CN106659716B

CN106659716B - 阿吡莫德组合物及其使用方法

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Publication number: CN106659716B
Application number: CN201580016018.3A
Authority: CN
Inventors: H.卢亨施泰因; J.M.罗思伯格; S.盖尔; N.比哈里; P.贝克特; S.兰德雷特; C.康拉德; M.戴尔; T.徐
Original assignee: Artificial Intelligence Treatment Co
Current assignee: Artificial Intelligence Treatment Co
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2035-01-23
Also published as: IL246879B; AU2015209133B2; NZ722491A; AU2015209133A1; US20200268764A1; CN106659716A8; IL246879A0; BR112016017112A2; RU2016134406A3; RU2016134406A; CN106659716A; WO2015112888A1; JP2021046430A; US20190183902A1; KR20160126984A; EP3096757A4; CA2937655A1; MX2016009590A; RU2019107011A; US20170007613A1

Abstract

本发明涉及用阿吡莫德治疗癌症的方法以及相关组合物和方法。

Description

阿吡莫德组合物及其使用方法

发明领域

本发明涉及包含阿吡莫德(apilimod)的组合物及其使用方法。

发明背景

阿吡莫德，也称为STA-5326，以下称为“阿吡莫德”，被认为是一种强效的IL-12与IL-23的转录抑制剂。参见例如Wada等人Blood 109(2007):1156-1164。IL-12和IL-23是通常由免疫细胞如B细胞和巨噬细胞响应抗原刺激而产生的炎性细胞因子。自身免疫性疾病和以慢性炎症为特征的其它疾病部分由不适当地产生这些细胞因子来表征。在免疫细胞中，通过阿吡莫德选择性抑制IL-12/IL-23转录近来显示受到阿吡莫德向磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶(PIKfyve)的直接结合的介导。参见例如Cai等人Chemistry and Biol.20(2013):912-921。PIKfyve在Toll样受体发信号中起作用，这在先天免疫中是重要的。

基于其作为免疫调节剂和IL-12/IL-23的特异性抑制剂的活性，已经提出阿吡莫德可用于治疗自身免疫性和炎性的疾病与失调。参见例如US 6,858,606和6,660,733(描述了一类嘧啶化合物，包括阿吡莫德，据称可用于治疗以IL-12或IL-23过度产生为特征的疾病和失调，如类风湿性关节炎、脓毒症、克罗恩病、多发性硬化症、银屑病或胰岛素依赖型糖尿病)。类似地，基于其抑制c-Rel或IL-12/23的活性，有人建议阿吡莫德可用于治疗某些癌症，特别是在其中这些细胞因子据信在促进异常的细胞增殖方面起作用的癌症中。参见例如WO 2006/128129和Baird等人,Frontiers in Oncology 3:1(分别为2013)。

三种阿吡莫德临床试验各自专注于其在自身免疫性和炎性疾病中的潜在功效。在患有银屑病、类风湿性关节炎和克罗恩病的患者中进行该试验。在患有银屑病的患者中的开放标签临床研究的结论是，口服阿吡莫德显示了支持抑制IL-12/IL-23合成的免疫调节活性，用于治疗TH1-和TH17-介导的炎性疾病。Wada等人,PLosOne 7:e35069(2012年4月)。但是在类风湿性关节炎和克罗恩病中的对照试验的结果不支持阿吡莫德对IL-12/IL-23的抑制转化为这些适应证任一的临床改善的概念。在患有类风湿性关节炎的患者中的随机双盲安慰剂对照的阿吡莫德II期临床试验中，阿吡莫德未能改变滑膜的IL-12与IL-23表达。Krauz等人,Arthritis&Rheumatism 64:1750-1755(2012)。作者得出结论“结果不支持阿吡莫德对IL-12/IL-23的抑制能够在RA中诱导强有力的临床改善的概念”。类似地，用于治疗活动性(active)克罗恩病的阿吡莫德的随机双盲安慰剂对照试验得出以下结论：尽管耐受性良好，阿吡莫德未表现出超越安慰剂的功效。Sands等人Inflamm Bowel Dis.2010 Jul；16(7):1209-18。

雷帕霉素哺乳动物靶蛋白(mTOR)通路是重要的细胞信号通路，其参与多种生理功能，包括细胞生长、细胞增殖、代谢、蛋白质合成和自体吞噬(La Plante等人Cell 2012,(149(2),第274-293页)。mTOR是集成了发送氨基酸、应激、氧、能量和生长因子的水平信号的胞内与胞外信号并调节对这些环境信号的细胞响应的激酶。mTOR调节异常(deregulation)已经牵涉了多种失调和疾病，包括癌症、肥胖、糖尿病和神经退行性变。已经探索了mTOR通路的某些组分作为用于治疗一些此类疾病的药物靶标。但是，疗效是有限的，例如在一些癌症的治疗中，并且一些mTOR抑制剂已经显示对代谢具有不利影响。该结节性硬化症复合肿瘤抑制基因TSC1与TSC2是mTOR的负调节物。

发明概述

本发明部分基于令人惊讶的发现：阿吡莫德在TSC裸细胞中是高度细胞毒性剂。在这些细胞中，mTOR通路是组成性活性的。该mTOR通路在多种癌症中被激活，并且在进一步筛选超过100种癌细胞系时，阿吡莫德在来自不同癌症的细胞系中显示出抗增殖活性。在阿吡莫德敏感性癌细胞系中，B细胞淋巴瘤是最为敏感的。但是，预料不到的是，B细胞淋巴瘤对阿吡莫德的差异敏感性与这些细胞中的c-Rel表达、IL-12表达或IL-23表达不相关。这是令人惊讶的，因为较早期的工作已提出阿吡莫德将可用于对抗其中c-Rel和/或IL-12/23表达在促进异常细胞增殖方面至关重要的癌症。相反，本发明人证明，阿吡莫德在癌细胞中的细胞毒活性是由于胞内运输的抑制和细胞凋亡方面的相应提高。根据阿吡莫德的免疫调节活性(经由其抑制IL-12/23产生)无法预测这种活性。此外，筛选超过450种激酶将PIKfyve确定为人类癌细胞系中唯一的阿吡莫德高亲和力结合靶(Kd＝75pM)。本发明提供了用于阿吡莫德的治疗用途的新方法，尤其是治疗癌症，且特别是治疗B细胞淋巴瘤，且尤其是对标准化疗方案耐受或顽固的那些。

在一方面，本发明提供了在需要其的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的阿吡莫德组合物，所述组合物包含阿吡莫德，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前药、类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。在一个实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用至少一种附加活性剂。所述至少一种附加活性剂可以是治疗剂或非治疗剂。所述至少一种附加活性剂可以与该阿吡莫德组合物一起在单一剂型中施用，或与该阿吡莫德组合物在分开的剂型中施用。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自烷基化剂、***剂、微管蛋白结合剂、皮质类固醇及其组合。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自依鲁替尼(ibrutinib)、利妥昔单抗、多柔比星、***龙、长春新碱、万珂和依维莫司及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自环磷酰胺、羟基柔红霉素(也称为多柔比星或Adriamycin^TM)、长春新碱(也称为Oncovin^TM)、***、***龙及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选择以改善阿吡莫德组合物的一种或更多种副作用的非治疗剂。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。

在一个实施方案中，该阿吡莫德组合物的剂型是口服剂型。在另一实施方案中，该阿吡莫德组合物的剂型适于静脉内施用。在一个实施方案中，当该剂型适于静脉内施用时，通过单次注射或通过滴灌袋(drip bag)进行施用。

在一个实施方案中，所述受试者是人类癌症患者。在一个实施方案中，需要用本发明的阿吡莫德组合物治疗的人类癌症患者是其癌症对标准化疗方案顽固的患者。在一个实施方案中，需要用阿吡莫德组合物治疗的人类癌症患者是其癌症在用标准化疗方案治疗后已经复发的患者。在一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一个实施方案中，所述癌症是B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是非霍奇金B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述非霍奇金B细胞淋巴瘤选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤。在一个实施方案中，所述非霍奇金B细胞淋巴瘤是DLBCL。在一个实施方案中，所述DLBCL是GCB亚型。

在一个实施方案中，所述标准化疗方案包含一种或更多种选自依鲁替尼、利妥昔单抗、多柔比星、***龙、长春新碱、万珂、环磷酰胺、***和依维莫司的治疗剂。在一个实施方案中，所述标准化疗方案选自CHOP(环磷酰胺、羟基柔红霉素、Oncovin^TM(长春新碱)和***或***龙)、COOP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、***)、CVP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、***)、EPOCH(依托泊苷、***、硫酸长春新碱、环磷酰胺、盐酸多柔比星)、Hyper-CVAD(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸多柔比星、***)、ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)、R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、***)和R-CVP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、***)。

在一个实施方案中，所述方法是使用包含阿吡莫德组合物与用于治疗淋巴瘤的化疗方案的联合疗法治疗淋巴瘤的方法。在一个实施方案中，所述化疗方案是CHOP方案。在另一实施方案中，该化疗方案选自COOP、CVP、EPOCH、Hyper-CVAD、ICE、R-CHOP和R-CVP。

在一些实施方案中，在本文中提供阿吡莫德组合物，所述组合物可用于治疗与TSC缺乏和/或mTOR激活相关的癌症。在一些实施方案中，在本文中提供了使用阿吡莫德组合物治疗TSC1-或TSC2-缺乏型癌症的方法。在一些实施方案中，提供了使用阿吡莫德组合物治疗mTOR相关癌症的方法。在一些实施方案中，mTOR相关癌症与缺失、功能丢失突变、低表达或其它TSC1或TSC2缺乏相关。在一些实施方案中，mTOR相关癌症与导致癌症细胞中mTOR通路活性的激活(例如组成性激活)的功能获得突变相关。在一些实施方案中，在本文中提供了进一步包括根据受试者的TSC1、TSC2和/或mTOR状态来确定患有癌症的受试者是否是用阿吡莫德组合物进行治疗的候选者的方法。例如，在一些实施方案中，具有TSC1或TSC2缺乏(例如在TSC1或TSC2中的失活性突变)或组成性活性的mTOR信号的受试者是用阿吡莫德组合物进行治疗的候选者。

附图简述

图1：TSC2缺陷细胞对阿吡莫德高度敏感(IC₅₀＝20nM)。

图2A：癌细胞系对阿吡莫德的敏感性(具有小于500nM的IC₅₀的细胞系的百分比)。

图2B：NHL细胞系对阿吡莫德特别敏感(具有小于500nM的IC₅₀的细胞系的百分比)。

图2C：阿吡莫德的细胞毒活性对癌细胞是选择性的，超出正常细胞。正常的肺成纤维细胞在高达10微摩尔的浓度下对阿吡莫德诱导的细胞毒性不敏感。

图3：弥漫性大B细胞淋巴瘤，SUDHL-4，表现出50nM的IC₅₀。

图4：阿吡莫德在NHL细胞中的细胞毒活性是提高的细胞凋亡的结果。在向培养基中添加阿吡莫德后48小时在阿吡莫德处理的弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中的细胞凋亡(半胱天冬酶(Caspase)-3/7，中间的条)和坏死(双-AAF-R110，右侧的条)标记；左侧的条显示存活率标记(GF-AFC)。

图5：阿吡莫德以剂量依赖性方式诱导自体吞噬。

图6：在0.1μM浓度下在优化的捕获条件下应用CT-689的显著捕获命中(capturedhits)的火山图。

图7：阿吡莫德以高亲和力结合到PIKfyve上(Kd＝75pM)。

图8：在阿吡莫德敏感(系#1-13)和不敏感(系#14-22)的B细胞淋巴瘤系中的RELCCLE表达。

图9：在阿吡莫德敏感(#1-23系)和不敏感(#24-75系)的癌细胞系中的IL12A CCLE表达。

图10：在阿吡莫德敏感(#1-23系)和不敏感(#24-75系)的癌细胞系中的IL12BCCLE表达。

图11：在阿吡莫德敏感(#1-23系)和不敏感(#24-75系)的癌细胞系中的IL12RB1CCLE表达。

图12：在阿吡莫德敏感(#1-23系)和不敏感(#24-75系)的癌细胞系中的IL12RB2CCLE表达。

图13：在阿吡莫德敏感(#1-23系)和不敏感(#24-75系)的癌细胞系中的IL23RCCLE表达。

图14：在阿吡莫德敏感(#1-23系)和不敏感(#24-75系)的癌细胞系中的IL23ACCLE表达。

图15：在非霍奇金B细胞淋巴瘤中，IL-23A表达并不是敏感性的统计学显著预测指标。显示的是阿吡莫德敏感(底部，深色)和不敏感(顶部，浅色)的NHB细胞系。

图16：阿吡莫德抑制SU-DHL-6 DLBCL异种移植肿瘤的生长；顶部的线显示了媒介物盐水(菱形，浅灰色实线)QD×5，2天停药，QD×5i.v.；0.5％甲基纤维素(三角形，深灰色实线)QD×5，2天停药，QD×5p.o.；二甲磺酸阿吡莫德(正方形，虚线)67.5毫克/千克(47毫克/千克游离碱)QD×5i.v.，2天停药，QD×5；阿吡莫德游离碱(正方形，浅灰色实线)150毫克/千克QD×5，2天停药，QD×5p.o；阿吡莫德游离碱(叉，实线)75毫克/千克BID×5，2天停药，BID×5p.o.。

图17：阿吡莫德结合依鲁替尼对DLBCL肿瘤在体内的抗肿瘤活性；顶部的线显示媒介物(菱形，浅灰色实线)QD×5，2天停药，QD×5p.o.+i.v.；依鲁替尼(三角形，深灰色实线)10毫克/千克QD x12i.v.；阿吡莫德游离碱(正方形，虚线)75毫克/千克QD×5，2天停药，QD×5p.o.；依鲁替尼(叉，深色实线)20毫克/千克QD×12i.v.；阿吡莫德游离碱75毫克/千克QD×5，2天停药，QD×5p.o.+依鲁替尼10毫克/千克QD×12i.v.(正方形，浅灰色实线)；阿吡莫德游离碱75毫克/千克QD×5，2天停药，QD×5p.o.+依鲁替尼10毫克/千克QD×12i.v.(圆形，中灰色实线)。

图18：在含有和不含有阿吡莫德(10nM)的情况下用93种药物的人工组织图书馆(manually curated library)筛选SU-DHL-4细胞确定了依鲁替尼作为与阿吡莫德结合时发挥协同活性的药物。

图19：阿吡莫德诱导代表性癌细胞系的液泡化。左侧：未处理的细胞。右侧：用500nM阿吡莫德处理24小时的活细胞。

发明详述

本发明提供涉及在需要此类治疗的受试者，优选人类受试者中使用阿吡莫德治疗癌症的组合物和方法。本发明通常涉及阿吡莫德的新用途，其基于令人惊讶的发现：阿吡莫德针对淋巴和非淋巴来源的一系列癌细胞的细胞毒活性(并非明确涉及阿吡莫德的已知免疫调节和IL-12/23抑制活性或可由所述已知活性预测的活性)。此外，基于使用阿吡莫德和至少一种附加治疗剂的联合疗法，本发明向癌症治疗提供了新的治疗方法。本文中描述的联合疗法利用了阿吡莫德的独特的细胞毒活性，所述细胞毒活性在与其它治疗剂(包括例如抗癌剂)结合时显示提供协同效应。

本文中所用的术语“阿吡莫德组合物”可以指包含阿吡莫德本身(游离碱)的组合物，或可以如下所述涵盖阿吡莫德的药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前药、类似物或衍生物。阿吡莫德的结构显示在式I中：

阿吡莫德的化学名称是2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶(IUPAC名称：(E)-4-(6-(2-(3-甲基亚苄基)肼基)-2-(2-(吡啶-2-基)乙氧基)嘧啶-4-基)吗啉)，并且CAS编号为541550-19-0。

阿吡莫德可以例如根据美国专利号7,923,557和7,863,270以及WO 2006/128129中描述的方法来制备。

本文中所用的术语“药学上可接受的盐”是由例如酸和阿吡莫德组合物的碱性基团形成的盐。说明性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、苯磺酸盐(besylate)、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、glucaronate、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(例如1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。在优选实施方案中，阿吡莫德的盐包含甲磺酸盐。

术语“药学上可接受的盐”还指的是由具有酸性官能团，如羧酸官能团的阿吡莫德组合物与药学上可接受的无机或有机碱制备的盐。

术语“药学上可接受的盐”还指的是由具有碱性官能团，如氨基官能团的阿吡莫德组合物与药学上可接受的无机或有机酸制备的盐。

本文中所述的化合物的盐可以由母体化合物通过常规化学方法来合成，如Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.Hemrich Stalil(编者),Camille G.Wermuth(编者),ISBN:3-90639-026-8,2002年8月中描述的方法。通常，此类盐可以通过使母体化合物与适当的酸在水中或在有机溶剂中或在二者的混合物中反应来制备。

本文中所述的化合物的一种盐形式可以通过本领域技术人员熟知的方法转化成游离碱和任选转化成另一种盐形式。例如，可以通过使盐溶液通过含有胺固定相的柱(例如Strata-NH₂柱)来形成该游离碱。或者，该盐的水溶液可以用碳酸氢钠处理以分解该盐并沉淀出该游离碱。该游离碱可以随后使用常规方法与另一种酸混合。

本文中所用的术语“多晶型物”指的是本发明的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)或其络合物的固体结晶形式。相同化合物的不同多晶型物可以展现出不同的物理、化学和/或光谱性质。不同的物理性质包括但不限于稳定性(例如，对热或光)、可压缩性和密度(在制剂和产品制造中是重要的)，以及溶解速率(这可以影响生物利用度)。稳定性方面的差异可能来自于化学反应性(例如不同的氧化，使得剂型在由一种多晶型物组成时比由另一种多晶型物组成时更快速地变色)或机械特性(例如，由于动力学有利的多晶型物转化成热力学更稳定的多晶型物，片剂在储存时破裂)或二者(例如，一种多晶型物的片剂更容易在高湿度下破碎)的变化。多晶型物的不同物理性质可影响它们的加工。例如，一种多晶型物与另一种多晶型物相比可能更可能形成溶剂化物或可能更难以过滤或洗涤至不含杂质，归因于例如其粒子的形状或尺寸分布。

本文中所用的术语“水合物”指的是本发明的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)或其盐，其进一步包括化学计算量或非化学计算量的通过非共价分子间力结合的水。

本文中所用的术语“包合物”指的是晶格形式的本发明的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)或其盐，所述晶格包含具有捕获在其中的客体分子(例如溶剂或水)的空间(例如，通道)。

本文中所用的术语“前药”指的是本文中所述的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)的衍生物，其可以在生物条件(体外或体内)下水解、氧化或以其它方式反应以提供本发明的化合物。前药可以仅在生物条件下在此类反应时变为活性，或它们可以以其未反应形式具有活性。在本发明中设想的前药的实例包括但不限于本文中所述的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)的类似物或衍生物，其包含可生物水解部分，如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。前药的其它实例包括包含-NO、-NO₂、-ONO或-ONO₂部分的本文中公开的任一化学式的化合物的衍生物。通常可以使用熟知方法，如由Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery(1995),172-178,949-982(Manfred E.Wolff编著,第5版)描述的那些方法制备前药。

本文中所用的术语“溶剂化物”或“药学上可接受的溶剂化物”是一个或更多个溶剂分子缔合到本文中公开的化合物之一(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)上所形成的溶剂化物。术语溶剂化物包括水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等等)。

本文中所用的术语“类似物”指的是结构上类似于另一种但是在组成上略微不同的化合物(如一个原子被不同元素的原子替代，或存在特定官能团，或一个官能团被另一个官能团替代)。由此，类似物是在功能和外观方面而非在结构或来源方面类似于参照化合物或可与之相比的化合物。本文中所用的术语“衍生物”指的是具有共同的核心结构并被本文中所述的各种基团取代的化合物。

治疗方法

本发明提供了通过向受试者施用治疗有效量的本发明的阿吡莫德组合物，从而在需要其的受试者中治疗癌症的方法，所述组合物包含阿吡莫德，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前药、类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。本发明进一步提供了阿吡莫德组合物用于制备可用于治疗癌症的药物的用途。

在一个实施方案中，所述癌症是脑癌、胶质瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、阑尾癌、泌尿生殖***癌、肾细胞癌、***癌、膀胱癌、睾丸癌、***癌、***、卵巢癌、希-林病(von Hippel Lindau disease)、头颈部癌、胃肠癌、肝细胞癌、胆囊癌、食道癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺肿瘤、垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、恶性血液肿瘤或白血病。

在一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一个实施方案中，所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤选自霍奇金B细胞淋巴瘤和非霍奇金B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是选自DLBCL、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(MZL)或黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤(与慢性淋巴细胞性白血病重叠)和套细胞淋巴瘤的非霍奇金B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是选自伯基特淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(其可以表现为瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(

macroglobulinemia))、***边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富于T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性皮肤弥漫性大B细胞淋巴瘤、腿型(原发性皮肤DLBCL，腿型)、老年人的EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤和浆母细胞性淋巴瘤的非霍奇金B细胞淋巴瘤。

联合疗法

本发明还提供了包含联合疗法的方法。本文中所用的“联合疗法”或“综合疗法”包括施用治疗有效量的阿吡莫德组合物与至少一种附加活性剂，作为意在由阿吡莫德组合物与附加活性剂的共同作用提供有益效果的特定治疗方案的部分。“联合疗法”并非意在涵盖施用两种或更多种作为单独的单一治疗方案的部分的治疗化合物，所述单一治疗方案附带和任意地导致并未设想或预测的有益效果。

在一个实施方案中，所述方法是使用包含阿吡莫德组合物和用于治疗癌症的化疗方案的联合疗法来治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述化疗方案是CHOP方案。CHOP指的是通常用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案，由以下活性剂组成：环磷酰胺((C)yclophosphamide)，一种通过与DNA结合并导致形成交联来破坏DNA的烷基化剂；羟基柔红霉素((H)ydroxydaunorubicin，也称为多柔比星或阿霉素)，一种通过其本身在DNA碱基之间***来破坏DNA的***剂；长春新碱((O)ncovin,vincristine)，其通过与微管蛋白结合来防止细胞复制；和***((P)rednisone)或***龙((P)rednisolone)，其是皮质类固醇。在另一实施方案中，该化疗方案选自COOP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、***)、CVP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、***)、EPOCH(依托泊苷、***、硫酸长春新碱、环磷酰胺、盐酸多柔比星)、Hyper-CVAD(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸多柔比星、***)、ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)、R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、***)和R-CVP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、***)。

所述至少一种附加活性剂可以是治疗剂，例如抗癌剂或癌症化疗剂，或非治疗剂及其组合。对于治疗剂，该组合的有益效果包括但不限于治疗活性化合物的组合所产生的药代动力学或药效动力学共同作用。对于非治疗剂，该组合的有益效果可以涉及减轻与组合中的治疗活性剂相关的毒性、副作用或不良事件。

在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是缓解阿吡莫德组合物的一种或更多种副作用的非治疗剂，所述一种或更多种副作用选自恶心、呕吐、头痛、头晕(dizziness)、眩晕(lightheadedness)、嗜睡和压力中的任意一种。在该实施方案的一个方面，该非治疗剂是血清素受体(也称为5-羟色胺受体或5-HT受体)的拮抗剂。在一方面，所述非治疗剂是5-HT₃或5-HT_1a受体的拮抗剂。在一方面，所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。在另一方面，所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。

在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是抗癌剂。在一个实施方案中，所述抗癌剂是依鲁替尼。在一个实施方案中，阿吡莫德组合物与依鲁替尼一起在单一剂型中或在分开的剂型中施用。在一个实施方案中，所述剂型是口服剂型。在另一实施方案中，所述剂型适于静脉内施用。

在一个实施方案中，所述抗癌剂是批准用于治疗淋巴瘤的药物。此类药物的非限制性实例包括abitrexate(甲氨蝶呤)、adcetris(brentuximab vedotin)、ambochlorin(苯丁酸氮芥)、amboclorin(chloramucil)、arranon(奈拉滨)、becenum(卡莫司汀)、beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、bexxar(托西莫单抗和碘[¹³¹I]托西莫单抗)、BiCNU(卡莫司汀)、blenoxane(博来霉素)、博来霉素、硼替佐米、brentuximab vedotin、carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、clafen(环磷酰胺)、环磷酰胺、cytoxan(环磷酰胺)、地尼白介素-毒素连接物、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、盐酸多柔比星、folex(甲氨蝶呤)、folotyn(普拉曲沙)、替伊莫单抗、依鲁替尼、艾代拉里斯(idelalisib)、imbruvica(依鲁替尼)、甘乐能(重组干扰素α-2b)、istodax(罗米地辛)、来那度胺、瘤可宁(苯丁酸氮芥)、linfolizin(苯丁酸氮芥)、阿糖胞苷脂质体、盐酸氮芥、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、mexate(甲氨蝶呤)、mexate–AQ(甲氨蝶呤)、mozobil(普乐沙福)、mustargen(盐酸氮芥)、奈拉滨、neosar(环磷酰胺)、昂他克(地尼白介素-毒素连接物)、普乐沙福、普拉曲沙、***、重组干扰素α-2b、revlimid(来那度胺)、美罗华(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、罗米地辛、托西莫单抗和碘[¹³¹I]托西莫单抗、treanda(盐酸苯达莫司汀)、velban(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、velsar(硫酸长春碱)、硫酸长春碱、vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、伏立诺他、zevalin(替伊莫单抗)、zolinza(伏立诺他)和zydelig(艾代拉里斯)。

在一个实施方案中，所述抗癌剂选自EZH2的抑制剂，例如EPZ-6438。在一个实施方案中，所述抗癌剂选自紫杉酚、长春新碱、多柔比星、坦罗莫司、卡铂、奥法木单抗、利妥昔单抗及其组合。

在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是B细胞受体通路抑制剂。在一些实施方案中，所述B细胞受体通路抑制剂是CD79A抑制剂、CD79B抑制剂、CD 19抑制剂、Lyn抑制剂、Syk抑制剂、PI3K抑制剂、Blnk抑制剂、PLCy抑制剂、PKCP抑制剂或其组合。在一些实施方案中，所述至少一种附加剂是抗体、B细胞受体信号抑制剂、PI3K抑制剂、IAP抑制剂、mTO抑制剂、放射免疫治疗剂、DNA损伤剂、蛋白酶体抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、Hedgehog抑制剂、Hsp90抑制剂、端粒末端转移酶抑制剂、Jakl/2抑制剂、蛋白酶抑制剂、PKC抑制剂、PARP抑制剂或其组合。

在一个实施方案中，所述至少一种附加剂选自苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、多柔比星、美沙拉秦、沙利度胺、来那度胺、坦罗莫司、依维莫司、氟达拉滨、fostamatinib、紫杉醇、多西他赛、奥法木单抗、利妥昔单抗、***、***、CAL-101、替伊莫单抗、托西莫单抗、硼替佐米、喷司他丁、内皮抑素或其组合。

在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是单克隆抗体，诸如，例如阿仑珠单抗、贝伐珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、依决可单抗、吉姆单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、阿达木单抗、阿非莫单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、卡那奴单抗、达克珠单抗、美泊利单抗、托珠单抗、优特克单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿仑珠单抗、抗CD30单克隆抗体Xmab2513、抗MET单克隆抗体MetMab、阿泊珠单抗、apomab、阿西莫单抗、巴利昔单抗、双特异性抗体2B1、兰妥莫单抗、brentuximab vedotin、卡罗单抗喷地肽、西妥木单抗、claudiximab、可那木单抗、达西珠单抗、地舒单抗、依库珠单抗、依帕珠单抗、厄马索单抗、达珠单抗、芬妥木单抗(figitumumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、加利昔单抗、ganitumab、吉妥珠单抗奥佐米星、glembatumumab、替伊莫单抗、依珠单抗奥佐米星、伊匹木单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米拉珠单抗、单克隆抗体CC49、奈昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥戈伏单抗、帕妥珠单抗、ramacurimab、雷珠单抗、希普利珠单抗、sonepcizumab、他尼珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲美木单抗(tremelimumab)、西莫白介素单抗、维妥珠单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗和扎鲁木单抗。

在联合疗法的情况下，阿吡莫德组合物的施用可以与一种或更多种附加活性剂的施用同时或相继进行。在另一实施方案中，联合疗法的不同组分的施用可以以不同的频率进行。所述一种或更多种附加剂可以在施用本发明的化合物之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。

所述一种或更多种附加活性剂可以配制用于与阿吡莫德组合物一起在单一剂型中共同施用，如本文中更详细地描述的那样。所述一种或更多种附加活性剂可以与包含本发明的化合物的剂型分开施用。当该附加活性剂与阿吡莫德组合物分开施用时，其可以通过与阿吡莫德组合物相同或不同的途径给药。

优选地，与一种或更多种附加剂结合施用阿吡莫德组合物在受治疗的受试者中提供协同响应。在这方面，术语“协同”指的是该组合的功效比任一单独的单一疗法的累加效应更有效。与该组合中至少一种药剂在该组合之外的其剂量和/或频率相比，根据本发明的联合疗法的协同效应可以允许使用更低的剂量和/或更低频率地施用所述药剂。该组合的附加有益效果可能表现为避免或减少与使用该组合中单独的任一疗法(也称为单一疗法)相关的不良或不想要的副作用。

“联合疗法”还包括与非药物疗法(例如手术或放射治疗)进一步结合施用本发明的化合物。当该联合疗法进一步包括非药物治疗时，所述非药物治疗可以在任何合适的时间进行，只要实现来自该治疗性化合物与非药物治疗的组合的共同作用的有益效果。例如，在适当的情况下，当从施用治疗性化合物中暂时(可能数天或甚至数周)移除非药物治疗时，仍实现该有益效果。

该非药物治疗可以选自化疗、放射疗法、激素疗法、抗***疗法、基因疗法和手术。例如，非药物疗法是除去卵巢(例如，为了降低身体中***的水平)、胸腔穿刺术(例如，从胸部移除流体)、穿刺术(例如，从腹腔移除流体)、手术切除或收缩血管肌脂瘤、肺移植(并任选采用抗生素以防止移植造成的感染)、或氧疗法(例如，通过包含两个放置在两个鼻孔中的小塑料管或叉管的鼻插管，通过贴合在鼻子与嘴上的面罩，或通过经颈部前部***气管的小管，也称为经气管氧疗法)。

本发明还提供了通过向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的阿吡莫德组合物在该受试者中治疗mTOR相关的疾病、失调和病症的方法。此类疾病和失调包括例如其中mTOR调节异常的癌症。mTOR调节异常已经牵涉到所有癌症的70％。参见例如Menon等人Oncogene 27(2009):S43-S51。具有mTOR调节异常的组分的具体癌症包括脑肿瘤如胶质瘤(例如，多形性成胶质细胞瘤)、肉瘤、乳腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、间皮瘤、阑尾癌、泌尿生殖***癌(例如，肾细胞癌、***癌、膀胱癌、睾丸癌、***癌、***、卵巢癌、希-林病)、头颈部癌、胃肠道肿瘤(例如，肝细胞癌、胆囊癌、食道癌、胃癌、结肠直肠癌或胰腺癌)、神经内分泌肿瘤(NETs)、甲状腺肿瘤、垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、恶性血液肿瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤)、或本文中所述癌症的一种或更多种的转移形式。参见例如Laplante等人Cell 149(2012):274-293。

在本文中所述的方法的情况下，施用于受试者的阿吡莫德组合物的量是治疗有效量。术语“治疗有效量”指的是足以治疗所治疾病或失调、改善其症状、减轻其严重程度或减少其持续时间，或增强或改善另一疗法的治疗效果，或足以在受试者中表现出可检测的治疗效果的量。在一个实施方案中，阿吡莫德组合物的治疗有效量是有效抑制PIKfyve激酶活性的量。

阿吡莫德组合物的有效量可以为大约0.001毫克/千克至大约1000毫克/千克、大约0.01毫克/千克至大约100毫克/千克、大约10毫克/千克至大约250毫克/千克、大约0.1毫克/千克至大约15毫克/千克的范围；或其中该范围的下限为0.001毫克/千克至900毫克/千克之间的任意量且该范围的上限为0.1毫克/千克至1000毫克/千克之间的任意量的任何范围(例如，0.005毫克/千克至200毫克/千克、0.5毫克/千克至20毫克/千克)。如本领域技术人员公认的那样，有效剂量还将根据治疗的疾病、给药途径、赋形剂使用、以及与其它治疗性治疗(如使用其它药剂)共同使用的可能性而不等。参见例如美国专利号7,863,270，其通过引用并入本文。

在更具体的方面，以30-1000毫克/天(例如30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300毫克/天)的剂量方案施用阿吡莫德组合物至少1周(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、36、48或更多周)。优选地，阿吡莫德组合物以100-1000毫克/天的剂量方案施用4或16周。替代地或随后地，阿吡莫德组合物以每天两次100毫克-300毫克的剂量方案施用8周，或任选52周。替代地或随后地，阿吡莫德组合物以每天两次50毫克-1000毫克的剂量方案施用8周，或任选52周。

有效量的阿吡莫德组合物可以每天施用一次、每天两次至五次、每天最多两次或最多三次，或每天最多八次。在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物每天施用三次、每天两次、每天一次，在3周周期中施用十四天(每天四次、每天三次或每天两次、或每天一次)和停药7天，在3周周期中最多施用五天或七天(每天四次、每天三次或每天两次、或每天一次)和停药14-16天，或每两天一次，或一周一次，或每两周一次，或每三周一次。

按照本文中所述的方法，“需要的受试者”是患有疾病、失调或病症的受试者，或相对于大多数人具有提高的发展疾病、失调或病症的风险的受试者。需要其的受试者可以是对疾病或失调(例如癌症)的现有可利用的疗法“无响应”或“顽固”的受试者。在这方面，术语“无响应”和“顽固”指的是受试者对治疗的响应在临床上不足以缓解与该疾病或失调相关的一种或更多种症状。在此处描述的方法的一个方面，需要其的受试者是患有癌症的受试者，其癌症对于标准疗法是顽固的，或者其癌症在标准治疗后复发。

“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可以是例如任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、脊椎动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。优选地，该哺乳动物是人。术语“患者”指的是人类受试者。

本发明还提供了用于治疗本文中所述的疾病、失调或病症的单一疗法。本文中所用的“单一疗法”指的是向需要其的受试者施用单一的活性或治疗性化合物。

本文中所用的“治疗”(“treatment”,“treating”或“treat”)描述了为了抗击疾病、病症或失调的目的对患者进行的管理和护理，并包括施用阿吡莫德组合物以缓解疾病、病症或失调的症状或并发症，或消除该疾病、病症或失调。

本文中所用的“预防/防止”(“prevention”,“preventing”或“prevent”)描述了减少或消除疾病、病症或失调的症状或并发症的发作，并包括施用阿吡莫德组合物以减少疾病、病症或失调的症状的发作、发展或复发。

在一个实施方案中，施用阿吡莫德组合物导致消除了所治疗的疾病或失调的症状或并发症，但是，消除并不是必须的。在一个实施方案中，降低了所述症状的严重程度。在癌症的情况下，此类症状可以包括严重程度或进展的临床指标，包括肿瘤分泌生长因子、降解细胞外基质、变得血管化、丧失对并置组织(juxtaposed tissue)的粘附、或转移的程度，以及转移灶的数量。

根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致肿瘤尺寸的减小。肿瘤尺寸的减小也被称为“肿瘤消退”。优选地，在治疗后，肿瘤尺寸相对于其治疗前的尺寸减小5％或更多；更优选地，肿瘤尺寸减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；且最优选地，减小超过75％或更多。肿瘤的尺寸可以通过任何可再现的测量手段来测量。可以以肿瘤直径的形式来测量肿瘤的尺寸。

根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致肿瘤体积的减小。优选地，在治疗后，肿瘤体积相对于其治疗前的尺寸减小5％或更多；更优选地，肿瘤体积减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；且最优选地，减小超过75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可再现的测量手段来测量。

根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致肿瘤数量的降低。优选地，在治疗后，肿瘤数量相对于治疗前的数量减少5％或更多；更优选地，肿瘤数量减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；且最优选地，减少超过75％。肿瘤数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤的数量可以通过计数肉眼可见或在规定放大倍数下可见的肿瘤来测量。所述规定放大倍数优选为2×、3×、4×、5×、10×或50×。

根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致在远离肿瘤原发部位的其它组织或器官中转移病灶数量的降低。优选地，在治疗后，转移病灶的数量相对于治疗前的数量减少5％或更多；更优选地，转移病灶的数量减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；且最优选地，减少超过75％。转移病灶的数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。转移病灶的数量可以通过计数肉眼可见或在规定放大倍数下可见的转移病灶来测量。所述规定放大倍数优选为2×、3×、4×、5×、10×或50×。

根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致受治疗的受试者群体与仅接受载体的群体相比平均存活时间的提高。优选地，平均存活时间提高超过30天；更优选地，提高超过60天；更优选地，提高超过90天；且最优选地，提高超过120天。群体的平均存活时间的提高可以通过任何可再现手段测量。例如可以通过对一群体计算在开始用活性化合物治疗后的平均存活时长来测量群体的平均存活时间的提高。例如还可以通过对一群体计算在完成用活性化合物的第一轮治疗后的平均存活时长来测量群体的平均存活时间的提高。

根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致受治疗的受试者群体与未受治疗的受试者群体相比平均存活时间的提高。优选地，平均存活时间提高超过30天；更优选地，提高超过60天；更优选地，提高超过90天；且最优选地，提高超过120天。群体的平均存活时间的提高可以通过任何可再现手段测量。例如可以通过对一群体计算在开始用活性化合物治疗后的平均存活时长来测量群体的平均存活时间的提高。例如还可以通过对一群体计算在完成用活性化合物的第一轮治疗后的平均存活时长来测量群体的平均存活时间的提高。

根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致受治疗的受试者群体与接受采用并非本文中所述阿吡莫德组合物的药物的单一疗法的群体相比平均存活时间的提高。优选地，平均存活时间提高超过30天；更优选地，提高超过60天；更优选地，提高超过90天；且最优选地，提高超过120天。群体的平均存活时间的提高可以通过任何可再现手段测量。例如可以通过对一群体计算在开始用活性化合物治疗后的平均存活时长来测量群体的平均存活时间的提高。例如还可以通过对一群体计算在完成用活性化合物的第一轮治疗后的平均存活时长来测量群体的平均存活时间的提高。

根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致受治疗的受试者群体与仅接受载体的群体相比死亡率的降低。根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致受治疗的受试者群体与未受治疗的群体相比死亡率的降低。根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致受治疗的受试者群体与接受采用并非阿吡莫德组合物的药物的单一疗法的群体相比死亡率的降低。优选地，死亡率降低超过2％；更优选地，降低超过5％；更优选地，降低超过10％；且最优选地，降低超过25％。受治疗的受试者群体的死亡率的降低可以通过任何可再现手段测量。例如可以通过对一群体计算在开始用活性化合物治疗后每单位时间疾病相关死亡的平均数量来测量群体的死亡率的降低。例如还可以通过对一群体计算在完成用活性化合物的第一轮治疗后每单位时间疾病相关死亡的平均数量来测量群体的死亡率的降低。

根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致肿瘤生长速率降低。优选地，在治疗后，肿瘤生长速率相对于治疗前的数字降低至少5％；更优选地，肿瘤生长速率降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤生长速率可以根据每单位时间肿瘤直径的变化来测量。在一个实施方案中，在治疗后，肿瘤生长速率可以为大约0，并被确定为保持相同尺寸，例如已经停止生长。

根据本文中所述的方法治疗失调、疾病或病症可以导致肿瘤再生长的降低。优选地，在治疗后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；且最优选地，小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可再现的测量手段来测量。例如通过测量在治疗后的现有肿瘤收缩之后肿瘤直径的提高来测量肿瘤再生长。肿瘤再生长的降低显示为治疗停止后肿瘤未能复发。

根据本文中所述的方法治疗或预防细胞增殖性障碍可以导致细胞增殖速率的降低。优选地，在治疗后，细胞增殖速率降低至少5％；更优选地，降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。细胞增殖速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。例如通过测量每单位时间在组织样品中的***细胞的数量来测量细胞增殖速率。

根据本文中所述的方法治疗或预防细胞增殖性障碍可以导致增殖细胞的比例降低。优选地，在治疗后，增殖细胞比例降低至少5％；更优选地，降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。增殖细胞的比例可以通过任何可再现的测量手段来测量。优选地，例如通过相对于组织样品中的非***细胞数量量化***细胞数量来测量增殖细胞的比例。增殖细胞的比例可以等效于有丝***指数。

根据本文中所述的方法治疗或预防细胞增殖性障碍可以导致细胞增殖的范围或区域的大小降低。优选地，在治疗后，细胞增殖的范围或区域的大小相对于其在治疗前的大小降低至少5％；更优选地，降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。细胞增殖的范围或区域的大小可以通过任何可再现的测量手段来测量。细胞增殖的范围或区域的大小可以作为细胞增殖的范围或区域的直径或宽度来测量。

根据本文中所述的方法治疗或预防细胞增殖性障碍可以导致具有不正常的外观或形态的细胞的数量或比例降低。优选地，在治疗后，具有不正常形态的细胞的数量相对于其在治疗前的规模降低至少5％；更优选地，降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；且最优选地，降低至少75％。不正常的细胞外观或形态可以通过任何可再现的测量手段来测量。可以通过显微术，例如使用倒置组织培养显微镜来测量不正常的细胞形态。不正常的细胞形态可以采取核多型性的形式。

本文中所用的术语“选择性”指的是倾向于在一个群体中比在另一群体中更频繁发生。对比群体可以是细胞群体。优选地，本文中所述的阿吡莫德组合物与正常细胞相比选择性作用于过度增殖细胞或不正常增殖细胞。本文中所用的“正常细胞”是不能被归类为“细胞增殖性障碍”的部分的细胞。正常细胞缺乏失调或不正常的生长或两者(这可导致不希望的病症或疾病的发展)。优选地，正常细胞通常具有功能细胞周期检查点控制机制。优选地，阿吡莫德组合物选择性作用以调节一种分子靶(例如，靶激酶)，但是不显著调节另一分子靶(例如，非靶激酶)。本发明还提供了选择性抑制酶(如激酶)的活性的方法。优选地，如果一事件在群体A中与群体B相比以大于两倍的更高频率发生，该事件在群体A中相对于群体B选择性发生。如果一事件在群体A中以大于五倍的更高频率发生，该事件选择性发生。如果与群体B相比，一事件在群体A中以大于十倍的更高频率发生；更优选地，大于五十倍；甚至更优选地，大于100倍；且最优选地，大于1000倍的更高频率在群体A中发生，该事件选择性发生。例如，如果细胞死亡在病变或过度增殖细胞中与正常细胞相比以大于两倍的频率发生的话，细胞死亡将被称作在病变或过度增殖细胞中选择性发生。

药物组合物和制剂

本发明提供为优选适合用于哺乳动物，优选人类的药学上可接受的组合物的阿吡莫德组合物。在这方面，该组合物可以进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中其量对于治疗疾病或失调有效。在一个实施方案中，所述疾病或失调是癌症，优选淋巴瘤，且最优选B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述疾病或失调是mTOR疾病或失调。

在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。

在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物与至少一种附加活性剂在单一剂型中组合。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含抗氧化剂。

在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自烷基化剂、***剂、微管蛋白结合剂、皮质类固醇及其组合。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自依鲁替尼、利妥昔单抗、多柔比星、***龙、长春新碱、万珂和依维莫司及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自环磷酰胺、羟基柔红霉素(也称为多柔比星或Adriamycin^TM)、长春新碱(也称为Oncovin^TM)、***、***龙及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选择以改善该阿吡莫德组合物的一种或更多种副作用的非治疗剂。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。

在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自mTOR通路的抑制剂、PI3K抑制剂、双重PI3K/mTOR抑制剂、SRC抑制剂、VEGF抑制剂、两面神激酶(Janus kinase,JAK)抑制剂、Raf抑制剂、Erk抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、抗有丝***剂、多重耐药外排抑制剂、抗生素和治疗性抗体。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自法尼基转移酶抑制剂(例如替吡法尼)、抗有丝***剂(例如多西他赛)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如伏立诺他)和多重耐药外排抑制剂。

在一个实施方案中，所述mTOR抑制剂选自雷帕霉素(也称为西罗莫司)、依维莫司、坦罗莫司、地磷莫司、umirolimus、唑罗莫司、AZD8055、INK128、WYE-132、Torin-1、吡唑并嘧啶类似物PP242、PP30、PP487、PP121、KU0063794、KU-BMCL-200908069-1、Wyeth-BMCL-200910075-9b、INK-128、XL388、AZD8055、P2281和P529。参见例如Liu等人Drug Disc.TodayTher.Strateg.,6(2):47-55(2009)。

在一个实施方案中，所述mTOR抑制剂是反式-4-[4-氨基-5-(7-甲氧基-1H-吲哚-2-基)咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基]环己烷羧酸(也称为OSI-027)，及其任何盐、溶剂化物、水合物和其它物理形式、结晶或非晶的。参见US 2007/0112005。OSI-027可以根据US2007/0112005来制备，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，所述mTOR抑制剂是OXA-01。参见例如WO 2013152342 A1。

在一个实施方案中，所述PI3K抑制剂选自GS-1101(艾代拉里斯)、GDC0941(Pictilisib)、LY294002、BKM120(Buparlisib)、PI-103、TGX-221、IC-87114、XL 147、ZSTK474、BYL719、AS-605240、PIK-75、3-甲基腺嘌呤、A66、PIK-93、PIK-90、AZD6482、IPI-145(Duvelisib)、TG100-115、AS-252424、PIK294、AS-604850、GSK2636771、BAY 80-6946(Copanlisib)、CH5132799、CAY10505、PIK-293、TG100713、CZC24832和HS-173。

在一个实施方案中，所述双重PI3K/mTOR抑制剂选自GDC-094、WAY-001、WYE-354、WAY-600、WYE-687、Wyeth-BMCL-200910075-16b、Wyeth-BMCL-200910096-27、KU0063794和KUBMCL-200908069-5、NVP-BEZ235、XL-765、PF-04691502、GDC-0980(Apitolisib)、GSK1059615、PF-05212384、BGT226、PKI-402、VS-558和GSK2126458。参见例如Liu等人DrugDisc.Today Ther.Strateg.,6(2):47-55(2009)，其通过引用并入本文。

在一个实施方案中，所述mTOR通路抑制剂是结合到mTOR通路中的蛋白(或编码该蛋白的核酸)上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、锁核酸或适体)。例如，该多肽或核酸抑制mTOR复合物1(mTORC1)、mTOR的调控相关蛋白(Raptor)、哺乳动物致死SEC13蛋白8(MLST8)、40kDa的富含脯氨酸的Akt底物(PRAS40)、含有DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(DEPTOR)、mTOR复合物2(mTORC2)、mTOR的雷帕霉素不敏感性伴随物(RICTOR)、G蛋白β亚基样蛋白(GβL)、哺乳动物应激激活的蛋白激酶相互作用蛋白1(mSIN1)、桩蛋白、RhoA、Ras-相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Rac1)、细胞***控制蛋白42同系物(Cdc42)、蛋白激酶Cα(PKCα)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、p70S6K、Ras和/或真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)结合蛋白(4EBP)，或编码这些蛋白之一的核酸。

在一个实施方案中，所述SRC抑制剂选自博舒替尼、塞卡替尼、达沙替尼、帕纳替尼、KX2-391、XL-228、TG100435/TG100855和DCC2036。参见例如Puls等人Oncologist.2011年5月；16(5):566–578。在一个实施方案中，所述SRC抑制剂是结合到所述SRC蛋白或编码该SRC蛋白的核酸上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、锁核酸或适体)。

在一个实施方案中，所述VEGF抑制剂选自贝伐珠单抗、舒尼替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、索拉非尼、瑞格非尼、乐伐替尼和莫特塞尼。在一个实施方案中，所述VEGF抑制剂是结合到VEGF蛋白、VEGF受体蛋白或编码这些蛋白之一的核酸上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、吗啉代(morpholino)、锁核酸或适体)。例如，该VEGF抑制剂是可溶性VEGF受体(例如可溶性VEGF-C/D受体(sVEGFR-3))。

在一个实施方案中，所述JAK抑制剂选自facitinib、鲁索替尼、巴瑞克替尼、CYT387(CAS编号1056634-68-4)、来他替尼、帕克替尼和TG101348(CAS编号936091-26-8)。在一个实施方案中，所述JAK抑制剂是结合到JAK(例如JAK1、JAK2、JAK3或TYK2)或编码该JAK蛋白的核酸上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、吗啉代、锁核酸或适体)。

在一个实施方案中，所述Raf抑制剂选自PLX4032(威罗菲尼)、索拉非尼、PLX-4720、GSK2118436(达拉菲尼)、GDC-0879、RAF265、AZ 628、NVP-BHG712、SB90885、ZM336372、GW5074、TAK-632、CEP-32496和LGX818(Encorafenib)。在一个实施方案中，所述Raf抑制剂是结合到Raf(例如A-Raf、B-Raf、C-Raf)或编码该Raf蛋白的核酸上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、吗啉代、锁核酸或适体)。在一个实施方案中，所述MEK抑制剂选自AZD6244(司美替尼)、PD0325901、GSK1120212(曲美替尼)、U0126-EtOH、PD184352、RDEA119(Rafametinib)、PD98059、BIX 02189、MEK162(比尼替尼,Binimetinib)、AS-703026(Pimasertib)、SL-327、BIX02188、AZD8330、TAK-733和PD318088。在一个实施方案中，所述MEK抑制剂是结合到MEK(例如MEK-1、MEK-2)或编码该MEK蛋白的核酸上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、吗啉代、锁核酸或适体)。

在一个实施方案中，所述Akt抑制剂选自MK-2206、KRX-0401(哌立福辛)、GSK690693、GDC-0068(Ipatasertib)、AZD5363、CCT128930、A-674563、PHT-427。在一个实施方案中，所述Akt抑制剂是结合到Akt(例如Akt-1、Akt-2、Akt-3)或编码该Akt蛋白的核酸上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、吗啉代、锁核酸或适体)。

在一个实施方案中，所述法尼基转移酶抑制剂选自LB42708或替吡法尼。在一个实施方案中，所述法尼基转移酶抑制剂是结合到法尼基转移酶或编码该法尼基转移酶蛋白的核酸上并抑制其表达水平或活性的多肽(例如抗体或其片段)或核酸(例如双链小干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、反义寡核苷酸、吗啉代、锁核酸或适体)。在一个实施方案中，所述组蛋白调节抑制剂选自漆树酸、C646、MG149(组蛋白乙酰转移酶)、GSK J4 Hcl(组蛋白去甲基化酶)、GSK343(针对EZH2的活性物)、BIX 01294(组蛋白甲基转移酶)、MK0683(伏立诺他)、MS275(恩替诺特)、LBH589(帕比司他)、曲古抑菌素A、MGCD0103(Mocetinostat)、他喹莫德、TMP269、Nexturastat A、RG2833、PDX101(贝利司他)。

在一个实施方案中，所述抗有丝***剂选自灰黄霉素、酒石酸长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、长春新碱、长春碱、埃博霉素A、埃博霉素B、ABT-751、CYT997(Lexibulin)、酒石酸长春氟宁、Fosbretabulin、GSK461364、ON-01910(Rigosertib)、Ro3280、BI2536、NMS-P937、BI 6727(Volasertib)、HMN-214和MLN0905。

在一个实施方案中，所述聚醚抗生素选自莫能菌素、尼日利亚菌素、缬氨霉素、盐霉素的钠盐。

“药物组合物”是适于施用于受试者的含有药学上可接受形式的本文中所述的化合物的制剂。本文中所用的短语“药学上可接受的”指的是在合理的医学判断范围内适于与人类和动物的组织接触使用而不具有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、载体和/或剂型。

“药学上可接受的赋形剂”指的是可用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全、无毒且既非生物学上也非在其它方面不合意的，并包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于无菌液体、水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)、油、洗涤剂、悬浮剂、碳水化合物(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白或其合适的混合物。

药物组合物可以以散装或以剂量单位形式提供。为了便于给药和剂量的均匀性，尤其有利的是以剂量单位形式配制药物组合物。本文中所用的术语“剂量单位形式”指的是适于作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上分离的单位；各单位含有计算以与所需药物载体结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果决定并直接取决于此。剂量单位形式可以是安瓿、小瓶、栓剂、糖衣丸、片剂、胶囊、IV袋、或在气溶胶吸入器上的单极泵。

在治疗应用中，在影响所选剂量的其它因素中，该剂量取决于药剂、受体患者的年龄、重量和临床症状、以及施用该疗法的临床医生或医师的经验与判断而不同。通常，该剂量应当为治疗有效量。剂量可以以毫克/千克/天的测量单位来提供(该剂量可以针对患者的重量(以千克计)、体表面积(以平方米计)和年龄(以岁计)来进行调节)。药物组合物的有效量是提供由临床医生或其他合格的观察者所注意到的客观上可鉴定的改善的量。例如，缓解失调、疾病或病症的症状。本文中所用的术语“剂量有效方式”指的是在受试者或细胞中产生所需生物效应的药物组合物的量。

例如，该剂量单位形式可以包含1纳克至2毫克、或0.1毫克至2克；或10毫克至1克，或50毫克至500毫克，或1微克至20毫克；或1微克至10毫克；或0.1毫克至2毫克。

该药物组合物可以采取任何合适的形式(例如液体、气溶胶、溶液、吸入剂、雾、喷雾；或固体、粉末、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、贴剂等等)用于通过任何所需途径给药(例如经肺、吸入、鼻内、经口、口腔、舌下、胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、鞘内、透皮、透粘膜、直肠等等)。例如，本发明的药物组合物可以是用于通过吸入或吹入(经口或鼻)的气溶胶给药的水溶液或粉末形式、用于口服的片剂或胶囊形式、适于通过直接注射或通过添加到用于静脉内输注的无菌输注液中来给药的无菌水溶液或分散液形式；或用于透皮或透粘膜给药的洗剂、霜剂、泡沫、贴剂、悬浮液、溶液或栓剂的形式。

药物组合物可以是口服可接受的剂型的形式，包括但不限于胶囊、片剂、含服形式、锭剂(troche)、含片(lozenge)和乳液、含水悬浮液、分散液或溶液形式的口服液。胶囊可以含有本发明的化合物与惰性填料和/或稀释剂如药学上可接受的淀粉(例如，玉米、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人造甜味剂、粉末状纤维素如结晶纤维素和微晶纤维素、面粉、明胶、树胶等等的混合物。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。也可以加入润滑剂如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服含水悬浮液和/或乳液时，本发明的化合物可以悬浮或溶解在油相中，所述油相与乳化剂和/或悬浮剂结合。如果需要的话，可以加入特定的甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

药物组合物可以为片剂形式。该片剂可以包含单位剂量的本发明的化合物以及惰性稀释剂或载体如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇或甘露糖醇。该片剂可以进一步包含非糖衍生的稀释剂如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙或纤维素或其衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、以及淀粉如玉米淀粉。该片剂可以进一步包含粘合剂和造粒剂(如聚乙烯基吡咯烷酮)、崩解剂(例如可溶胀的交联聚合物，如交联的羧甲基纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸盐)、防腐剂(例如对羟苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如BHT)、缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)和泡腾剂如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。

该片剂可以是包衣片剂。该包衣可以是保护膜包衣(例如蜡或清漆)或设计为控制活性剂释放的包衣，例如缓释(在摄取后预定滞后时间后释放活性物)或在消化道中的特定位置处释放。后者可以例如使用肠溶膜包衣(如以商品名

出售的那些)来实现。

片剂制剂可以通过常规压缩、湿法造粒或干法造粒方法，并使用药学上可接受的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、悬浮剂或稳定剂来制造，所述试剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、月桂基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、藻酸、***树胶、黄原胶、柠檬酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨糖醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露糖醇、氯化钠、滑石、干淀粉和糖粉。优选的表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、鲸蜡硬脂醇、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。

药物组合物可以为硬或软明胶胶囊形式。按照该制剂，本发明的化合物可以为固体、半固体或液体形式。

药物组合物可以为适于胃肠外给药的无菌水溶液或分散液形式。本文中所用的术语胃肠外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。

药物组合物可以为适于通过直接注射或通过添加到用于静脉内输注的无菌输注液来给药的无菌水溶液或分散液的形式，并包含溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物、或一种或更多种植物油。游离碱或药理学上可接受的盐形式的本发明的化合物的溶液或悬浮液可以在适当地混有表面活性剂的水中制备。下面给出合适的表面活性剂的实例。还可以例如在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。

除了存在于该制剂中的任何载体或稀释剂(如乳糖或甘露糖醇)之外，用于本发明的方法的药物组合物可以进一步包含一种或更多种添加剂。所述一种或更多种添加剂可以包含一种或更多种表面活性剂或由一种或更多种表面活性剂组成。表面活性剂通常具有一个或更多个长脂族链如脂肪酸，这使其能够直接***细胞的脂质结构以增强药物渗透和吸收。通常用于表征表面活性剂的相对亲水性和疏水性的经验参数是亲水亲油平衡值(“HLB”值)。具有较低HLB值的表面活性剂更疏水，且在油中具有更大的溶解度，而具有较高HLB值的表面活性剂更亲水，且在水溶液中具有更大的溶解度。由此，亲水性表面活性剂通常被认为是具有大于大约10的HLB值的那些化合物，且疏水性表面活性剂通常是具有小于大约10的HLB值的那些。但是，这些HLB值仅仅是指导，因为对于许多表面活性剂来说，根据选择用于测定HLB值的经验方法，该HLB值可以相差多达大约8个HLB单位。

用于本发明的组合物的表面活性剂尤其是聚乙二醇(PEG)-脂肪酸和PEG-脂肪酸单酯和二酯、PEG甘油酯、醇-油酯交换产物、聚甘油脂肪酸、丙二醇脂肪酸酯、甾醇和甾醇衍生物、聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚、糖及其衍生物、聚乙二醇烷基酚、聚氧乙烯-聚氧丙烯(POE-POP)嵌段共聚物、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、离子表面活性剂、脂溶性维生素及其盐、水溶性维生素及其两亲性衍生物、氨基酸及其盐、以及有机酸和它们的酯和酸酐。

本发明还提供包含用于本发明方法的药物组合物的包装和试剂盒。该试剂盒可以包含一种或更多种选自瓶子、小瓶、安瓿、泡罩包装和注射器的容器。该试剂盒可以进一步包括用于治疗和/或预防本发明的疾病、病症或失调的一个或更多个使用说明、一个或更多个注射器、一个或更多个涂敷器、或适于恢复本发明的药物组合物的无菌溶液。

本文中使用的所有百分比和比率除非另行说明均按重量计。本发明的其它特征和优点由不同实施例显而易见。提供的实施例说明了可用于实践本发明的不同组分和方法。所述实施例不限制要求保护的发明。基于本公开，本领域技术人员可以确定和采用可用于实践本发明的其它组分和方法。

实施例

实施例1：阿吡莫德是TSC2裸细胞增殖的高度选择性抑制剂

使用TSC2-/-小鼠胚胎成纤维(MEF-EV)细胞在高通量细胞存活率筛选中鉴定阿吡莫德。TSC2裸细胞具有组成性活性的mTOR。简而言之，用编码潮霉素抗生素抗性基因的逆转录病毒载体(MEF-EV)或也编码TSC2的相同逆转录病毒载体(MEF-TSC2)感染衍生自TSC2-/-基因敲除小鼠胚胎的MEF细胞(Onda等人,J.Clin.Invest.104(6):687-95,1999)。随后通过潮霉素选择来建立所述MEF-EV与MEF-TSC2系。

细胞在含有10％FBS(Omega Scientific)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中扩增。制备细胞的冷冻储备物以便直接用于HTS分析。将细胞收获、沉淀(pellete)并随后以1×10⁷细胞/毫升的浓度重新悬浮在95％FBS&5％DMSO中。将一毫升等分试样以1℃/分钟的速率按比率(rate)冷冻至-80℃。随后将这些储备物转移至气相液氮以便长期储存。

为了筛选，将小瓶在连续搅拌的情况下在37℃下解冻直至刚好解冻，随后重新悬浮在室温分析介质中并以1,000rpm离心5分钟。将所得小粒重新悬浮在合适的体积中，并使用自动细胞计数器计数并相应地稀释至40,000细胞/毫升的最终计数。

使用BiomekFX移液器将试验化合物(5微升储备溶液，6×所需最终孔浓度)分配到384孔测定板(Corning 3712)中。使用具有标准孔***头的Thermo Wellmate非接触式分配***将MEF-EV细胞(1000个细胞/孔，在25微升培养基中)添加到这些预格式化板中。将该板在加湿的培养箱中在5％的CO₂气氛下在37℃下培养72小时。

按照制造商说明用

发光分析(Promega)测定细胞存活率。存活率表示为未处理的对照细胞的百分比。作为实例，对于阿吡莫德，MEF-EV细胞存活率(平均值+/-标准偏差，n＝3)在0.5μM下为2.16+/-0.36％，以及在5μM下为1.94+/-0.07％。

通过对上述MEF-EV和MEF-TSC2系以及附加的三对等基因系进行10点剂量响应进一步证明阿吡莫德对于TSC2缺陷细胞的活性：(1)按照标准方法由(TSC2-/-,p53-/-)或(TSC2+/-,p53-/-)胚胎建立(TSC2-/-,p53-/-)和(TSC2+/-,p53-/-)MEF系。参见例如Zhang等人,J.Clin.Invest.112,1223-33,2003。(2)由ELT3大鼠肿瘤细胞系建立ELT3-EV和ELT3-TSC2系。该ELT3系是用于LAM/TSC的建立的大鼠肿瘤模型。参见例如Howe等人,Am.J.Path.146,1568-79,1995。这些细胞在TSC2中包含失活性突变，这导致了mTOR通路的组成性激活。为了开发细胞的等基因对，用编码潮霉素抗生素抗性基因的逆转录病毒载体(ELT3-EV)或也编码TSC2的相同逆转录病毒载体(ELT3-TSC2)感染ELT3细胞。随后通过潮霉素选择建立所述ELT3-EV和ELT3-TSC2系。(3)由Dr.Elizabeth Henske(Fox Chase CancerCenter,Philadelphia,PA)提供的TSC2缺失型原代人AML样品(TSC2 null primary humanAML sample)建立TRI-AML102和AML103系。该细胞用编码HPV16E6与E7开放阅读框和新霉素抗性基因盒的兼嗜性逆转录病毒LXSN16E6E7感染。将细胞扩增并进行新霉素选择。将单独克隆分离并冷冻。使用Fugene6转染试剂(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)将具有潮霉素抗性基因盒(pLXSN hTERT-hyg质粒)的人端粒末端转移酶基因(hTERT)的编码序列稳定地表达到TSC2^-/-证实的E6E7 AML克隆中。通过稳定结合对照zeomycin选择质粒(pcDNA3.1-zeo)生成TRI-AML102，而TRI-AML103表达人TSC2cDNA pcDNA3.1-zeo质粒。作为这些工程方法的结果，TRI102和TRI103均是新霉素、潮霉素和zeomycin抗性系。

对于10点剂量响应，将在100微升生长培养基(DMEM(CellGro 10-017-CV)FBS10％(Sigma Aldrich F2442-500ML,Lot 12D370)青霉素/链霉素(100X)(CellGro Ref 30-002))中的750MEF、2000 ELT3或2000AML细胞在96孔板的每个孔中铺板。将细胞铺板24小时后，除去培养基并加入在100微升生长培养基中的阿吡莫德稀释液(1-500nM，2倍稀释)(0.1％最终DMSO浓度)。加入化合物72小时后，通过

发光分析(Promega)测定相对细胞存活率并表示为相对于媒介物(DMSO)处理的对照细胞的百分比。随后使用XLFIT(IDBS)由剂量响应曲线计算IC₅₀值。

该TSC2缺陷细胞对于阿吡莫德高度敏感(IC₅₀＝20nM，图1)。如通过高于1的选择性比率(2.45)所表示，TSC2-/-p53-/-MEFs显示了与TSC2+/-p53-/-MEFs相比提高的对于阿吡莫德的敏感性。

表1：在各种细胞类型中阿吡莫德的IC₅₀(存活率)

对TSC2-/-缺乏系和解救系由10点剂量响应计算IC50(nM)。IC50由两次实验的平均值计算。选择性比率通过TSC2解救系的IC50除以TSC2-/-系的IC50来计算。

此外，与TSC2解救MEF-TSC2细胞相比，更高浓度的阿吡莫德对于TSC2-/-MEF-EV细胞具有更高的效力。该数据，与阿吡莫德对外周血单核细胞(Wada等人,Blood 109,1156-64,2007)、对包括U937、HELA、Jurkat和THP-1的多种其它癌(细胞)系(PCT公开号WO 2006/128129)均不具有细胞毒性的事实结合，暗示用阿吡莫德治疗TSC2-/-癌细胞将存在高治疗指数(图2A-2C)。

实施例2：阿吡莫德在癌细胞中是高度选择性的细胞毒性剂

使用标准细胞存活率分析如CellTiterGlo^TM按照制造商的说明来评估阿吡莫德的细胞毒活性。评价了122种人类癌细胞系对于阿吡莫德的敏感性。如果IC₅₀小于500nM的话，则细胞系被称为阿吡莫德敏感的。35种细胞系被确定为对于阿吡莫德诱导的细胞毒性敏感。与正常细胞(其具有比癌细胞高20-200倍范围的IC₅₀)相比，阿吡莫德对于癌细胞也是高度选择性的(图2A-2C)。

图2A显示，阿吡莫德敏感性细胞包括衍生自几种不同癌症的细胞，所述癌症包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、结肠直肠癌和肺癌。这些受试细胞中最敏感的是非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞系。受试的NHL细胞系的刚好超过50％对阿吡莫德敏感。NHL代表严重程度不等的不同的一组造血***恶性肿瘤，其亚型由缓慢生长至侵袭性。NHL的亚型包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、套(细胞)淋巴瘤和滤泡性B细胞淋巴瘤。根据基因表达和细胞起源，DLBCL分为两个亚型，GCB和ABC。GCB是生发中心B细胞类型，源于正常生发中心B细胞，且ABC是激活的B细胞类型，源于分化成浆细胞过程中的后生发中心B细胞。在本研究中我们发现，NHL的某些亚型对阿吡莫德极为敏感，其IC₅₀值小于100nM(与筛选中的敏感/不敏感截断值相比，其为500nM)。这些包括人类伯基特淋巴瘤(ST486)、人类套细胞淋巴瘤(JeKo-1)和人类DLBCL(SUDHL-4，IC₅₀＝50nM)。参见图2B。这些结果表明，阿吡莫德可以有效对抗许多NHL癌症，包括通常对于标准治疗顽固的更有侵袭性的亚型。

如下文实施例6和7中详述的那样，我们研究了阿吡莫德针对癌细胞的选择性细胞毒性所基于的生物机理，并发现这是由于抑制了胞内运输并相应地提高了那些细胞中的细胞凋亡。

实施例3：阿吡莫德与CHOP的组分协同作用

如上所述，NHL细胞在我们的癌细胞系筛选中表现出对阿吡莫德特别敏感。DLBCL是NHL的最常见类型，在西方国家占淋巴瘤的30-40％。DLBCL是成熟B细胞的侵袭性肿瘤。所有DLBCL患者的大约40％在一线治疗后旧病复发。许多顽固性DLBCL-GCB癌症表现出MYC与BCL2的单和双易位。具有这些遗传性变型的患者往往具有较差的预后，至少部分归因于MYC与BCL2的过度表达。值得注意的是，甚至在表现这些易位的DLBCL-GCB细胞系中，阿吡莫德也是有效的(表2)，支持了阿吡莫德(作为单一疗法单独使用或与标准治疗结合)在治疗NHL的甚至侵袭性亚型中的作用。

表2.B细胞淋巴瘤系的Bcl-2和c-myc易位状态以及它们对阿吡莫德的敏感性。ND＝无数据

编号	B细胞淋巴瘤模型	细胞系	IC<sub>50</sub>(nM)	Bcl-2	C-myc
						7	人类DLBCL-GCB	SUDHL-4	25	是	是
8	人类DLBCL-GCB	SUDHL-6	80	是	否
						9	人类DLBCL-GCB	DB	150	否	否
10	人类DLBCL-GCB	Toledo	270	ND	ND
						11	人类DLBCL-GCB	SUDHL-10	20	是	是
12	人类DLBCL-GCB	WSU-DLCL2	160	是	否
						13	人类DLBCL-GCB	OCI-Ly19	380	是	否
20	人类DLBCL-GCB	HT	642	ND	ND
						21	人类DLBCL-GCB	Pfeiffer	2,620	ND	ND

为了进一步评价阿吡莫德对抗侵袭性NHL肿瘤的有效性，测试了阿吡莫德与多种化疗剂(包含用于许多此类癌症的标准一线治疗)的任意一种协同作用的能力。这些包括例如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***(称为“CHOP”化疗方案)，和利妥昔单抗，其有时与CHOP组合(R-CHOP)，以及化疗剂万珂，其指示用于复发的套细胞淋巴瘤，和依维莫司，一种mTOR抑制剂。

对于协同作用研究，使用以下DLBCL-GCB细胞系：WSU-DLCL2、SUDHL-4和SUDHL-6。将细胞以其最佳密度接种在96孔板中。细胞用单独的阿吡莫德(7.8-1000nM)，单独或与阿吡莫德组合的多柔比星(3.13-400nM)、长春新碱(0.08–10nM)、***(19.5–2500nM)、万珂(0.16–20nM)或依维莫司(0.23–500nM)来处理。在各种情况下，稀释为2倍，在药物浓度范围内总计8个稀释液。

在使用

(Promega)评估增殖前，将细胞处理72小时。为了计算协同作用，CalcuSyn(2.11版,Biosoft)用于确定由Chou等人,Adv.Enzyme.Regul.(1984)22:27–55定义的组合指数(CI)。由此，将产生>1的CI值的药物组合定义为对抗性的，CI＝1定义为累加性的，且CI<1定义为协同作用的。

如表3中所示，阿吡莫德在SUDHL-6细胞系中显示了与6种受试药剂中的5种(多柔比星、***龙、长春新碱、万珂和依维莫司)的协同作用活性，并在所有三种细胞系中均与长春新碱协同作用。此外，阿吡莫德在三种受试细胞系中的至少两种中与***龙、万珂和依维莫司协同作用。这些结果表明，采用阿吡莫德的联合疗法代表了解决治疗未能满足的医疗需求的有希望的新方法，所述治疗有益于在标准化疗方案后复发或对于标准化疗方案顽固的患者。

表3

在DLBCL-GCB细胞系中阿吡莫德与CHOP的个体组分(排除环磷酰胺)、万珂或依维莫司的药物组合效果的总结。组合指数(CI)用于确定组合效果，其中CI>1是对抗性的，CI＝1是累加性的，且CI<1是协同作用的。显示了为了产生所述效果的阿吡莫德与任一CHOP组分、万珂或依维莫司组合的浓度范围(斜体)。\

实施例4：阿吡莫德与依鲁替尼之间的协同作用活性

还进行了在SUDHL-4细胞中的研究以筛选可与阿吡莫德协同作用的其它药物。在筛选中使用包括FDA批准和未批准的药物的93种药物的人工组织图书馆。细胞在药物的存在下生长，所述药物含有或不含有阿吡莫德(在IC₂₀＝10nM下)，该图书馆的各种药物在10点浓度响应曲线(1.5-30,000nM；3倍稀释)中测试。SUDHL-4细胞在含有青霉素/链霉素(100X)(CellGro Ref 30-002)的RPMI Medium 1640(Sigma Aldrich F2442-500ML,Lot 12D370)中生长。以50微升的最终体积，将细胞以每孔19,000个细胞的密度接种到96孔板中。将50微升的10点药物稀释系列(以2×)加入到细胞中以获得上述最终浓度。将该板在加湿的培养箱中在5％的CO₂气氛下在37℃下培养。在加入化合物72小时后，按照制造商说明通过

发光分析(Promega)测定相对细胞存活率，且该值表示为相对于媒介物(DMSO)处理的对照细胞(设定为100％)的百分比。

将用药物图书馆中的单个化合物处理的细胞的存活率与用各图书馆药物+阿吡莫德(IC₂₀)处理的细胞的存活率进行比较，并确定显著组合。将依鲁替尼确定为在阿吡莫德的存在下与单独的依鲁替尼或阿吡莫德相比显著降低SUDHL-4细胞存活率。参见图18。依鲁替尼是靶向B细胞恶性肿瘤的FDA批准的药物，并且指示用于单一疗法来治疗套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病。其也称为PCI-32765并以商品名Imbruvica^TM销售。依鲁替尼是酶布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的选择性和共价抑制剂。BTK是至少三种平行发生的关键B细胞促生存机理(细胞凋亡、细胞粘附和细胞迁移与归巢的调节)的关键介导物。阿吡莫德与依鲁替尼的协同作用活性进一步表明阿吡莫德是有望用于使用其它化疗剂(尤其是靶向B细胞淋巴瘤的那些)的联合疗法的药剂。

实施例5：阿吡莫德与依鲁替尼结合在体内对于DLBCL肿瘤的抗肿瘤活性

接下来测试了单独或与依鲁替尼组合的阿吡莫德在体内抑制肿瘤生长的能力。如下文所述，单独的阿吡莫德显著减少了肿瘤生长，并且阿吡莫德与依鲁替尼的组合提供了比任一单独药剂更大的生长抑制。

该研究目的是临床前评估单独或与依鲁替尼组合的阿吡莫德在皮下SUDHL-6人类DLBCL癌症异种移植模型的治疗中的体内疗效。

在研究的第一种方式(arm)中，单独测试了阿吡莫德。在37℃下在5％CO₂的气氛中将SUDHL-6细胞系保持在补充有10％胎牛血清和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI-1640培养基中。肿瘤细胞每周继代培养两次，并在指数生长期间收获用于肿瘤接种。将NOD-SCID小鼠在接种前

-辐照24小时。各小鼠在右侧用在0.1毫升的PBS与Matrigel(1:1)中的SU-DHL-6肿瘤细胞(5×10⁶)皮下接种。肿瘤随后生长至大约80-120mm³的平均尺寸，并随后将小鼠分成5组并如表4中详述的那样进行处理。

表4：DLBCL肿瘤的异种移植模型

肿瘤尺寸用卡尺在两个维度上一周测量两次，且体积使用以下公式以mm³为单位表示：V＝0.5a×b²，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。监控小鼠29天，并在所有阿吡莫德治疗方式中观察到显著的生长抑制。静脉内施用将肿瘤尺寸减少58％(47毫克/千克)，且口服给药使生长减少68％(150毫克/千克分次剂量)或减少64％(150毫克/千克单剂量)，对体重影响可以忽略不计(参见图16)。由此，阿吡莫德的静脉内施用和口服在体内削弱SU-DHL-6肿瘤生长方面表现出类似的功效。

在相同SUDHL-6人类DLBCL癌症异种移植模型中使用与上述相同的方案，研究的第二方式评价了与依鲁替尼结合时阿吡莫德的功效。各小鼠在右侧用在0.1毫升的PBS与Matrigel(1:1)中的SU-DHL-6肿瘤细胞(5×10⁶)皮下接种。肿瘤随后生长至大约80-120mm³的平均尺寸，并随后将小鼠分成6组并如表5中详述的那样进行处理。

表5：SUDHL-6细胞系异种移植实验

肿瘤尺寸用卡尺在两个维度上一周测量两次，且体积使用以下公式以mm³为单位表示：V＝0.5a×b²，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。监控小鼠31天，并在75毫克/千克阿吡莫德(57％)、10毫克/千克依鲁替尼(54％)和20毫克/千克依鲁替尼(64％)治疗方式中观察到显著的生长抑制。75毫克/千克阿吡莫德与依鲁替尼的组合以剂量依赖性方式进一步降低了肿瘤生长；10毫克/千克依鲁替尼(65％)和20毫克/千克依鲁替尼(70％)(参见图 17)。

实施例6：阿吡莫德是PIKfyve激酶的高度选择性的结合物

为了确定阿吡莫德在癌细胞中的细胞靶，由人类神经胶质瘤细胞制备的全细胞溶解产物用于采用化学捕获质谱法(CCMS)来识别其结合配偶体(binding partner)。这项工作在Caprotec Bioanalytics GmbH,Berlin Germany处进行。参见Michaelis等人,J.Med.Chem.,55 3934-44(2012)和其中引用的参考文献。简而言之，合成两种使用阿吡莫德作为单方向上连接的选择性功能的捕获化合物变体并通过LC-MS和¹H-NMR进行分析以确保同一性和纯度。在全细胞溶解产物中优化捕获条件，例如最小化蛋白与捕获化合物的非特异性相互作用，要获得蛋白与捕获化合物的最大结合的试剂和蛋白的浓度等等。选择一种捕获化合物以便在使用阿吡莫德作为竞争配体的CCMS实验中确定特异性蛋白结合物。在捕获分析中通过LC-S检测到的并在竞争对照实验中显著减少的蛋白被认为是特异性结合物。使这些特异性结合物进一步经受严格的数据分析标准以便在无偏移数据评估后确定特异性。特异性蛋白结合物根据其在捕获实验中的倍数变化(FC)值进行排列。仅有两种蛋白被确定为阿吡莫德的高概率候选目标蛋白：PIKfyve和Vac14。在四种不同捕获化合物浓度实验中这些蛋白的FC和p-值显示在表6中。

表6

在单独的研究中，进行阿吡莫德的蛋白激酶轮廓分析以确定激酶靶(DiscoveRx,Fremont,CA)。使用阿吡莫德在渐增的浓度(0.05-3000nM)下针对PIKfyve(一种已知的阿吡莫德的靶)进行解离常数(K_d)研究。该实验一式两份进行，且K_d测定为0.075nM(范围0.069-0.081nM)(图7)。

接下来，针对激酶的综合组(comprehensive panel)(不包括PIKfyve)筛选阿吡莫德。总计分析了456种激酶(包括疾病相关的激酶)的它们与阿吡莫德结合的能力。阿吡莫德的筛选浓度为1μM，该浓度比阿吡莫德对PIKfyve的K_d高>10,000倍。来自该筛选的结果表明，阿吡莫德未结合到受试的456种激酶的任一种上。

总之，这些结果表明，阿吡莫德在癌细胞中以高选择性结合到单一的细胞激酶，PIKfyve上。PIKfyve是结合到PI(3)P上并催化脂质第二信使PI(3,5)P2与PI(5)P的形成的酶，并且其他人已经表明阿吡莫德在正常细胞中也是这种激酶PIKfyve的有效和特异性的抑制剂。Cai X等人,Chem Biol.2013Jul 25；20(7):912-21。如下面更详细地讨论的那样，为了理解阿吡莫德针对癌细胞的选择性细胞毒性的机理，我们进行了一系列旨在阐明其在癌细胞中的生物活性的实验。

实施例7：阿吡莫德的抗癌活性的机理

阿吡莫德已知是炎性细胞因子IL-12和IL-23的有效抑制剂。到阿吡莫德被指示用于治疗疾病或失调的程度上，基于这种活性进行预测。尽管阿吡莫德的临床试验集中于其在自身免疫性和炎性疾病如银屑病、类风湿性关节炎和克罗恩病方面的潜在功效，存在一些公开的建议：阿吡莫德可能可用于对抗癌症，且特别是对抗其中c-rel或IL-12/23充当促增殖因子的癌症。分别参见例如WO 2006/128129和Baird等人,Frontiers in Oncology 3:1(2013)。令人惊讶地并与基于阿吡莫德的IL-12/23抑制活性所预测的这些预期相反，我们并未在受试细胞系中发现任意的c-Rel表达(c-Rel是IL-12/23基因的转录因子)、IL-12或IL-23表达和对阿吡莫德的敏感性之间的相关性(参见图8-14)。

简而言之，对22种B细胞淋巴瘤系分析了来自癌细胞系百科全书(CCLE)的基因表达数据，对此我们获得了针对阿吡莫德的剂量响应曲线(参见表7)。

表7.分析22种B细胞淋巴瘤系的基因表达和对阿吡莫德的响应。注意埃巴(Epstein Barr)状态和核cREL状态。ND＝无数据

通过非配对t-检验在敏感(IC₅₀小于500nM)和不敏感(IC₅₀大于500nM)的系中比较了c-REL的表达。在c-REL表达和敏感性之间没有发现统计学上显著的关系(p＝0.97)。此外发现，在已经公开数据的细胞系中没有检测到在对阿吡莫德的敏感性与存在构核c-REL或用埃巴病毒感染之间存在显著的关系。受试的细胞系包括以下阿吡莫德敏感(#1-13)和不敏感(#14-22)的B细胞淋巴瘤系：人类伯基特淋巴瘤细胞系1-4(ST486、Daudi、EB1、GA-10)、人类套细胞淋巴瘤5-6(Rec-1、JeKo-1)、人类弥漫性大B细胞淋巴瘤–GCB 7-13(SUDHL-4、SUDHL-6、DB、Toledo、SUDHL-10、WSU-DLCL2、OCl-Ly19)、人类伯基特淋巴瘤14-16(Namalwa、CA46、Raji)、人类套细胞淋巴瘤17(GRANTA-519)、人类滤泡性B细胞淋巴瘤18(RL)、人类滤泡性淋巴瘤-DLBCL-GCB 19(DOHH-2)、人类弥漫性大B细胞淋巴瘤-GCB(HT、Pfeiffer、KARPAS-422)。

在不同组的75种癌细胞系(包括前述22种淋巴瘤系)中对IL-12A、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-12B、IL-23A和IL-23R的表达进行了进一步分析(参见表8)。

表8.各种癌细胞系

简而言之，对75种癌细胞系分析了来自CCLE的基因表达数据，对此获得了针对阿吡莫德的剂量响应曲线。通过非配对t-检验在敏感(IC₅₀小于500nM)和不敏感(IC₅₀大于500nM)的系中比较各白介素基因的表达。没有发现统计学上显著的关系，唯一的例外是IL-23A(p＝0.022)。此前已经指出IL-23A在阿吡莫德敏感的非小细胞肺癌系中升高，并指出重组体IL-23A提高了非小细胞肺癌系的增殖(参见Baird等人2013，见上)。重要的是，IL-23A表达在敏感癌症系中的统计学显著性似乎完全仅由两种结肠癌系驱动。此外，IL-23A表达在非霍奇金B细胞淋巴瘤中不是敏感性的统计学显著的预测指标(图15)。为了在22种B细胞淋巴瘤系中用于阿吡莫德敏感性的可靠的两基因生物标记，对来自CCLE数据库的全球基因表达数据进行分析。

附加实验表明，阿吡莫德的细胞毒活性至少部分基于其诱导细胞凋亡。使用Apotox-Glo Triplex分析(Promega,Inc.)按照制造商的说明对细胞凋亡进行量化并与坏死进行区分。在该分析中，使用三种不同的标记(分别为GF-AFC、半胱天冬酶-3/7和双-AAF-R110)同时评估存活率、细胞凋亡和坏死。图4显示了在向培养基中加入阿吡莫德后48小时在阿吡莫德处理过的弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中的细胞凋亡(中间的条)和坏死(右侧的条)标记。左侧的条显示存活率标记。

通过在H4神经胶质瘤细胞系(IC₅₀ 250-300nM)中处理72小时后对自噬泡进行分析来进一步研究阿吡莫德的细胞毒活性的机理。使用Cyto-ID自体吞噬检测试剂盒(Enzo)按照制造商的指引对自体吞噬进行定量。图5显示了阿吡莫德以剂量依赖性方式诱导自体吞噬。

PIKfyve与早期核内体的胞质小叶(cytosolic leaflet)相关，并且其活性为内膜稳态、内吞溶酶体功能和由核内体向高尔基体外侧网络的适当的逆向运输所需。向细胞中引入激酶死亡突变体诱导了肿胀的液泡表型，这可以通过注射PI(3,5)P2来解救。通过药理学方法以及RNAi抑制PIKfyve也产生了肿胀的液泡和内膜动力学的中断。如图21中所示，用阿吡莫德药理学中断PIKfyve通过中断胞内运输诱导了特定癌细胞系的选择性致死。

Claims

1.阿吡莫德单独或与一种或更多种附加活性剂的组合在制备用于在需要其的受试者中治疗顽固或复发的非霍奇金B细胞淋巴瘤(NHL)的药物中的用途，其中所述NHL选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)-GCB和滤泡性淋巴瘤。

2.权利要求1所述的用途，其中所述阿吡莫德是阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。

3.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物是口服剂型或适于静脉内施用的剂型。

4.权利要求1所述的用途，其中阿吡莫德与至少一种附加活性剂组合。

5.权利要求4所述的用途，其中所述至少一种附加活性剂是治疗剂或非治疗剂或其组合。

6.权利要求4所述的用途，其中所述至少一种附加活性剂与所述阿吡莫德一起在单一剂型中，或与所述阿吡莫德在分开的剂型中。

7.权利要求5或6所述的用途，其中所述至少一种附加活性剂选自烷基化剂、***剂、微管蛋白结合剂、皮质类固醇及其组合。

8.权利要求5或6所述的用途，其中所述至少一种附加活性剂是选自依鲁替尼、利妥昔单抗、多柔比星、***龙、长春新碱、万珂和依维莫司及其组合的治疗剂。

9.权利要求5或6所述的用途，其中所述至少一种附加活性剂是选自环磷酰胺、羟基柔红霉素(也称为多柔比星或Adriamycin™)、长春新碱(也称为Oncovin™)、***、***龙及其组合的治疗剂。

10.权利要求5或6所述的用途，其中所述至少一种附加活性剂是选择以改善阿吡莫德的一种或更多种副作用的非治疗剂。

11.权利要求10所述的用途，其中所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。

12.权利要求10所述的用途，其中所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。

13.权利要求1所述的用途，其中所述受试者是人。