CN114903856A

CN114903856A - 一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂及制备方法与应用

Info

Publication number: CN114903856A
Application number: CN202210488085.7A
Authority: CN
Inventors: 朱玲玲; 周清华; 张志荣
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2022-08-16

Abstract

本发明公开了一种载2′，3′‑cGAMP脂质体纳米制剂及制备方法与应用，涉及医药及肿瘤免疫治疗技术领域，其技术方案要点是：所述脂质体纳米制剂为通过旋蒸法、薄膜水化法、水浴超声、冰浴超声作用下制备的包封2′，3′‑cGAMP的脂质体；所述脂质体的制备原料包括棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000。本发明制备得到的2′，3′‑cGAMP脂质体纳米制剂具有稳定性好、递送效率高、生物活性高且毒性低等优点，在克服氧化应激诱导的免疫抑制，激活***性免疫反应，发挥抗肺腺癌作用等方面具有重要的潜在应用价值。

Description

一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药及肿瘤免疫治疗技术领域，更具体地说，它涉及一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂及制备方法与应用。

背景技术

2′，3′-cGAMP作为一种最常用的STING激动剂，具有激活与调节免疫，显著抑制远端皮下移植肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存的作用。然而，其体内快速***性扩散、剂量限制性毒性和降解快，限制了其抗肿瘤效率。目前的纳米技术着重于通过延长2′，3′-cGAMP释放发挥持久抗肿瘤作用。值得注意的是，脂质体本身具有在给定部位缓慢释放封装药物的能力。因此，载2′，3′-cGAMP脂质体可优化2′，3′-cGAMP免疫激活和抗肺腺癌作用。

氧化应激(外源性和内源性)通过产生大量的活性氧(ROS)，在细胞命运和疾病的平衡中起着关键的作用。超过正常生理量的ROS在癌症和其他疾病状态的病理生理学中起着关键的作用。例如，500μM过氧化氢(H₂O₂，一种强有力的ROS诱导剂，使细胞处于高度氧化应激状态)诱导肺癌细胞凋亡，导致肺部损伤。抗炎的细胞凋亡和促炎性细胞坏死，代表了细胞死亡的两个方式。坏死细胞释放免疫原性物质，特别是炎症细胞因子I型IFN(IFN-I)，称为损伤相关分子模式(DAMPs)。然而，DAMPs可以在细胞凋亡过程中以依赖caspase的方式失活，同时凋亡过程中伴随着cGAS的裂解和IFNI的下调，从而使细胞死亡保持免疫沉默。因此，可利用载STING激动剂2′，3′-cGAMP脂质体(STING-Lip)通过激活cGAS-STING途径诱导IFN的表达，重建免疫反应，因此STING-Lip可能是克服氧化应激诱导的凋亡相关免疫耐受的一个新方案。目前尚无利用此载2′，3′-cGAMP脂质体克服氧化应激诱导的凋亡相关免疫耐受，从而克服肺腺癌免疫检查点抑制剂(ICB)耐药的技术。

目前的纳米技术如纳米凝胶等多着重于通过延长2′，3′-cGAMP释放发挥持久抗肿瘤作用，但不同肿瘤细胞状态对2′，3′-cGAMP的反应不同。氧化应激是癌症的特征之一，促进ROS诱导的免疫抑制和诱导细胞凋亡。Caspase介导的细胞凋亡可抑制STING相关信号激活，以及诱导免疫抑制性抗炎细胞因子，如转化生长因子(TGF)-β和IL10分泌，从而介导免疫抑制。此外，正如大多数肺癌患者，种植肺腺癌(Lewis)的小鼠对ICB的反应率低。因此，氧化应激诱导的lewis凋亡细胞的天然、强大的免疫耐受潜力再现了在大多数肺癌患者中观察到的对免疫治疗的不良临床反应，使其成为免疫治疗耐药相关研究的理想平台。然而，目前缺乏针对该氧化应激诱导免疫耐受状态的新型载2′，3′-cGAMP脂质体。

因此，本发明旨在提供一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂及制备方法与应用，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂及制备方法与应用，该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂具有稳定性好、递送效率高、生物活性高且毒性低等优点，在激活***性免疫，克服氧化应激诱导的免疫抑制，发挥抗肺腺癌作用等方面具有重要的潜在应用价值。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，所述脂质体纳米制剂为由薄膜分散法在超声作用下包封2′，3′-cGAMP的脂质体；由通过旋蒸法将脂质体溶液吹干制得薄膜；所述薄膜的制备原料包括棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

进一步地，所述棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为：12：7：1。

进一步地，所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于以雾化吸入方式给药的免疫增强制剂的制备。

进一步地，所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于克服氧化应激诱导的免疫耐受的免疫增强制剂的制备。

进一步地，所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于通过无创性方式被吸收治疗肺转移瘤的药物制备。

进一步地，所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于对模拟临床实际状态的氧化应激诱导的免疫抑制小鼠模型进行验证。

本发明还提供一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、由棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)按照12：7：1摩尔比的比例混合成脂质体溶液；

S2、采用旋蒸法将脂质体溶液吹干，使磷脂在圆底烧瓶瓶壁上形成薄膜；

S3、将圆底烧瓶置于真空烘箱中，抽真空12小时以确保残余溶剂完全挥发；然后向圆底烧瓶中加入2′，3′-cGAMP溶液，超声作用后即得包封2′，3′-cGAMP的脂质体。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、在本发明的载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂中，棕榈酰磷脂酰胆碱是一种天然存在的肺部表面活性剂，能降低肺泡的气液界面的表面张力，从而防止肺泡塌陷，从而有利于穿过肺泡粘膜屏障，从而便于该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂可以到达肺上皮组织，具有无创性治疗肺转移瘤潜能；

2、本发明的载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂可通过吸入给药，具有治疗肺转移瘤潜能；

3、本发明的载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂具有稳定性好、递送效率高、生物活性高且毒性低等优点，可通过增强***性免疫反应，发挥逆转氧化应激下肺腺癌免疫抑制状态的作用。

附图说明

图1是本发明实施例中该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂到达肺上皮组织靶向肺部肿瘤组织的原理示意图；

图2是本发明实施例中该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂作用于小鼠模型的原理示意图；

图3是本发明实施例中H₂O₂处理的Lewis荷瘤小鼠模型的数据图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

实施例：

一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，该脂质体纳米制剂为由薄膜在超声作用下包封2′，3′-cGAMP的脂质体；该薄膜由通过旋蒸法将脂质体溶液蒸干制得；该薄膜的制备原料包括棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

其中，棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为：12：7：1。

其中，该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于以雾化吸入方式给药的免疫增强制剂的制备。

其中，该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于克服氧化应激诱导的免疫耐受的免疫增强制剂的制备。

其中，该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于通过无创性方式被吸收发挥治疗肺转移瘤。

其中，该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于对模拟临床实际状态的氧化应激诱导的免疫挠首小鼠模型进行验证。图2为该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂作用于小鼠模型的原理示意图。

该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂的制备方法包括以下步骤：

S3、将圆底烧瓶置于真空烘箱中，抽真空12小时以确保残余溶剂完全挥发；然后向圆底烧瓶中加入2′，3′-cGAMP溶液，水浴超声和探头超声作用后即得包封2′，3′-cGAMP的脂质体。

在本实施例中，该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂中的棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoyl-phosphatidylcholine,DPPC)是一种天然存在的肺部表面活性剂，能降低肺泡的气液界面的表面张力，从而防止肺泡塌陷，从而有利于穿过肺泡粘膜屏障。因此，以DPPC为主要成分的脂质体可以到达肺上皮组织靶向肺部肿瘤组织。其中，图1为该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂到达肺上皮组织靶向肺部肿瘤组织的原理示意图。

此外，目前的纳米技术如纳米凝胶等多着重于通过延长2′，3′-cGAMP释放发挥持久抗肿瘤作用，但不同肿瘤细胞状态对2′，3′-cGAMP的反应不同。氧化应激是癌症的特征之一，促进ROS诱导的免疫抑制和诱导细胞凋亡。Caspase介导的细胞凋亡可抑制STING信号激活，以及诱导抗炎细胞因子，如转化生长因子(TGF)-β和IL10分泌，从而介导免疫抑制。正如大多数肺癌患者，种植肺腺癌(Lewis)的小鼠对ICB的反应率低。因此，氧化应激诱导的lewis凋亡细胞的天然、强大的免疫耐受潜力再现了在大多数肺癌患者中观察到的对免疫治疗的不良临床反应，使其成为免疫治疗的理想平台。然而，目前缺乏针对该氧化应激诱导免疫耐受状态的新型2′，3′-cGAMP脂质体。

并且，目前现有的纳米技术如纳米凝胶等多着重于通过延长2′，3′-cGAMP释放发挥持久抗肿瘤作用，并且现有技术中多为肿瘤内和静脉内药物注射等侵入性操作。然而肺转移瘤以多发为主，并且由于呼吸运动以及肺部邻近心脏大血管等生理屏障，肺转移瘤瘤内给药风险大，可操作性小。静脉给药到达肺部的药物浓度不足。

因此，本发明实施例中该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂可通过吸入给药，能够用于肺转移瘤(STING1激动剂抑制了H₂O₂处理的Lewis荷瘤小鼠模型中的皮下移植瘤生长，为了建立体内H₂O₂处理的Lewis荷瘤小鼠模型，将未处理的和H₂O₂处理的LLC细胞按1:1的比例混合，并注射到C57BL/6J小鼠皮下(图2)。透射电子显微镜显示了2′，3′-cGAMP脂质体典型的球形形态(平均直径，约100nm)，多分散指数为0.097(图3A)。11天后，含H₂O₂处理的细胞肿瘤体积比H₂O₂未处理的肿瘤体积大(P＝0.035；图3B)。2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂有抑制H₂O₂处理的Lewis远端瘤生长趋势(P＝0.212[两次注射2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂][图3C]。H₂O₂促进了Lewis的生长，2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂抑制了H₂O₂诱导的Lewis荷瘤小鼠体内生长)。

关于该载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂激活***性免疫方面：

采用H₂O₂诱导的鼠源性肺腺癌细胞Lewis细胞，将其与未处理Lewis细胞按照1：1比例混合并接种C57BL/6小鼠，形成皮下移植瘤，瘤内注射载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂并收集小鼠脾脏，CBA实验显示相比于对照组，H₂O₂处理组脾脏中的IFN-β/γ/CCL5/CXCL9/10/CXCR3的水平低，CCL2的水平较高。

H₂O₂处理的Lewis皮下移植瘤组织免疫微环境的特点是CD3+T(P＝0.001)和CD8+(P<0.001)T细胞减少，骨髓源性抑制细胞(MDSC)(P＝0.044)比例增加；与单独H₂O₂相比，载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂有逆转免疫耐受状态，包括减少MDSC、增加CD3+和CD8+T细胞比例增加的趋势。STING1的激活将Lewis远端瘤免疫耐药的微环境重新编程为一个免疫激活的肿瘤微环境。

在本发明的上述实施例中，本发明的载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂具有稳定性好、递送效率高、生物活性高且毒性低等优点，可通过增强***性免疫反应，发挥逆转氧化应激下肺腺癌免疫抑制状态的作用。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，其特征是：所述脂质体纳米制剂为通过薄膜水化法制备得到的装载2′，3′-cGAMP的脂质体；所述薄膜由通过旋蒸法将脂质体溶液吹干制得；所述薄膜的制备原料包括棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

2.根据权利要求1所述的一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，其特征是：所述棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为：12：7：1。

3.根据权利要求1至2任意一项所述的一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，其特征是：所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于以雾化吸入方式给药的免疫增强制剂的制备。

4.根据权利要求1至2任意一项所述的一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，其特征是：所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于克服氧化应激诱导的免疫耐受的免疫增强制剂的制备。

5.根据权利要求1至2任意一项所述的一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，其特征是：所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于通过无创性方式被吸收治疗肺转移瘤的药物的制备。

6.根据权利要求1至2任意一项所述的一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂，其特征是：所述载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂应用于对模拟临床实际状态的氧化应激诱导的免疫抑制小鼠模型进行验证。

7.根据权利要求1至2任意一项所述的一种载2′，3′-cGAMP脂质体纳米制剂的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

S1、由棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)按照12：7：1摩尔比的比例混合成氯仿溶液；

S2、采用旋蒸法将脂质体溶液吹干，使磷脂在圆底烧瓶瓶壁上形成均匀薄膜；

S3、将圆底烧瓶置于真空烘箱中，抽真空12小时以确保残余溶剂完全挥发；然后向圆底烧瓶中加入含2′，3′-cGAMP PBS溶液，水浴超声(37℃，5分钟)和探头超声(150W，10分钟)作用后即得包载2′，3′-cGAMP的脂质体。