CN106661593A - 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 - Google Patents
一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106661593A CN106661593A CN201780000020.0A CN201780000020A CN106661593A CN 106661593 A CN106661593 A CN 106661593A CN 201780000020 A CN201780000020 A CN 201780000020A CN 106661593 A CN106661593 A CN 106661593A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mouse
- nsi
- talen
- nsif
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 101150094145 FAH gene Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 238000011160 research Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 261
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 57
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 31
- 101100334119 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) fahA gene Proteins 0.000 claims description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 27
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 26
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 26
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 21
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 20
- 108700022368 Whn Proteins 0.000 claims description 18
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 11
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000006651 lactation Effects 0.000 claims description 10
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims description 9
- 101150083447 Foxn1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101100067103 Mus musculus Foxn1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 7
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000011575 immunodeficient mouse model Methods 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 3
- -1 ammonia Amide Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 abstract description 12
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 16
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 12
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 229960001721 nitisinone Drugs 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 5
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 5
- 108010065394 aminopherase Proteins 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 4
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 4
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 2
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 208000033040 Somatoform disorder pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 244000144987 brood Species 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025321 B-lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100191385 Mus musculus Prkdc gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000031951 Primary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102100031358 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 108010022687 fumarylacetoacetase Proteins 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010224 hepatic metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000023247 mammary gland development Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 208000017426 precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于动物基因工程技术领域,具体涉及一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用,所述制备方法采用NOD‑Scid IL2rg‑/‑免疫缺陷型小鼠(NSI小鼠),敲除Foxnl基因或Fah基因。本发明通过在NSI小鼠上敲除Fah基因得到NSIF小鼠,所述NSIF小鼠可用于高效构建新型人源化小鼠模型,可用于肝脏生理和病理研究;本发明通过在NSI小鼠上敲除Foxn1基因得到NSIN小鼠,所述NSIN小鼠无体毛,免疫***进一步缺陷,易于实体瘤的构建、监控和测量。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域,具体涉及一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用。
背景技术
肝脏在人体发挥解毒和代谢外源化合物功能中占领着战略性的地位。由于小鼠饲养成本低、繁殖速度快、实验周期段短、遗传背景清晰、实验重复性高等优点,研究人员利用小鼠构建各种小鼠肝脏疾病模型,如肝损伤、病毒性肝炎、肝纤维化、肝癌等,进行肝脏疾病研究。但这些模型难以弥补人和小鼠存在巨大种属差异(例如,很多肝脏代谢酶具有种属特异性,一些人肝脏病毒如HBV、HCV等无法感染小鼠肝脏细胞)在这些模型上获得的研究成果或治疗药物无法在人体上重现相同效果。而利用人体肝脏细胞体外培养进行研究,则局限于人体原代细胞体外存活期限、冻存技术和无法重现体内器官协作。
于是,研究人员开展了肝脏人源化小鼠研究。肝脏人源化小鼠模型,即在可诱导肝脏损伤的免疫缺陷小鼠体内移植并重建人体肝脏组织或器官。肝脏人源化模型所使用的受体小鼠免疫缺陷程度越高,对异种、异体移植物的排斥则越小;且免疫细胞参与肝脏损伤引起的炎症反应,若免疫***完善,则在诱导肝脏损伤而人源肝脏组织或器官未重建的同时加速肝脏衰竭,提高小鼠死亡率。此外,可控的诱导性小鼠肝脏细胞损伤对移植的人源肝脏细胞的生存、增殖和发育提供了足够的空间。
现有技术中最优的可诱导肝脏损伤的免疫缺陷小鼠:TK-NOG(Thymidine Kinase即胸苷嘧啶激酶缺陷的NOD-Scid IL2rg-/-)免疫缺陷小鼠(Masami Hasegawa et al.,2013)、uPA-SCID(urokinase-type Plasminogen Activator即尿激酶纤维蛋白融酶原激活剂缺陷的Scid)免疫缺陷小鼠(Mercer et al.,2001)、FRG(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-)和FRGN(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-NOD)免疫缺陷小鼠(Hisaya Azuma et al.,2007;Elizabeth M.Wilson et al.,2014)。然而,TK转基因雄性小鼠不育,仅能通过杂合雌鼠和野生型雄鼠,无纯合小鼠品系,而uPA小鼠对供体肝脏细胞的要求非常高,且uPA基因缺失可引起迅速而严重的肝脏损伤,具有不可控的选择性。基于Fah基因敲除的肝脏诱导损伤小鼠,如FRG、FRGN,是目前应用最广泛、可控性最好、高移植效率的肝脏模型工具,可通过护肝药物NTBC(2-硝基-4-三氟甲苯-1,3环己二酮)控制Fah缺失诱导的肝脏损伤(Grompe etal.,1995;)。
然而,FRG和FRGN小鼠的免疫基因缺陷背景Rag2-/-IL2rg-/-和NOD Rag2-/-IL2rg-/-并非现有技术中免疫程度最高的,在构建肝脏人源化小鼠模型中,将会对外源的异种(人体)、异体细胞产生一定的排斥作用影响移植效率。Wei Ye et al.,Journal ofHematology&Oncology 2015报道发现NOD-scid IL2rg-/-小鼠的免疫缺陷程度最高,构建人源化小鼠模型的效果最好。基于NOD-scid IL2rg-/-免疫缺陷背景的Fah敲除小鼠将是最好的肝脏疾病人源化小鼠模型工具。然而,在探索该基因型小鼠研发上,研究人员却遇到了一系列困难。由于NOD((non-obese diabetic)小鼠基因背景复杂且自发非肥胖性糖尿病,在NOD小鼠上进行基因敲除可能会诱发致死或糖尿病病发(Baxter AG et al.,1995;Nichols J et al.,2009;)。再则,scid(Severe Combined Immunodeficiency Disease)小鼠Prkdc基因缺陷,DNA修复能力部分缺失,影响基因敲除工具脱靶后的基因修复,提高基因敲除小鼠的死亡率,且有研究人员发现NOD-scid Fah-/-小鼠在NTBC(肝脏保护药)停药之后,肝脏迅速衰竭,小鼠死亡(Blunt,T.et al.,1996)。而NOD-scid IL2rg的基因背景缺陷程度更高于NOD和NOD-scid小鼠。
此外,目前所有的高度免疫缺陷小鼠(缺失B、T、NK等免疫细胞),包括NOD-ScidIL2rg-/-、Rag2-/-IL2rg-/-、Rag1-/-IL2rg-/-等,在构建肿瘤模型上都具有极高的效率,然而这些小鼠都有毛发,在利用活体成像等技术检测带有荧光标记(特别是荧光蛋白)的肿瘤细胞体内生长和分布时,毛发对于检测结果都具有严重的干扰。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求,本发明提供一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用,所述免疫缺陷小鼠比现有的NSI或其他第三代免疫缺陷小鼠有更好的效果。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种基因敲除的方法,所述方法采用NOD-Scid IL2rg-/-免疫缺陷型小鼠(NSI小鼠),敲除Fah基因或Foxnl基因。
本发明中,通过在目前公认为免疫缺陷程度最高的免疫缺陷小鼠NOD-ScidIL2rg-/-背景下进行Fah基因敲除,获得可持续繁殖NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)小鼠品系,并利用NSIF小鼠构建了高嵌合率、高成功率的新型肝脏人源化小鼠模型(移植了人源肝脏等器官细胞或组织的人源化小鼠模型),该模型可用于人体肝脏疾病(如脂肪肝、肝损伤、肝炎、肝癌等)的科学研究和治疗方法(如化药、生物制剂等)的疗效评估,以及用于药物分解代谢和毒性评估。
本发明中,通过在目前公认为免疫缺陷程度最高的免疫缺陷小鼠NOD-ScidIL2rg-/-背景下进行Foxn1基因敲除,获得了体毛发育缺陷(几乎无体毛)的高度免疫缺陷小鼠NSIN(NOD-Scid IL2rg-/-Foxn1-/-)。在无体毛的情况下,肿瘤受体小鼠或者带荧光标记细胞的受体小鼠更易于观察小鼠的细胞生长、发育、迁移情况,同时易于实体瘤的观察和大小量取;由于Foxn1基因在胸腺上皮细胞发育和淋巴生成中有着重要作用,而Foxn1基因缺陷将不仅将进一步防止NOD-Scid IL2rg-/-高度免疫缺陷小鼠随着年龄增长发生的概率性胸腺重生事件,而且由于Foxn1基因缺失跟原发性免疫缺陷程度有关,且在裸鼠中构建实体瘤模型相对于其它一代免疫缺陷小鼠效果更好。
优选地,所述Fah基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.1所示,所述Foxn1基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.2所示,。
所述核苷酸序列如下:
Fah:aagctgcatggaagg(SEQ ID NO.1);
Foxn1:ggaagtgcctcttgtagggg(SEQ ID NO.2)。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的敲除Fah基因的方法,包括如下步骤:
(1)TALEN质粒的构建,获取TALEN mRNA;
(2)获取NSI小鼠受精卵,将步骤(1)得到的TALEN mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质,培养24h后,移植入假孕小鼠子宫,获得嵌合或杂合NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠;
(3)将步骤(4)得到的嵌合或杂合NSIF免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交获得更多杂合NSIF免疫缺陷小鼠,杂合NSIF免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIF纯合免疫缺陷小鼠。
优选地,所述步骤(1)所述的TALEN质粒的构建包括如下步骤:根据Fah基因的靶点序列分别得到TALEN左臂识别结合序列和TALEN右臂识别结合序列,设计编码TALEN左臂和右臂重复序列,再将重复序列连接到TALEN表达载体上,获得pCAG-TALEN L(左臂)-X-pA和pCAG-TALEN R(右臂)-X-pA质粒。
优选地,所述TALEN左臂识别结合序列为SEQ ID NO.3,所述TALEN右臂识别结合序列为SEQ ID NO.4;
TALEN左臂识别结合序列:5-aacttcatgggtctgggtc-3(SEQ ID NO.3);
TALEN右臂识别结合序列:5-aaggatgctcttgcct-3(SEQ ID NO.4)。
优选地,所述TALEN mRNA的获取是按照试剂盒m MESSAGE SP6(Ambion)和E.coliPoly(A)Polymerase(NEB)的操作步骤进行。
优选地,步骤(2)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的TALEN mRNA的浓度为10-200ng/μL,例如可以是10ng/μL、11ng/μL、12ng/μL、13ng/μL、15ng/μL、18ng/μL、20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、35ng/μL、40ng/μL、45ng/μL、50ng/μL、55ng/μL、60ng/μL、65ng/μL、70ng/μL、75ng/μL、80ng/μL、85ng/μL、90ng/μL、100ng/μL、110ng/μL、120ng/μL、130ng/μL、140ng/μL、150ng/μL、160ng/μL、170ng/μL、180ng/μL、190ng/μL或200ng/μL,优选为12-100ng/μL,进一步优选为20ng/μL。
优选地,所述敲除Fah基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基为10-40mmol/L的HEPES,pH 7.0-8,非必需氨基酸为0.05-1mmol/L,必需氨基酸为0.1-2mmol/L,优选为20mmol/L的HEPES,pH 7.4-7.8,非必需氨基酸为0.1mmol/L,必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L。
优选地,所述敲除Fah基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L,谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L,葡萄糖浓度0.01-1mmol/L,优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L,谷氨酰胺浓度1mmol/L,葡萄糖浓度0.1mmol/L。
优选地,步骤(2)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚,例如可以是10枚、11枚、12枚、13枚、14枚、15枚、16枚、17枚、18枚、19枚或20枚,优选为10-15枚。
优选地,所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种。
优选地,所述敲除Foxnl基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠。
优选地,所述代养小鼠为ICR小鼠。
第三方面,本发明提供一种如第二方面所述的基因敲除的方法敲除Fah基因后得到的NSIF小鼠。
第四方面,本发明提供一种免疫缺陷小鼠模型,所述小鼠模型在第三方面所述的NSIF小鼠的基础上进一步进行基因改造。
第五方面,本发明提供一种如第三方面或第四方面所述的小鼠模型作为人体的病理和生理的研究的模型鼠的用途,优选作为肝脏疾病研究的模型鼠的用途和/或肝脏人源化的模型鼠的用途。
第六方面,本发明提供一种敲除Foxnl基因的方法,包括如下步骤:
(1)构建Foxn1基因敲除的重组载体,体外转录gRNA;
(2)体外转录Cas9 mRNA;
(3)获取NSI小鼠受精卵,将步骤(1)得到的gRNA和步骤(2)得到的Cas9 mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质,培养24h后,移植入假孕小鼠子宫,获得杂合NSIN(NOD-scidIL2rg-/-Foxn1-/-)免疫缺陷小鼠;
(4)将步骤(3)得到的嵌合或杂合NSIN免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交获得更多杂合NSIN免疫缺陷小鼠,杂合NSIN免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIN纯合免疫缺陷小鼠。
本发明中,采用原核注射将得到的mRNA注入小鼠受精***,对原核注射过程中各种胚胎培养基进行了适合NSI胚胎的调整,提高胚胎原核注射的效率及注射后胚胎的恢复。
优选地,所述构建Foxn1基因敲除的重组载体的步骤包括:通过引物获得线性化guide DNA(L-gDNA、),再通过DNA连接酶连接到线性化L-pT7载体上,得到pT7-gDNA完整载体。
优选地,所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6所示;
所述核苷酸序列如下:
SEQ ID NO.5:5’-ATAGGN ggaagtgcctcttgtagggg GT-3’;
SEQ ID NO.6:5’-TAAAACN cccctacaagaggcacttccG-3’;
其中,所述N可代表A、T、G或C中的任意一个核苷酸。
优选地,所述gRNA体外转录包括如下步骤:以pT7-gDNA完整载体为模板,通过引物扩增gDNA基因片段,再进行体外转录获得gRNA。
优选地,所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7-8所示;
SEQ ID NO.7:5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’;
SEQ ID NO.8:5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。
优选地,步骤(2)所述的体外转录Cas9 mRNA包括如下步骤:使pcDNA3.3-hCas9载体线性化,回收线性化的pcDNA3.3-hCas9载体为体外转录的模板,以SP6聚合酶启动子在体外转录Cas9 mRNA,Licl法回收带帽Cas9 mRNA,加poly A,纯化后保存。
优选地,步骤(3)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的gRNA和Cas9 mRNA的浓度为10-200ng/μL,例如可以是10ng/μL、11ng/μL、12ng/μL、13ng/μL、15ng/μL、18ng/μL、20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、35ng/μL、40ng/μL、45ng/μL、50ng/μL、55ng/μL、60ng/μL、65ng/μL、70ng/μL、75ng/μL、80ng/μL、85ng/μL、90ng/μL、100ng/μL、110ng/μL、120ng/μL、130ng/μL、140ng/μL、150ng/μL、160ng/μL、170ng/μL、180ng/μL、190ng/μL或200ng/μL,优选为12-100ng/μL,进一步优选为20ng/μL。
优选地,所述敲除Foxn1基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基10-40mmol/L的HEPES,pH 7.0-8,非必需氨基酸为0.05-1mmol/L,必需氨基酸为0.1-2mmol/L,优选为为20mmol/L的HEPES,pH 7.4-7.8,非必需氨基酸为0.1mmol/L,必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L。
优选地,所述敲除Foxn1基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L,谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L,葡萄糖浓度0.01-1mmol/L,优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L,谷氨酰胺浓度1mmol/L,葡萄糖浓度0.1mmol/L。
优选地,步骤(3)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚,例如可以是10枚、11枚、12枚、13枚、14枚、15枚、16枚、17枚、18枚、19枚或20枚,优选为10-15枚。
优选地,所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种。
优选地,所述敲除Foxn1基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠。
优选地,所述代养小鼠为ICR小鼠。
本发明中,敲除Foxn1和Fah基因的小鼠都采用NSI母鼠作为***母鼠,采用至少一次以上生产经验的ICR母鼠作为代养母鼠。采用NSI母鼠作为***母鼠是由于通过这种基因型的生长环境和体内微环境更适合该缺陷型的小鼠生长,可以提高存活率;而采用ICR母鼠作为代养母鼠,可以提高可哺乳率。
第七方面,本发明提供一种如第一方面所述的基因敲除的方法敲除Foxn1基因后得到的NSIN小鼠。
本发明中,所述NSIN小鼠在移植肿瘤的移植率、异种细胞的存活和生长都明显优于其他免疫缺陷小鼠,可见NSIN小鼠的免疫缺陷程度高,可作为最优的肿瘤疾病研究的模型小鼠。
第八方面,本发明提供一种免疫缺陷小鼠模型,所述小鼠模型在第七方面所述的NSIN小鼠的基础上进一步进行基因改造。
第九方面,本发明提供如第七方面或第八方面所述的小鼠模型作为人体病理和生理的研究的模型鼠的用途,优选作为肿瘤疾病研究的模型鼠的用途。
第十方面,本发明提供如第一方面所述的基因敲除的方法敲除Fah基因和Foxn1基因后得到的小鼠。
本发明中,作为优选技术方案,敲除Foxn1和Fah基因小鼠中的移植受精卵等胚胎操作所用培养基为20mmol/L的HEPES,pH 7.4-7.8,非必需氨基酸为0.1mmol/L,必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L。
所述敲除Foxn1和Fah基因小鼠中所述小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.35mmol/L,谷氨酰胺浓度1mmol/L,葡萄糖浓度0.1mmol/L。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明免疫缺陷程度最高的免疫缺陷小鼠NOD-Scid IL2rg-/-背景下进行Foxn1基因敲除,获得了体毛发育缺陷(几乎无体毛)的高度免疫缺陷小鼠NSIN(NOD-ScidIL2rg-/-Foxn1-/-),该小鼠无体毛,更易于观察小鼠的细胞生长、发育、迁移情况,同时易于实体瘤的观察和大小量取,还能防止高度免疫缺陷小鼠随着年龄增长发生的概率性胸腺重生事件;
(2)本发明在免疫缺陷小鼠NOD-Scid IL2rg-/-背景下进行Fah基因敲除,获得可持续繁殖NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)小鼠品系,Fah缺失可诱导肝脏衰竭,而免疫细胞参与后续的肝脏衰竭,NSIF免疫缺陷程度越高,则可缓解肝脏衰竭于可控范围,利用NSIF小鼠构建了高嵌合率、高成功率的新型肝脏人源化小鼠模型,该模型可用于人体肝脏疾病(如脂肪肝、肝损伤、肝炎、肝癌等)的科学研究和治疗方法(如化药、生物制剂等)的疗效评估,以及用于治疗方法分解代谢和毒性评估;
(3)本发明采用NSI小鼠***,ICR小鼠代养的方式培养NSIN和NSIF小鼠,提高了缺陷型小鼠的存活率和可哺乳率,且本发明采用原核注射的方式将获得的mRNA注入受精卵中,且通过对原核注射中各种胚胎培养基进行了适合NSI胚胎的调整,提高胚胎原核注射的效率及注射后胚胎的恢复。
附图说明
图1是本发明NSIN小鼠基因PCR酶切鉴定结果,其中WT为野生型,Foxn1+/-为杂合型,Foxn1-/-为纯合型;
图2是本发明NSIF小鼠基因PCR酶切鉴定结果,其中WT为野生型,Fah+/-为杂合型,Fah-/-为纯合型;
图3是本发明NSIF小鼠测序结果在NCBI上进行比对的结果;
图4是本发明检测肝损伤NSIF小鼠Fah蛋白的表达Western Blot结果图;
图5是本发明NSIF小鼠肝脏病理切片,其中,图5(A)为NSIF小鼠停止使用NTBC药物后的肝脏病理切片,图5(B)为NSIF小鼠正常使用NTBC药物后的肝脏病理切片;
图6是本发明NSIF小鼠停止使用NTBC药物后丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的表达水平;
图7是本发明NSIF小鼠停止使用NTBC药物后葡萄糖的表达水平;
图8是本发明NSIF小鼠肝脏移植/不移植C57BL/6小鼠肝脏并停止使用NTBC药物后小鼠体重变化,其中,NISF-NTBC+liver为移植了C57BL/6小鼠肝脏的NSIF小鼠,NSIF-NTBC为未移植肝脏的NSIF小鼠;
图9是本发明NSIF小鼠移植/不移植C57BL/6小鼠肝脏并停止使用NTBC药物后丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的表达水平,其中,NISF-NTBC+liver为移植了C57BL/6小鼠肝脏的NSIF小鼠,NSIF-NTBC为未移植肝脏的小鼠;
图10是本发明NSIF小鼠移植/不移植C57BL/6小鼠肝脏并停止使用NTBC药物后葡萄糖的表达水平,其中,NISF-NTBC+liver为移植了C57BL/6小鼠的肝脏,NSIF-NTBC为未移植肝脏的小鼠;
图11是Fah靶位点及TALEN左右臂结构示意图;
图12是1×104NALM6-GFP细胞分别移植入NOG、NSI、NSIN小鼠后,小鼠外周血NALM6-GFP重建效率的比较;
图13是1×105NALM6-GFP细胞分别移植入NOG、NSI、NSIN小鼠后,小鼠外周血NALM6-GFP重建效率的比较;
图14是1×106NALM6-GFP细胞分别移植入NOG、NSI、NSIN小鼠后,小鼠外周血NALM6-GFP重建效率的比较;
图15是1×104A549细胞分别移植入NOG、NSI、NSIN小鼠30天后,小鼠皮下肿瘤组织重量的比较;
图16是1×105A549细胞分别移植入NOG、NSI、NSIN小鼠30天后,小鼠皮下肿瘤组织重量的比较;
图17是1×106A549细胞分别移植入NOG、NSI、NSIN小鼠30天后,小鼠皮下肿瘤组织重量的比较。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明所有动物饲养、繁殖于SPF(Specific Pathogen Free)级别实验动物中心。
本发明NSI小鼠,基因型:NOD-scid IL2rg-/-,授权专利号:ZL201310229629.9。
实施例1:Cas9敲除体系质粒的构建
(1)靶点选择:利用ZiFiT Targeter Version网站设计遵循Cas9敲除靶点的GGN(17-18)NGG(N为任意碱基)的序列要求Cas9敲除的靶位点,并通过Ensembl/NCBI网站的“Blast”检索功能确定靶位点是基因组中的单一位点;
靶位点序列:ggaagtgcctcttgtagggg(SEQ ID NO.1)
靶点确认:依据打靶细胞的基因组设计扩增靶位点的高特异性引物,PCR扩增获得含靶位点片段;在靶位点中选择扩增片段唯一的限制性内切酶进行酶切电泳鉴定;酶切鉴定正确后,将PCR扩增产物送去测序鉴定;通过酶切、测序鉴定,确认打靶鉴定引物的特异性和酶切、测序鉴定的可行性;
(2)构建打靶载体pT7-gDNA
①基因合成分别与靶位点序列相同和互补的两条引物,即多聚核苷酸单链(Oligo),分别为S Oligo和AS Oligo;按照下表将反应组分加入1.5mL EP管中,置于沸水中加热10分钟后,冷却至室温,瞬间离心,获得编码guide RNA(gRNA)的含粘性末端的、线性化guide DNA序列(即L-gDNA)备用;
S Oligo序列:5’-ATAGGN ggaagtgcctcttgtagggg GT-3’(SEQ ID NO.3)
AS Oligo序列:5’-TAAAACN cccctacaagaggcacttccG-3’(SEQ ID NO.4)
②通过限制性内切酶BbsI剪切空载体pMD18-T Simple(即pT7载体,带氨苄抗性),获得含粘性末端的线性化空载体pMD18-T Simple,即L-pT7;
③通过DNA连接酶(如Takara公司Solution I),将L-pT7和L-gDNA连接成完整载体pT7-gDNA,转化、涂板、挑单克隆、摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定、质粒测序,筛选测序正确质粒备用;
(3)gRNA体外转录
①以测序正确的pT7-gDNA质粒(1-30ng)为模版,以T7-S和Tracr-Rev为引物扩增gDNA基因片段,电泳、胶回收、溶解于30μL无(RNA)酶水中备用;
T7-S引物序列:5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’(SEQ ID NO.5)
Tracr-Rev引物序列:5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’(SEQ ID NO.6)
②通过体外转录试剂盒T7 Kit(Ambion公司)将PCR扩增后的gDNA基因片段体外转录成gRNA,利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit试剂盒(Ambion公司)从转录体系中回收纯化体外转录的gRNA,用20μL无酶水溶解,-80℃保存备用。
(4)Cas9体外转录
①按照下列体系配置酶切反应液:用PmeI限制性内切酶剪切pcDNA3.3-hCas9(Cas9载体,Addgene NO.MLM3613),使载体线性化,电泳、跑胶、回收,用20μL无酶水溶解备用;
②按照下列体系和步骤,用mMESSAGE mMACHINE T7 Kit体外转录带帽的Cas9mRNA,电泳、跑胶、回收带帽Cas9 mRNA。
③按照下列体系配置反应体系,在带帽Cas9 mRNA上加上poly A,获得稳定而且翻译效率也更高的RNA;
④利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit试剂盒(Ambion公司)从转录体系中回收纯化体外转录的Cas9 mRNA,用10-20μL无酶水溶解,-80℃保存备用。
实施例2:NSIN小鼠的构建和验证
(1)NSI小鼠超排:公鼠周龄:10-11周,雌鼠周龄:8周。母鼠于第一天13:00注射PMSG(7.5IU/只),第三天13:00注射HCG(7.5IU/只),第三天17:00每只雌鼠与2只雄鼠合笼,第四天8:00-9:00检查雌鼠***栓,从见栓雌鼠子宫获取NSI小鼠受精卵;
提供***的NSI雄鼠和雌鼠的生产注意事项:NSI母代鼠与父代鼠(提供***的NSI雄鼠和雌鼠的母代和父代)合笼见栓后,将父代鼠分出,放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠,以保证NSI母代鼠所产仔哺乳充足;
(2)将浓度20ng/μL gRNA和Cas9 mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质(胚胎操作所有培养基为20mmol/L的HEPES,pH 7.4~7.8,非必需氨基酸为0.1mmol/L,必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L),用小鼠胚胎培养基培养24小时后(培养基调整为:丙酮酸浓度提高至0.35mmol/L,谷氨酰胺浓度调至1mmol/L,葡萄糖浓度调至0.1mmol/L),移植入0.5dpc(二细胞期胚胎)假孕NSI母鼠输卵管壶腹部,每只小鼠移植受精卵数量为15;
***NSI鼠饲养注意事项:生产***母鼠的NSI母代鼠与父代鼠合笼见栓后,将父代鼠分出,放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠,***母鼠出生后7天,将同窝雄性仔取出,以保证***母鼠的哺乳期营养供给充足;
(3)移植受精卵后的母鼠与生产过一次以上的ICR母鼠同笼(1只***NSI母鼠与1只ICR母鼠);
***母鼠产仔后,通过基因型鉴定(PCR扩增和测序)小鼠基因型,获得杂合NSIN(NOD-scid IL2rg-/-Foxn1-/-)免疫缺陷小鼠,通过进一步与NSI小鼠杂交获得NSIN纯合子,PCR结果如图1所示;
注意事项:由于纯合NSIN母鼠Foxn1缺失,乳腺发育不完全,无法良好哺乳NSIN幼仔,则NSIN品系的繁殖主要通过纯合的NSIN雄鼠与杂合的NSIN雌鼠交配繁殖后代;纯合NSIN无体毛,杂合NSIN有体毛;
从图1可以看出,纯合的NSIN小鼠Foxn1基因缺陷。
实施例3:TALEN质粒的构建
(1)利用TELAN Targeter软件对Fah基因CDS序列(NOD-scid IL2rg-/-小鼠背景)进行分析,从Fah基因CDS序列中筛选出特异性最高的基因位点作为TALEN靶点;
TALEN靶点序列:5-aagctgcatggaagg-3;
TALEN左臂识别结合序列:5-aacttcatgggtctgggtc-3;
TALEN右臂识别结合序列:5-aaggatgctcttgcct-3;
(2)根据靶向Fah基因的TALEN左臂、右臂所识别结合的序列、TALE识别编码原则,设计TALEN左臂和右臂序列,如图11所示:
TALEN左臂:AACTTCATGGGTCTGGGTCAAG;
TALEN右臂:AAGGATGCTCTTGCCTCCT;
(3)基因合成两侧含BsmBI(即Esp3I,Thermo Scientific公司,型号FD0454)限制性酶切位点的TALEN左臂、右臂重复序列,并通过BsmBI酶切、连接入TALEN表达载体pCAG-TALEN-X-pA(Addgene公司),获得pCAG-TALEN L(左臂)-X-pA和pCAG-TALEN L(右臂)-X-pA质粒;
(4)TALEN活性评估:体外检TALEN活性采用的是单链复性(Single-strandannealing,SSA)方法,SSA报告载体中报告基因为荧光素(Luciferase)基因,启动子为CMV。操作方法为24孔板293T细胞转染200ng TALENs表达质粒、50ng SSA报告质粒、10ngRenilla plasmid,1d后收集转染的细胞,并用Luciferase Cell Lysis Buffer(NEB)处理,检测荧光素酶活性,预测TALEN的切割活性;
(5)TALEN mRNA获取:TALENs质粒需要通过体外转录合成编码TALEN的m RNA并在末端加上poly(A)后进行胚胎胞质注射。TALEN m RNA体外转录和加多聚腺苷酸的实验过程是按照试剂盒m MESSAGE SP6(Ambion)和E.coli Poly(A)Polymerase(NEB)的操作步骤进行,方法简述如下:
①Not I酶切线性化TALENs质粒:取大提质粒得到的L-TALENs和R-TALENs质粒各15μg,37℃酶切过夜后,取0.2μL酶切产物上样至1%琼脂糖凝胶孔,分别以原质粒为对照,电泳确定线性化完全,用DNA回收试剂盒(DP214)回收酶切产物,并测定浓度;
②体外转录:冰上融解SP6 m MESSAGE m MACHINE Kit(Ambion,AM1340)剂盒中的试剂,并短暂离心,Bufferr融解后放室温,其余溶液置于冰上,总体系设为10μL,加完样后将样品充分混匀,37℃孵育3h;
③加入0.5μL TURBO DNase,充分混匀后37℃孵育15min;
④RNA加Poly A尾修饰冰上解冻E.coil poly(A)polymerase试剂盒中的相关试剂,总体系设为50μL,按表体系加样,加完样后将样品充分混匀,37℃孵育45min。
⑤TALEN m RNA沉淀回收,利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit试剂盒(Ambion公司)从转录体系中回收纯化体外转录的Cas9 RNA,用10-20μL无酶水溶解,-80℃保存备用。
实施例4:NSIF小鼠的构建和验证
(1)NSI小鼠超排:公鼠周龄:10-11周,雌鼠周龄:8周。母鼠于第一天13:00注射PMSG(7.5IU/只),第三天13:00注射HCG(7.5IU/只),第三天17:00每只雌鼠与2只雄鼠合笼,第四天8:00-9:00检查雌鼠***栓,从见栓雌鼠子宫获取NSI小鼠受精卵;
提供***的NSI雄鼠和雌鼠的生产注意事项:NSI母代鼠与父代鼠(提供***的NSI雄鼠和雌鼠的母代和父代)合笼见栓后,将父代鼠分出,放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠,以保证NSI母代鼠所产仔哺乳充足。
(2)将浓度20ng/μL TALEN左臂、右臂mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质(胚胎操作所有培养基为20mmol/L的HEPES,PH 7.4~7.8,非必需氨基酸为0.1mmol/L,必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L),用小鼠胚胎培养基培养24小时后(培养基调整为:丙酮酸浓度提高至0.35mmol/L,谷氨酰胺浓度调至1mmol/L,葡萄糖浓度调至0.1mmol/L),移植入0.5dpc(二细胞期胚胎)假孕NSI母鼠输卵管壶腹部,每只小鼠优选移植受精卵数量为13枚;
***NSI鼠饲养注意事项:生产***母鼠的NSI母代鼠与父代鼠合笼见栓后,将父代鼠分出,放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠,***母鼠出生后7天,将同窝雄性仔取出,以保证***母鼠的哺乳期营养供给充足。
(3)移植受精卵后的母鼠与生产过一次以上的ICR母鼠同笼(1只***NSI母鼠与1只ICR母鼠);
(4)***母鼠产仔后,通过基因型鉴定(PCR扩增和测序)小鼠基因型,获得杂合NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠,通过进一步与NSI小鼠杂交获得NSIF纯合子,将NSIF测序结果在NCBI上比对,结果如图3所示,PCR电泳结果如图2所示;
注意事项:***母鼠饮用水(PH3.0,高压灭菌)中加入NTBC(终浓度:7.5mg/L);母鼠产仔前一周需皮下注射NTBC(终浓度:7.5mg/L)120ul/只;母鼠产仔后,不足4周大的鼠仔须每天皮下注射NTBC 10-20uL/只,哺乳母鼠注射NTBC 120uL/只;
从图2和图3可以看出,测序结果和基因PCR扩增后电泳结果同时反映了NSIF小鼠基因组中Fah基因缺陷、不完整。
通过Western Blot检测NSIF小鼠肝脏中Fah蛋白表达(以NSI小鼠为阳性对照),结果如图4所示,NSI表达Fah蛋白,NSIF小鼠中不表达Fah蛋白,证明Fah基因敲除成功。
实施例5:肝损伤动物模型的构建
(1)停止在NSIF小鼠日常饮用水中加入NTBC(且不注射NTBC)
(2)每天对-NTBC NSIF小鼠进行称重、记录,并通过绘制体重变化曲线,与饮用NTBC酸性水的NSIF小鼠对比,去除NTBC对NSIF小鼠体重变化的影响;
(3)NTBC停药40天后,将停止用药的小鼠与正常用药的小鼠肝脏的病理切片如图5(A)和图5(B)所示,抽取实验组小鼠外周血300mL,提取血清样品,检测其中的血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT,Alanine Aminotransferase)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST,AspartateAminotransferase)、葡萄糖(Glucose)水平,结果如图6-7所示;
从肝脏实物图和病理切片结果图5(A)和(B)可以看出NSIF小鼠停止给NTBC后,肝脏发生肉眼可见损伤,组织切片染色显示肝细胞坏死(A);持续给药的小鼠肝脏细胞,未见明显肝脏损伤及肝细胞坏死情况(B)。表明NSIF小鼠可自发诱导肝脏损伤,而该损伤可通过基于NTBC药物予以缓解和控制,图6-7同样为该结果佐证;
图6-7可以看出,NSIF小鼠停止用NTBC药后,血清中丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的合成水平明显增加,而葡萄糖的合成水平明显下降。
实施例6:不同品系小鼠肝脏移植实验
(1)选择出生日期相差不超过一周、同性别的6只NSIF小鼠(选同一胎出生的),分成两组(每组3只),一组为NSIF-NTBC+Liver(即NSIF小鼠移植C57BL/6小鼠肝脏细胞后,逐渐停止NTBC用药),一组为NSIF-NTBC(即不移植C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠,与NSIF-NTBC+Liver实验组同步进行NTBC逐渐停药);
(2)二氧化碳法处死1只C57BL/6小鼠,取C57BL/6小鼠肝脏研磨、裂解红细胞,获取单肝脏细胞悬液(浓度为2×107细胞/mL)备用;
(3)通过静脉注射为每只NSIF-NTBC+Liver小鼠注射100μL步骤2中的C57BL/6小鼠单肝脏细胞悬液,即每只小鼠注射2×106细胞;
(4)小鼠肝脏细胞移植试验后,对两组实验小鼠停止NTBC用药,并每天为实验小鼠称重并记录重量,如图8所示;
(5)小鼠肝脏细胞移植40天后,抽取两组实验小鼠外周血300ml,提取血清样品,检测其中的血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT,Alanine Aminotransferase)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST,Aspartate Aminotransferase)、葡萄糖(Glucose)水平,如图9-10所示;
从图8可以看出,不移植C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠停止用药后,体重逐渐下降直至死亡,而移植了C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠体重于33天慢慢恢复。说明移植的不同品系的小鼠肝脏细胞可以在小鼠体内生长,并替代受体鼠肝脏功能。
从图9-10可以看出,不移植C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠停止用药后血清中丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的合成水平明显增加,而葡萄糖合成水平明显下降。
实施例7:利用NSIN构建实体瘤人源化小鼠模型
(1)将不同数量级(1×104、1×105、1×106)的NALM6-GFP细胞(人B淋系急性白血病BALL细胞系,用绿色荧光蛋白标记),分别通过尾静脉注射的方式移植入NSIN(NOD/SCIDIL2rg-/-Foxn1-/-)、NSI(NOD/SCID IL2rg-/-)、NOG(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1sug/JicCrl,日本CIEA/IVS公司)免疫缺陷小鼠,构建血液瘤(B-ALL)人源化小鼠模型;
(2)NALM6-GFP细胞移植后,观察肿瘤移植小鼠的状态,于小鼠病发时,取小鼠外周血,通过流式细胞技术检测外周血中NALM6-GFP细胞的比例,记录并制成不同数量级的肿瘤重量对比柱状图,结果如图12-14所示;
(3)通过不同数量级的柱状对比图,图12-14可以得出:在NSIN免疫缺陷小鼠的体内环境更适合于异种(血液瘤、正常血液)细胞的存活和生长;特别是在细胞少的时候,NSIN小鼠的移植效率显著高于NSI和NOG小鼠;可得初步结论,三种小鼠的免疫缺陷程度排序是NSIN>NSI>NOG。
实施例8:利用NSIN构建实体瘤人源化小鼠模型
(1)将不同数量级(1×104、1×105、1×106)的A549细胞(人肺腺癌细胞系),分别通过皮下注射的方式移植入NSIN(NOD/SCID IL2rg-/-Foxn1-/-)、NSI(NOD/SCID IL2rg-/-)、NOG(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Sug/JicCrl,日本CIEA/IVS公司)免疫缺陷小鼠,构建实体瘤(肺癌)人源化小鼠模型;
(2)A549细胞移植30天后,取小鼠肿瘤组织,称量肿瘤组织重量,记录并制成不同数量级的肿瘤重量对比柱状图,结果如图15-17所示。
(3)通过不同数量级的柱状对比图,图15-17可以得出:在NSIN免疫缺陷小鼠的体内环境更适合于异种(实体瘤、非血液正常细胞)细胞的存活和生长;特别是在细胞少的时候,NSIN小鼠的移植效率显著高于NSI和NOG小鼠;进一步验证了,三种小鼠的免疫缺陷程度排序是NSIN>NSI>NOG。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司
<120> 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用
<130> 2016
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
aagctgcatg gaagg 15
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
ggaagtgcct cttgtagggg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
aacttcatgg gtctgggtc 19
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
aaggatgctc ttgcct 16
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> DNA
<222>
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 5
ataggnggaa gtgcctcttg tagggggt 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> DNA
<222>
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 6
taaaacnccc ctacaagagg cacttccg 28
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
gaaattaata cgactcacta ta 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25
Claims (10)
1.一种基因敲除的方法,其特征在于,所述方法采用NOD-Scid IL2rg-/-免疫缺陷型小鼠(NSI小鼠),敲除Fah基因或Foxnl基因。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Fah基因的核苷酸靶点序列为SEQ IDNO.1所示,所述Foxn1基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述敲除Fah基因包括如下步骤:
(1)TALEN质粒的构建,获取TALEN mRNA;
(2)获取NSI小鼠受精卵,将步骤(1)得到的TALEN mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质,培养24h后,移植入假孕小鼠子宫,获得嵌合或杂合NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠;
(3)将步骤(2)得到的嵌合或杂合NSIF免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交获得更多杂合NSIF免疫缺陷小鼠,杂合NSIF免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIF纯合免疫缺陷小鼠;
优选地,所述步骤(1)所述的TALEN质粒的构建包括如下步骤:根据Fah基因的靶点序列分别得到TALEN左臂识别序列和TALEN右臂识别序列,设计TALEN左臂和右臂结构,再将重复序列连接到TALEN表达载体上,获得pCAG-TALEN L(左臂)-X-pA和pCAG-TALEN R(右臂)-X-pA质粒;
优选地,所述TALEN左臂识别结合序列为SEQ ID NO.7,所述TALEN右臂识别结合序列为SEQ ID NO.8;
优选地,所述TALEN mRNA的获取包括如下步骤:
优选地,步骤(2)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的TALEN mRNA的浓度为10-200ng/μL,优选为12-100ng/μL,进一步优选为20ng/μL;
优选地,所述敲除Fah基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基为10-40mmol/L的HEPES,pH 7.0-8,非必需氨基酸为0.05-1mmol/L,必需氨基酸为0.1-2mmol/L,优选为20mmol/L的HEPES,pH 7.4-7.8,非必需氨基酸为0.1mmol/L,必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L;
优选地,所述敲除Fah基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L,谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L,葡萄糖浓度0.01-1mmol/L,优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L,谷氨酰胺浓度1mmol/L,葡萄糖浓度0.1mmol/L;
优选地,步骤(2)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚,优选为10-15枚;
优选地,所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种;
优选地,所述敲除Fah基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠;
优选地,所述代养小鼠为ICR小鼠。
4.一种如权利要求3所述的基因敲除的方法敲除Fah基因后得到的NSIF小鼠。
5.一种免疫缺陷小鼠模型,其特征在于,所述小鼠在权利要求4所述的NSIF小鼠的基础上进一步进行基因改造。
6.如权利要求4或5所述的小鼠模型作为人体的病理和生理的研究的模型鼠的用途,优选作为肝脏疾病研究的模型鼠的用途和/或肝脏人源化的模型鼠的用途。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述敲除Foxnl基因的方法包括如下步骤:
(1)构建Foxn1基因敲除的重组载体,体外转录gRNA;
(2)体外转录Cas9mRNA;
(3)获取NSI小鼠受精卵,将步骤(1)得到的gRNA和步骤(2)得到的Cas9mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质,培养24h后,移植入假孕小鼠子宫,获得嵌合或杂合NSIN(NOD-scidIL2rg-/-Foxn1-/-)免疫缺陷小鼠;
(4)将步骤(3)得到的嵌合或杂合NSIN免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交,获得更多杂合NSIN免疫缺陷小鼠,杂合NSIN免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIN纯合免疫缺陷小鼠;
优选地,所述构建Foxn1基因敲除的重组载体的步骤包括:通过引物获得线性化guideDNA(L-gDNA),再通过DNA连接酶连接到线性化L-pT7载体上,得到pT7-gDNA完整载体;
优选地,所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3-4所示;
优选地,所述gRNA体外转录包括如下步骤:以pT7-gDNA完整载体为模板,通过引物扩增gDNA基因片段,再进行体外转录获得gRNA;
优选地,所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6所示;
优选地,步骤(2)所述的体外转录Cas9 mRNA包括如下步骤:使pcDNA3.3-hCas9载体线性化,回收线性化的pcDNA3.3-hCas9载体为体外转录的模板,以SP6聚合酶启动子在体外转录Cas9 mRNA,Licl法回收带帽Cas9 mRNA,加poly A,纯化后保存;
优选地,步骤(3)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的gRNA和Cas9 mRNA的浓度为10-200ng/μL,优选为12-100ng/μL,进一步优选为20ng/μL;
优选地,所述敲除Foxn1基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基10-40mmol/L的HEPES,pH 7.0-8,非必需氨基酸为0.05-1mmol/L,必需氨基酸为0.1-2mmol/L,优选为为20mmol/L的HEPES,pH 7.4-7.8,非必需氨基酸为0.1mmol/L,必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L;
优选地,所述敲除Foxn1基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L,谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L,葡萄糖浓度0.01-1mmol/L,优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L,谷氨酰胺浓度1mmol/L,葡萄糖浓度0.1mmol/L;
优选地,步骤(3)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚,优选为10-15枚;
优选地,所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种;
优选地,所述敲除Foxnl基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠;
优选地,所述代养小鼠为ICR小鼠。
8.一种如权利要求7所述的基因敲除的方法敲除Foxnl基因后得到的NSIN小鼠。
9.一种免疫缺陷小鼠模型,其特征在于,所述小鼠模型在权利要求8所述的NSIN小鼠的基础上进一步进行基因改造;
如权利要求8或9所述的小鼠模型作为人体病理和生理的研究的模型鼠的用途,优选作为肿瘤疾病研究的模型鼠的用途。
10.一种如权利要求1所述的基因敲除的方法敲除Fah基因和Foxnl基因后得到的小鼠。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911347317.1A CN110951787B (zh) | 2016-02-25 | 2017-01-19 | 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610103735.6A CN107119076A (zh) | 2016-02-25 | 2016-02-25 | 一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用 |
CN2016101037356 | 2016-02-25 | ||
PCT/CN2017/071697 WO2017143894A1 (zh) | 2016-02-25 | 2017-01-19 | 免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911347317.1A Division CN110951787B (zh) | 2016-02-25 | 2017-01-19 | 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106661593A true CN106661593A (zh) | 2017-05-10 |
Family
ID=59684708
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610103735.6A Pending CN107119076A (zh) | 2016-02-25 | 2016-02-25 | 一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用 |
CN201911347317.1A Active CN110951787B (zh) | 2016-02-25 | 2017-01-19 | 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 |
CN201780000020.0A Pending CN106661593A (zh) | 2016-02-25 | 2017-01-19 | 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610103735.6A Pending CN107119076A (zh) | 2016-02-25 | 2016-02-25 | 一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用 |
CN201911347317.1A Active CN110951787B (zh) | 2016-02-25 | 2017-01-19 | 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (3) | CN107119076A (zh) |
WO (1) | WO2017143894A1 (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108396036A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-08-14 | 昆明医科大学 | 一种过表达cox5a转基因鼠模型及其构建方法与应用 |
CN108504624A (zh) * | 2018-04-08 | 2018-09-07 | 深圳市体内生物医药科技有限公司 | 一种免疫缺陷小鼠模型的新应用 |
CN110283850A (zh) * | 2018-03-19 | 2019-09-27 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | 一种免疫缺陷裸鼠模型的制备方法及应用 |
CN111100876A (zh) * | 2018-10-25 | 2020-05-05 | 立沃生物科技(深圳)有限公司 | CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA |
CN111621523A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-09-04 | 湖南昭泰生物医药有限公司 | 一种ace2细胞人源化的小鼠模型及其构建方法和应用 |
CN112237637A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-19 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种基于免疫缺陷小鼠脑瘫模型的细胞治疗研究方法 |
CN113106101A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-07-13 | 广州欣意生物技术有限公司 | 一种nod遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法及应用 |
WO2022012544A1 (zh) * | 2020-07-13 | 2022-01-20 | 黄菁 | 对非人动物进行基因改造和构建免疫缺陷动物模型的方法 |
WO2022062055A1 (zh) * | 2020-09-23 | 2022-03-31 | 南京启真基因工程有限公司 | Crispr***及其在制备多基因联合敲除的重症免疫缺陷克隆猪核供体细胞中的应用 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108504685A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-09-07 | 宜明细胞生物科技有限公司 | 一种利用CRISPR/Cas9***同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法 |
CN108925500A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-12-04 | 广东药科大学 | Lfa-1敲除的自发肠道肿瘤基因工程鼠的应用与研究方法 |
CN109735485B (zh) * | 2019-01-29 | 2021-04-16 | 深圳市拓普生物科技有限公司 | 人源化肝脏动物模型及其构建方法和应用 |
CA3149497A1 (en) | 2019-08-09 | 2021-02-18 | Nutcracker Therapeutics, Inc. | Methods and apparatuses for manufacturing for removing material from a therapeutic composition |
CN112243949A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-01-22 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种脑瘫小鼠动物模型的构建及评价方法 |
CN114763557A (zh) * | 2021-01-13 | 2022-07-19 | 北京市农林科学院 | Ddx5在抗病毒和调节免疫反应中的应用 |
WO2023077360A1 (zh) * | 2021-11-04 | 2023-05-11 | 云南农业大学 | 一种构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103409468A (zh) * | 2013-03-20 | 2013-11-27 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种免疫缺陷小鼠模型的建立方法 |
WO2015086727A2 (en) * | 2013-12-11 | 2015-06-18 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | New prognostic method for patients suffering of a cancer |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010127275A1 (en) * | 2009-05-01 | 2010-11-04 | Oregon Health & Scince University | Method of expanding human hepatocytes in vivo |
-
2016
- 2016-02-25 CN CN201610103735.6A patent/CN107119076A/zh active Pending
-
2017
- 2017-01-19 CN CN201911347317.1A patent/CN110951787B/zh active Active
- 2017-01-19 WO PCT/CN2017/071697 patent/WO2017143894A1/zh active Application Filing
- 2017-01-19 CN CN201780000020.0A patent/CN106661593A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103409468A (zh) * | 2013-03-20 | 2013-11-27 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种免疫缺陷小鼠模型的建立方法 |
WO2015086727A2 (en) * | 2013-12-11 | 2015-06-18 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | New prognostic method for patients suffering of a cancer |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
苏宝亮等: "人成体肝细胞在Fah−/−Nod/Scid小鼠肝脏中的显著增殖", 《中国科学:生命科学》 * |
郑瑶: "乳腺癌细胞移植瘤模型的建立及小动物超声和活体荧光成像的应用比较", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108396036A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-08-14 | 昆明医科大学 | 一种过表达cox5a转基因鼠模型及其构建方法与应用 |
CN108396036B (zh) * | 2018-03-01 | 2021-08-03 | 昆明医科大学 | 一种过表达cox5a转基因鼠模型及其构建方法与应用 |
CN110283850A (zh) * | 2018-03-19 | 2019-09-27 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | 一种免疫缺陷裸鼠模型的制备方法及应用 |
CN108504624A (zh) * | 2018-04-08 | 2018-09-07 | 深圳市体内生物医药科技有限公司 | 一种免疫缺陷小鼠模型的新应用 |
CN111100876A (zh) * | 2018-10-25 | 2020-05-05 | 立沃生物科技(深圳)有限公司 | CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA |
CN111621523A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-09-04 | 湖南昭泰生物医药有限公司 | 一种ace2细胞人源化的小鼠模型及其构建方法和应用 |
WO2022012544A1 (zh) * | 2020-07-13 | 2022-01-20 | 黄菁 | 对非人动物进行基因改造和构建免疫缺陷动物模型的方法 |
WO2022062055A1 (zh) * | 2020-09-23 | 2022-03-31 | 南京启真基因工程有限公司 | Crispr***及其在制备多基因联合敲除的重症免疫缺陷克隆猪核供体细胞中的应用 |
CN112237637A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-19 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种基于免疫缺陷小鼠脑瘫模型的细胞治疗研究方法 |
CN113106101A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-07-13 | 广州欣意生物技术有限公司 | 一种nod遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法及应用 |
CN113106101B (zh) * | 2021-05-11 | 2023-04-07 | 广州欣意生物技术有限公司 | 一种nod遗传背景双基因缺陷小鼠模型的制备方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110951787B (zh) | 2023-08-08 |
CN110951787A (zh) | 2020-04-03 |
WO2017143894A1 (zh) | 2017-08-31 |
CN107119076A (zh) | 2017-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106661593A (zh) | 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用 | |
CN108660161B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
CN107287245A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法 | |
CN105039339A (zh) | 一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA | |
CN105132427A (zh) | 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA | |
CN106417184A (zh) | 经遗传修饰的动物及其生成方法 | |
JP6958917B2 (ja) | 遺伝子ノックイン細胞の作製方法 | |
CN106282231B (zh) | 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用 | |
CN105505879B (zh) | 一种培养转基因动物胚胎细胞或转基因动物的方法及培养基 | |
CN113088521A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法 | |
CN110184301A (zh) | 通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合 | |
CN113615643B (zh) | 一种可诱导b细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用 | |
CN104334017B (zh) | 尿激酶型纤溶酶原激活剂转基因小鼠 | |
CN113234756A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的LAMA3基因敲除动物模型的构建方法 | |
Tanihara et al. | Pigs with an INS point mutation derived from zygotes electroporated with CRISPR/Cas9 and ssODN | |
CN110250108B (zh) | Rprm基因敲除小鼠模型及其构建方法与应用 | |
CN111088290B (zh) | 一种杜鹃素在基因编辑中的应用 | |
CN114250247B (zh) | Glud1突变基因敲入小鼠动物模型的构建方法及其应用 | |
CN104962595A (zh) | 一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法 | |
CN114763557A (zh) | Ddx5在抗病毒和调节免疫反应中的应用 | |
CN110283851B (zh) | 与恶性胸腔积液相关的靶点myo9b及其应用 | |
CN109068620A (zh) | 基因编辑的猪 | |
CN101412999A (zh) | 一种基因打靶定点转基因方法及其应用 | |
CN111778288A (zh) | 构建hbv转基因小鼠模型的方法、组合物和应用 | |
CN105132426A (zh) | 一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190313 Address after: 410007 402 houses of Zhongnan headquarters base 688, two, 688 Wan Li South Road, Yuhua District, Changsha, Hunan Applicant after: Hunan Zhao Tai Biological Medicine Co.,Ltd. Address before: 518100 5th Floor, Five Buildings, Hongwan Industrial Zone, Gushi Community, Xixiang Street, Baoan District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant before: SHENZHEN IN VIVO BIOMEDICINE TECHNOLOGY Ltd. |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170510 |