JP6539729B2 - ペプチド−薬物複合体 - Google Patents
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Description
アスパラギナーゼを発現する細胞は、多くの腫瘍がこれらのプロテアーゼを過発現するために、ペプチド−薬物複合体アプローチのための魅力的な標的となっている。このようなアスパラギナーゼの1つであるレグマインは、これに関して特に注目を集めている(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4)。
マイトマイシン、ドキソルビシン及びカンプトテシンは、ペプチド−薬物複合体療法で使用される薬物として注目を集めている。特許文献2、特許文献3、特許文献4、及び特許文献5では、ドキソルビシンを含む薬物でレグマインを標的とするペプチド−薬物複合体の例を開示している。
R−Y−Z−Asn−Linker−D (式I)
の構造を有し、
式中、
Rは、
i)1〜約5個のヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、スルホン酸基、またはホスホリル基で任意に置換された、C1〜約C20の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、カルバモイル基、スルホニル基、ホスホリル基またはアルキル基、
ii)1〜約50個のL−またはD−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
iii)400〜約40,000の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Yは、Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Pheからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Zは、Ala、Thr、Asn及びProからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Asnは、アスパラギン残基であり、
Linkerは、p−アミノベンジルカルバモイル部分またはp−アミノベンジルカルボネート部分であり、
Dは、リンカー部分に結合した抗腫瘍薬部分であり、この薬物は、マイトマイシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、9−アミノ−カンプトテシン、N8−アセチルスペルミジン、1−(2−クロロエチル)−1,2−ジメタンスルホニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、エトポシド、カンプトテシン、タキソール、エスペラミシン、ポドフィラトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、モルホリン−ドキソルビシン、n−(5,5−ジアセトキシ−ペンチル)ドキソルビシン、及びこれらの誘導体からなる群から選択される。
Rは、
i)1〜約5個のヒドロキシル、アミン、カルボキシル、スルホン酸、またはホスホリル基で任意に置換された、C1〜約C20の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、
ii)1〜約50個のL−またはD−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
iii)400〜約40,000の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Yは、Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Pheからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Zは、Ala、Thr、Asn及びProからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Asnは、アスパラギン残基であり、
Linkerは、p−アミノベンジルカルバモイル部分であり、
Dは、抗腫瘍薬部分であり、この薬物は、マイトマイシン及びドキソルビシンから選択される。
Rは、
i)1〜約5個のヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、スルホン酸基、またはホスホリル基で任意に置換された、C1〜約C20の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、カルバモイル基、スルホニル基、ホスホリル基またはアルキル基、
ii)1〜約50個のL−またはD−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
iii)400〜約40,000の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Yは、Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Pheからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Zは、Ala、Thr、Asn及びProからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Asnは、アスパラギン残基であり、
Linkerは、p−アミノベンジルカルボネート部分であり、
Dは、リンカー部分に結合した抗腫瘍薬部分であり、この薬物は、カンプトテシンである。
D’−Linker−Asn−Z−Y−R’−Y−Z−Asn−Linker−D(式II)
に示される式の二量体ペプチド−薬物複合体を含み、
式中、D及びD’は、互いに同一または異なる細胞障害性薬部分であり、マイトマイシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、9−アミノ−カンプトテシン、N8−アセチルスペルミジン、1−(2−クロロエチル)−1,2−ジメタンスルホニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、エトポシド、カンプトテシン、タキソール、エスペラミシン、ポドフィラトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、モルホリン−ドキソルビシン、n−(5,5−ジアセトキシ−ペンチル)ドキソルビシン、及びこれらの誘導体からなる群から独立して選択され、
Linkerは、p−アミノベンジルカルバメート部分またはp−アミノベンジルカルボネート部分であり、これらのリンカーは、同一であっても異なってもよく、
R’は、
i)1〜約5個のヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、スルホン酸基、またはホスホリル基で任意に置換された、C1〜約C20の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、カルバモイル基、スルホニル基、ホスホリル基またはアルキル基から選択されるビス−官能基、
ii)1〜約50個のL−またはD−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
iii)400〜約40,000の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Yは、Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Pheからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Asnは、アスパラギン残基であり、
Zは、Ala、Thr、Asn及びProからなる群から選択されるアミノ酸残基であ
る。
Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン、
Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン、
Nα−アセトアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン、
Nα−ブチルアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン、
Nα−ヘキサンアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン、
Nα−[−(2−アミド−2−オキソエトキシ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン、及び
Nα−[−((2−アミド−2−オキソエトキシ)(メチル)アミノ酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン、
Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン、
Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン、
Nα−アセトアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン、
Nα−ブチルアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン、及び
Nα−ヘキサンアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシンン、
Nα−[−(2−アミド−2−オキソエトキシ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン、ならびに
Nα−[−((2−アミド−2−オキソエトキシ)(メチル)アミノ酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシンが含まれ、式中、PABCは、p−アミノベンジルカルバモイルリンカー部分である。
Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン、
Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン、
Nα−[−(2−アミド−2−オキソエトキシ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン、及び
Nα−[−((2−アミド−2−オキソエトキシ)(メチル)アミノ酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシンが含まれ、
式中、PABCは、p−アミノベンジルカルボネートリンカー部分である。
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N4−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン−スクシンアミド、
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン−ビス(Oα)−アセトアミド、
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン−ビス(Nα−メチル)−アセトアミド、
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N4−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン−スクシンアミド、
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン−ビス(Oα)−アセトアミド、及び
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン−ビス(Nα−メチル)−アセトアミドが含まれ、
式中、PABCは、p−アミノベンジルカルバモイルまたはp−アミノベンジルカルボネートリンカー部分である。
一般に、式I及び式IIのペプチド−薬物複合体は、入手可能な材料及び従来の有機合成技術を用いて調製されてもよい。例えば、記載されるタイプの細胞障害性薬は、市販されているものであり、これらの合成は、科学文献に記載されている。一般的に、本発明のペプチド−薬物複合体は、薬物部分を、自壊性リンカーを介してペプチド配列に共有結合させることによって構築され得る。以下に示される調製物の具体的な合成経路は、利用され得るものを例示するものである。
a)Fmoc及びトリチル除去、ならびにペプチドカップリングに対しては、標準ペプチド合成法が使用された。
b)自壊性リンカーは、有機/水性溶媒混合物中で、EEDQをカップリング試薬として用いて、Nα−Fmoc−Asnまたはトリチル保護Nα−Fmoc−Asnとp−アミノベンジルアルコールとを反応させることによって、アミノ酸に結合された。
c)p−アミノベンジルアルコールの活性化炭酸塩は、p−ニトロフェニルクロロホルメートとNα−Fmoc−Asn−PAB−OHまたはNα−Fmoc−Ala−Ala−N−トリチル−Asn−PAB−OHとを反応させることによって得ることができた。
d)マイトマイシン及びドキソルビシンのペプチド薬物複合体は、DMF中、HOBTの存在下で、Nα−Fmoc−Asn−PAB−PNPまたはNα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−PNPの対応する活性化炭酸塩と反応させることによって得られた。
e)カンプトテシン複合体の合成については、カンプトテシンをトリホスゲンと反応させて、インサイチュでカンプトテシンクロロホルメートを得て、次いで、これを、Nα−Fmoc−Asn−PAB−OHとカップリングさせて、対応するNα−Fmoc−Asn−PABC−カンプトテシンを得た。
f)ペプチドカップリング法によって、種々の無水物、塩化アシルまたはカルボン酸によるアシル化によって、最終ペプチド−薬物複合体を得た。
本発明の代表的なペプチド−薬物複合体を、インビトロ及びインビボ系の両方で試験して、それらの生物学的活性を決定した。これらの試験において、細胞障害薬の複合体の効力を、ヒトの癌原発部位の細胞に対する複合体の細胞毒性を測定することによって決定した。当業者であれば、所望の腫瘍関連プロテアーゼ(本発明の複合体を切断して、薬物を活性形態で放出するプロテアーゼ)を発現する任意の腫瘍細胞株が、以下の分析で使用される特定の腫瘍細胞株の代わりに使用することができることを認識するであろう。以下では、使用された代表的な試験及び得られた結果について説明する。
ヒト血漿安定性
500μMのペプチド−薬物複合体Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[本明細書では化合物8]の20μLのDMSO保存溶液を、ヒト血漿で1mLに希釈し(最終濃度:10μM、2%DMSO)、混合物を37℃でインキュベートした。100μLのアリコートを、0、0.25、0.5、1、2、4、6時間の時点で取り出し、内部標準としてトルブタミド(200ng/mL)を含有する冷アセトニトリル400μLで希釈した。試料を14,000rpmで4分間遠心分離した。上記上清100μLを、0.1%ギ酸のHPLC水300μLで希釈し、10μLをLC/MS/MS分析用に採取した(カラム:C−18;移動相:水中0.1%ギ酸/アセトニトリル中0.1%ギ酸;イオン遷移:Q1イオン(m/z)=840.5、Q2イオン(m/z)=462.2)。図1に示すように、ペプチド−薬物複合体は、ヒト血漿中で比較的安定しており、15時間超(T1/2>15時間)の半減期を有する。2%未満の遊離薬物マイトマイシンを検出した。
インビトロ細胞毒性アッセイ
ヒト癌腫細胞の単層培養物を、トリプシンーEDTAを用いて採取し、細胞を計数し、10%のFBSを含有するRPMI−1640またはDMEM1×105/mLに再懸濁させた。細胞(0.1mL/ウェル)を、96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、5%CO2の加湿空気中で、37℃にて一晩インキュベートした。培地をプレートから除去し、培地中のマイトマイシンまたは複合体の連続希釈液(最終DMSO濃度<0.1%)を、ウェルに添加した。全ての希釈は、三通り行った。薬物で処理された細胞を、5%CO2の加湿空気中で、37℃にてさらに72時間インキュベートした。冷TCA(50%、重量/体積)50μLを、各ウェルに添加し、プレートを4℃で1時間インキュベートした。プレートをゆっくりと流れる水道水で3回洗浄し、室温で乾燥させた。スルホローダミンB溶液(0.4%、重量/体積)50μLを各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間放置した。プレートを酢酸溶液(1%、体積/体積)で濯ぎ、未結合の染料を除去し、室温で乾燥させた。10mMのTris塩基溶液200μLを各ウェルに添加し、プレートを旋回シェーカー上で15分間振動させ、タンパク質結合染料を可溶化した。マイクロプレートリーダで、510nmにおけるウェルの光学密度を測定し、IC50を、各実験で三通り行われた3つの別個の実験からのGraphPadにより計算し、平均値として表した(表1)。
Balb/cマウスにおけるインビボ最大耐用量(MTD)
マイトマイシン及び単剤としてのそのペプチド−薬物複合体Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン [化合物8]の忍容性を、Balb/cマウスにおいて別個に評価した。処置後の異なる時点での異なる群における体重の結果を図2に示す。
インビボ抗腫瘍活性
ペプチド−薬物複合体Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン [8]の殺腫瘍効果を、Balb/cマウスにおける皮下CT−26同一遺伝子型結腸癌モデルで評価した。各マウスを、PBS 0.1mL中、CT−26腫瘍細胞(5×105)で、右わき腹領域に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約180mm3に達したとき(10日後近辺)、CT−26腫瘍マウスを、ビヒクル(2%DMA及び98%の40%2HP−β−CD)、マイトマイシン(2mg/kg;5mg/kg、QW)及び複合体Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン [8](25mg/kg;50mg/kg、QW)を、3週間にわたって、マウス毎に合計3回の注射で、静脈内投与することによって処置した。CT−26モデルの腫瘍成長曲線を図3に示す。
実施例1
Nα―Fmoc−Ala−Ala[1]の調製
Nα―Fmoc−Ala(1.58g、5.0ミリモル)、N−ヒドロキシルスクシンイミド(0.63g、5.5ミリモル)及びDCC(1.03g、5.0ミリモル)のCH2Cl2溶液(50mL)を、5℃で6時間撹拌した。DCUを濾過して取り除き、濾液を濃縮した。残渣をTHF(50mL)中に再溶解させて、冷蔵庫(4℃)で一晩保管した。より多量のDCUを濾過して取り除き、THF溶液を、アラニン(0.99g、7.5ミリモル)及びNaHCO3(1.68g、20ミリモル)の25%THF/H2O溶液(80mL)に添加した。反応混合物を、25℃で5時間にわたり激しく撹拌した。THFを濃縮によって除去し、水性懸濁液を、濃HClでpH4に調節した。水性懸濁液を、25℃でさらに3時間撹拌し、濾過により沈殿物を集め、脱塩水で十分に濯ぎ、KOHで真空にて乾燥させて、白色固体生成物(1.77g、83.7%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=383
Nα―Fmoc−Asn−PAB−OH[2]の調製
Nα―Fmoc−Asn(1.77g、5.0ミリモル)、p−アミノベンジルアルコール(0.86g、7.0ミリモル)及びEEDQ(1.48g、6ミリモル)のTHF/H2O溶液(100/20mL)を、室温で一晩撹拌した。EEDQの追加量(0.61g、2.5ミリモル)を添加し、さらに24時間撹拌した。THFを濃縮によって除去し、残った懸濁液を、NaOH/NaHCO3水性溶液(2/8g、200mL)で希釈し、3時間撹拌した。沈殿物を濾過により集め、水で濯ぎ、10%クエン酸(150mL)中に再懸濁させた。沈殿物を濾過によって集め、10%クエン酸、続いて脱塩水で濯ぎ、真空中で乾燥させた。上記固体を、酢酸エチル(100mL)中で摩砕した。濾過により固体を集め、真空中で乾燥させて、灰白色生成物(0.95g、40%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=460
Nα―Fmoc−Asn−PABC−PNP[3]の調製
乾燥THF/DMF(50/5mL)中、Nα―Fmoc−Asn−PAB−OH[2](0.75g、1.6ミリモル)を室温で、p−ニトロフェニルクロロホルメート(0.4g、2.0ミリモル)及びピリジン(0.15g、2.0ミリモル)で処理した。16時間後に、追加量のp−ニトロフェニルクロロホルメート(0.2g、1.0ミリモル)を添加し、反応溶液をさらに6時間撹拌した。上記溶液を、酢酸エチル(250mL)で希釈し、5%クエン酸(2×100mL)、続いて塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を50%EA/ヘキサン中で摩砕し、固体を濾過により集め、灰黄色生成物(0.8g、81%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=625
Nα―Fmoc−Asn−PABC−マイトマイシン[4]の調製
乾燥DMF(15mL)中、Nα―Fmoc−Asn−PABC−PNP[3](624mg、1.0ミリモル)及びマイトマイシン(400mg、1.2ミリモル)を、室温でHOBT(675mg、5.0ミリモル)及びDIEA(650mg、5.0ミリモル)で4時間処理した。反応混合物を、酢酸エチル(150mL)で希釈し、NaOH/NaHCO3(1/4g、200mL)で3回洗浄し、続いて塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮乾固させた。残渣を50%酢酸エチル/ヘキサン(50mL)中で摩砕し、固体を濾過により集め、酢酸エチル/ヘキサンで濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(635mg、76.3%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=820
Asn−PABC−マイトマイシン[5]の調製
Nα―Fmoc−Asn−PABC−マイトマイシン[4](624mg、0.76ミリモル)を、20%モルホリン/NMP(15mL)で室温にて処理した。30分後に、50%酢酸エチル/ヘキサン(100mL)を添加し、上清を除去した。上記工程を2回繰り返した。残渣をメタノール(25mL)中に再溶解させ、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。残渣を、50%酢酸エチル/ヘキサン(100mL)中で摩砕し、室温で一晩撹拌した。固体を濾過により集め、酢酸エチル/ヘキサンで濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(440mg、95.6%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=598
Nα―Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[6]の調製
Asn−PABC−マイトマイシン[5](440mg、0.73ミリモル)及びNα―Fmoc−Ala−Ala[1](286mg、0.75ミリモル)を、NMP(15mL)中PyBop(390mg、0.75ミリモル)及びDIEA(585mg、4.5ミリモル)で室温にて処理した。1時間後に、反応混合物を、酢酸エチル(200mL)で希釈した。有機溶液を、5%クエン酸(3×100mL)、塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を50%酢酸エチル/ヘキサン(100mL)中で摩砕し、室温で一晩撹拌した。固体を濾過により集め、酢酸エチル(50mL)中に再懸濁させ、超音波処理した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(530mg、75.4%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=962
Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[7]の調製
Nα―Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[6](481mg、0.5ミリモル)を、20%モルホリン/NMP(10mL)中で室温にて処理した。30分後に、50%酢酸エチル/ヘキサン(150mL)を添加し、1時間撹拌した。上清を除去し、残渣をCH2Cl2(50mL)中で摩砕した。固体を濾過により集め、メタノール(20mL)中に再溶解させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル中で摩砕した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(277mg、75%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=740
Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[8]の調製
DMA/CH2Cl2(2/6mL)中、Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[7](260mg、0.35ミリモル)を、室温において、無水コハク酸(50mg、0.5ミリモル)及びDIEA(130mg、1.0ミリモル)で処理した。反応混合物を一晩撹拌した。上記反応混合物に、エチルエーテル(100mL)を添加し、30分間撹拌した。上清を除去し、この工程を2回繰り返した。残渣を2%HOAc/酢酸エチル(50mL)中で摩砕し、固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(265mg、90%収率)を得た。
LC/MS:(MH)-=838
Nα−アセトアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[9]の調製
DMA/CH2Cl2(1/3mL)中、Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[7](37mg、0.05ミリモル)を、室温において、無水酢酸(10mg、0.1ミリモル)及びDIEA(13mg、0.1ミリモル)で処理した。30分後、エチルエーテル(50mL)を添加し、60分間撹拌した。軟質固体を濾過により集め、エチルエーテルで濯ぎ、メタノール(5mL)中に再溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を50%酢酸エチル/ヘキサン(10mL)中で摩砕し、固体を濾過により集め、酢酸エチル/ヘキサンで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(35mg、90%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=805
Nα−ブチルアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[10]の調製
DMA/CH2Cl2(1/3mL)中、Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[7](37mg、0.05ミリモル)を、室温において、塩化ブチリル(6.3mg、0.06ミリモル)及びDIEA(13mg、0.1ミリモル)で処理した。30分後、エチルエーテル(50mL)を添加し、60分間撹拌した。固体を濾過により集め、エチルエーテルで濯ぎ、メタノール(5mL)中に再溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル(10mL)中で摩砕した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(27mg、67%収率)を得た。
LC/MC:(MH)+=808;(M+Na)+=833
Nα−ヘキサンアミド−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[11]の調製
DMA/CH2Cl2(1/3mL)中、Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[7](37mg、0.05ミリモル)を、室温において、塩化ヘキサノイル(9.0mg、0.06ミリモル)及びDIEA(13mg、0.1ミリモル)で処理した。30分後、エチルエーテル(50mL)を添加し、60分間撹拌した。固体を濾過により集め、エチルエーテルで濯ぎ、メタノール(5mL)中に再溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を50%酢酸エチル/ヘキサン(10mL)中で摩砕した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物(27mg、67%収率)を得た。
LC/MC:(MH)+=836;(M+Na)+=860
Nα−[−(2−アミド−2−オキソエトキシ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[12]の調製
THF/DMF(4/0.5mL)中、Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[7](295mg、0.4ミリモル)を、室温において1,4−ジオキサン−2,6−ジオン(70mg、0.6ミリモル)及びDIEA(60mg、0.5ミリモル)で2時間処理した。エチルエーテル(10mL)をゆっくりと添加し、混合物を30分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル中1%酢酸中で摩砕し、超音波処理した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、暗色生成物(276mg、80%収率)を得た。
LC/MC:(MH)+=854
Nα−[−((2−アミド−2−オキソエトキシ)(メチル)アミノ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[13]の調製
THF/DMF(4/0.5mL)中、Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[7](295mg、0.4ミリモル)を、室温において4−メチルモルホリン−2,6−ジオン(77mg、0.6ミリモル)及びDIEA(130mg、1.0ミリモル)で2時間処理した。エチルエーテル(10mL)をゆっくりと添加し、混合物を30分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル中1%酢酸中で摩砕し、超音波処理した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、暗色生成物(339mg、97%収率)を得た。
LC/MS:(M-H)+=867
Nα―Fmoc−Asn−(N−トリチル)−PAB−OH[14]の調製
Nα―Fmoc−Asn(N−トリチル)(1.49g、2.5ミリモル)、p−アミノベンジルアルコール(0.37g、3.0ミリモル)及びEEDQ(0.74g、3ミリモル)のTHF溶液(50mL)を、室温で一晩撹拌した。EEDQの追加量(0.25g、1.0ミリモル)を添加し、さらに6時間撹拌した。反応溶液を、酢酸エチル(300mL)で希釈し、0.1NのHClで3回洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。酢酸塩溶液を短いシリカプラグを介して濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、濃縮乾固させた。残渣を酢酸エチル中で摩砕し、濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、真空中で乾燥させて、白色固体を得た(1.65g、93%収率)。
LC/MS:(MH)+=702
Asn−(N−トリチル)−PAB−OH[15]の調製
Nα―Fmoc−Asn−(N−トリチル)−PAB−OH[14](1.6g、2.28ミリモル)のCH2Cl2溶液(50mL)に、DBU(1mL)を添加した。反応溶液を15分間撹拌した。反応溶液を、CH2Cl2(200mL)で希釈し、塩水で2回洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させた。残渣を、ヘキサン/エチルエーテル(1/1)中で摩砕した。固体を濾過により集めて、エチルエーテルで濯ぎ、真空中で乾燥させて白色固体を得た(1.1g、100%収率)。
LC/MS:(MH)+=480
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−(N−トリチル)−PAB−OH[16]の調製
Asn−(N−トリチル)−PAB−OH[15](0.72g、1.5ミリモル)、Nα−Fmoc−Ala−Ala[1](0.57g、1.5ミリモル)、PyBop(0.94g、1.8ミリモル)及びDIEA(1.17g、9.0ミリモル)のNMP溶液(20mL)を、室温で1時間撹拌した。上記反応物に、5%クエン酸水溶液(150mL)を、氷水温度でゆっくりと添加し、2時間撹拌した。沈殿物を濾過により集めて、5%クエン酸溶液、続いて脱塩水で濯いだ。固体を、水性NaHCO3溶液中に再懸濁させ、摩砕し、濾過し、脱塩水で濯ぎ、KOHで真空中にて乾燥させ、白色生成物を得た(1.1g、87%収率)。
LC/MS:(MH)+=845
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−(N−トリチル)−PABC−PNP[17]の調製
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−(N−トリチル)−PAB−OH[16](1.1g、1.3ミリモル)、p−ニトロフェニルクロロホルメート(0.31g、1.6ミリモル)及びピリジン(0.13g、1.6ミリモル)の乾燥THF反応溶液を、室温で一晩撹拌した。追加量のp−ニトロフェニルクロロホルメート(0.2g、1.0ミリモル)及びピリジン(0.08g、1.0ミリモル)を添加し、さらに4時間撹拌した。上記溶液を酢酸エチル(300mL)で希釈し、5%クエン酸溶液(3×100mL)、続いて塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させて、濾過し、濃縮乾固させた。残渣をエチルエーテル中で摩砕し、濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空中で乾燥させて、灰白色生成物(1.1g、83%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=1010
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−PNP[18]の調製
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−(N−トリチル)−PABC−PNP[17](1.0g、1ミリモル)及びTIPS(2.5mL)のTFA/CH2CL2溶液(6/24mL)を、室温で2時間撹拌した。上記反応溶液に、エチルエーテル(150mL)をゆっくりと添加し、懸濁液を1時間撹拌した。沈殿物を濾過により集め、エチルエーテルで濯いだ。固体を酢酸エチル中で摩砕し、濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、真空中で乾燥させて、灰白色生成物(0.75g、97%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=767
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン[19]の調製
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−PNP[18](383mg、0.5ミリモル)、ドキソルビシン塩酸塩(348mg、0.6ミリモル)、HOBT(202mg、1.5ミリモル)及びDIEA(325mg、2.5ミリモル)の乾燥DMF反応溶液(5mL)を、暗所で一晩撹拌した。上記溶液に、氷水温度で5%クエン酸(100mL)をゆっくりと添加し、1時間撹拌した。沈殿物を濾過により集め、5%クエン酸、続いて脱塩水で濯いだ。固体を水性NaHCO3溶液中に再懸濁させ、30分間撹拌した。固体を集め、NaHCO3溶液、続いて脱塩水で十分に濯いだ。固体をイソプロパノール、10%メタノール/酢酸エチル中に再懸濁させ、摩砕し、濾過し、真空中で乾燥させて、暗赤色生成物(550mg、94%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=1171
Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン[20]の調製
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン[19](500mg、0.42ミリモル)の20%モルホリン/NMP溶液(5mL)を、1時間撹拌した。上記反応溶液に、エチルエーテル(50mL)をゆっくりと添加し、得られた懸濁液を30分間撹拌した。エチルエーテルを、流出させた(3回繰り返した)。残渣を酢酸エチル、20%メタノール/酢酸エチル中で摩砕した。固体を濾過により集め、真空中で乾燥させた、固体を水中に再懸濁させ、超音波処理し、濾過し、KOHで真空中にて乾燥させ、暗赤色生成物(320g、80%収率)を得た。
LC/MC:(MH)+=949
Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン[21]
LC/MS:(MH)+=1049
Nα−[−(2−アミド−2−オキソエトキシ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン[22]
LC/MS:(MH)+=1065
Nα−[−((2−アミド−2−オキソエトキシ)(メチル)アミノ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン[23]
LC/MS:(MH)+=1078
Nα−Fmoc−Asn−PABC−カンプトテシン[24]の調製
カンプトテシン(348mg、1ミリモル)及びDAMP(366mg、3ミリモル)の乾燥CH2Cl2懸濁液(20mL)に、トリホスゲン(100mg、0.33ミリモル)を、撹拌しながら氷水温度で添加した。20分後に、Nα−Fmoc−Asn−PAB―OH[2](459mg、1ミリモル)の乾燥CH2Cl2懸濁液(10mL)を、上記反応混合物に添加し、室温で一晩撹拌した。得られた反応混合物に、p−ニトロフェニルクロロホルメート(100mg、0.5ミリモル)、続いて追加量のDAMP(60mg、0.5ミリモル)を添加し、反応混合物をさらに4時間撹拌した。濃縮後に、得られた残渣を25%CH2Cl2/酢酸エチル中で摩砕し、濾過し、25%CH2Cl2/酢酸エチルで濯いで、真空中で乾燥させた。固体を、水性NaHCO3中に懸濁させ、超音波処理し、濾過し、水性NaHCO3、続いて5%クエン酸、脱塩水で十分に濯いで、KOH上で真空にて乾燥させ、灰黄色生成物(763mg、91%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=834
Asn−PABC−カンプトテシン[25]の調製
Nα−Fmoc−Asn−PABC−カンプトテシン[24](500mg、0.6ミリモル)の2%DBU/CH2Cl2溶液(15mL)を、20分間撹拌した。エチルエーテル(80mL)を、上記反応溶液にゆっくりと添加し、30分間撹拌した。沈殿物を摩砕し、濾過により集め、エチルエーテルで十分に濯いだ。固体を20%CH2Cl2/酢酸エチル中で再摩砕し、濾過し、乾燥させた。固体を水性NaHCO3中に再懸濁させ、摩砕し、濾過し、脱塩水で濯ぎ、KOHで真空にて乾燥させて、灰黄色生成物(295mg、80%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=612
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン[26]の調製
H2N−Asn−PABC−カンプトテシン[25](244mg、0.4ミリモル)、Nα−Ala−Ala[1](190mg、0.5ミリモル)、PyBop(260mg、0.5ミリモル)及びDIEA(325mg、2.5ミリモル)のNMP溶液(5mL)を、1時間撹拌した。上記反応溶液に、5%クエン酸(50mL)をゆっくりと添加して、得た混合物を30分間撹拌した。沈殿物を濾過により集めて、5%クエン酸溶液、続いて脱塩水で濯ぎ、KOH上、真空中で乾燥させた。固体を15%CH2Cl2/酢酸エチル中で摩砕し、超音波処理し、濾過し、乾燥させて、灰色生成物(274mg、70%収率)。
LC/MS:(MH)+=976
Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン[27]の調製
Nα−Fmoc−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン[26](487mg、0.5ミリモル)の2%DBU/CH2Cl2溶液(10mL)を、10分間撹拌した。上記反応溶液に、エチルエーテル(50mL)をゆっくりと添加し、30分間撹拌した。沈殿物を集め、エーテルで濯いだ。固体を20%CH2Cl2/酢酸エチル中に懸濁させ、摩砕し、濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、乾燥させて、灰色生成物(290mg、77%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=754
Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン[28]
LC/MS:(MH)+=854
Nα−[−(2−アミド−2−オキソエトキシ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン[29]
LC/MS:(MH)+=870
Nα−[−((2−アミド−2−オキソエトキシ)(メチル)アミノ)酢酸]−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン[30]
LC/MS:(MH)+=883
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N4−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン−スクシンアミド[31]の調製
Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン[8](85mg、0.1ミリモル)、Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン[20](104mg、0.11ミリモル)、PyBop(62mg、0.12ミリモル)及びDIEA(78mg、0.6ミリモル)のNMP溶液(2mL)を、1時間撹拌した。エチルエーテル(20mL)を添加し、得られた混合物を撹拌し、超音波処理した。エーテルを流出させ(2回繰り返した)、残渣をメタノール中で摩砕し、濾過し、乾燥させて、暗色生成物(100mg、57%収率)を得た。
LC/MS:(MH)+=1770
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン−ビス(Oα)−アセトアミド[32]の調製
実施例31の調製の同様の方法を、化合物[20]及び化合物[12]から実施例32を調製するために用いた。
LC/MS:(MH)+=1786
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−ドキソルビシン−ビス(Nα−メチル)−アセトアミド[33]の調製
実施例31の調製についての同様な方法を、化合物[20]及び化合物[13]から実施例33を調製するために用いた。
LC/MS:(MH)+=1799
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N4−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン−スクシンアミド[34]の調製
実施例31の調製の同様の方法を、化合物[27]及び化合物[8]から実施例34を調製するために用いた。
LC/MS:(MH)+=1575
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン−ビス(Oα)−アセトアミド[35]の調製
実施例31の調製の同様の方法を、化合物[27]及び化合物[12]から実施例34を調製するために用いた。
LC/MS:(MH)+=1591
N1−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシン,N5−Ala−Ala−Asn−PABC−カンプトテシン−ビス(Nα−メチル)−アセトアミド[36]の調製
実施例31の調製の同様の方法を、化合物[27]及び化合物[13]から実施例34を調製するために用いた。
LC/MS:(MH)+=1604
DCC=ジクロヘキシルカルビジイミド
DCM=ジクロロメタン
DCU=ジシクロヘキシル尿素
DIEA=ジイソプロピルエチルアミン
DMA=ジメチルアセトアミド
DMEM=ダルベッコ修飾イーグル培地
DMF=N,N−ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
EDC=1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
EDTA=N,N’,N’’,N’’’,N’’’’−エチレンジアミン四酢酸
FBS=ウシ胎児血清
Fmoc=フルオレニルメトキシカルバモイル
HATU=1−[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]−1H−1,2,3−トリアゾロ[4,5−b]ピリミジニウム−3−オキシドヘキサフルオロホスフェート
HOBT=N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
IR=赤外分光法
LC/MS=液体クロマトグラフィー/質量分析法
MS=質量分析法
MTD=最大耐用量
NMP=N−メチルピロリジノン
NMR=核磁気共鳴
PABC=p−アミノベンジルカルバモイル
PBS=リン酸緩衝塩類溶液
Py=ピリジン
QW=毎週
TCA=トリクロロ酢酸
Tr=トリチル、トリフェニルメチル、
UV/VIS=紫外/可視分光法
Claims (12)
- Nα−スクシンアミド酸−Ala−Ala−Asn−PABC−マイトマイシンであるペプチド−薬物複合体、またはその薬学的に許容される塩であって、該PABCが、式:
- 請求項1に記載のペプチド−薬物複合体またはその薬学的に許容される塩と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 1つまたは複数の個々の投与量として包装された、請求項2に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物における癌の治療に用いるための医薬組成物であって、請求項1に記載のペプチド−薬物複合体またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- 哺乳動物における癌の治療に用いるための、請求項2または3に記載の医薬組成物。
- 該癌が固形腫瘍である、請求項4または5に記載の医薬組成物。
- 該癌が、結腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、食道癌、大腸癌、皮膚癌、または前立腺癌である、請求項4または5に記載の医薬組成物。
- ペプチド−薬物複合体が他の化学療法剤と併用される、請求項4〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ペプチド−薬物複合体が放射線療法と併用される、請求項4〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 癌治療薬の調製のための、請求項1に記載のペプチド−薬物複合体またはその薬学的に許容される塩の使用。
- 該癌が固形腫瘍である、請求項10に記載の使用。
- 該癌が、結腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、食道癌、大腸癌、皮膚癌、または前立腺癌である、請求項10に記載の使用。
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