459C (zh) 2004-12-03 2008-04-16 成都南山药业有限公司 阿霉素的衍生物及其制备方法和用途
WO2009059450A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
CN103204901B (zh) 2010-05-27 2016-03-09 中国医学科学院药物研究所 紫杉醇共缀物的制备方法
CN101935336B (zh) 2010-09-01 2014-04-09 北京大学 一类水溶性紫杉烷类药物的制备方法和应用
JP6207509B2 (ja) * 2011-08-30 2017-10-04 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 固形腫瘍を治療するためのｆａｐ活性化プロテアソーム阻害剤
PL3327027T3 (pl) * 2011-11-17 2021-06-28 Pfizer Inc. Cytotoksyczne peptydy i ich koniugaty przeciwciało lek
JP6539729B2 (ja) * 2014-06-03 2019-07-03 ジアリー・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＪｉａｒａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ペプチド−薬物複合体
CN104262457A (zh) * 2014-08-22 2015-01-07 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 一种水溶性肿瘤靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及用途

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1040593A (zh) * 1988-08-23 1990-03-21 乔治敦大学 具有较低骨髓毒性的丝裂霉素衍生物及其制备方法和应用
CN101374856A (zh) * 2005-11-29 2009-02-25 斯克里普斯研究学院 抑制肿瘤细胞浸润、转移和血管生成
CN103044521A (zh) * 2012-12-26 2013-04-17 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物、其制备方法和用途
CN103965458A (zh) * 2013-01-28 2014-08-06 天津键凯科技有限公司 聚乙二醇-氨基酸寡肽-达沙替尼结合物及其药物组合物
CN104147612A (zh) * 2014-08-22 2014-11-19 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途
CN104177474A (zh) * 2014-08-22 2014-12-03 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 一种肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及其用途
CN104231045A (zh) * 2014-08-22 2014-12-24 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物及其用途
CN104231047A (zh) * 2014-08-22 2014-12-24 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途
CN104262455A (zh) * 2014-08-22 2015-01-07 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRISHNA MOHAN BAJJURI ET AL: "The legumain protease-activated auristatin produrs suppress tumor growth and metastasis without toxicity", 《CHEMMEDCHEM》 *
吴进: "聚乙二醇衍生物的合成及其对胰蛋白酶的化学修饰", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）》 *
郑水莲等: "丝裂霉素C在眼科的应用及并发症", 《中国现代应用药学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113274507A (zh) * 2020-02-20 2021-08-20 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 靶向递送和激活的免疫刺激性偶联复合物的制备和用途

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