CN109735485B

CN109735485B - 人源化肝脏动物模型及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN109735485B
Application number: CN201910085265.9A
Authority: CN
Inventors: 饶秀茸; 黄�益; 易艳琼; 李泓彦
Original assignee: Shenzhen Topbiotech Co ltd
Current assignee: Shenzhen lingfu topu Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: CN109735485A

Abstract

本发明涉及一种人源化肝脏动物模型及其构建方法和应用。该人源化肝脏动物模型的构建方法包括以下步骤：将人源肝祖细胞注射入肝脏经部分切除的免疫缺陷动物中，得到人源化肝脏动物模型。经上述人源化肝脏动物模型的构建方法简捷，避免在构建过程中使用肝损伤药物、病毒、细菌等而给建模后期的应用带来干扰的问题。

Description

人源化肝脏动物模型及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种人源化肝脏动物模型及其构建方法和应用。

背景技术

肝病是指发生在肝脏的病变，肝病种类繁多包括甲肝，乙肝，丙肝，脂肪化，肝癌，肝硬化，酒精性或非酒精性肝病等，肝病是一种常见的对人类的生活有着极大危害疾病。中国是肝病发病率最大的国家之一，有数据统计近年来肝炎、脂肪肝、药物性肝损害、肝癌肝硬化等肝病已威胁人类的健康生活，其中以病毒性肝炎的发病率最高，发病率逐年增长。根据世界卫生组织(WHO)对肝病死亡率的研究，在过去20年里，全世界因肝硬化和肝癌死亡的总人数每年增加5000万。经过多年的研究，我们国家的肝脏疾病谱存在着如下的特点：一是肝病种类丰富，至少有100多种；二是感染性肝病仍然是比重大；三是感染肝病的年龄年轻化；四是非感染肝病的种类呈现明显上升的趋势。

针对上述肝病，全球药企及科研单位积极投入大量人力和物力，力求能研制出具有良好治疗效果的药物。但目前肝病药物研制前期主要采用普通动物造模进行药物进行初步的筛选和药效评价，比如小鼠模型，但毕竟动物的肝脏与人类的肝脏存在相当大的差异，因此，不能很好的模拟人肝脏对药物的反应。

发明内容

基于此，有必要提供一种人源化肝脏动物模型的构建方法。

此外，还提供一种人源化肝脏动物模型及应用。

一种人源化肝脏动物模型的构建方法，包括以下步骤：

将人源肝祖细胞注射入肝脏经部分切除的免疫缺陷动物中，得到人源化肝脏动物模型。

上述人源化肝脏动物模型的构建方法，采用肝脏经部分切除的免疫缺陷动物为构建模型的对象进行人源肝祖细胞注射而构建人源化肝脏动物模型，一方面避免在人源肝祖细胞注射入动物体内后因异种的免疫排斥而对动物进行环孢素A、放射线等免疫抑制而带来的模型构建完成之后的应用局限；另一方面也避免了使用药物、病毒、细菌等造成肝损伤后对建模之后的应用带来的干扰。而且，经证实，按照该构建方法的到的该人源化肝脏动物模型具有人胆管结构，表明构建的人源化肝脏动物模型具有肝脏的功能，能够为临床上肝病研究或者新药代谢性研究提供了一种可行的动物模型支撑，对于肝脏再生和相关研究都有重要的意义。

在其中一个实施例中，在所述将人源肝祖细胞注射入肝脏经部分切除的免疫缺陷动物中的步骤中，所述人源肝祖细胞的用量为1×10⁶个/只动物～1×10⁷个/只动物。

在其中一个实施例中，还包括所述人源肝祖细胞的获取步骤：

将人干细胞在肝细胞分化培养基中进行诱导分化，其中，所述肝细胞分化培养基中包括肝细胞生长因子、纤维生长因子及表皮生长因子。

在其中一个实施例中，所述肝细胞生长因子的质量体积浓度为10μg/L～40μg/L；所述纤维生长因子的质量体积浓度为10μg/L～20μg/L；所述表皮生长因子的质量体积浓度为10μg/L～20μg/L。

在其中一个实施例中，所述免疫缺陷动物的被切除的肝脏的质量为所述免疫缺陷动物原始肝脏的质量的50％～70％。

在其中一个实施例中，所述免疫缺陷动物为免疫缺陷小鼠或免疫缺陷大鼠。

在其中一个实施例中，所述免疫缺陷小鼠选自Nude小鼠、SCID小鼠、NOD-SCID小鼠、NSI小鼠、NCG小鼠、Rag2小鼠及IL2RG小鼠中的一种。

在其中一个实施例中，所述免疫缺陷动物为NCG小鼠。

一种人源化肝脏动物模型，由上述人源化肝脏动物模型的构建方法得到。

上述人源化肝脏动物模型在肝病药物筛选和药效评价中的应用。

附图说明

图1为实施例1的人源肝祖细胞的免疫荧光图；

图2为实施例2的NCG小鼠被固定及腹部开口的示意图；

图3为实施例2的NCG小鼠的肝脏被切除的部分；

图4为实施例2的将人源肝祖细胞注射入NCG小鼠的脾脏中的示意图；

图5为实施例2的人源化肝脏动物模型的肝脏免疫组化检测结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的人源化肝脏动物模型的构建方法，包括以下步骤：

S110、将免疫缺陷动物的肝脏经手术部分切除，得到肝损伤动物。

免疫缺陷动物是指由于先天性遗传突变或用人工的方法造成一种或多种免疫***组成成分缺陷的动物。在本实施方式中，免疫缺陷动物为非人类哺乳动物。优选地，所述免疫缺陷动物为啮齿类动物。进一步地，免疫缺陷动物为免疫缺陷大鼠或免疫缺陷小鼠。在其中一个实施例中，免疫缺陷小鼠选自Nude小鼠、SCID小鼠、NOD-SCID小鼠、NSI小鼠、NCG小鼠、Rag2小鼠及IL2RG小鼠中的一种。

具体地，将免疫缺陷动物的肝脏经手术部分切除的步骤具体包括：

将免疫缺陷动物的腹部开口，然后将免疫动物的肝脏从开口挤出，将挤出的免疫动物的肝脏结扎并切除，其中，被切除的肝脏的质量为免疫缺陷动物原始肝脏的质量的50％～70％。进一步地，被切除的肝脏的质量为免疫缺陷动物肝脏的质量的50％、55％、60％、65％或70％。

上述肝脏经部分切除的免疫缺陷动物，在注射入人源肝祖细胞后，能够避免使用药物比如环孢素A，对动物进行免疫抑制处理而减弱异种间的免疫排斥，不影响后续动物构建完成后的如药物筛选和药效评价等的应用。另外，因上述肝脏经部分切除的免疫缺陷动物避免了免疫抑制处理而动物的存活率也能得到提高。

在一些实施例中，肝脏经部分切除的免疫缺陷动物可以购得。

S130、将人源肝祖细胞注射入肝脏经部分切除的免疫缺陷动物中，得到人源化肝脏动物模型。

具体地，将人源肝祖细胞注射入肝脏经部分切除的免疫缺陷动物，得到人源化肝脏动物模型的步骤包括以下操作：

S131、制备人源肝祖细胞。

肝祖细胞又称为小肝细胞、胆管上皮样细胞，是一类分布于成体肝脏，具有双向分化潜能的异质性细胞。人源肝祖细胞也即是人的肝祖细胞，由人干细胞分化而成。其中，人干细胞是分离培养的人干细胞或商业化的人干细胞。进一步地，人干细胞选自人脐带间充质干细胞、IPS细胞及胚胎干细胞中的一种。

具体地，将人干细胞在肝细胞分化培养基中进行诱导分化，其中，肝细胞分化培养基中包括肝细胞生长因子、纤维生长因子及表皮生长因子。干细胞具有多能性，如果没有定向分化，也难以形成肝祖细胞。进一步地，细胞分化培养基中肝细胞生长因子的质量体积浓度为10μg/L～40μg/L；纤维生长因子的质量体积浓度为10μg/L～20μg/L；表皮生长因子的质量体积浓度为10μg/L～20μg/L。优选地，肝细胞生长因子的质量体积浓度为12μg/L、16μg/L、20μg/L、25μg/L、30μg/L或35μg/L；纤维生长因子的质量体积浓度为12μg/L、14μg/L、16μg/L或18μg/L；表皮生长因子的质量体积浓度为12μg/L、14μg/L、16μg/L或18μg/L。进一步地，肝细胞生长因子与纤维生长因子的质量体积浓度比为2：0.5～4。肝细胞生长因子与表皮生长因子的质量体积浓度比为1：0.5～2。

S133、将人源肝祖细胞注射入肝脏经部分切除的免疫缺陷动物，得到人源化肝脏动物模型。

具体地，注射方式选自皮下注射、包膜注射、静脉注射、腹腔注射和脾脏注射中的一种。优选地，注射方式为脾脏注射。将人源肝祖细胞注射到脾脏内，人源肝祖细胞通过血液循环转运到肝脏内，并对损伤的肝脏进行修复。利用肝脏的超强的修复能力，在肝脏切除后补充人源肝祖细胞，使得肝脏经部分切除的免疫缺陷动物的肝脏迅速利用外源的人源肝祖细胞对该损伤进行修复，从而生成的人源化肝脏小鼠模型。

在其中一个实施例中，人源肝祖细胞的用量为1×10⁶/只动物～1×10⁷/只动物。进一步地，人源肝祖细胞的用量为1×10⁶个/只动物、3×10⁶个/只动物、5×个10⁶/只动物、7×个10⁶/只动物或1×1个0⁷/只动物。按照此用量进行注射，人源肝祖细胞更容易在小鼠肝脏中生长分化，形成胆管。

人源肝祖细胞的用量是影响人源肝祖细胞能否在肝脏经部分切除的免疫缺陷动物体内生长存活的关键。细胞量过高，会造成动物血管堵塞，引起动物死亡；细胞量过低也达不到效果。按照上述用量，人源肝祖细胞能够在肝损伤动物的肝内生长分化并修复受损肝脏。

上述人源化肝脏动物模型的构建方法，操作简便、周期短、便于大规模生产。经上述人源化肝脏动物模型的构建方法构建得到的上述人源化肝脏动物模型中具有人源的胆管的形成，无其他药物、病毒、细菌等干扰，有利于肝病药物的筛选和药效评价。

一种肝病药物的药效评价方法，包括以下步骤：

将肝病药物注射入上述人源化肝脏动物模型中；及评价肝病药物的药效。

一种肝病药物的筛选方法，包括以下步骤：

将肝病药物注射入上述人源化肝脏动物模型中；及筛选肝病药物。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1分离并诱导成人源肝祖细胞

(1)在无菌环境下，将人脐带(来自南山医院)沿中心剪开、分离血管后，将剩余组织剪成约2mm³小块，然后内侧贴于预先用1ml干细胞完全培养基(人源脐带间充质干细胞培养基，友康生物)润湿的10cm细胞培养皿中。然后置于37℃、体积分数为5％的CO₂二氧化碳培养箱中培养2h，待组织贴紧后加8ml完全培养基(人源脐带间充质干细胞培养基，友康生物)。每3天换液一次，期间观察贴块周围贴壁细胞爬出情况；培养2周后得到人源原代脐带间充质干细胞。

(2)收集分离得到的人源原代脐带间充质干细胞，用肝脏定向分化培养基(赛业：HUXMX-90101)进行诱导分化成人源肝祖细胞，诱导分化14天后，利于免疫荧光法鉴定之后，得到人源肝祖细胞。其中鉴定结果如图1所示，图1中亮白部分为人源肝祖细胞。

实施例2人源化肝脏动物模型的建立

(1)如图2所示～图3所示，将NCG小鼠(南京大学模式动物研究所)麻醉后仰卧位固定，并在小鼠腹部开口1cm长的切口，从开口的两边向中间挤压，将肝脏挤出，并将挤出的肝脏向近心端进行结扎，结扎后将整个肝脏体积的50％切除，并将其余的肝放回到腹部，把小鼠放回笼中饲养2天，得到肝损伤小鼠。

(2)如图4所示，将人源肝祖细胞以1×10⁷个/只注射入步骤(1)得到的肝损伤小鼠的脾脏中，分别在注射后1周、2周、4周通过免疫组化检测肝脏的检测人ALB标志蛋白，以组织切片免疫组化标准确定免人源化肝脏动物模型的建立。其中，注射4周后的肝脏检测结果如图5所示。在图5中，深灰色(实际彩色照片中为褐色)的为为ALB标志蛋白，黑色(实际彩色照片中为深蓝色)为胆管，小鼠肝脏内人源肝脏的嵌合率为60％。由图5可以看出，人源化肝脏动物模型的建立。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种人源化肝脏动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将人源肝祖细胞注射入肝脏经部分切除的免疫缺陷动物中，得到人源化肝脏动物模型，其中，所述免疫缺陷动物为免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷动物的被切除的肝脏的质量为所述免疫缺陷动物原始肝脏的质量的50％～60％，所述人源肝祖细胞的用量为1×10⁷个/只动物。

2.根据权利要求1所述的人源化肝脏动物模型的构建方法，其特征在于，还包括所述人源肝祖细胞的获取步骤：

3.根据权利要求2所述的人源化肝脏动物模型的构建方法，其特征在于，所述肝细胞生长因子的质量体积浓度为10μg/L～40μg/L；所述纤维生长因子的质量体积浓度为10μg/L～20μg/L；所述表皮生长因子的质量体积浓度为10μg/L～20μg/L。

4.根据权利要求3所述的人源化肝脏动物模型的构建方法，其特征在于，所述肝细胞生长因子与所述纤维生长因子的质量体积浓度比为2：0.5～4，所述肝细胞生长因子与所述表皮生长因子的质量体积浓度比为1：0.5～2。

5.根据权利要求1所述的人源化肝脏动物模型的构建方法，其特征在于，所述免疫缺陷小鼠选自Nude小鼠、SCID小鼠、NOD-SCID小鼠、NSI小鼠、NCG小鼠、Rag2小鼠及IL2RG小鼠中的一种。

6.根据权利要求5所述的人源化肝脏动物模型的构建方法，其特征在于，所述免疫缺陷动物为NCG小鼠。

7.权利要求1～6任一项所述的人源化肝脏动物模型在肝病药物筛选和药效评价中的应用。