CN103703147A - 扩增核酸以产生保守的和随机的产物的荧光标记的片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本文所公开的是用于鉴定微生物的菌种、血清型、和菌株的方法。还公开了用于在检测此类微生物中使用的引物和包括此类引物的试剂盒。

Description

扩增核酸以产生保守的和随机的产物的荧光标记的片段的方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2011年7月25日的美国临时申请序列号61/511,367的优先权，该专利申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明领域涉及使用随机扩增多态性DNA(RAPD)PCR的微生物鉴定的方法。
背景技术
使用短的、保守的核糖体引物来产生保守的rDNA片段和随机的扩增产物的实验方法见于美国专利5,753,467。通过对位于高度保守的rDNA序列之间的片段的长度和数量变化的表征，完成了在属和菌种的水平的微生物鉴定。鉴定的水平通过对微生物基因组的其它的随机区域的同时扩增被延伸至血清型和菌株的水平。这些随机的扩增事件被称为随机扩增多态性DNA(RAPD)。
该方法的优点是相同的引物的组被用于全部微生物菌种以产生扩增产物。由于这些引物的序列在原核生物体中是高度保守的，因此这些引物被普遍地应用。由于消除了筛选或根据推定的鉴定的必要性，因此实现了时间和费用的充分节省。
所述rDNA基因座是存在于原核细胞中的基因单元。保守的扩增靶标是存在于rDNA基因座的16S和23S区域之间的间隔区域的那些序列。这些靶标从邻近的16S和23S区域中的保守序列扩增。构成该基因座的核酸序列的主要部分是所有原核生物体共有的(图1显示了该基因座的一般性示意图)。该基因座的16S、23S、和5S区域的总体相关性已作为一种工具用于对原核生物的不同菌种进行分类。
美国专利5,753,467中描述的方法使用了长度为10-12个碱基的短引物。由这些引物产生的产物通过使用在琼脂糖或聚丙烯酰胺中的电泳分离而被分离。然后通过用溴化乙锭染色使片段可视化。在凝胶上样过程期间，PCR产物能够潜在地污染实验室环境。
发明内容
一个方面是关于用于鉴定微生物的菌种、血清型、和菌株的方法，所述方法包括：(a)使用长度为13-15个碱基的第一引物和长度为11-13个碱基的第二引物，通过PCR扩增包含散布在高度保守的rDNA序列之间的可变序列的DNA并且通过随机扩增多态性DNA(RAPD)PCR扩增其它的基因组序列，所述第一引物包含：(i)来自高度保守的16S rDNA区域的至少11个连续的碱基；和(ii)荧光标记；以及(b)分离步骤(a)中产生的扩增的DNA。
另一个方面是关于选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、以及它们的全长互补序列的分离的多核苷酸。
另外的方面是关于包括一组引物的试剂盒，所述引物包括用荧光团标记的SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的至少一个的PCR引物。
参见下文的详述，其他目标和优点对本领域的技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
图1是本文所公开的rDNA操纵子的示意图。
图2显示了就婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)而言，单独用6-FAM标记的17mers和用6-FAM标记的13和11mer引物组产生的PCR产物的电泳图谱。
生物序列简述
下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for PatentApplications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(WorldIntellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及经济和计划委员会(European Patent Convention)(EPC)和专利合作条约(PatentCooperation Treaty)(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822所示的规定。
SEQ ID NO：1是包含来自16S rDNA的11bp序列的正向引物。
SEQ ID NO：2是包含SEQ ID NO：1加上在5′末端处的两个额外核苷酸的正向引物。
SEQ ID NO：3是包含来自23S rDNA的11bp的反向引物。
SEQ ID NO：4是包含来自23S rDNA的13bp的反向引物。
SEQ ID NO：5是包含来自16S rDNA的17bp的正向引物。
SED ID NO：6是包含来自23S rDNA的17bp的反向引物。
具体实施方式
申请人特别地将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开中。此外，当量、浓度、或其他值或参数以范围、优选范围、或优选上限值和优选下限值的列表形式给出时，其应被理解为具体地公开由任何范围上限或优选数和任何范围下限或优选值的任何一对所构成的所有范围，而无论所述范围是否被单独地公开。凡在本文列出的某一数值范围之处，该范围都旨在包括其端值，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另外说明。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时所列的具体值。
在本公开中，使用了多个术语和缩写。除非另外特别说明，下面的定义适用。
如本文所用，涉及元素或组分的例子(即出现的事物)的数目在本发明元素或组分前的冠词“一个”、“一种”、和“所述”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”、“一种”和“所述”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
术语“包含”是指如权利要求中所提及的所述特征、整数、步骤、或组分的存在，但它不排除一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由...组成”和“由...组成”涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由...组成”旨在包括由术语“由...组成”涵盖的实施例。
如本文所用，修饰成分或反应物的量所使用的术语“约”是指可以通过例如下列方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的典型测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过在制备组合物或进行所述方法所使用的成分的制造、来源、或纯度方面的差异等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。
当存在时，所有范围是包括端值在内的且是可组合的。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应被视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2&4-5”、“1-3&5”等。
如本文所用，术语“扩增”包括用于复制靶标核酸，从而增加所选择的核酸序列的复制数的方法。扩增可以是指数的或线性的。靶标核酸可以是DNA或RNA。以这种方式扩增的序列形成“扩增子”。
术语“核酸”是指核糖核酸或脱氧核糖核酸的聚合物，包括RNA、mRNA、rRNA、tRNA、小核RNA、cDNA、DNA、PNA、RNA/DNA共聚物、或它们的类似物。核酸可以从细胞提取物、基因组(gDNA)或基因组外DNA、病毒RNA或DNA、或人工/化学合成的分子获得。
术语“互补的”是指核酸序列能够按照标准Watson-Crick互补规则碱基配对，或者能够在相对严格条件下与特定核酸片段杂交。核酸聚合物任选地仅在它们的完整序列的部分是互补的。
术语“靶标”、“靶标序列”、或“靶标核苷酸序列”是指其存在、不存在或丰度有待测定的特异性核酸序列。
如本文所用，用于扩增的“引物”是与靶标核苷酸序列互补并在DNA或RNA聚合酶的存在下引导核苷酸向所述引物的3′末端添加的寡核苷酸。对于最佳的表达和扩增，引物的3′核苷酸一般应当与靶标序列在对应的核苷酸位点处是相同的。如本文所用，术语“引物”包括可被合成的全部形式的引物，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸修饰的引物、被标记的引物等。如本文所用，“正向引物”是与dsDNA的反义链互补的引物。“反向引物”与dsDNA的有义链互补。引物的长度通常介于约10个和约100个核苷酸之间，优选长度介于约15个和约60个核苷酸之间，最优选长度介于约20个和约30个核苷酸之间。
对于靶标核酸而言，特异性的寡核苷酸(例如，探针或引物)将在适宜条件下与靶标核酸“杂交”。如本文所用，“杂交”或“使杂交”是指寡核苷酸单链与互补链在限定的杂交条件下通过碱基配对退火的过程。“特异性杂交”是两种核酸序列具有高度互补性的指征。特异性杂交复合物在自由退火条件下形成，并在任何后续洗涤步骤之后保持杂交的。核酸序列的自由退火条件通常可由本领域的普通技术人员确定，并且可在例如65℃下在约6×SSC的存在下发生。杂交的严格性可部分地根据进行洗涤步骤的温度来表示。对于在限定的离子强度和pH下的特异序列，此类温度通常被选择成比热解链温度(Tm)低约5℃至约20℃。一组优选的条件使用一系列洗涤，开始用6×SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2×SSC、0.5％SDS在45℃下重复洗涤30分钟，并接着用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组条件使用更高的温度，其中洗涤与上述相同，不同的是将最终两次用0.2×SSC、0.5％SDS洗涤30分钟的温度增加至60℃。另一种优选的一组严格杂交条件是0.1×SSC、0.1％SDS、65℃，并且用2×SSC、0.1％SDS洗涤，然后是0.1×SSC、0.1％SDS，65℃的最终洗涤。
术语“标记”是指任何可检测的部分。标记可被用于区分特定的核酸与其他未被标记的、或被不同标记的核酸，或者标记可被用于增强检测。
术语“样品”是指生物样品，例如唾液、粪便、尿液、血液、胃活体组织切片、胃肠组织、肿瘤细胞、粘液分泌物、牙斑、以及其他生物组织；肉类产品；食物产品；以及环境样品如土壤或水。
核酸检测
为了避免实验室环境污染的潜在危险，本发明方法需要使用荧光标记的引物。由这些引物产生的产物可以通过毛细管电泳直接检测。10至12个碱基的短荧光标记引物的使用存在困难，因为荧光部分的存在使得此类引物成为DNA聚合酶的不良底物。与保守序列具有100％同源性的较长引物不可以被代替，因为此类引物将仅扩增不含对于菌株水平的分化至关重要的随机引发模式元件的核糖体片段。
结合荧光标记的引物所需的最小长度是13个碱基。由于与核糖***点完全匹配的13-碱基引物仅扩增核糖体片段，因此有必要在荧光标记的引物的5’末端上使用2-碱基失配。由于仅最后11个碱基与核糖体序列匹配，因此此类引物能够同时扩增核糖体片段和随机的基因组片段两者。
更具体地，本发明方法包括使用长度为13-15个碱基的第一引物和长度为11-13个碱基的第二引物，通过PCR扩增包含散布在高度保守的rDNA序列之间的可变序列的DNA和通过RAPD PCR扩增其它的基因组序列。所述第一引物包含来自高度保守的16S rDNA区域的至少11个连续碱基和荧光标记。在第二步骤中，所述方法包括分离在扩增步骤中产生的扩增的DNA。
本文所述的方法在多种微生物的鉴定中是有用的。包括可通过本方法的使用得出的属、菌种和血清型的代表性而非详尽的许多类型的生物体是单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、新港沙门菌(Salmonella newport)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus scuiri)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、费格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、黑氏埃希氏菌(Escherichia hermanii)、伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、异型柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)。此类列表可形成此前被可视化的产物的数据库，当将其与根据本发明方法经电泳的、可视化的片段产物比较时，提供了对这些菌种(以及血清型和菌株，如果适用的话)的鉴定。
本领域的技术人员将容易地理解，本发明方法可在很多种环境的情况下应用于微生物。因此，本发明的优选的用途是食品中的微生物的鉴定。此外，针对人类、其他动物、和植物中的微生物感染的研究将受益于本文的方法。
核酸可根据本领域的技术人员所熟知的任何方法从样品中分离。如果有必要的话，样品可通过离心等被收集或浓缩。样品的细胞可以经受裂解，例如经过酶、加热、表面活性剂、超声波、或它们的组合处理。
多种核酸提取方法适于分离核酸。适宜的方法包括苯酚和氯仿提取。参见例如，Maniatis等人，Molectlar Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
RAPD PCR公开于美国专利5，126,239(还参见，Williams等人，NucleicAcids Res.18：6531-34(1990))。该方法描述了在DNA扩增反应中随机组合的小寡核苷酸，即大于七个核苷酸的寡核苷酸的使用。使用短引物，以便与该引物互补的和反向互补的序列可以在沿着基因组足够小，使得DNA扩增可以发生的距离处被发现。在扩增过程中产生的片段被称为RAPD标记。这些RAPD标记显示了在扩增过程中使用的DNA的基因组的组成方面对适度差异敏感的尺寸分布。
如美国专利5,753,467中所指出的，美国专利5,126,239的方法需要45个循环，这很多情况下导致次要扩增产物的形成和非特异性DNA合成。包含高含量的此类次要扩增产物和非特异性DNA的产物谱背景可以严格地限制模式识别软件将此类产物谱与已知的数据库进行比较的能力。然而，本文所公开的方法以较长的退火时间使用较少的扩增循环，来产生具有显著降低的非特异性DNA背景的复杂度远远更低的产物谱。
技术人员能够设计和制备适用于RAPD PCR的随机引物。扩增引物的长度取决于多种因素，包括核苷酸序列同一性和这些核酸杂交的温度或体外核酸扩增期间使用的温度。确定特定序列同一性的扩增引物的优选长度必要的注意事项是本领域的普通技术人员所熟知的。
扩增核酸分子的引物可以使用例如，诸如OLIGO(Molecular BiologyInsights，Inc.，Cascade，CO)的计算机程序来设计。设计将被用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于有利于检测(例如，通过电泳)的扩增产物的适当尺寸、一对引物的成员相近的熔解温度、和每一引物的长度(即，引物需要足够长，以具有序列特异性地退火并引发合成，但又不长至在寡核苷酸合成期间保真度被降低)。优选的引物与它们的靶标一起被描述于下文表1中。
如美国专利5,753,467中所讨论的，已知在rDNA基因座中发生显著程度的分子内的杂交。在很多情况下，所得的二级结构使得扩增引物难以针对杂交位点进行竞争。为了增强rDNA区域内包含的片段的扩增，有必要修改通常使用的扩增温度谱。主要的修改由约3至约7分钟范围的显著更长的退火时间的使用组成。扩增反应在高严格度条件下结合减少的扩增循环数进行。高严格度扩增通过在最高的退火温度下产物可再生形成而进行的反应来完成。最高的退火温度的使用确保了仅有最稳定的杂交结构将形成，并且引发位点周围的区域将具有最少量的二级结构。
靶标核酸的存在或不存在能够通过，例如，使用标准方法分析扩增的引物延伸的核酸产物的尺寸来确定，所述标准方法例如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、脉冲场电泳、变性梯度凝胶电泳、DNA微阵列、或质谱。优选地，毛细管电泳被用于分离扩增的产物。
在毛细管电泳中，核酸片段的长度通过使样品经过填充了凝胶的薄壁管迁移并测量样品迁移一定距离(例如，至毛细管的末端)所需的一段时间而被测定。在毛细管电泳中，经常使用安装在毛细管末端处的荧光信号检测器来检测样品。
进行毛细管电泳的设备为人们所熟知。描述基本设备的许多参考文献是可用的，并且多种毛细管电泳仪器是可商购获得的，例如，可从AppliedBiosystems(Foster City，CA)商购获得。描述毛细管电泳设备以及它们的操作的示例性参考文献包括Jorgenson，Methods4：179-90(1992)；Colburn等人，Applied Biosystems Research News，第1期(1990年冬)；等。
就荧光测量而言，当使用在它们的5′末端处用荧光团标记的引物进行PCR时，所扩增的靶标序列用可检测的荧光物质标记，并且使用荧光分光光度计来测量从荧光物质发射的荧光的强度。适宜的荧光团包括但不限于6-FAM；Alexa fluor405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、或660；Cy2；Cy3；Cy3.5；Cy5；Cy5.5；Cy7；羟基香豆素；甲氧基香豆素；氨基香豆素；荧光素；HEX；R-藻红蛋白；若丹明Red-X；ROX；Red613；Texas Red；别藻蓝素；TruRed；BODIPY630/650；BODIPY650/665；BODIPY-FL；BODIPY-R6G；BODIPY-TMR；BODIPY-TRX；羧基荧光素；Cascade Blue；6-JOE；丽丝胺若丹明B；Oregon Green488、500、或514；Pacific Blue；REG；若丹明Green；SpectrumAqua；TAMRA；TET；和四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)。
如上文所讨论的，优选的引物公开于表1中。与其相关的一个实施例是关于一种选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、和SEQ IDNO：4的分离的多核苷酸。另一个实施例是关于包括一组引物的试剂盒，所述引物包括用荧光团标记的SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4中的至少一个的PCR引物。在一些方面，所述试剂盒包括PCR引物SEQ ID NO：3和4两者。
此类试剂盒可包括载体，所述载体被分隔，以在一种或多种容器装置如管或小瓶中严密封闭地被容纳。所述容器装置之一可包含未标记的或可检测地标记的引物。所述引物可以根据需要以冻干的形式或在适当的缓冲液中存在。一个或多个容器装置可包含将在PCR反应中被利用的一种或多种酶或试剂。这些酶可单独地或在混合物中、以冻干的形式或在适当的缓冲液中存在。所述试剂盒还可包含进行PCR和/或CE所需的一些或全部其它的元素，诸如缓冲液、提取剂、酶、移液管、平板、核酸、核苷三磷酸、滤纸、凝胶材料、转移材料、放射自显影用品等。
一般方法
提供以下实例来说明优选的实施例。本领域的技术人员应认识到下文示例中公开的技术代表本发明人发现的在本文所公开方法的实施中作用良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据本发明理解的是，在不脱离本发明所公开方法的实质和范围的情况下，可对所公开的具体实施例进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。
本说明书中的以下缩写对应于量度、技术、特性、或化合物的单位如下：“sec”或“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”或“hr”是指小时，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“μM”是指微摩尔每升，“M”是指摩尔每升，“pmol”是指皮摩尔，“g”是指克，“μg”是指微克，“ng”是指纳克，“pg”是指皮克，“CE”是指毛细管电泳，“bp”是指碱基对，“6-FAM”是指6-羧基荧光素。
实例1
首先，扩增反应用17-mer引物对(SEQ ID NO：5和6)进行，其中之一包含6-FAM荧光标记(SEQ ID NO：5)，以确定PCR扩增的核糖体组分的尺寸分布。这些片段提供了参考产物，其使得有可能鉴定混合的核糖体的和随机的扩增中的核糖体模式组分。
为了产生核糖体/RAPD DNA谱，使用了三种单独引物(一种正向和两种反向引物)的混合物。正向引物用6-FAM染料标记，并且包含来自16SrDNA的11bp序列(SEQ ID NO：1)加上在5′末端处添加的两个额外的核苷酸(CA)(SEQ ID NO：2)。CA序列不与已知的保守的16S核糖体序列匹配，仅用于使荧光标记的底物成为DNA聚合酶的更好的底物。为了扩增核糖体和RAPD片段两者，从23S rDNA的单一位置获得两种反向引物的序列。反向引物的序列如下：R-23S反向引物1：SEQ ID NO：3(11mer)和R-23S反向引物2：SEQ ID NO：4(13mer)。
表1：引物
引物位置 序列5′-3′
16S-17mer6-FAM标记 (6-FAM)-SEQ ID NO：5
23S-17mer SEQ ID NO：6
23S-11mer SEQ ID NO：3
23S-13mer SEQ ID NO：4
16S-13mer6-FAM (6-FAM)-SEQ ID NO：2
PCR反应在30μl的反应混合物中进行，包含来自KAPA2G robustHotStart ReadyMix(Kapa Biosystems，Woburn，MA)的1×PCR缓冲液、20pmol的正向引物(6-FAM)-SEQ ID NO：2)、20pmol的反向引物1(SEQ IDNO：3)、4pmol的反向引物2(SEQ ID NO：4)、和50pg至100ng的gDNA。通过首先在95℃下预变性2分钟，然后是35个循环(95℃-30秒、45℃-5分钟、和72℃-30秒)，来扩增PCR片段。最终的延伸在72℃下进行10分钟。GeneScan1200
Figure BDA0000461818910000111
(Applied Biosystems，Carlsbad，CA)被用作DNA尺寸标准品，并在扩增之后被添加在PCR产物中。PCR片段被分离，并使用Applied Biosystem的3730型CE仪器进行检测。Applied BiosystemPeakScanner软件被用于鉴定CE图谱中的片段的峰并表征它们。
三种扩增反应的例子显示在图2中。针对来自婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的基因组DNA提取物，如上文的PCR方案中所描述的进行反应。在图2中，将每个电泳图谱与仅包含核糖体间隔区片段的电泳图谱进行了比较。进行了上述比较以展示在随机的扩增事件的存在下保留了这些核糖体的片段和显示任意的核糖体的片段的产量是可比较的。
混合11-碱基和13-碱基的引物的方法清楚地提供了核糖体和RAPD片段两者的扩增，所述引物之一包含荧光标记。在指定的扩增条件下，核糖体的和主要的RAPD片段的产量是可比较的。
所得的图谱包含荧光标记的片段，所述荧光标记的片段可以通过毛细管电泳来分离，以产生包含保守的核糖体片段和随机的RAPD片段两者的产物的图谱。
Figure IDA0000461818990000011
Figure IDA0000461818990000021

Claims (10)

1.用于鉴定微生物的菌种、血清型、和菌株的方法，包括：
(a)使用长度为13-15个碱基的第一引物和长度为11-13个碱基的第二引物，通过PCR扩增包含散布在高度保守的rDNA序列之间的可变序列的DNA并且通过随机扩增多态性DNA(RAPD)PCR扩增其它的基因组序列，所述第一引物包含：
(i)来自高度保守的16S rDNA区域的至少11个连续的碱基；和
(ii)荧光标记；以及
(b)分离步骤(a)中产生的扩增的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一引物是正向引物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一引物包括SEQ IDNO：1。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一引物是SEQ ID NO：2。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二引物包含来自23SrDNA的11-13个连续的碱基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二引物是SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述扩增步骤利用了长度为11-13个碱基的第三引物，所述第三引物包含来自23S rDNA的11-13个连续的碱基。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)通过毛细管电泳来完成。
9.分离的多核苷酸，其选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、以及它们的全长互补序列。
10.试剂盒，包括一组引物，所述引物包括用荧光团标记的SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的至少一个的PCR引物。
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