CN106661636A

CN106661636A - 衔接子连接的扩增子的制备

Info

Publication number: CN106661636A
Application number: CN201580045347.0A
Authority: CN
Inventors: 方南; 德科·洛斐尔特
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-08-21
Publication date: 2017-05-10
Also published as: EP3189157A1; AU2015311099A2; EP3842544A1; EP3330386A1; AU2015311099A1; JP2017525369A; WO2016034433A1; US10648031B2; US20180057876A1; US20170283869A1

Abstract

本发明涉及分别用于制备衔接子连接的扩增子或靶DNA的测序文库的新颖方法和试剂盒。

Description

衔接子连接的扩增子的制备

本发明涉及分别用于制备衔接子连接的扩增子或靶DNA的测序文库的新方法和试剂盒。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地分别涉及衔接子连接的扩增子的制备，并且特别地涉及靶DNA的测序文库的制备。

背景技术

现代分子生物学技术中的许多应用需要衔接子连接的扩增的DNA片段。例如，衔接子连接的扩增子构成预期用于测序分析的靶DNA的文库。例如通过聚合酶链反应(PCR)对DNA样品中的靶区域进行扩增程序。随后将由PCR产生的扩增子连接到衔接子分子。然后对衔接子连接的扩增子或靶DNA片段进行测序反应。因此，DNA衔接子分子可具有对测序引物具特异性的核苷酸序列。衔接子连接的扩增子的所得群体被称为所谓的文库，特别是扩增子测序文库。

目前，有几种常见的产生扩增子测序文库的方法。

一种方法使用常规的多步酶促反应将衔接子连接到扩增子。这种方法例如公开于Illumina Manual,“Mate Pair Library Preparation”,2009中。扩增子通过PCR由靶特异性引物产生，然后进行末端修复。所述末端修复步骤通常需要两种酶：多核苷酸激酶，通常是T4多核苷酸激酶(PNK)，其分别将双链扩增子或PCR产物的5'端磷酸化；和具有聚合酶和核酸外切酶活性的酶，其使PCR产物的末端通过任一种填充和修整反应而钝化。在末端修复步骤之后，为了在一些平台(例如由提供的那些平台)上测序，所谓的A添加步骤需要添加腺嘌呤核苷酸。在该步骤中，例如通过克列诺片段(Klenow fragment)exo-(具有5'→3'聚合酶活性但缺乏3'→5'核酸外切酶活性和5'→3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的大片段)，将A突出端添加到末端修复的PCR产物的3'端。这是为了产生具有由胸苷核苷酸形成的突出端即T突出端的测序衔接子的对接侧。在A添加后，可以通过DNA连接酶(通常是T4DNA连接酶)将所述测序衔接子连接到扩增子。对于其它测序平台，例如来自Life的那些，例如Ion Torrent PGM或Proton、SOLid，无需A添加步骤并且将钝端衔接子直接连接到末端修复的扩增子。

另一种文库制备方法是使用含有靶特异性序列和一部分衔接子序列的融合引物。在第一轮PCR和靶特异性区域的扩增后，可以利用含有完整衔接子序列的引物进行第二轮PCR以将所述衔接子序列添加到扩增子。

文献WO 2009/072972公开了用于将dsRNA衔接子分子酶促连接到dsRNA分子的方法。

本领域中的所有这些方法都是繁琐和耗时的。此外，使用融合引物的方法也可以对合适PCR引物的设计产生挑战，所述PCR引物应该在相同的多重PCR反应中扩增数百到数千个扩增子，而不产生大量的非特异性产物。

在这种背景下，本发明的目的是提供一种制备衔接子连接的扩增子的方法，其中可以减少或避免与现有技术方法相关的问题。本发明的另一个目的是提供一种制备靶DNA的测序文库的改进方法。

本发明满足这些和其它需求。

发明内容

本发明提供一种制备衔接子连接的扩增子的方法，其包括以下步骤：

(i)使双链扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，

(ii)在同时允许以下的条件下温育所述反应混合物以获得衔接子连接的扩增子：

-通过所述多核苷酸激酶进行所述双链扩增子的5'磷酸化，和

-通过所述DNA连接酶将所述DNA衔接子分子与所述双链扩增子的至少一个末端接合。

本发明还提供一种制备靶DNA的测序文库的方法，其包括以下步骤：

(i)在产生所述靶DNA的双链PCR扩增子的条件下对所述靶DNA进行PCR，

(ii)使所述双链PCR扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，

(iii)在同时允许以下的条件下温育所述反应混合物以获得所述靶DNA的测序文库：

-通过所述多核苷酸激酶进行所述双链PCR扩增子的5'磷酸化，和

-通过所述DNA连接酶将所述DNA衔接子分子与所述双链PCR扩增子的至少一个末端接合。

本发明人已惊奇地认识到，在通过扩增方法扩增靶DNA后，所得扩增子可以在一个步骤中直接与衔接子分子例如测序平台特异性衔接子连接，而无需中间修饰步骤，特别是消除了耗时且低效的通常需要的末端修复和A添加步骤。

因此，在制备衔接子连接的扩增子的方法的步骤(i)中以及在制备靶DNA的测序文库的方法的步骤(ii)中，双链扩增子以从前面的扩增反应直接得到的构型提供，而没有后续的3'和/或5'端的化学修饰，即没有后续添加或去除核苷酸(例如腺嘌呤或胸苷核苷酸)、磷酸酯基团等。

根据本发明的方法将允许在仅一个步骤中产生衔接子连接的扩增子或靶DNA的测序文库，并且将显著减少工作时间。获得的衔接子连接的DNA扩增子然后可用于常规平台中，例如用于下一代测序(NGS)。

如本文所用，“双链扩增子”是指作为通过分子扩增方法如聚合酶链反应(PCR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、切口酶扩增反应(NEAR)进行的DNA扩增的来源或产物的一段DNA。在本文中，“扩增”是指基因片段或靶序列、特别是扩增子的一个或多个拷贝的产生。扩增反应的产物(扩增子)与常用的实验室术语例如扩增产物可互换使用。

如本文所用，“靶DNA”是指可进行扩增方法以产生双链扩增子的任何相关双链DNA(dsDNA)。“靶DNA”可以来自任何体内或体外来源，包括来自一种或多种细胞、组织、器官或生物体，无论是活的还是死的，无论是原核的还是真核的，或来自任何生物或环境来源。通常但不排他地，“靶DNA”是指所述dsDNA，通过测序例如NGS阐明的核苷酸序列。

如本文所用，“测序文库”分别是靶DNA片段或靶DNA扩增子的集合。通常所述集合可通过分子克隆过程在微生物群体中储存和繁殖。术语“文库”还可以指群体或生物体，其中的每一个都携带***克隆载体中的靶DNA片段，或者可选地指所有克隆的载体分子的集合。根据本发明，所述文库意在用于后续的测序反应中以阐明靶DNA的核苷酸序列。

如本文所用，“激酶”是一类从高能量供体分子如ATP转移磷酸酯基团(两种特定底物，称为磷酸化的过程)的酶。“多核苷酸激酶”是指具有多核苷酸作为其底物(例如DNA或RNA)，但也能够将寡核苷酸或单核苷酸磷酸化的激酶。突出的多核苷酸激酶的实例是T4噬菌体的产物，即T4多核苷酸激酶。

如本文所用，“连接酶”代表可以催化两个大分子通过形成新的化学键(通常伴随着依赖于较大分子之一的小化学基团的水解)而接合的酶，或催化两种组分连接在一起的酶，例如催化C-O、C-S、C-N等的接合的酶。“DNA连接酶”是指通过催化磷酸二酯键的形成而促进DNA链接合在一起的酶。适当的DNA连接酶的实例涵盖大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶、T4DNA连接酶、DNA连接酶I、DNA连接酶III、DNA连接酶IV等。

如本文所用，“DNA衔接子分子”是指能够接合到DNA片段的一个或两个末端的双链(ds)DNA分子。通常，“DNA衔接子分子”具有约5至100bp的长度。如在根据本发明的方法的步骤(i)或(ii)中提供的DNA衔接子分子的构型取决于扩增子的构型。如果扩增子以钝端构型提供，则DNA衔接子分子可为钝端的。如果由扩增反应产生的扩增子具有添加到各链的3'和/或5'末端的互补性突出端，则DNA衔接子分子可包含添加到各链的3'和/或5'末端的核苷酸突出端。示例性突出端分别是由一个或多个胸苷核苷酸组成的DNA衔接子分子所包含的T突出端，和由一个或多个腺嘌呤核苷酸组成的扩增子所包含的互补性A突出端。

如本文所用，“至少一个”是指可使用多于一个的元件。例如，本发明可包含两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种不同的元件，例如激酶、连接酶、聚合酶等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。

其中通过所述DNA连接酶进行双链扩增子的5'磷酸化和通过所述DNA连接酶将所述DNA衔接子分子与所述双链扩增子的至少一个末端接合的条件是本领域技术人员众所周知的。这些条件提供了允许多核苷酸激酶发挥其酶促活性并且同时DNA连接酶发挥其酶促活性的环境。此外，这些条件确保扩增子、多核苷酸激酶、DNA连接酶和DNA衔接子分子将能够相互作用，从而允许形成衔接子连接的扩增子。优选地，通过存在磷酸酯供体如NTP、特别是ATP、盐和离子如Mg⁺⁺等来实现这些条件。一些连接酶也可能需要NAD作为辅因子。

衔接子连接的扩增子的制备还包括产生衔接子连接的扩增子的文库的概念，其中扩增子由片段化靶DNA的扩增产生。经过扩增且衔接子连接的靶DNA可用于随后的分析，例如DNA测序。因此，衔接子连接的扩增子可形成靶DNA的测序文库。

因此完全解决了本发明的基本目的。

如本说明书中所述的本发明的特征、特性和实施方式相应地适用于制备衔接子连接的扩增子的方法以及制备靶DNA的测序文库的方法。

根据本发明方法的一个实施方式，所述双链扩增子是双链PCR扩增子。

该方法的优点是采用了一种完善的扩增方法，其属于大多数分子生物学实验室的标准工具。“PCR扩增子”是指通过使用聚合酶链反应(PCR)产生的扩增产物。术语“PCR扩增子”可以与“PCR产物”互换使用。

根据本发明方法的一个实施方式，所述双链PCR扩增子是由使用包含末端腺苷酰转移酶活性的DNA聚合酶的PCR产生的。

该方法的优点是：本发明人利用DNA聚合酶的末端腺苷酰转移酶活性在双链PCR扩增子上、优选在各链的3'端产生A突出端。因而在后续的接触步骤(i)或(ii)中提供的DNA衔接子分子可包含T突出端，优选在各链的3'端。包含A突出端的双链PCR扩增子然后将与包含T突出端的DNA衔接子分子杂交。与DNA衔接子分子杂交的双链PCR扩增子然后将通过连接反应彼此共价结合。

根据本发明方法的一个优选实施方式，包含末端腺苷酰转移酶活性的所述DNA聚合酶选自：Taq聚合酶、克列诺片段、TopTaq聚合酶、Tfl聚合酶、Tma聚合酶、Tne聚合酶和Tth聚合酶。

该方法的优点是提供了这种DNA聚合酶，其已被证明适合于实现本发明。

根据本发明的一个优选实施方式，所述DNA衔接子分子包含T突出端。

在本文中，“T突出端”是指添加到DNA衔接子分子的各链的3'和或5'末端的至少一个或多个胸苷核苷酸。根据一个优选实施方式，T突出端位于3'末端，即一个或多个胸苷核苷酸添加到DNA衔接子分子的3'端。由于T突出端，所述DNA衔接子分子能够与具有互补性腺嘌呤核苷酸的相应突出端即A突出端的DNA片段例如所述双链扩增子杂交。所述A突出端可位于DNA片段或双链扩增子的各链的3'或5'末端。在另一个优选实施方式中，A突出端分别位于DNA片段或扩增子的各链的3'末端。在DNA连接酶存在下，DNA片段或扩增子分别与DNA衔接子分子连接在一起，产生衔接子连接的扩增子。

根据本发明方法的一个实施方式，所述多核苷酸激酶选自：T4多核苷酸激酶、T4多核苷酸激酶(3'磷酸酶活性缺失(3'phosphatase minus))。

该方法的优点是使用这样的多核苷酸激酶，其可以被证明特别适合于本发明。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，所述DNA连接酶选自T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶和9°N DNA连接酶。

该方法的优点是提供这种DNA连接酶，其已经被证明提供最佳结果。

根据本发明方法的另一个优选实施方式，所述DNA衔接子分子是测序DNA衔接子分子，优选是用于下一代测序(NGS)的DNA衔接子分子。

该方法的优点是，所得衔接子连接的扩增子提供的构型允许在常规测序平台上优选在NGS情形内后续阐明核苷酸序列。

在根据本发明方法的另一个优选实施方式中，在制备衔接子连接的扩增子的方法的步骤(i)中，或在制备靶DNA的测序文库的方法的步骤(ii)中，通过将所述双链扩增子、所述至少一种多核苷酸激酶、所述至少一种DNA连接酶和所述DNA衔接子分子置于一个单独的反应容器中来实现所述接触。

该方法的优点是，它体现了“一步”法的原则。即使根据本发明的方法可以分别细分成接触步骤和温育步骤，但该细分仅意在示出方法事件的时间顺序。然而，该方法的使用者只需要在规定的条件下产生反应混合物。在温育时间跨度后，自动产生衔接子连接的扩增子或靶DNA的测序文库，即实际上在一个步骤中。特别地，不需要对双链扩增子进行先前的修饰步骤，例如末端修复和A添加步骤。

在根据本发明方法的另一个实施方式中，在制备衔接子连接的扩增子的方法中的步骤(ii)之后，或在制备靶DNA的测序文库的方法的步骤(iii)之后，进行以下步骤(iii)或(iv)：分离衔接子连接的扩增子。

该方法的优点是，衔接子连接的扩增子在允许后者直接进行测序反应的条件下提供。在本文中，“分离”是指通过除去反应物如所涉及的酶、盐、反应缓冲剂、杂质等来纯化衔接子连接的扩增子，并在确保长期储存或后续反应的条件下提供扩增子。

本发明的另一种主题物涉及用于制备衔接子连接的扩增子的试剂盒，其包括：

(i)至少一种多核苷酸激酶，

(ii)至少一种DNA连接酶，

(iii)DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

(iv)反应缓冲剂，其被配置以同时允许所述至少一种多核苷酸激酶和所述至少一种DNA连接酶的酶功能，和

(v)手册，其用于执行根据本发明用于制备衔接子连接的扩增子的方法。

本发明的另一种主题物涉及用于制备靶DNA的测序文库的试剂盒，其包括：

(i)至少一种DNA聚合酶，其优选包含末端腺苷酰转移酶活性，

(ii)至少一种多核苷酸激酶，

(iii)至少一种DNA连接酶，

(iv)DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

(v)PCR缓冲剂，

(vi)反应缓冲剂，其被配置以同时允许所述至少一种多核苷酸激酶和所述至少一种DNA连接酶的酶功能，和

(vii)手册，其用于执行根据本发明用于制备靶DNA的测序文库的方法。

本领域技术人员能够容易地确定反应缓冲剂的组成，例如基于常规多核苷酸激酶缓冲剂和DNA连接酶缓冲剂，并且如果适用的话，单独调整组分。在一系列实验中，可以确定两种酶在特定反应缓冲剂中的单独活性，从而允许鉴定两种酶均正常工作的最佳缓冲剂组合物。这种反应缓冲剂可含有磷酸酯供体，例如NTP，特别是ATP、盐和离子，例如Mg⁺⁺等。一些连接酶也可能需要NAD作为辅因子。合适的反应缓冲剂的实例是美国马萨诸塞州比弗利的快速连接缓冲液，其包含最终浓度66mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT、1mMATP、7.5％PEG 6000(pH 7.6，在25℃下)。

根据本发明的方法的特征、特性、优点和实施方式相应地适用于根据本发明的试剂盒。

不言而喻，上述特征和下面仍然要解释的特征不仅可以在各自指定的组合中使用，而且可以在其它组合中使用或单独使用，而不脱离本发明的范围。

从优选实施方式和附图的描述中得出其它特征、特性和优点。

附图说明

图1示出根据本发明的衔接子连接的PCR扩增子或扩增子测序文库的一步构建方案。

图2示出呈现第一说明实验的结果的图。在所有四个样品中，IL1R2扩增子以相似的量存在(A)。与T4DNA连接酶和T4PNK的反应使得测序衔接子直接连接到扩增子(B)。

图3示出说明用于Gene Read^TM DNAseq targeted panels扩增子测序的标准实验室制备构建工作的方案(A)，和根据本发明用于Gene Read^TM DNAseq targeted panels扩增子测序的一步文库制备构建工作流程(B)。

图4示出第二说明实验的结果。已证明，用根据本发明的标准或一步法产生的测序文库显示相似的尺寸分布模式。

具体实施方式

实施例

1.本发明的原理

本发明的目的是在用于扩增子测序的下一代文库制备工作流程中避免繁琐和耗时的末端修复和A添加步骤。本发明人利用PCR聚合酶的末端腺苷酰转移酶活性以在PCR期间在扩增子的3'端产生A突出端。在PCR后，对所述扩增子进行组合的磷酸化和连接反应。在该反应中，将具有A突出端的扩增子与在各链的3'端含有T突出端的测序衔接子、多核苷酸激酶(PNK)如T4PNK、DNA连接酶混合，并在对所述连接酶和激酶起作用的反应缓冲剂中温育；参看图1。在该方案中，gDNA代表基因组DNA并且Pi代表无机磷酸酯残基。

2.实验测试1

为了证明本发明的原理，本发明人使用上述方法来进行使用Taq聚合酶的PCR，然后将扩增子直接连接到具有T突出端的TruSeq测序衔接子。简言之，利用各10ng的作为模板的人类基因组DNA、1x最终浓度的HotStar Plus Master Mix(含有化学修饰的Taq聚合酶)和各0.2μM的特异性识别人类IL1R2基因的PCR引物IL1R2F(Seq_1)和IL1R2R(Seq_2)，建立四个相同的50μl PCR反应。PCR循环条件如下：95℃，5分钟，用于初始变性；然后35个循环的94℃，30秒；60℃，30秒；和72℃，60秒；接着72℃，20分钟，用于最终延伸和A添加。一旦PCR完成，就用MinElute PCR纯化试剂盒提纯PCR反应并且将来自每个反应的PCR产物在20μl不含RNA酶的水中洗脱并汇集在一起。然后对一式两份的19μl的纯化PCR产物(样品1和样品2)进行组合的磷酸化和与以下各物的连接反应：1x快速连接缓冲液1μM的通过将两个寡核苷酸粘接以形成双链体而产生的测序衔接子(IDT，Seq_3和Seq_4)、3μl的T4DNA连接酶(T4DNA快速连接酶，600U/μl，)和2μl的T4多核苷酸激酶(T4PNK，10U/μl，New England)。对另外一式两份的19μl的纯化PCR产物(样品3和样品4)进行仅与上述组分但没有T4多核苷酸激酶的连接反应；参看表1。所有四个反应具有50μl的反应体积并且在室温下进行30分钟。

	连接酶	T4PNK	利用文库引物的Ct	利用IL1R2引物的Ct
					样品1	是	是	13.96	8.07
样品1	是	是	13.18	7.96
					样品2	是	是	13.83	7.7
样品2	是	是	14.05	7.75
					样品3	是	否	未检测到	8.16
样品3	是	否	未检测到	8.05
					样品4	是	否	未检测到	7.79
样品4	是	否	未检测到	8.02

表1：可以用识别衔接子序列或IL1R2扩增子序列的qPCR引物检测到的连接产物(样品1至样品4)的Ct值。

在连接反应后，用MinElute PCR纯化试剂盒纯化产物并在20μl的不含RNA酶的水中洗脱。将洗脱液用不含RNA酶的水以1:1000稀释并在定量实时PCR中用作模板，以检测连接产物的存在或不存在。使用两组引物：一组引物(文库引物F和文库引物R)识别衔接子序列(Seq_5和Seq_6)；另一组引物与用于产生IL1R2扩增子并识别所有IL1R2扩增子序列(Seq_1和Seq_2)者相同。特异性识别内部IL1R2扩增子序列的具有5'FAM标签(Seq_7)的TaqMan探针分别与文库引物或IL1R2引物组合使用以定量衔接子连接的扩增子或总IL1R2扩增子的量。利用QuantiFast探针PCR混合物(1x最终浓度)、0.4μM的各引物、0.2μM的TaqMan探针和2μl的来自样品1至样品4的稀释连接产物建立qPCR反应。在Rotorgene实时PCR循环仪上利用以下循环条件进行qPCR：95℃，3分钟；和40个循环的95℃，3秒；60℃，30秒。

这个实验的结果示于图2和表1中。所有四个样品(一式两份)在利用IL1R2引物的qPCR中显示相似的Ct值，表明相似量的总IL1R2扩增子；图2A。然而，仅样品1和样品2(其中在连接反应中存在T4PNK)在利用文库引物F和R的qPCR反应中显示具有低Ct值的阳性信号，而样品3和样品4(其中不存在T4PNK的连接反应)利用文库引物F和R不产生可检测的qPCR产物；图2B。

结果肯定地证明了可以在PCR后直接利用一步组合磷酸化和连接步骤成功地且快速地制备下一代扩增子测序文库的原理，从而消除了本领域中通常使用的耗时和易错的多个酶步骤。

3.实验测试2

本发明人进一步用使用GeneRead^TM DNAseq Targeted Panel的扩增子测序实验证明了本发明的原理。GeneRead^TM DNAseq Targeted Panel使用多重PCR来选择性扩增相关基因的外显子。在多重PCR后，扩增子需要与平台特异性测序衔接子连接以进行测序。

用于在平台上进行靶扩增子测序的标准文库构建方法涉及三个酶步骤：末端修复、A添加和连接，以及多个提纯和尺寸选择步骤以除去非特异性副产物。还包括连接后的PCR步骤以扩增测序文库；参看图3A，也参见GeneRead^TM DNAseqTargeted Panels V2手册。

本发明人比较了根据本发明的一步文库构建方法与标准文库构建方案的性能。根据本发明的一步法在图3B中概述。具体地，将来自匿名供体的人类基因组DNA(gDNA)用作模板并用GeneRead^TM Human Carrier Panel V2(目录#NGHS-011X)扩增。在多重PCR后，对扩增子进行标准文库制备工作流程(‘对照’)或根据本发明的一步文库制备方案(‘一步’)。利用一步方案，利用3μl的T4DNA连接酶(T4DNA快速连接酶，600U/μl，)和2μl的T4多核苷酸激酶(T4PNK，10U/μl，New England)在最终体积为90μl的1x快速连接缓冲液中将纯化的PCR产物直接连接到衔接子。具有组合的磷酸化和连接的一步反应在室温下进行30分钟。在生物分析仪上用高灵敏度DNA芯片表征两种测序文库。

如图4中所示，利用标准方法(‘对照’)和根据本发明的一步法(‘一步’)构建的文库具有非常相似的尺寸分布模式。

然后在miSeq仪器上使用双层300nt流动池和miSeq Reagent试剂盒V2(300)对两个文库进行测序。将具有2×150nt阅读长度的配对末端测序模式用于操作。利用GeneRead Targeted Exon Enrichment Panel数据分析工具来分析数据。

扩增子测序质量的指标总结在表2中，并且证明了用标准方法(‘对照’)和根据本发明的新颖一步法(‘一步’)产生的扩增子测序文库的良好测序质量。如表2中所示，基于诸如以下指标：总读数、与靶区域和对照扩增子比对的读数的百分比、在中值>＝20％下覆盖的碱基百分比、在>＝10X、30X或100X覆盖率下覆盖的碱基百分比以及平均和中值覆盖率，通过标准方法和根据本发明的新颖方法产生的文库提供了类似的良好测序结果。

表2：利用标准方法(‘对照’)或一步法(‘一步’)产生的扩增子测序文库的测序质量指标。

4.结论

总之，根据本发明的新颖的一步扩增子测序文库制备方法已经证明在产生具有良好质量的测序文库中是有效的。此外，所述一步法也显著简化了文库制备工作流程，并且可以通过去除方案中的多重酶法和处理步骤而潜在地减少变化。

序列

Seq_1:5'-cgg gta ggc gct ctc tat gt-3'

Seq_2:5'-aag act gac aat ccc gtg taa gg-3'

Seq_3:

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*G-3'(*：表示硫代磷酸酯)

Seq_4:

5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTT*G-3'(*：表示硫代磷酸酯)

Seq_5:5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'

Seq_6:5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'

Seq_7:5'-FAM-tgctgtggtggacggccaatga-TAMRA-3'(FAM代表6-羧基荧光素；TAMRA代表四甲基罗丹明)。

序列表

<110> 凯杰有限公司（QIAGEN GmbH）

<120> 衔接子连接的扩增子的制备（Preparation of Adapter-ligated PCRAmplicons）

<130> SCT170395-10

<160> 7

<170> BiSSAP 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequences

<220>

<221> source

<222> 1..20

<223> /mol_type="DNA"

/note="PCR primer"

/organism="artificial sequences"

<400> 1

cgggtaggcg ctctctatgt 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequences

<220>

<221> source

<222> 1..23

<223> /mol_type="DNA"

/note="PCR primer"

/organism="artificial sequences"

<400> 2

aagactgaca atcccgtgta agg 23

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> artificial sequences

<220>

<221> source

<222> 1..58

<223> /mol_type="DNA"

/note="sequencing adapter"

/organism="artificial sequences"

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> artificial sequences

<220>

<221> source

<222> 1..63

<223> /mol_type="DNA"

/note="sequencing adapter"

/organism="artificial sequences"

<400> 4

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt caccttgtaa tctcgtatgc cgtcttctgc 60

ttg 63

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequences

<220>

<221> source

<222> 1..20

<223> /mol_type="DNA"

/note="PCR primer"

/organism="artificial sequences"

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequences

<220>

<221> source

<222> 1..21

<223> /mol_type="DNA"

/note="PCT primer"

/organism="artificial sequences"

<400> 6

caagcagaag acggcatacg a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequences

<220>

<221> source

<222> 1..22

<223> /mol_type="DNA"

/note="TaqMan probe"

/organism="artificial sequences"

<400> 7

tgctgtggtg gacggccaat ga 22

Claims

1.一种制备衔接子连接的扩增子的方法，其包括以下步骤：

(i)使双链扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，

-通过所述多核苷酸激酶进行所述双链扩增子的5'磷酸化，和

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述双链扩增子是双链PCR扩增子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述双链PCR扩增子由使用包含末端腺苷酰转移酶活性的DNA聚合酶的PCR产生。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA聚合酶选自：Taq聚合酶、克列诺片段、TopTaq聚合酶、Tfl聚合酶、Tma聚合酶、Tne聚合酶和Tth聚合酶。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA衔接子分子包含T突出端。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述多核苷酸激酶选自：T4多核苷酸激酶、T4多核苷酸激酶(3'磷酸酶活性缺失)。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA连接酶选自：T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶、Taq DNA连接酶和9°NDNA连接酶。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA衔接子分子是测序DNA衔接子分子，优选是用于下一代测序(NGS)的DNA衔接子分子。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于在步骤(i)中，通过将所述双链扩增子、所述至少一种多核苷酸激酶、所述至少一种DNA连接酶和所述DNA衔接子分子置于一个单独的反应容器中来实现所述接触。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于在步骤(ii)后，进行以下步骤：

(iii)分离衔接子连接的PCR扩增子。

11.一种制备靶DNA的测序文库的方法，其包括以下步骤：

(ii)使所述双链PCR扩增子与以下接触以获得反应混合物：

-至少一种多核苷酸激酶，

-至少一种DNA连接酶，和

-DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

-通过所述DNA连接酶进行所述双链PCR扩增子的5'磷酸化，和

12.一种用于制备衔接子连接的PCR扩增子的试剂盒，其包括：

(i)至少一种多核苷酸激酶，

(ii)至少一种DNA连接酶，

(iii)DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

(v)手册，其用于执行根据权利要求1至10中的任一项所述的方法。

13.一种用于制备靶DNA的测序文库的试剂盒，其包括：

(i)至少一种DNA聚合酶，其优选包含末端腺苷酰转移酶活性，

(ii)至少一种多核苷酸激酶，

(iii)至少一种DNA连接酶，

(iv)DNA衔接子分子，其优选包含T突出端，

(v)PCR缓冲剂，

(vii)手册，其用于执行根据权利要求9所述的方法。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶是Taq聚合酶。

15.根据权利要求10至12中的任一项所述的试剂盒，其特征在于所述多核苷酸激酶选自：T4多核苷酸激酶、克列诺片段、TopTaq聚合酶、Tfl聚合酶、Tma聚合酶、Tne聚合酶和Tth聚合酶，优选地所述DNA连接酶选自：T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶和9°N DNA连接酶。