CN106604647A - 发酵可可豆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了能够通过发酵碳水化合物而产生乙醇和乙酸的酵母在用于发酵可可豆的方法中的用途。

Description

发酵可可豆的方法
技术领域
本发明涉及用于发酵可可豆的方法。其还涉及酵母用于此类方法的用途。
背景技术
可可产品由可可树(Theobroma cacao)的豆制成。成熟果实(荚果)直接起源于可可树干并且壁较厚，并且包含30-40个豆(种子)。每个豆由被外种皮(种皮)包围的两片子叶和胚芽(胚根)组成并且包裹在甜的白色粘性果肉(占种子鲜重的约40％)中。
可可豆的收获后处理开始于打开荚果并从果实中移除种子以进行发酵。在发酵之后，可对豆进行洗涤并然后干燥。干燥通常在日光中进行并且要花费1至3周。一旦干燥到6-7％的湿度，就将豆储存于仓库的袋中直至销售和出口。
可可的发酵具有多个目的。首先，其有利于去除果肉。其次，其产生乙醇和乙酸，所述乙醇和乙酸连同所产生的热扩散到豆中，这致使种子胚芽死亡。第三，其致使豆的植物细胞壁分解，并且释放的内源性酶诱导豆内的生化反应，导致巧克力调味剂的前体。
通常，可可通过天然存在的酵母、乳酸菌(LAB)和醋酸菌(AAB)的聚生体自然发酵。实际发酵发生在包围可可豆的粘性果肉中并且持续5至7天。
根据R.F.Schwan和A.E.Wheals，Critical Reviews in Food Science andNutrition，2004，44，205-221，可可果肉包含82-87％水、10-15％糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)、2-3％戊聚糖、1-1.5％果胶、3％柠檬酸、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质。其初始pH为约3.6。
发酵的初始阶段由酵母和乳酸菌主导。利用酵母的醇发酵致使糖转化为乙醇和CO2。此外，发酵包括柠檬酸降解、果胶降解和挥发物(主要为杂醇、脂肪酸和脂肪酸酯)的产生。
虽然一些乳酸菌菌种将葡萄糖转化为乳酸、乙酸、乙醇和CO2(异型乳酸发酵)，但是利用乳酸菌的乳酸发酵主要包括将糖转化为乳酸(同型乳酸发酵)。果糖可被一些乳酸菌还原为甘露糖醇，并且还可发生柠檬酸同化。乳酸发酵受益于低pH、高含糖量、低乙醇并因而可在醇发酵结束时发生。柠檬酸转化导致pH升高并且可能有助于可可调味剂。
乙酸发酵通过醋酸菌进行。其包括将乙醇氧化为乙酸。虽然糖发酵成乙醇是厌氧的(即，可在不存在氧气时进行)，但乙醇转化成乙酸却是有氧的并且需要存在氧气。
通常应当理解，醇和乙酸发酵两者可能对于获得高品质可可是必须的。然而，并非总是需要乳酸发酵，因为当乳酸进入子叶时其不能蒸发并可因而影响可可豆的品质。
果肉降解酶导致称为“浆汁”的液体排出。R.Buamah等人，World Journal ofMicrobiology and Biotechnology，1997，13，457-462描述了酵母培养物对可可发酵的影响及其对浆汁收率的影响。具体地，文章描述了脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、Candida norvengensis和白色球拟酵母(Torulopsis candida)特定ATCC菌株的使用。该文档描述了两个实验：第一个在无菌环境(即，不存在其它微生物)中使用酵母或酵母的组合；第二个为正常自然发酵而无需添加酵母。
WO 2013/064678描述了在可可发酵中克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)菌种的起动酵母的使用。发酵按实验室规模进行。然而，其并未公开该酵母能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者。
J.Sanchez等人，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie，1985，18(2)，69-75描述了采用脆壁克鲁维酵母、诞沫假丝酵母(Candida zeylanoides)和薛瓦酵母菌种的纯酵母培养物进行发酵，其它条件与自然发酵(其被用作对照)的那些相同。然而，使用脆壁克鲁维酵母的结果并未示出相比于自然发酵有改进，并且使用诞沫假丝酵母的那些是适度的。然而，该文献并未公开任何酵母都能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者。
J.E.Sanchez Vasquez，Café Cacao Thé，1989，第XXXIII卷，第3期，157-163描述试图通过用微生物直接接种来改善可可发酵。该文档描述了两个实验：第一个使用醋酸菌醋杆菌属(Acetobacter sp.)，另一个使用克劳森酒香酵母(Brettanomyces claussenii)菌种的酵母。然而，在这个第二实验中存在相当大的醋酸菌污染，因此并未公开该酵母能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者。此外，该实验的结果示出，酵母群体在发酵第一天达到其最大值，但酵母在第四天消失或死亡。此外，相比于相同条件下的自然发酵，发酵持续时间并没有减少。
已知特别是来自于饮料工业诸如啤酒和葡萄酒工业的某些酵母菌种能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和有机酸两者(包括乙酸)。然而，这些酵母在这些工业中是被不希望的，因为它们致使酒精饮料腐败。
此外，仍然需要可改善可可豆的发酵的微生物。希望在可可发酵过程中引入能够催化乙醇和乙酸两者产生的微生物。
发明内容
因此，在一个方面，本发明包括用于发酵可可豆的方法，该方法包括以下步骤：
a)将至少一种酵母添加至植物材料，所述植物材料包括：
(i)来源于可可树物种的果实荚的豆；和
(ii)果肉；以及
b)将所述植物材料发酵以获得经发酵的可可豆，发酵环境包含选自酵母、乳酸菌和醋酸菌的至少一种其它微生物；
其中所添加的酵母能够通过发酵碳水化合物而产生乙醇和乙酸。
在另一方面，根据本发明，提供了通过以上方法获得或可获得的经发酵的可可豆。
在另一方面，根据本发明，提供了产生可可基产品的方法，该方法包括：
(a)提供通过以上方法获得或可获得的经发酵的可可豆；以及
(b)在所述经发酵的可可豆上实施一个或多个进一步的加工步骤，以产生可可基产品。
在另一方面，根据本发明，提供了通过以上方法获得或可获得的可可基产品。可可基产品可为食品例如巧克力，或非食品。
在另一方面，根据本发明，提供了能够通过发酵碳水化合物而产生乙醇和乙酸的酵母在用于在包含至少一种其它微生物的环境中发酵可可豆的方法中的用途，所述至少一种其它微生物选自酵母、乳酸菌和醋酸菌。
优点
不受理论的束缚，据信向可可发酵过程添加根据本发明的能够产生乙醇和乙酸两者的酵母将导致比不添加酵母的常规自然发酵过程更早产生乙酸。这可以减少实施可可发酵过程所需的时间，例如从目前使用自然发酵的6至7天减少到4至5天。
此外，不受理论的束缚，据信向可可发酵过程添加根据本发明的能够产生乙醇和乙酸两者的酵母，将限制参与发酵过程的其它微生物的发育：具体地，据信相比于不添加酵母的常规自然发酵过程，在该过程期间醋酸菌的发育将受到限制。
具体地，据信在可可发酵过程中添加的根据本发明的酵母贯穿整个发酵过程维持酵母水平。相比于不添加酵母的自然发酵环境中的相同比率，这将增大整个发酵过程期间的计数比(总酵母计数/总醋酸菌计数)。这将违背如下现有技术的教导：其通常描述了甚至在添加酵母时，发酵过程期间的酵母计数仍减小并且酵母/醋酸菌的计数比返回到自然发酵期间所观察的正常水平。
附图说明
图1示出根据实施例1(灰色)或实施例3(黑色)，在48小时和30℃下10种酵母的乙酸产量(g/L)。
图2示出根据实施例1(灰色)或实施例3(黑色)，在48小时和30℃下10种酵母的乙醇产量(g/L)。
图3示出根据时间(小时)，布鲁塞尔德克酵母(Dekerra bruxellensis)菌株产生乙酸和乙醇(g/L)的动力学，其消耗的葡萄糖和果糖以及OD600nm。
图4示出根据时间(小时)，两种酿酒酵母(S.cerevisiae)和1种贝酵母(S.bayanus)菌株产生(A)乙酸(g/L)和(B)乙醇(g/L)的动力学，以及(C)600nm处的OD。
图5示出根据时间(小时)，两种马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)菌株(A)产生乙酸和乙醇(g/L)的动力学，以及(B)600nm处的OD。
图6示出根据时间(小时)，两种乳酒假丝酵母(C.kefyr)菌株(A)产生乙酸和乙醇(g/L)的动力学，以及(B)600nm处的OD。
具体实施方式
至少一种酵母的添加
本发明的方法包括向可可发酵环境添加能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母。发酵环境包括可可豆(即，来源于可可树(Theobroma cacao)物种的果实荚的豆)和果肉。果肉的性质如下所述。
实现任何形式的至少一种酵母的添加(步骤a)，从而使所述至少一种酵母与最多可可豆接触。
在一个实施方案中，将酵母以液体形式添加到可可豆上。在一个实施方案中，当酵母以粉末形式(干燥或冷冻干燥)获得时，将酵母培养物预先再水化成例如无菌盐水溶液。在一个实施方案中，当酵母呈冷冻形式时，在添加步骤之前，将酵母培养物预先解冻并任选地稀释。
在一个实施方案中，当酵母以粉末形式或冷冻形式获得时，酵母在以液体形式添加到可可豆上之前在包含可可果肉和果汁(例如，椰子水、香蕉汁或菠萝汁)的培养基上繁殖。
在一个实施方案中，将酵母以粉末形式(干燥或冷冻干燥)添加到可可豆上。
所述至少一种酵母的添加例如通过将液体或粉末倾倒或喷洒到可可豆上进行。
在一个任选实施方案中，在添加至少一种酵母之后，将可可豆混合以确保所添加酵母的良好均化。
将至少一种酵母以足以使乙醇和乙酸两者能够在发酵期间产生的计数添加到发酵环境中。通常，酵母以每克植物材料(豆+果肉)104至109，优选105至108菌落形成单位数(cfu)的计数添加。在一个实施方案中，酵母以至少104、105、106、107、108cfu/克植物材料的计数添加。
除在发酵起始时添加如本文所述的至少一种酵母之外，过程还可包括在发酵已经开始之后另外添如本文所述的至少一种酵母。因此，过程还包括在发酵步骤(b)期间添加如本发明所述的至少一种酵母的步骤。在一个实施方案中，在发酵步骤(b)期间添加的酵母与步骤a)期间添加的酵母相同。在另一个实施方案中，在发酵步骤(b)期间添加的酵母不同于步骤a)期间添加的酵母，但是仍如本文所述。技术人员可确定是否需要在发酵步骤(b)期间添加至少一种菌株，例如通过确定所产生的乙醇水平是不足的，并且/或者所产生的乙酸水平是不足的。可在发酵步骤(b)期间的任何时间添加至少一种酵母，并且优选发酵前24小时，前48小时或前96小时期间。在一个具体实施方案中，在步骤a)之后24小时、48小时或96小时，具体地在步骤a)之后18小时与30小时之间，更具体地在22小时与26小时之间添加至少一种酵母。
发酵过程
发酵通常导致形成巧克力前体化合物。这些在如下所述的后续处理(特别是热处理，例如豆的烘烤)期间彼此相反应，以形成导致巧克力调味剂的化合物。
在本发明的过程开始时，存在豆和果肉两者。过程开始于将酵母添加至发酵过程。在一个实施方案中，过程在消耗至少部分果肉(即，果肉中可发酵碳水化合物的至少一部分转化为乙醇和乙酸)时结束。在一个实施方案中，过程在消耗至少部分果肉(即，果肉中的所有可发酵碳水化合物转化为乙醇和乙酸)时结束。在一个实施方案中，过程在果肉被完全液化时结束。在一个实施方案中，过程在几乎所有果肉(至少80％，至少90％或至少95％)被液化时结束。
在一个实施方案中，发酵在堆积物、木箱、托盘或篮筐中进行，以允许发生自然发酵。
可实现本发明方法的温度通常在20℃至60℃，并优选30℃至50℃之间变化。在一个实施方案中，可实现本发明方法的温度高于30℃，优选高于35℃。
具体地，不受理论的束缚，据信相比于现有技术的方法，在本发明中使用的添加的酵母可催化乙醇和乙酸两者同时产生。这可使发酵过程加速。通常，发酵步骤(b)花费2至7天，更优选4或5天。使用本发明的方法，发酵花费至少1天，优选至少2天，这少于不添加酵母的对应发酵过程。
在一个实施方案中，将豆在发酵过程中翻转。这确保足够的空气供应于发酵的豆周围。在一个实施方案中，在发酵过程的每天进行一次翻转过程。
发酵环境通常包含宽泛的微生物范围。存在的微生物包括酵母、乳酸菌和/或醋酸菌中的至少一种。通常，发酵环境中的微生物包括酵母和醋酸菌。在一个实施方案中，发酵环境中的微生物包括酵母、乳酸菌和醋酸菌。
在一个实施方案中，发酵环境为自然发酵环境。在本说明书中，术语“自然发酵环境”在其最广义的意义上是指通常存在于常规可可发酵过程(即，不添加任何微生物)中的环境。自然发酵的示例公开于“Qualité du cacao，L’impact du traitement post-récolte”；版本2013)。
在一个实施方案中，本发明的方法在户外即处于收集可可豆的位置的天然环境中进行。在一个实施方案中，本发明的方法不在无菌条件下进行。在一个实施方案中，自然发酵环境处于与农场加工(on-farm processing)相同的环境中，但是不添加酵母。在一个实施方案中，自然发酵环境包含与常规可可发酵过程相同的可可豆，但是不添加酵母。在一个实施方案中，自然发酵环境包含与常规可可发酵过程相同的果肉，但是不添加酵母。在一个实施方案中，自然发酵环境处于与常规可可发酵过程相同的温度，但是不添加酵母。在一个实施方案中，自然发酵环境包含通常与常规可可发酵过程相同的微生物(包括但不限于酵母、醋酸菌、和乳酸菌)，但是不添加酵母。在一个实施方案中，自然发酵环境包含与常规可可发酵过程相同的土著菌群(包括但不限于酵母、醋酸菌、和乳酸菌)，但是不添加酵母。在一个实施方案中，自然发酵环境使用与现有技术的常规可可发酵过程相同的覆盖植物材料，但是不添加酵母。
在一个实施方案中，发酵环境(具有所添加的酵母)中的醋酸菌所产生的乙酸的量少于不添加酵母的自然发酵环境中产生的乙酸的量。
所添加的酵母通常产生发酵步骤期间所产生的乙酸的大部分，其它部分乙酸由土著醋酸菌产生。在一个实施方案中，所添加的酵母产生多于50％的发酵步骤期间所产生的乙酸。在一个实施方案中，所添加的酵母产生多于60％的发酵步骤期间所产生的乙酸。在一个实施方案中，所添加的酵母产生多于70％的发酵步骤期间所产生的乙酸。在一个实施方案中，所添加的酵母产生多于80％的发酵步骤期间所产生的乙酸。在一个实施方案中，当所添加的酵母产生多于50％、60％、70％或80％的发酵步骤期间所产生的乙酸时，其产生至多90％的发酵步骤期间所产生的乙酸。在一个具体的实施方案中，所添加的酵母产生介于50与80％、50与90％、60与80％、60与90％、70与80％、70与90％或80与90％之间的发酵步骤期间所产生的乙酸。在一个具体的实施方案中，土著醋酸菌产生少于10％或少于20％的发酵步骤期间所产生的乙酸，发酵步骤期间所产生的乙酸的大部分由添加的酵母产生。
在一个实施方案中，本发明的整个过程期间的(总酵母计数/总醋酸菌计数)比率高于不添加酵母的自然发酵环境中对应的比率。不受理论的束缚，据信与酵母计数通常随发酵过程进行而减少的现有技术不同，在整个过程中维持的高酵母水平(具体为高比率的酵母/醋酸菌)使得醋酸菌水平能够被控制并且发酵过程的持续时间缩短。
在一个实施方案中，在步骤(b)期间存在于发酵环境中的总酵母/总醋酸菌(log/log)比(本文称为“Y/AAB比”，该比率基于每种微生物的菌落形成单位数以10为底的对数来计算)等于或大于0.8。在一个实施方案中，在发酵的前3天期间，Y/AAB比等于或大于0.8。在一个实施方案中，在发酵的前4天期间，Y/AAB比等于或大于0.8。在一个实施方案中，在发酵的前5天期间，Y/AAB比等于或大于0.8。在一个实施方案中，Y/AAB比等于或大于0.9。在一个实施方案中，Y/AAB比等于或大于1。不受理论的束缚，据信与酵母计数通常随发酵过程进行而减少的现有技术不同，维持的高酵母群体使得酵母能够优先于醋酸菌生长并且发酵过程的持续时间因而缩短。
豆
本发明的过程在可可豆即来源于可可树的果实荚的豆上进行。在过程期间，发酵期间产生的乙醇和乙酸渗入豆，以便杀死豆中的胚芽并产生巧克力调味剂前体。
通常，过程在通常重20kg至2000kg的堆积物、箱(例如木箱)、托盘或篮筐上进行。通常，豆由植物材料(诸如香蕉或大蕉叶)包围，所述植物材料的功能为保存发酵过程期间产生的热。通常，此类盒的尺寸被设计成允许最佳绝热和空气转移。
果肉
本发明的发酵过程包括将酵母添加至果肉。果肉充当添加的酵母及其它微生物的营养源，以及用于产生发酵过程中形成的乙醇和乙酸的碳水化合物源。这些及其它化合物(例如芳族分子)渗入豆并导致可可调味剂和可可调味剂前体形成。
果肉的性质不受特别限制，前提条件是其包含发酵微生物能够作用于其上的一种或多种可发酵碳水化合物以产生乙醇和乙酸。果肉中所含的典型碳水化合物包括单糖例如葡萄糖和果糖、二糖例如蔗糖、以及多糖例如果胶、纤维素、半纤维素和木质素。
在一个实施方案中，果肉包括可可果肉，即天然围绕可可豆的果肉。在一个实施方案中，在添加酵母期间或之前移除可可果肉的部分(至多10％、至多20％或介于10与20％之间)。不受理论的束缚，据信通过限制初始果肉含量，可以控制用本发明方法产生的乙酸水平。
在一个实施方案中，果肉包括可可果肉连同来自于除可可树之外的植物的果肉的混合物。在一个实施方案中，果肉基本上仅由或仅由来自于除可可树之外的植物的果肉组成，即可可果肉被完全除去。其它植物的性质不受特别限制，前提条件是其果肉包含发酵微生物能够作用于其上的一种或多种可发酵碳水化合物以产生乙醇和乙酸。
酵母
本文所用的酵母分类根据“The yeasts：a taxonomic study”第5版；Elsevier，2011。
根据本发明，将酵母添加至可可发酵过程(例如，天然发酵过程)。在一个实施方案中，添加的酵母为单酵母菌株。在一个实施方案中，酵母包括酵母的混合物。
在一个实施方案中，添加的酵母与天然存在于自然发酵环境中的酵母的菌种相同。然而，根据本发明通常优选的是，酵母不同于天然存在于自然发酵环境中的酵母，因为参与天然可可发酵的酵母通常不能产生乙醇和乙酸两者。在一个实施方案中，根据本发明通常优选的是，添加的酵母不同于天然存在于其中添加所述酵母的自然发酵环境中的酵母。因此，在一个实施方案中，添加于特定自然发酵环境(其中该菌种不天然存在)中的酵母来自于另一个特定的自然发酵环境。实际上，已知一些酵母菌种仅存在于一些国家或地理区域的发酵环境(表2的“Qualité du cacao，L’impact du traitement post-récolte”；版本2013)。作为一个具体示例，在亚洲自然发酵环境中，将所添加的来自于非洲自然发酵环境的酵母在本发明的发酵方法内使用，或者反之亦然。作为另一个具体示例，在第二国家的自然发酵环境中，将所添加的来自于第一国家的自然发酵环境的酵母在本发明的发酵方法内使用。
在本发明中使用的添加的酵母是能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的那些酵母。
表达“能够产生乙醇和乙酸两者的酵母”涵盖能够产生(或生产)低水平乙醇和高水平乙酸的酵母，以及能够产生(或生产)高水平乙醇和高水平乙酸的酵母这两种。在本发明中，能够产生(或生产)高水平乙醇和高水平乙酸两者的酵母是优选的。
在本发明内，认为酵母在以下情况时产生高水平的乙酸：
-在测定I期间所述酵母产生的乙酸浓度等于或高于0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，并且/或者
-在测定I期间由所述酵母产生的乙酸的浓度相对于最终OD(即，在测定I结束时的OD600nm)的比率等于或高于50、60、70、80、90、100、120、150、200、250或300mg/L/OD。
在本发明内，认为酵母在以下情况时产生高水平的乙醇：
-在测定I期间由所述酵母产生的乙醇的浓度等于或高于30、35、40、45或50g/L，并且/或者
-在测定I期间由所述酵母产生的乙醇的浓度相对于最终OD(即，在测定I结束时的OD600nm)的比率等于或高于3、3.5或4g/L/OD。
在一个实施方案中，用于本发明的酵母能够在测定I期间产生浓度等于或高于0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，优选等于或高于1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，更优选等于或高于1.5，2或2.5g/L的乙酸。
在一个实施方案中，单独地或者与前者结合，用于本发明的酵母能够在测定I期间以等于或高于50、60、70、80、90、100、120、150、200、250或300mg/L/OD，优选等于或高于100、120、150、200、250或300mg/L/OD，更优选等于或高于150、200、250或300mg/L/OD的由所述酵母产生的乙酸的浓度相对于最终OD的比率产生乙酸。
在一个实施方案中，并且除了如前两个段落所述产生高水平的乙酸之外，用于本发明的酵母能够在测定I期间产生浓度等于或高于30、35、40、45或50g/L，优选等于或高于40、45或50g/L，更优选等于或高于45或50g/L的乙醇。
在一个实施方案中，单独地或者与前者结合，用于本发明的酵母能够在测定I期间以等于或高于3、3.5或4g/L/OD的由所述酵母产生的乙醇的浓度相对于最终OD的比率产生乙醇。
在一个实施方案中，用于本发明的酵母能够：
(a)在测定I期间产生浓度等于或高于1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，优选等于或高于1.5、2或2.5g/L的乙酸，并且/或者在测定I期间以等于或高于100、120、150、200、250或300mg/L/OD，优选等于或高于150、200、250或300mg/L/OD的由所述酵母产生的乙酸的浓度相对于最终OD的比率产生乙酸，并且
(b)任选地，在测定I期间产生浓度等于或高于40、45或50g/L，更优选等于或高于45或50g/L的乙醇，并且/或者在测定I期间以等于或高于3、3.5或4g/L/OD的由所述酵母产生的乙醇的浓度相对于最终OD的比率产生乙醇。
在一个实施方案中，用于本发明的酵母能够：
(a)在测定I期间产生浓度等于或高于1.5、2或2.5g/L的乙酸，并且/或者在测定I期间以等于或高于150、200、250或300mg/L/OD的由所述酵母产生的乙酸的浓度相对于最终OD的比率产生乙酸，并且
(b)任选地，在测定I期间产生浓度等于或高于45或50g/L的乙醇，并且/或者在测定I期间以等于或高于3、3.5或4g/L/OD的由所述酵母产生的乙醇的浓度相对于最终OD的比率产生乙醇。
在一个实施方案中，用于本发明的酵母能够(a)在测定I期间产生浓度等于或高于1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，优选等于或高于1.5、2或2.5g/L的乙酸，并且任选地在测定I期间产生浓度等于或高于40、45或50g/L，更优选等于或高于45或50g/L的乙醇。在一个实施方案中，用于本发明的酵母能够(a)在测定I期间产生浓度等于或高于1.5、2或2.5g/L的乙酸，并且任选地在测定I期间产生浓度等于或高于45或50g/L的乙醇。在一个实施方案中，用于本发明的酵母能够(a)在测定I期间产生浓度等于或高于1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，优选等于或高于1.5、2或2.5g/L的乙酸，并且在测定I期间产生浓度等于或高于40、45或50g/L，更优选等于或高于45或50g/L的乙醇。在一个实施方案中，用于本发明的酵母能够(a)在测定I期间产生浓度等于或高于1.5、2或2.5g/L的乙酸，并且在测定I期间产生浓度等于或高于45或50g/L的乙醇。
本文表达了乙酸水平(g/L)、乙醇水平(g/L)和比率(mg/L/OD和g/L/OD0)的值，相对标准偏差为±10％。
从能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的菌种中，本文描述了合适的酵母的示例，并且包括根据称为本文实施例1(测定法I)的测定选择的那些。
在一个实施方案中，添加的酵母为选自以下的属：德克酵母属(Dekkera)、酒香酵母属(Brettanomyces)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、Kazachstania、Wickerhamomyces、Lindnera和Zygotorulaspora、或它们的任何混合物。
在一个实施方案中，添加的酵母为德克酵母属。
在一个实施方案中，添加的酵母为酒香酵母属。在一个实施方案中，当添加的酵母为酒香酵母属，所述酵母不为克劳森酒香酵母(Brettanomyces claussenii)菌种(目前称为异酒香酵母(Brettanomyces anomalus))，或者当与多种一种酵母组合时不包含克劳森酒香酵母菌种(目前称为异酒香酵母)。
在一个实施方案中，添加的酵母为有孢汉逊酵母属。
在一个实施方案中，添加的酵母为克氏酵母属。
在一个实施方案中，添加的酵母为毕赤酵母属。在一个实施方案中，当添加的酵母为毕赤酵母属时，添加的酵母不为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。
在一个实施方案中，添加的酵母为假丝酵母属。在一个实施方案中，当添加的酵母为假丝酵母时，添加的酵母不为Candida incommunis(也称为C.norvengenis)菌种和/或诞沫假丝酵母(Candida zeylanoides)并且/或者不为菌株ATCC20031。
在一个实施方案中，添加的酵母为酵母属。在一个实施方案中，当添加的酵母为酵母属时，添加的酵母不为酿酒酵母(S.cerevisiae)菌种。
在一个实施方案中，添加的酵母为克鲁维酵母属。在一个实施方案中，当添加的酵母为克鲁维酵母属，添加的酵母不为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
在一个实施方案中，添加的酵母为德巴利氏酵母属。
在一个实施方案中，添加的酵母为Kazachstania属。
在一个实施方案中，添加的酵母为Wickerhamomyces属。
在一个实施方案中，添加的酵母为Lindnera属。
在一个实施方案中，添加的酵母为Zygotorulaspora属。
在一个实施方案中，添加的酵母选自以下菌种中的一种或几种：
-布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)(无性型酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis))，
-班图酒香酵母(Brettanomyces custersianus)，
-Brettanomyces nanus，
-Brettanomyces naardenensis，
-葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)(无性型柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata))、
-Hanseniaspora guillermondii(无性型蜜蜂克勒克酵母)，
-嗜高压有孢汉生酵母(Hanseniaspora osmophila)(无性型Kloeckeracortisis)，
-发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)(无性型郎比可假丝酵母(Candidalambica))，
-膜醭毕赤酵母(无性型粗状假丝酵母)，
-异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)(之前称为异常汉逊酵母(Pichia anomala))(无性型菌膜假丝酵母(Candida pelliculosa))，
-克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)；在一个实施方案中，当酵母为克鲁维毕赤酵母菌种时，所述酵母不为克鲁维毕赤酵母PK-KR1菌株和/或克鲁维毕赤酵母PKKR2菌株，2006年8月24日以登录号为V06/022711和V06/022712保藏于National MeasurementInstitute，
-乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(无性型Candida spherica)，
-汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)(无性型无名假丝酵母(Candidafamata))，
-Lindnera jadinii(无性型产朊假丝酵母(Candida utilis))，
-单孢酿酒酵母(Kazachstania unispora)(也称为Saccharomyces unisporus)，
-Zygotorulaspora florentina(之前称为Saccharomyces florentinus)，
-贝酵母(Saccharomyces bayanus)。
在一个实施方案中，酵母为马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)(也称为脆壁克鲁维酵母(K.fragilis))；在一个实施方案中，当酵母来自于马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)菌种时，所述酵母不为以保藏号8601获得于ATCC的脆壁克鲁维氏酵母菌株和/或以CBS1555(Centraal Bureau voor Schimmelcultures)保藏的马克斯克鲁维酵母菌株。
在一个实施方案中，该酵母为诞沫假丝酵母菌种。
在一个实施方案中，该酵母为Candida incommunis菌种。在一个实施方案中，当酵母为Candida incommunis菌种时，酵母不为以保藏号CBS5604(或ATCC22971)保藏的Candida incommunis菌株。
在一个实施方案中，酵母为酿酒酵母菌种(也称为薛瓦酵母(Saccharomyceschevalieri))。在一个实施方案中，当酵母来自于酿酒酵母(S.cerevisiae)菌种时，酵母不为以保藏号52712保藏于ATCC的酿酒酵母菌株。
在一个实施方案中，酵母为异酒香酵母(Brettanomyces anomalus)菌种(也称为Dekerra anomala或克劳森酒香酵母(Brettanomyces claussenii))。在一个实施方案中，当酵母来自于异酒香酵母菌种时，酵母不为J.Sanchez等人，Lebensmittel Wissenschaftund Technologie，1985，18(2)，69-75中称为C-Y-31-2-2的异酒香酵母菌株。
在一个实施方案中，本发明内所用的酵母选自：贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母、异常汉逊酵母以及它们的任何混合物，前提条件是当：
-该酵母为酿酒酵母并且单独使用时，该酵母不为保藏号52712保藏于ATCC的酿酒酵母菌株，
-该酵母为马克斯克鲁维酵母并且单独使用时，该酵母不为以保藏号8601获得于ATCC的脆壁克鲁维氏酵母菌株和/或以CBS1555保藏的马克斯克鲁维酵母菌株，并且
-该酵母为克鲁维毕赤酵母并且单独使用时，该酵母不为克鲁维毕赤酵母PK-KR1和/或克鲁维毕赤酵母PKKR2菌株，2006年8月24日以登录号V06/022711和V06/022712保藏于National Measurement Institute。
在一个实施方案中，本发明内使用的至少一种添加的酵母选自：贝酵母、布鲁塞尔德克酵母、异常毕赤酵母以及它们的任何混合物。在一个实施方案中，本发明内使用的至少一种添加的酵母选自：贝酵母、布鲁塞尔德克酵母以及它们的任何混合物。在一个实施方案中，本发明内使用的至少一种添加的酵母选自：贝酵母以及任何包含贝酵母的酵母的混合物。在一个实施方案中，本发明内使用的至少一种添加的酵母选自：布鲁塞尔德克酵母以及任何包含布鲁塞尔德克酵母的酵母的混合物。
在一个实施方案中，本发明内优选使用的酵母为产生高水平乙酸和高水平乙醇(如本文所定义，例如使用测定法I)的酵母并且选自贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、以及它们的任何混合物，前提条件是当：
-该酵母为酿酒酵母并且单独使用时，该酵母不为以保藏号52712保藏于ATCC的酿酒酵母菌株，并且
-该酵母为马克斯克鲁维酵母并且单独使用时，该酵母不为以保藏号8601获得于ATCC的脆壁克鲁维氏酵母菌株和/或以CBS1555保藏的马克斯克鲁维酵母菌株。在一个实施方案中，酵母为产生高水平乙酸和高水平乙醇(如本文所定义)的贝酵母。
在一个实施方案中，酵母为产生高水平乙酸和高水平乙醇(如本文所定义)的酵母，选自贝酵母和任何包含贝酵母的酵母的混合物。
在一个实施方案中，本发明内优选使用的酵母为产生高水平乙酸和低水平乙醇(如本文所定义，例如使用测定法I)的酵母，并且选自布鲁塞尔德克酵母、Hanseniasporaguillermondii、克鲁维毕赤酵母、异常毕赤酵母以及它们的任何混合物，前提条件是当该酵母为克鲁维毕赤酵母并且单独使用时，该酵母不为克鲁维毕赤酵母PK-KR1和/或克鲁维毕赤酵母PKKR2菌株(2006年8月24日以登录号V06/022711和V06/022712保藏于NationalMeasurement Institute)。在一个实施方案中，本发明内优选使用的酵母为产生高水平乙酸和低水平乙醇(如本文所定义，例如使用测定法I)的酵母，并且选自布鲁塞尔德克酵母、克鲁维毕赤酵母、异常毕赤酵母以及它们的任何混合物，前提条件是当该酵母为克鲁维毕赤酵母并且单独使用时，该酵母不为克鲁维毕赤酵母PK-KR1和/或克鲁维毕赤酵母PKKR2菌株(2006年8月24日以登录号V06/022711和V06/022712保藏于National MeasurementInstitute)。在一个实施方案中，酵母为产生高水平乙酸和低水平乙醇(如本文所定义)的酵母并且选自布鲁塞尔德克酵母、异常毕赤酵母以及它们的任何混合物。
在一个实施方案中，酵母为产生高水平乙酸和低水平乙醇(如本文所定义)的酵母，选自布鲁塞尔德克酵母以及任何包含布鲁塞尔德克酵母的酵母的混合物。
“酵母的混合物”在本文被定义为至少2种酵母，特别是2、3或4种酵母的共混物。在一个具体的实施方案中，至少2种酵母，特别是2、3或4种酵母为不同的菌种。
在一个实施方案中，将酵母的混合物添加到可可发酵过程中，其中至少一种酵母选自本文所述的酵母。在一个实施方案中，酵母的混合物包含或由至少2种选自本文所述的酵母的酵母组成。在一个实施方案中，酵母的混合物由至少2种酵母组成或包含至少2种酵母，例如2、3或4种酵母，所述酵母各自独立地选自：贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
在一个实施方案中，酵母的混合物——添加到本发明的可可发酵过程——由至少2种不同菌种的酵母组成或包含至少2种不同菌种的酵母，例如2、3或4种不同菌种的酵母，所述酵母各自独立地选自：贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
在一个具体的实施方案中，酵母的混合物由至少2种不同菌种的酵母组成或包含至少2种不同菌种的酵母，例如2、3或4种不同菌种的酵母，其中一种酵母选自贝酵母和布鲁塞尔德克酵母，并且一种酵母选自贝酵母、布鲁塞尔德克酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、酿酒酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
在一个具体的实施方案中，酵母的混合物——添加到本发明的可可发酵过程——包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母为布鲁塞尔德克酵母并且一种酵母选自贝酵母、酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)。在这些实施方案中，布鲁塞尔德克酵母优选地产生高水平乙酸和低水平乙醇(如本文所定义)。
在一个实施方案中，酵母的混合物－－添加到本发明的可可发酵过程－－包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母来自于贝酵母菌种并且一种酵母来自于毕赤酵母属、克鲁维酵母菌属、有孢汉逊酵母属或德克酵母属或者为来自于不同于贝酵母菌种的酵母属的酵母。在一个实施方案中，混合物包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母来自于贝酵母菌种，并且一种酵母选自酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。在一个实施方案中，混合物包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母来自于贝酵母菌种，并且一种酵母选自酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)和布鲁塞尔德克酵母。在这些实施方案中，贝酵母菌株优选地产生高水平的乙酸和高水平的乙醇(如本文所定义)。
在一个实施方案中，当单独使用或作为混合物使用时，如本文所定义的酵母适于在本发明过程中以高于30℃，优选高于35℃的温度使用。因此，如本文所定义的酵母能够在高于30℃，优选高于35℃的温度下进行的本发明过程中产生乙酸和任选的乙醇。
在一个实施方案中，酵母或酵母的混合物为发酵过程期间添加的唯一微生物。在一个实施方案中，酵母或酵母的混合物为发酵过程期间添加的参与豆发酵的唯一微生物。
其它成分
在一个实施方案中，在过程的至少部分期间存在至少一种具有果胶分解活性的酵母。在一个实施方案中，至少一种具有果胶分解活性的酵母是所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母。在另一个实施方案中，具有果胶分解活性的酵母不同于所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母，但添加于具有所述添加的酵母的常见组合物中。在另一个实施方案中，具有果胶分解活性的酵母不同于并独立于所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母而添加。具有果胶分解活性的酵母的示例为产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基酯酶(PME)和/或果胶和果胶酸裂解酶(PL)的酵母。
在一个实施方案中，在过程的至少部分期间存在至少一种具有果胶分解活性的酶，例如果胶酶的商业溶液。在一个实施方案中，至少一种具有果胶分解活性的酶由所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母原位产生。在另一个实施方案中，将具有果胶分解活性的酶添加于具有所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母的常见组合物中。在另一个实施方案中，至少一种具有果胶分解活性的酶独立于所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母进行添加。
在一个实施方案中，在本发明过程期间不添加醋酸菌。
在一个实施方案中，在本发明过程期间添加乳酸菌。乳酸菌可为在可可发酵期间通常存在的任何那些，如以上描述和举例说明的那样。在一个实施方案中，在本发明过程期间不添加乳酸菌。在另一个实施方案中，将乳酸菌添加于具有所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母的常见组合物中。在另一个实施方案中，乳酸菌独立于所添加的能够通过发酵碳水化合物产生乙醇和乙酸两者的酵母进行添加。
在一个实施方案中，添加另外的营养物质以助于酵母生长和发酵过程。此类另外的营养物质的示例包括氮和铁。
经发酵的可可豆
本发明还包括通过本发明方法获得或可获得的经发酵的可可豆。发酵过程(特别是升高的温度和酸流入)破坏豆的细胞结构并使得存在于豆中的化合物混合和反应。具体地，在贮藏蛋白、酶(例如蛋白酶、多酚氧化酶和转化酶)之间发生反应并导致形成巧克力调味剂前体。巧克力调味剂前体的示例包括多肽和氨基酸(由蛋白质的降解产生)、由蔗糖的降解产生的还原糖(葡萄糖和果糖)。此外，单宁分子由多酚的降解和氧化形成，其降低涩味。可可碱和咖啡因也从豆中扩散和流出，其也降低涩味和苦味。
后续加工步骤和可可基产品
本发明还包括通过本发明方法获得或可获得的可可基产品，继之以制备可可基产品所需的后续加工步骤。可可基产品的示例包括可可基食品，例如巧克力和可可饮料(热巧克力)。
根据本发明产生的经发酵的可可豆可经历多个进一步的加工步骤以使其适于巧克力生产。
在一个实施方案中，进一步的加工步骤包括干燥经发酵的可可豆。形成调味剂的反应通常持续于整个干燥步骤。此外，强褐变反应例如多酚的氧化继续降低涩味。
在一个实施方案中，干燥步骤为日光干燥步骤或人工干燥步骤。此类干燥是优选的，因为其导致酸度显著降低：挥发性乙酸通过壳离开，并且非挥发性乳酸通过水从豆部分地输送到壳。
在一个实施方案中，进一步的加工步骤包括对干燥的豆进行热处理。通常，热处理包括如下过程的干烘烤：在不存在水或空气作为载体时将热施加于干燥的豆。通常，在干烘烤期间搅拌干燥的豆以确保均匀加热。
在一个实施方案中，进一步的加工步骤包括从经烘烤的豆移除外壳(壳)以产生可可碎粒。在一个实施方案中，进一步的加工步骤包括碾磨和液化碎粒以产生可可浆。
在一个实施方案中，进一步的加工步骤包括将可可浆与可可油和糖混合以产生巧克力。可添加巧克力生产领域所熟知的另外的成分，例如乳或乳固体(以生产牛奶巧克力)、大豆卵磷脂(乳化剂)和调味剂，例如香草醛、薄荷或果类调味料。
酵母的混合物
本发明还涉及酵母(如本文所定义)的混合物，以及其在可可豆发酵中的用途。
在一个实施方案中，酵母的混合物由至少2种酵母组成或包含至少2种酵母，例如2、3或4种酵母，所述酵母各自独立地选自：贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
在一个实施方案中，酵母的混合物由至少2种不同菌种的酵母组成或包含至少2种不同菌种的酵母，例如2、3或4种不同菌种的酵母，所述酵母各自独立地选自：贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniasporaguillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
在一个实施方案中，酵母的混合物由至少2种不同菌种的酵母组成或包含至少2种不同菌种的酵母，例如2、3或4种不同菌种的酵母，其中一种酵母选自贝酵母和布鲁塞尔德克酵母，并且一种酵母选自贝酵母、布鲁塞尔德克酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、酿酒酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
在一个具体的实施方案中，该混合物包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母为布鲁塞尔德克酵母并且一种酵母选自贝酵母、酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)。在这些实施方案中，布鲁塞尔德克酵母优选地产生高水平乙酸和低水平乙醇(如本文所定义)。
在一个实施方案中，该混合物包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母来自于贝酵母菌种并且一种酵母来自于毕赤酵母属、克鲁维酵母菌属、有孢汉逊酵母属或德克酵母属或者为来自于不同于贝酵母菌种的酵母属的酵母。在一个实施方案中，该混合物包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母来自于贝酵母菌种，并且一种酵母选自酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。在一个实施方案中，该混合物包含或由至少两种酵母特别是2种酵母组成，其中一种酵母来自于贝酵母菌种，并且一种酵母选自酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)和布鲁塞尔德克酵母。在这些实施方案中，贝酵母菌株优选地产生高水平的乙酸和高水平的乙醇(如本文所定义)。
在一个实施方案中，所述混合物中的酵母能够在高于30℃，优选高于35℃的温度下实施的本发明过程中产生乙酸和任选的乙醇。
在一个实施方案中，本发明的酵母的混合物不包含醋酸菌和/或乳酸菌，优选地不包含醋酸菌。
在一个实施方案中，任选地与上文刚刚提及的段落结合，本发明的酵母的混合物呈冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，团粒或冷冻团粒的形式，或粉末或干粉形式。在一个实施方案中，本发明的酵母的混合物呈冷冻形式或呈团粒或冷冻团粒形式。在一个实施方案中，本发明的酵母的混合物呈干燥或冷冻干燥形式，或者呈粉末或干粉形式。
在一个实施方案中，任选地与以上形式特征结合，本发明的酵母的混合物是高度浓缩的，由此使得其可直接添加到或与可可豆接触，即可能无需任何先前的繁殖。在一个实施方案中，并且无论形式如何(特别是呈冷冻或干燥形式)，酵母浓度的范围为105至1011CFU(菌落形成单位数)/g混合物，并且更优选至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010或至少1011CFU/g混合物。
实施例
实施例1：乙醇和乙酸的产生
该测定旨在的主要功能是在可可果肉模拟培养基(培养基1)中产生乙醇和乙酸。
培养基制备
培养基1：果糖(25g/L)、葡萄糖(25g/L)、蔗糖(75g/L)、柠檬酸(10g/L)、酵母提取物(5g/L)和大豆蛋白胨(5g/L)。
将酵母提取物、经中和的大豆蛋白胨和蔗糖混合在一起，并且在120℃下将混合物灭菌20min。在灭菌之后，测量pH并且如果必要将pH调节至6.5-7。
将果糖、葡萄糖和柠檬酸各自独立地高压消毒(120℃，20min)并且一旦温度约＜50℃就无菌地添加至杀菌混合器中。
在混合所有培养基组分之后，测量pH并且如果需要将pH调节至3.5。
测定法I
实验室级可可发酵试验在松弛封闭的1L带挡板锥形瓶中进行，该锥形瓶包含150ml可可果肉模拟培养基(培养基1)。
将锥形瓶置入25℃的培养箱中。在发酵期间不调控pH。锥形瓶以150-500rpm搅拌。
将先前在25℃下于20ml管中的可可果肉模拟培养基(培养基1)中繁殖20-30h的菌株以1-1.5％(体积/体积)的比率接种到锥形瓶中。发酵持续48小时。在发酵结束开始、期间和结束时取样。
底物消耗(葡萄糖、果糖、蔗糖)和代谢物产量(乙酸、乙醇)的测量使用联接到波长阵列分光光度计检测器和折射计的高效液相色谱法HPLC(前置柱：阳离子H短柱0mm×4.6mm和柱：Aminex HPX-87H；Biorad)进行。
实现600nm处的OD测量以跟踪发酵期间的酵母生长。在发酵的不同时间采集的样品用胰蛋白胨盐(TS)稀释，然后在Thermo Scientific Genesys 20TM分光光度计(谱隙宽规格为8nm并且有效光学路径为10mm)中于600nm处测量；OD(光密度)通过将样品的稀释因子乘以由分光光度计给出的值来计算。所计算的OD为将稀释因子乘以由分光光度计给出的值。
酵母选择
根据以下判据对酵母进行分类和选择：
1.产生乙醇的酵母，
2.产生乙酸的酵母，和
3.在产生乙醇和乙酸的酵母中，首先选择产生的水平最高的酵母
实施例2：将实施例1的测定法应用于酵母
将以下提及的43种不同的酵母菌株范围用作种菌来实现以上实施例1：
-异常德克拉酵母
-布鲁塞尔德克酵母
-Brettanomyces naardenensis
-葡萄汁有孢汉逊酵母
-Hanseniaspora guillermondii
-克鲁维毕赤酵母；
-膜醭毕赤酵母
-发酵毕赤酵母
-异常威克汉姆酵母
-乳酸克鲁维酵母
-马克斯克鲁维酵母
-单孢酿酒酵母
-汉逊德巴利酵母
-无名假丝酵母
-产朊假丝酵母
-诞沫假丝酵母
-Candida incommunis
-酿酒酵母
-贝酵母
-Zygotorulaspora florentina
-Candida insconspicua
-解脂耶氏酵母(Yarrowia lypolytica)
表1和2列出了根据本发明定义的能够产生高水平乙酸和/或高水平乙醇的菌株。
首先根据测定法I期间产生的乙酸的水平对酵母进行分类(表1)。从43种受试酵母中，18种酵母产生等于或高于0.7g/L的乙酸水平。在这些中，11种酵母产生高于1g/L的乙酸水平并且来自于以下菌种：贝酵母、克鲁维毕赤酵母、异常毕赤酵母、布鲁塞尔德克酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、酿酒酵母、Hanseniaspora guillermondii和Candidaincommunis。
然后根据测定法I期间产生的乙醇的水平对酵母进行分类(表2)。从43种受试酵母中，9种酵母产生等于或高于30g/L的高水平乙醇并且来自于以下菌种：酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、Saccharomyces florentinus、贝酵母和产朊假丝酵母。
对选自7种菌种的10种菌株进行选择，并且其产生的乙酸和乙醇水平用测定法I中公开的条件来测定，不同的是温度为30℃或35℃。表3汇总了所获得的数据。
如表3所示，2个子组可由产生高乙酸水平的菌株表征：
(1)产生高水平乙酸和高水平乙醇的酵母，例如来自于贝酵母、酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)菌种的菌株；以及
(2)产生高水平乙酸和低水平乙醇的酵母，例如来自于布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母菌种的菌株。
实施例3：由酵母菌株产生乙酸的动力学
培养基制备
培养基1：果糖(25g/L)、葡萄糖(25g/L)、蔗糖(75g/L)、柠檬酸(10g/L)、酵母提取物(5g/L)和大豆蛋白胨(5g/L)。
将酵母提取物、经中和的大豆蛋白胨和蔗糖混合在一起，并且在120℃下将混合物灭菌20min。在灭菌之后，测量pH并且如果必要将pH调节至6.5-7。
将果糖、葡萄糖和柠檬酸各自独立地高压消毒(120℃，20min)并且一旦温度约＜50℃就无菌地添加至杀菌混合器中。
在混合所有培养基组分之后，测量pH并且如果需要将pH调节至3.5。
测定法
实验室级可可发酵试验在包含2L可可果肉模拟培养基的3L发酵罐中进行。
将发酵温度调控于30℃。调节pH并且通过添加碱进一步调控于3.5-4.0。
搅拌为250-500rpm。
出气口为0.1-1vvm。
将先前在可可果肉模拟培养基中繁殖的菌株以1-10％(体积/体积)的比率接种到发酵罐中。发酵持续72h。在发酵结束开始、期间和结束时取样。
底物消耗(葡萄糖、果糖、蔗糖)和代谢物产量(乙酸、乙醇)的测量使用联接到阵列检测器和折射计的高效液相色谱法HPLC(前置柱：阳离子H短柱0mm×4.6mm和柱：AminexHPX-87H；Biorad)进行。底物和代谢物的测量还可利用Gallery食物通过酶方法实现。
实现600nm处的OD测量以跟踪发酵期间的酵母生长(如实施例1详述)。
选择
根据以下判据对酵母进行分类和选择：
-乙酸的产量最高
-乙酸产生的速率最高
在发酵罐中测定与表3中所测的菌株相同的菌株(以上实施例2)的动力学，并且数据汇总于表4以及图1至6中。
利用在30℃下的实施例1的测定法(锥形瓶)和实施例3的测定法(发酵罐)，10种菌株的乙酸产量和乙醇产量的比较结果(在48h)分别示于图1和2中。
图1示出，发酵罐研究确认了布鲁塞尔德克酵母、马克斯克鲁维酵母和酵母属菌种(贝酵母和酿酒酵母)的利益、以及较低程度上Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母的利益。
图2示出，发酵罐研究确认了酵母属和克鲁维酵母属菌株的利益，以及较低程度上布鲁塞尔德克酵母和Hanseniaspora guillermondii的利益[锥形瓶与发酵罐研究之间类似的特征]。两种毕赤酵母属菌株均在发酵罐实验中示出为低乙醇生产者。
图3示出布鲁塞尔德克酵母产生乙酸和乙醇的动力学。在0至45h之间，观察到生物质(OD)以及乙酸和乙醇产量增加。在45小时之后，观察到乙醇产量和生物质稳定性减小，而乙酸产量仍增大(在72h至多16g/L)。值得注意的是，在45h，所有果糖和葡萄糖都被消耗，这表明乙醇产量与生物质产量和糖可用性相关联。
图4示出3种酵母属菌株——贝酵母和酿酒酵母产生乙酸和乙醇的动力学。在0至25h之间，观察到生物质(OD)以及乙酸和乙醇产量的增加。在25h之后，生物质稳定化。乙醇产量保持约较高水平(对3种酵母属菌株40g/L)，而乙酸的产量保持增加以在70小时达到1至3g/L(酿酒酵母)并至多6g/L(贝酵母)。在25h，所有的葡萄糖、果糖和蔗糖都被消耗(未示出数据)。令人感兴趣地，动力学数据示出，贝酵母是比酿酒酵母更好的乙酸生产者。
图5示出2种克斯克鲁维酵母菌株产生乙酸和乙醇的动力学。在0至25h之间，观察到生物质(OD)以及乙酸和乙醇产量的增加。在25小时之后，观察到乙醇产量和生物质的稳定性少量减小，而乙酸产量仍增大(一种菌株至多1g/L，第二种菌株大于4g/l)。值得注意的是，在25h，所有的果糖、葡萄糖和蔗糖都被消耗(未示出数据)。
图6示出乳酒假丝酵母产生乙酸和乙醇的动力学。在0至22h之间，观察到生物质(OD)增加，这与观察结果一致：在该时间所有的果糖、葡萄糖和蔗糖都被消耗(未示出数据)。在相同的时间段期间，观察到乙醇产量增加，之后在22h后减少。产生乙酸的动力学较慢但很规律，并且产生的乙酸水平在72h达到0.9g/L。
其它菌株并未在测试条件下示出任何显著产生的乙酸(未示出数据)。
这些测定示出，关于在测试条件下产生乙酸(和产生乙醇)的动力学，最感兴趣的酵母为布鲁塞尔德克酵母、贝酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)和酿酒酵母。
实施例4：使用所选酵母菌株来发酵巴氏杀菌的可可果肉
在可可豆收获后的发酵期间，微生物生长的主要底物由来自于荚果的果肉提供。该实施例的目的在于检查先前所选酵母在可可果肉培养基中生长的能力。按此顺序，对果肉进行巴氏杀菌，从而消灭果肉的土著微生物并且使其对所选择的添加的酵母的生长和活性的影响最小化。
巴氏杀菌的可可果肉制备
将冷冻的可可果肉在50℃的水浴中解冻。然后通过在105℃的温度下高压釜加热5分钟对果肉进行巴氏杀菌。然后，在10min内将巴氏杀菌的果肉以4700rpm离心并且移除获得的上清液。将离心液用作酵母的培养基。
测定法
用巴氏杀菌的果肉填充500ml烧瓶。以1E+05cfu/ml果肉的浓度接种酵母。在调控于32℃的水浴中进行孵育而不搅拌。在孵育48h和72h之后，取样10ml，从而通过用联接到阵列检测器和折射计的高效液相色谱法HPLC(前置柱：阳离子H短柱0mm×4.6mm和柱：AminexHPX-87H；Biorad)来估计葡萄糖、果糖、乙醇和乙酸浓度。使用用于生长培养基的PDA琼脂平板(马铃薯-葡萄糖-琼脂)通过平板计数技术测量烧瓶中的酵母群体。将皿于25℃温育48小时。
表5汇总了48h和72h在巴氏杀菌的可可果肉上发酵的5种不同酵母的乙酸和乙醇产量、葡萄糖和果糖消耗以及总酵母群体(在两个独立实验中测试H.guillermondiCBS465)。这些数据表示所添加酵母的行为，因为土著菌群通过对可可果肉进行巴氏杀菌而消灭。这些示出：
-在48h和72h两者，所有添加的酵母产生高水平的乙酸
-在48h和72h两者，所有添加的酵母产生高水平的乙醇
-果糖和葡萄糖两者在72h完全被消耗掉；并且
-所有添加的酵母从初始105cfu/ml果肉生长为最终的107至多5.9108cfu/ml果肉。
这些数据一起确认，本文实施例1和3详述的培养基和方法(具体为本文所述的测定法I)满足了模拟可可果肉底物上酵母行为的模型。
实施例5：使用所选酵母菌株来发酵原可可果肉
该测定的目的在于检查将先前所选的酵母添加至原可可果肉(包含土著微生物)导致乙酸和乙醇的两者相比于对照更早地增加。
原可可果肉制备
将冷冻的可可果肉在50℃的水浴中解冻。
测定法
用原果肉填充500ml烧瓶。以1E+05cfu/ml果肉的浓度接种酵母。对于各个实验，不添加酵母的测定作为阴性对照来进行。在调控于32℃的水浴中进行孵育而不搅拌。在孵育48h和72h之后，取样10ml，从而如实施例4所详述的那样来估计葡萄糖、果糖、乙醇和乙酸浓度。如实施例4中所详述的那样测量烧瓶中的酵母群体。
表6汇总了48h和72h在原(未巴氏杀菌的)可可果肉上发酵的4种不同酵母的乙酸和乙醇产量、以及葡萄糖和果糖消耗(在两个独立实验中测试H.guillermondi CBS465)，以及其对应的对照(未添加酵母)。表6还汇总了t＝0(土著酵母)以及48h和72h的总酵母群体(cfu)。这些数据表示存在于可可果肉中的添加的酵母和土著菌群两者的行为。群体表示酵母总数，即添加的酵母和土著菌群的生长。
这些示出：
-在48h和72h两者，当添加根据本发明的酵母时，产生的乙醇水平相比于对照在统计意义上显著更高；
-在48h和72h两者，当添加布鲁塞尔德克酵母时，产生的乙酸水平相比于对照在统计意义上显著更高；
-相比于对照，在48h和72h两者产生的乙酸水平通过添加马克斯克鲁维酵母或乳酒假丝酵母而有所增大；
-当添加根据本发明的酵母时，在72h消耗的果糖和葡萄糖相比于对照更高。
这些数据一起确认在可可发酵过程中使用布鲁塞尔德克酵母的利益，以及较低程度上使用马克斯克鲁维酵母或乳酒假丝酵母的利益。
实施例6：使用所选酵母菌株来发酵可可豆
该实施例示出相比于天然的自然发酵，使用根据本发明的一种或多种酵母菌株发酵可可豆的方法。
打开可可荚果(例如Ivory Coast，Forastero)并且将由果肉包围的可可豆转移到发酵箱中。
制备不同的酵母种菌。可在盐水溶液中将粉末形式的酵母再水化。
然后将各个酵母种菌以105至108CFU/g植物材料的速率添加至独立的发酵箱中。将豆充分混合以确保同质。将未接种的发酵箱用作对照。
在2和4天之后，将豆翻转以允许均匀发酵和空气进入。
定时例如每天，采集豆样品以检查果肉的液化水平。
发酵持续时间被确定为当80％、90％的豆不含果肉(意指果肉被完全液化)时。
在发酵结束时，收集豆并然后干燥(例如，通过日光干燥)直至其含水量＜9％。
豆总体品质的估计使用切割试验建立。豆的外观和更确切的颜色指示发酵是否良好进行。
正常的自然发酵持续6至7天；然而，期望根据本发明的起动酵母添加至其中的可可发酵的持续时间将减少1或2天。期望该实施例的结果示出，使用根据本发明的酵母发酵可可豆比自然发酵更快。
表1：由测定法I测试的菌株的乙酸产量，OD(600nm)和乙酸/OD比率
表2：由测定法I测试的菌株的乙醇产量，OD(600nm)和乙醇/OD比率
表3：通过类似于测定法I的测定法测试的菌株的乙酸和乙醇产量，以及OD(600nm) (30和35℃)
表4：在发酵罐(30℃)中测试的菌株的乙酸和乙醇产量，以及OD(600nm)
表5：在巴氏杀菌的可可果肉上发酵的乙酸和乙醇产量、葡萄糖和果糖消耗以及酵 母的总群体(pop)(48h和72h)
表6：在原可可果肉上发酵的乙酸和乙醇产量、葡萄糖和果糖消耗以及酵母的总群 体(pop)(48h和72h)。

Claims (17)

1.一种用于发酵可可豆的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将至少一种酵母添加至植物材料，所述植物材料包括：
(i)来源于可可树物种的果实荚的豆；和
(ii)果肉；以及
b)将所述植物材料发酵以获得经发酵的可可豆，所述发酵环境包含选自酵母、乳酸菌和醋酸菌的至少一种其它微生物；
其中所添加的酵母能够通过发酵碳水化合物而产生乙醇和乙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述添加的酵母能够：
(a)在测定I期间产生浓度等于或高于0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，优选地等于或高于1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2或2.5g/L，更优选地等于或高于1.5、2或2.5g/L的乙酸，并且/或者在测定I期间以等于或高于50、60、70、80、90、100、120、150、200、250或300mg/L/OD，优选地等于或高于100、120、150、200、250或300mg/L/OD，更优选地等于或高于150、200、250或300mg/L/OD的由所述酵母产生的乙酸的浓度相对于最终OD的比率产生乙酸；并且
(b)任选地，在测定I期间产生浓度等于或高于30、35、40、45或50g/L，优选地等于或高于40、45或50g/L，更优选地等于或高于45或50g/L的乙醇，并且/或者在测定I期间以等于或高于3、3.5或4g/L/OD的由所述酵母产生的乙醇的浓度相对于所述最终OD的比率产生乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述发酵步骤期间不添加醋酸菌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在可可豆的所述发酵期间产生多于60％的所述乙酸通过所述至少一种添加的酵母来实施。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中特别是在所述发酵的前3、4或5天期间或在所述整个发酵步骤期间，存在于所述发酵环境中的所述总酵母/总醋酸菌(log/log)比率大于0.8。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种酵母来自于选自以下的属：德克酵母属、酒香酵母属、有孢汉逊酵母属、克氏酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、酵母属、克鲁维酵母属、德巴利氏酵母属、Kazachstania、Wickerhamomyces、Lindnera和Zygotorulaspora、或它们的任何混合物。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种酵母来自于选自以下的菌种：布鲁塞尔德克酵母(无性型酒香酵母)、班图酒香酵母、Brettanomyces nanus、Brettanomyces naardenensis、葡萄汁有孢汉逊酵母(无性型柠檬形克勒克酵母)、Hanseniaspora guillermondii(无性型蜜蜂克勒克酵母)、嗜高压有孢汉生酵母(无性型Kloeckera cortisis)、发酵毕赤酵母(无性型郎比可假丝酵母)、膜醭毕赤酵母(无性型粗状假丝酵母)、异常威克汉姆酵母、克鲁维毕赤酵母[特别是除克鲁维毕赤酵母PK-KR1菌株(V06/022711)和/或克鲁维毕赤酵母PKKR2菌株(V06/022712)之外]、乳酸克鲁维酵母、汉逊德巴利酵母(无性型无名假丝酵母)、Lindnera jadinii(无性型产朊假丝酵母)、单孢酿酒酵母、Zygotorulaspora florentina、以及贝酵母或它们的任何混合物，优选地所述至少一种酵母来自于选自布鲁塞尔德克酵母、贝酵母、包含布鲁塞尔德克酵母的酵母的混合物以及包含贝酵母的酵母的混合物的菌种。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种酵母具有果胶分解活性。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中添加至少另一种酵母，所述另一种酵母具有果胶分解活性。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中添加至少一种具有果胶分解活性的酶。
11.一种制备可可基产品的方法，所述方法包括：
(a)提供通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法获得或能够获得的经发酵的可可豆；以及
(b)在所述经发酵的可可豆上实施一个或多个进一步的加工步骤以产生所述可可基产品。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述进一步的加工步骤(b)包括干燥所述经发酵的可可豆，优选地其中所述干燥步骤为日光干燥步骤或人工干燥步骤。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，所述方法还包括热处理所述经干燥的豆的另外步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括从所述经烘烤的豆移除壳以产生可可碎粒；以及碾磨所述碎粒以产生可可浆的另外步骤。
15.能够通过发酵碳水化合物而产生乙醇和乙酸的酵母在用于在包含至少一种其它微生物的环境中发酵可可豆的方法中的用途，所述至少一种其它微生物选自酵母、乳酸菌和醋酸菌。
16.酵母的混合物，其由至少2种不同菌种的酵母组成或包含至少2种不同菌种的酵母，诸如2、3或4种不同菌种的酵母，所述酵母各自独立地选自：贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、布鲁塞尔德克酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
17.根据权利要求16所述的酵母的混合物，其由至少2种不同菌种的酵母组成或包含至少2种不同菌种的酵母，诸如2、3或4种不同菌种的酵母，其中一种酵母选自贝酵母和布鲁塞尔德克酵母，并且一种酵母选自贝酵母、布鲁塞尔德克酵母、马克斯克鲁维酵母(乳酒假丝酵母)、酿酒酵母、Hanseniaspora guillermondii、克鲁维毕赤酵母和异常毕赤酵母。
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