CN106610406A - 一种金银花的微量提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由β-环糊精作为基质固相分散萃取技术的吸附剂用于提取检测金银花药材中酚酸类有效成分的方法。所述方法为：取金银花药材粉末和β-环糊精吸附剂加入研钵中研磨，取固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入小柱内，对小柱进行洗脱，底部用离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为金银花酚酸类有效成分提取液。本发明所用方法相比传统的提取方法步骤更为简洁快速，省时省力，有机溶剂用量大大减少，提取效果显著，可有效地提取金银花中的酚酸类成分。

Description

一种金银花的微量提取方法

技术领域

本发明属于天然药物提取检测领域。它涉及一种药用植物的微量提取方法，具体地说，它涉及由β-环糊精作为吸附剂，结合微量基质固相分散萃取技术，用来提取金银花中酚酸类有效成分的新方法。

背景技术

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花。金银花具有清热解毒，疏散风热的作用。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等。绿原酸(chlorogenic acid)、新绿原酸(neochlorogenic acid)、异绿原酸(isochlorogenic acid)是金银花的主要活性成分。异绿原酸是一混合物，而3，5-二咖啡酰奎宁酸(3，5-O-dicaffeoylquinic acid)与4，5-二咖啡酰奎宁酸(4，5-O-dicaffeoylquinic acid)为其主要成分。据报道，绿原酸类化合物具有抗菌、利胆、止血、增加白血球等药理作用。并且有显著增强胃肠蠕动和促进胃液分泌的药理作用。其中含量最高的为绿原酸，其次是3，5-二咖啡酰奎宁酸，4，5-二咖啡酰奎宁酸和新绿原酸。

传统的中药提取方法有浸渍法、渗流法、回流法等，它们普遍具有有机溶剂用量大、提取时间较长、操作过程繁琐、提取率低等缺点。而且这些方法容易损失有效成分，产生较大的误差，大量有机溶剂的使用对身体健康影响较大，且对环境有较大的污染，不符合绿色化学的倡议。固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)是近年发展起来的一种样品预处理技术，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，相比传统的方法可以提高分析物的回收率，使分析物与干扰组分得到有效的分离，减少样品预处理过程，操作简单快速。广泛应用在医药、环境、食品、商检等领域。但它也有有机溶剂用量大、重复性差，易堵塞，流量低，截面积小等缺点。

鉴于上述局限，许多新的提取方法在固相萃取的基础上发展了起来，主要包括基质固相分散萃取、分子印迹固相萃取、分散液相微萃取、磁性固相萃取等。相比传统的固相萃取方法这类新型的萃取方法有更显著的优势，主要有有机溶剂用量少、对环境污染小、操作简单快速、提取效率高。其中基质固相分散萃取技术就颇具代表性。

基质分散固相萃取(MSPD，matrix solid-phase dispersion)是美国Louisiana州立大学的Barker教授在1989年建立的一种快速样品处理技术。其原理是将固相吸附剂与样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。它将样品的均化、提取、浓缩和净化一步完成，避免了样品在均化、提取、净化等过程中造成的被测物的损失，同时使样品的预处理变的简便，提高了分析速度，减少了有机溶剂的消耗，得到的提取液大都可直接分析检测，减少了操作步骤和对环境的污染。目前针对天然产物的基质固相分散萃取技术的文献报道中，其药材、吸附剂以及洗脱剂的用量都较大，既浪费材料又对环境造成很大的污染。

基质固相分散萃取的一个关键步骤是吸附剂的选择，目前，用于基质固相分散萃取的吸附剂主要包括硅胶，C18，活性炭，氧化铝，弗罗里硅土等。

1891年，Villier首先从Bacillus amylobacter作用过的土豆淀粉里分离出环糊精。环糊精(Cyclodextyin，CD)是由环糊精葡萄糖残基转移酶作用于淀粉、糖原、麦芽寡聚糖等葡萄糖聚合物而形成的，由6-12个D-吡喃葡萄糖基以α-1，4-葡萄糖苷键连接而成的环状低聚糖。常见的主要有环糊精α、β、γ三种。其中β-环糊精价廉易得，应用最广，它具有“内腔疏水，外壁亲水”的特殊结构和性质，并在外型上呈“截顶圆锥”状，因此可以于水相中模拟酶的疏水口袋，与一系列有机分子形成包结络合物，广泛应用于环境污染物的吸附和萃取、水不溶性药物分子的包结和增溶、超分子仿酶体系的设计与构筑等领域。而且β-环糊精空腔大小适中，包合能力强，在人体内能被吸收、分解，对人体安全无毒，因此适合作为基质固相分散萃取的吸附剂。

截止目前，以β-环糊精作为吸附剂应用于基质固相分散萃取技术，在提取领域尚未见报道，该方法对于金银花的提取检测更是一片研究空白。

发明内容

本发明是要解决现有基质固相分散萃取技术存在吸附剂选择性少、药材和吸附剂用量大、有机溶剂消耗量大的问题，而提供的利用β-环糊精作为吸附剂，微量基质固相分散萃取金银花药材中有效成分的方法。β-环糊精作为吸附剂与金银花药材中的目标分子吸附结合，使目标分子从药材粉末中快速提取、洗脱，且本发明在一个微量体系中实施，相比药典的提取方法，大大减少了有机溶剂的使用量。

本发明采用的技术方案是：

一种提取金银花药材中酚酸类有效成分的方法，所述酚酸类有效成分为新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或两种以上，所述方法包括以下步骤：

称取金银花样品，置于研钵中，加入环糊精固相萃取填料，与药材样品充分混合研磨。另取固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的粉末填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，对小柱进行洗脱，底部用离心管收集洗脱液，离心，取上层清液即为酚酸类有效成分提取液，用超高效液相色谱仪检测分析。

所述环糊精的种类为：α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，甲基-β-环糊精，二羟丙基-β-环糊精，优选为β-环糊精。

所述金银花粉末与β-环糊精吸附剂的质量比为1∶0.25～4，优选为1∶3.

所述研磨时间为60～160s，优选为120s。

所述洗脱剂的种类有：甲醇，80％甲醇水，90％甲醇水，乙腈，乙醇，甲醇：乙醇1∶1，优选为80％甲醇水。

优选后的具体实验操作步骤为：

称取金银花药材粉末25mg、按照质量比1∶3称取β-环糊精75mg，加入研钵中研磨120s，取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取0.5mL80％甲醇水，对小柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为酚酸类有效成分提取液，装入进样瓶，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析，得到提取液的液相色谱图；

然后用新绿原酸的对照品配制一系列不同浓度的对照品溶液，按金银花提取液的同样条件用超高效液相色谱仪检测，获得新绿原酸对照品的液相色谱图，以新绿原酸对照品的浓度为横坐标，以新绿原酸对照品色谱峰的峰面积为纵坐标绘制新绿原酸的标准曲线，按同样方法制作绿原酸标准曲线、3，5-二咖啡酰奎宁酸标准曲线，4，5-二咖啡酰奎宁酸标准曲线；根据提取液的液相色谱图中各色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到提取液中新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸的含量，可相应换算得到提取液中提取的有效成分相对于金银花药材粉末的含量。

本发明的优点在于：

本方法首次采用β-环糊精作为基质固相分散萃取的吸附剂来对中药材进行提取检测，具有独创性，在目前的文献资料中均未见报道。

本方法是在微量体系下进行提取检测，相比中国药典所述的提取方法显著减少了有机溶剂的使用，减少了对环境的污染。此外，药材、吸附剂的使用量也极低，节约了资源的同时也提高了环境保护效益。

本发明所述的吸附剂环糊精具有“内腔疏水，外壁亲水”的特殊结构和性质，并在外型上呈“截顶圆锥”状，因此吸附萃取效率高、而且β-环糊精空腔大小适中，包合能力强，在人体内能被吸收、分解，对人体安全无毒，不污染环境且廉价易得。使得实验操作环境安全可靠，在倡导绿色化学的今天，符合可持续发展和环境友好理念。

本发明方法具备一系列优异突出的特性：对人体无毒、不污染环境；操作环境安全可靠；对于天然药物的提取，本发明还具有效率高、操作步骤快速便捷等优点。

附图说明

图1为本发明基质固相分散萃取方法的工艺流程图。

图2为考察吸附剂种类的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2、3、4代表金银花中不同的有效成分，1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。

图3为考察药材和β-环糊精之间不同质量比例下的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2、3、4分别代表金银花中不同的有效成分，1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。图中横坐标代表β-环糊精的质量，单位mg。

图4为考察洗脱剂种类的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2、3、4分别代表金银花中不同的有效成分，1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。

图5为考察不同研磨时间的基质固相分散萃取效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表金银花中不同的有效成分，1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。图中横坐标代表研磨时间。

图6为金银花混合对照品的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表金银花中不同的有效成分，1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。

图7为金银花酚酸类有效成分提取液的液相色谱图。图中，1、2、3、4代表金银花中的有效成分，依次为：1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。

具体实施方式

通过以下实例来对本发明所提供的检测方法进行更为详细的描述。由于其应用范围广，故具体实施方案也多，下面将结合几个实例的讨论对本发明的内容作进一步的阐述。

金银花对照品溶液的制备方法具体步骤为：取新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸的对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含新绿原酸500μg、绿原酸500μg、3，5-二咖啡酰奎宁酸500μg、4，5-二咖啡酰奎宁酸500μg的对照品溶液，即得。

实施例1

称取5份金银花药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取不同种类的环糊精(α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，甲基-β-环糊精，二羟丙基-β-环糊精)各25mg，加入5组研钵中与金银花药材粉末研磨120s。取5支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部均加入筛板，置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用5个1.5mL规格离心管收集，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液，即为金银花中酚酸类有效成分提取液，分别取样用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实施例所用仪器为安捷伦超高效液相色谱***(Agilent 1290 Infinity LC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)配备真空抽气泵，二元泵流动相***，恒温自动进样器，恒温柱温箱。色谱柱：Agilent Zorbax Extend-C18 column(2.1mm×50mm，1.8μm)，检测波长：330nm。柱温：40℃。进样量：1μL。流速0.4mL/min，流动相：A：0.1v％甲酸水，B：甲醇。梯度洗脱：0～2min，0％～30％B；2～3min，30％～35％B；3～4min，35％～40％B；4～7min，40％～50％B；7～8min，50％～100％B；8～9min，100％～100％B；9～10min，100％～30％B，平衡时间5min。

实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积。

表1.

1代表新绿原酸、2代表绿原酸、3代表3，5-二咖啡酰奎宁酸、4代表4，5-二咖啡酰奎宁酸。

不同种类吸附剂的固相萃取效果柱状图如图2所示。结果显示，β-环糊精的萃取效果最佳。β-环糊精洗脱下来的溶液为黄绿色且最深。可能由于β-环糊精的分子洞适中使得它能更好地吸附金银花中的活性成分。

实施例2

称取9份金银花药材粉末各25mg分别加入9组研钵中，并称取不同质量(6.25mg、12.5mg、25mg、37.5mg、50mg、62.5mg、75mg、87.5mg、100mg)的β-环糊精，分别加入9组研钵中与金银花药材粉末研磨120s。取9支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部均加入筛板。将填好的9支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用9个1.5mL规格离心管收集，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表2，表2中的数据为峰面积。

表2.

1代表新绿原酸、2代表绿原酸、3代表3，5-二咖啡酰奎宁酸、4代表4，5-二咖啡酰奎宁酸。

不同的药材与β-环糊精之间质量比例，对基质固相分散萃取效果的影响如图3所示。结果显示，随着β-环糊精用量的增加萃取效果依次增强，但增至75mg后，萃取效果趋于平缓甚至有所下降，所以在后续的实验中选用75mg为最佳的吸附剂用量。可能的原因是，随着吸附剂用量的增加，能够更好地吸附混合固体中的活性成分，但活性成分可吸附的总量有限，吸附剂用量增加至最优值之后，萃取效果趋向平缓，说明活性成分基本已经被吸附剂所吸附。而且过多的吸附剂还会导致活性成分从吸附剂中解吸变得困难，反而使得萃取效果有下降趋势。

实施例3

称取6份陈皮药材粉末各25mg分别加入6组研钵中，并称取6份75mgβ-环糊精，分别加入6组研钵中与金银花药材粉末研磨不同的时间(60s、80s、100s、120s、140s、160s)。取6支1ml规格的固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部均加入筛板。将填好的6支小柱置于固相萃取仪上。取0.5ml的甲醇，注入小柱内，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用6个1.5ml规格的离心管收集，放入离子仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表3，表3中的数据为峰面积。

表3.

1代表新绿原酸、2代表绿原酸、3代表3，5-二咖啡酰奎宁酸、4代表4，5-二咖啡酰奎宁酸。

不同研磨时间的基质固相分散萃取效果柱状图见图4。结果显示，随着研磨时间的增加，萃取效果逐渐变大，至最优值120s后，随着研磨时间的增加，萃取效果反而有下降的趋势。可能的原因是，充分的研磨将有助于吸附剂更充分地接触混合固体中的活性成分，从而增加萃取效果。但过量的研磨会使得活性成分被强制挤压在吸附剂中较小、致密的孔径中，使得洗脱变得困难，反而降低了萃取效果。

实施例4

称取6份金银花药材粉末各25mg分别加入6组研钵中，并称取6份75mgβ-环糊精，分别加入6组研钵中与金银花药材粉末研磨120s。取6支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部均加入筛板。将填好的6支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL不同种类的洗脱剂(甲醇、80％甲醇、90％甲醇、乙醇、乙腈、甲醇：乙醇为1∶1)，分别注入小柱内，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用6个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表4，表4中的数据为峰面积。

表4.

1代表新绿原酸、2代表绿原酸、3代表3，5-二咖啡酰奎宁酸、4代表4，5-二咖啡酰奎宁酸。

不同种类洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图见图5。结果表明，甲醇洗脱效果较其他洗脱液萃取效果好，可能甲醇可以和目标分子之间相互产生氢键作用，相比之下，乙腈一组的实验结果是所有考察组中最差的一组，可能的原因是乙腈对目标分子的溶解能力和与吸附剂相互作用最弱。而80％的甲醇萃取效果最佳可能是由于极性与目标分子最接近。

日内精密度

称取金银花药材粉末25mg、β-环糊精75mg，加入研钵中研磨120s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL80％甲醇水，注入小柱内，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。在同一天内连续进样6次。

日间精密度

称取金银花药材粉末25mg、β-环糊精75mg，加入研钵中研磨120s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL80％甲醇水，注入小柱内，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。将该样品连续进样3天，每天2次。

日内、日间精密度实验结果汇总如下表5：

表5

1代表新绿原酸、2代表绿原酸、3代表3，5-二咖啡酰奎宁酸、4代表4，5-二咖啡酰奎宁酸。

重复性考察

参照下列实验步骤，平行做3组，作为重复性考察。

称取金银花药材粉末25mg、β-环糊精75mg，加入研钵中研磨120s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL80％甲醇水，注入小柱内，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

药材含量测定

称取金银花药材粉末25mg、β-环糊精75mg，加入研钵中研磨120s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL80％甲醇水，注入小柱内，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液，即为酚酸类有效成分提取液，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。获得提取液的液相色谱图。

图7为酚酸类有效成分提取液的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表金银花中不同的有效成分，分别为：1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。

以新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸的对照品配制不同浓度的混合对照品溶液，按同样条件用超高效液相色谱检测，获得四者对照品的色谱图，以四者对照品的进样量为横坐标，以四者对照品溶液的色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，分别制作新绿原酸标准曲线、绿原酸标准曲线、3，5-二咖啡酰奎宁酸标准曲线和4，5-二咖啡酰奎宁酸标准曲线。根据提取液的液相色谱图和标准曲线计算得到金银花药材中新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸的含量。

新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸浓度均为100μg/mL的金银花对照品溶液的液相色谱图如图6所示，图中，1、2、3、4分别代表金银花中不同的有效成分，分别为：1：新绿原酸、2：绿原酸、3：3，5-二咖啡酰奎宁酸、4：4，5-二咖啡酰奎宁酸。

4种成分的标准曲线以及检测限和定量限如下表6所示：

表6.

回收率实验

称取金银花药材粉末25mg、β-环糊精75mg，平行做2组，其中一组加入100μμg/mL的金银花混合对照品50μL，另一组不加金银花混合对照品，两组均加入研钵中研磨120s。分别取2支1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的粉末填充小柱，填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL80％甲醇水，分别注入小柱内，对小柱进行逐一洗脱。底部均用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

重复性、含量测定、回收率实验结果汇总如下表7：

表7

结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性高。

对照例：

按照中国药典中的提取方法为：本品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。

所得提取液用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析，得到液相色谱图与标准曲线对照，可测得提取液中有效成分相对于金银花药材的含量为新绿原酸2.692mg/g、绿原酸25.05mg/g、3，5-二咖啡酰奎宁酸16.918mg/g、4，5-二咖啡酰奎宁酸2.3375mg/g。而本申请方法制得的提取液中有效成分相对于金银花药材的含量为新绿原酸3.3719mg/g、绿原酸33.3368mg/g、3，5-二咖啡酰奎宁酸20.733mg/g、4，5-二咖啡酰奎宁酸2.7641mg/g，相比药典的方法提取效果明显提高。

Claims (6)

1.一种天然产物的微量提取方法，用于提取金银花药材中的酚酸类成分，所述酚酸类有效成分为新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或两种以上，所述方法包括以下步骤：

(1)以一定的药材和吸附剂的质量比称取金银花药材粉末和吸附剂，加入研钵中研磨一定的时间。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取适量体积的洗脱液，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s，后放入离心仪中离心。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析，得到提取液中酚酸类有效成分的液相色谱图；

(2)以新绿原酸的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照提取液同样条件用超高效液相色谱仪检测，获得新绿原酸对照品的液相色谱图，以新绿原酸对照品的进样量为横坐标，以新绿原酸对照品溶液的液相色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标制作新绿原酸标准曲线，按同样方法制作绿原酸标准曲线、3，5-二咖啡酰奎宁酸标准曲线、4，5-二咖啡酰奎宁酸标准曲线；根据提取液的各成分的液相色谱图中色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到提取液中新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述吸附剂为β-环糊精。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述一定的药材和吸附剂的质量比为1∶3。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，研磨时间为120s。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述洗脱液为80％甲醇。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述洗脱液的体积为0.5mL。